EA006230B1 - ПЕПТИД, СПОСОБНЫЙ ОБРАЗОВЫВАТЬ СВЯЗИ С Ig1 И/ИЛИ Ig2 ДОМЕНАМИ АДГЕЗИОННОЙ МОЛЕКУЛЫ НЕРВНОЙ КЛЕТКИ, И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к лечению болезней и патологий центральной и периферической нервной системы, к лечению болезней и патологий мышц и к лечению болезней и патологий различных органов. В частности, настоящее изобретение относится к новым соединениям, которые могут стимулировать пролиферацию клеток и/или рост нейритов из клеток типа нейрона с адгезионной молекулой нервной клетки (АМНК). Кроме того, настоящее изобретение относится к соединениям и лекарственным препаратам, а также к способам обработки нормальных, дегенерированных или пораженных АМНК-представляющих клеток.

Description

Настоящее изобретение относится к лечению болезней и патологий центральной и периферической нервной системы, к лечению болезней и патологий мышц и к лечению болезней и патологий различных органов. В частности, настоящее изобретение относится к новым соединениям, которые могут стимулировать пролиферацию клеток и/или рост нейритов из клеток типа нейрона с адгезионной молекулой нервной клетки (АМНК). Кроме того, настоящее изобретение относится к соединениям и лекарственным препаратам, а также к способам обработки нормальных, дегенерированных или пораженных АМНКпредставляющих клеток.

Предпосылки создания изобретения

В последние десятилетия мозг и, следовательно, нервные клетки и их функции вызывали все возрастающий интерес исследователей. Без сомнения, для обеспечения правильного функционирования тела и сознания чрезвычайно важно, чтобы эта сложная система работала должным образом. Было обнаружено, что нарушение нормальной работы тела и сознания может объясняться отклонениями в уровне сигнальных соединений, включая нейронные передатчики (нейротрансмиттеры). Некоторые нарушения в работе органов могут объясняться разрушением нервных клеток (нейронов), соединений между нервными клетками и соединений между мышечными клетками и нервными клетками. В данном случае примером может служить такая дегенеративная патология нервных клеток, как болезнь Альцгеймера, когда гибель нервных клеток приводит к дряхлости.

Во время развития мозга между нервными клетками (нейронами) образуются контактные соединения. Эти соединения необходимы для осуществления связи между нейронами, которая позволяет отдельным нейронам функционировать совместно, как единому целому. В развитом мозге связи между нейронами постоянно перестраиваются, что обеспечивает приспособление к поражениям, вызванным меняющейся окружающей средой. Способность перестраивать связи нейронов является решающей при обучении и запоминании и при регенерации тканей, например, после поражения мозга или после дегенеративной патологии нервных клеток.

Очевидно, что механизмы, контролирующие образование контактов между нейронами, в основном, те же, что и механизмы развития и созревания тканей. При образовании контактов между нейронами используется несколько механизмов, включая адгезию клеток, удлинение нервных клеток (нейритов), образование пучков (группирование отдельных нейритов в пучки) и образование точек контакта (синапсов).

Адгезионные молекулы клетки (АМК) составляют группу протеинов, обеспечивающих межклеточную адгезию. Основной домен АМК принадлежит к суперсемейству иммуноглобулина, которое характеризуюется наличием доменов иммуноглобулина. Адгезионная молекула нервной клетки (АМНК) является такой адгезионной молекулой клетки суперсемейства иммуноглобулина, которой изобилует нервная система. Присутствие АМНК проявляется на внешней мембране нервных клеток. Связь между двумя клетками усиливается, когда одна АМНК на одной клетке соединяется с другой АМНК на другой клетке. АМНК соединяется не только с АМНК, но также и с другими протеинами, появляющимися на нервных клетках или во внеклеточном веществе мозга (внеклеточная матрица). При наличии адгезии между нервными клетками или между нервными клетками и внеклеточной матрицей АМНК влияет на миграцию клеток, рост нейритов, образование пучков нейритов и образование синапсов.

Вид АМНК находится в определенном соотношении с событиями морфогенеза, в предположении, что АМНК имеет большое значение во время развития организма (Ейе1тап, 1990 г.). Таким образом, очевидно, что АМНК имеет значение для развития нервной системы (Эа81оп и др., 1996 г.) и различных органов, включая почки (Баск! и др., 1990 г.), печень (Кшйе1 и др., 1996 г.), сердце (СаагЙ8Уо11 и др., 1993 г.), половые железы (Мо11ег и др., 1991 г.), поджелудочную железу (Мо11ег и др., 1992 г.) и мышечную ткань (Ьапйтеккег и др., 1990 г.). Поэтому лиганды, способные влиять на функции АМНК, могут оказаться полезными в условиях замедленного развития этих органов, если вводить соответствующие различия для мишенных клеток (\Уа1511 и др., 1990 г.). В мозгу роль АМНК исследовалась на подопытных мышах, у которых изменялось развитие определенных участков мозга, включая обонятельную систему, гиппокамп, мозжечок и участка внутренней оболочки глазного яблока (Сгетег и др., 1994 г.). В этих тканях отсутствие АМНК ухудшало миграцию клеток (Опо и др., 1994 г.) и рост и образование пучков нейритов (Сгетег и др., 1997 г.), что, в свою очередь, приводит к измененному синаптогенезису и морфологическим и функциональным изменениям. На примере трансгенной мыши с измененным геном АМНК, которая использовалась для получения только растворимых форм АМНК, было показано, что функции АМНК могут сильно мешать развитию (ВаЫпоуйх и др. 1996 г.).

Было показано, что в развитой нервной системе АМНК играет очень важную роль для обеспечения пластичности нейронных связей, имеющих отношение к регенерации тканей, обучению и памяти (Ие1Й8 и др., 1996г.). Очевидно, что в периферической нервной системе АМНК необходима для обеспечения роста нервных волокон и образования связей между нервами и мышечной тканью при регенерации тканей после их повреждения, включая поражения (№ек1е и др., 1985 г.) и удар (1искег и др., 1995 г.).

Более того, АМНК, по-видимому, вовлечена в процессы, связанные с возрастными нарушениями способности к регенерации периферических нервов и нервных соединений с мышечной тканью (Океп и др., 1995 г.), а также имеет отношение к многочисленным заболеваниям, связанным с дегенерацией мышечной ткани (\Уак11 и др., 1985 г.). Подобное влияние АМНК наблюдалось и в центральной нервной

- 1 006230 системе, где, по-видимому, АМНК играет важную роль для обеспечения роста нейритов, формирования пучков нейритов, разветвления нейритов и, возможно, распознавания целей, связанных с регенерацией тканей (Оаш1о££ и др., 1986 г.). Кроме того, на примере подопытных мышей с блокированными функциями АМНК показано, что АМНК необходима также для миелинезации нервных волокон, что чрезвычайно важно для работы нейронов (Сатешш и др., 1997 г.). Было показано существенное влияние АМНК на все процессы, сопутствующие обучению, воссозданию нейронных связей при необходимости стабилизации маршрутов памяти (Эоу1е и др., 1992 г.). Кроме того, вмешательство в работу АМНК антител или блокировка АМНК приводят к нарушению способность подопытных мышей к обучению (Ьи1Ы и др., 1994 г.; Вопи и др., 1995 г.; 8сйо1еу и др., 1993 г.). На примере подопытных мышей с блокированными функциями АМНК стало очевидно, что АМНК принимает участие в других поведенческих явлениях. Так, на примере подопытных мышей с блокированными функциями АМНК показано изменение сердечного ритма (8йеи и др., 1997 г.), а у мужских особей было отмечено увеличение агрессии (81отк и др., 1997 г.). У людей повышенные уровни растворимых форм АМНК были выявлены при шизофрении (уаи Каттеи и др., 1998 г.) и склерозе (Маззаго и др., 1987 г.), что дает повод полагать, что АМНК играет очень важную роль при этих заболеваниях.

Известны три основные формы АМНК, две из которых являются трансмембранными формами, в то время как третья форма крепится к мембране с помощью липидного якоря (см. фиг. 1). Все три формы имеют одну и ту же структуру, состоящую из пяти доменов иммуноглобулина Дд-домены) и двух доменов, подобных фибронектину (РиШ-домены). Форма, предшествующая АМНК, состоит из сигнальной последовательности. На фиг. 17 показана аминокислотная последовательность предшественника изоформы 140 кОа АМНК человека. Ν-концевым 1д-доменам присвоены номера с первого по пятый, т.е. с 1д1 по 1д5. Доменам фибронектина номера присвоены таким же образом, т.е. РиШ1 и ΡηΙΙΙ2. Помимо стимулирования адгезии клеток АМНК влияет на трансдукцию сигналов в клетке (8с1шс11 и др., 1989 г.). Когда поверхностная АМНК одной клетки образует связь с другой клеткой, то внутрь клетки передается сигнал (трансмембранная передача сигнала). Внутри этой клетки начинается каскад сигналов, который затем влияет на поведение клетки. Показано, что передача сигналов, инициированная процессом образования связей с помощью АМНК, может стимулировать рост нейритов (ЭоНеПу и др., 1996 г.).

Неясно, однако, который из доменов АМНК стимулирует адгезию клеток и трансдукцию сигналов. В соответствии с общепринятой гипотезой трансреципкорное взаимодействие между доменами !д3 двух противодействующих АМНК стимулирует адгезию гомофильных АМНК. Эта точка зрения имеет под собой серьезное основание, и предполагаемый связующий участок был найден (Вао и др., 1992 г., 8апбίη§ и др., 1994 г.). Кроме того, было показано, что лиганды, влияющие на ЦЗ-домен. подавляют адгезию клеток, стимулированную АМНК. В соответствии с последней теорией не только домен Ι§3, но и все пять Ц-доменов стимулируют адгезию гомофильных АМНК (ВаиНот, 1996г.). В соответствии с этой гипотезой 1 -домен одной АМНК образует связь с ^-доменом другой АМНК, Ι§2-домен образует связь с ^-доменом, а ЦЗ-домен образует связь с Ιβ3-доменом. Таким образом, эти две теории адгезии АМНК практически перекрывают друг друга. Авторы настоящего изобретения и их коллеги недавно предложили теорию, в соответствии с которой адгезия гомофильных АМНК может стимулироваться двойным реципкорным взаимодействием доменов Ι§1 и Ι§2 двух противодействующих АМНК (ТНотзеи и др., 1996 г., К1зе1уоу и др., 1997 г., Воии, 1997 г.). Воии наблюдал угнетение агрегации нейронов в культуре клеток гиппокампа при добавлении пептидов, о которых было заранее известно, что они могут образовывать связи с Ι§1-доменом АМНК. Наблюдалось дополнительное стимулирование роста нейритов. Воии, однако, не раскрыл последовательность исследования пептидов и не предложил использование этих наблюдений в медицинской практике. И, наконец, механизм адгезии гомофильных АМНК все еще является предметом обсуждения, хотя большинство исследователей в этой области склоняются к гипотезе о реципкорном взаимодействии пяти Ц-доменов или, по крайней мере, о взаимодействии Ι§3доменов двух противодействующих АМНК.

Было показано, что антитела к АМНК, очищенный протеин АМНК и рекомбинантные домены АМНК инициируют трансдукцию сигналов в определенной клетке. Высокая концентрация АМНКантител может вызвать временное увеличение содержания кальция, а также изменение уровня рН в некоторых, но не во всех нейронных клетках (8сйисй и др., 1989г.). Рекомбинантные домены АМНК Ι§1 и Ι§2 и рекомбинантные домены Ιβ1-5 могут инициировать такое же временное увеличение содержания кальция и изменение уровня рН в некоторых клетках (Рге1 и др., 1992г.). При использовании протеина АМНК в виде субстрата или монослоя в культуре клетки он может стимулировать рост нейритов. Ответная реакция зависит от взаимодействия между РиШ-доменами АМНК и (РСР)-рецепторами с фактором роста фибробласта (Р6Р) (ЭоНеПу и др., 1996 г.). Кроме того, для роста нейритов важно взаимодействие цитоплазмы АМНК с тирозинкиназа-фин (Веддз и др., 1997 г.).

По-видимому, это взаимодействие активизирует путь обмена Ваз-МАР-киназы (8с1пшб В.8. и др., 1999 г.).

К тому же рекомбинантные домены АМНК, иммоболизированные в субстрате, могут стимулировать рост нейритов, разветвление нейритов или группирование отдельных нейритов в пучки. Таким образом, при использовании РиШ-доменов АМНК в качестве субстрата культуры клетки они могут увеличивать ветвление нейритов (81аЫйи1 и др., 1997г., Казрег и др., 1996г.). Кроме того, как было отмечено в

- 2 006230 отчете, из всех доменов АМНК ЕпШ-домены оказывали наибольшее влияние на распластывание клетки и рост нейритов. Домены 1д1-5 также влияли на этот процесс, но не так сильно, как ЕпШ-домены (Рге1 и др., 1992 г.). С другой стороны, как видно из этого исследования, домены 1д1 и 1д2 больше других стимулировали адгезию клеток и миграцию клеток (Рге1 и др., 1992 г.). Рге1 и другие также наблюдали стимулирование роста нейритов такими изолированными доменами АМНК, как 1д3, 1д4, 1д5, РпШ1 и РпШ2, но не доменами 1д1 и 1д2. Для группирования нейритов в пучки очень важной оказалась последовательность, расположенная между доменами 1д5 и РпШ1 (РойегЬегд и др., 1993 г.). Домен 1д5 АМНК очень важен для роста нейритов благодаря наличию или отсутствию на этом домене полисиаловой кислоты (в составе) цепочки сахаров (Кийкйаикег и др., 1996 г.). Точно так же важен и домен 1д4 благодаря наличию или отсутствию на этом домене в качестве альтернативы сплайсированного домена УАЗЕ (ЭойеПу и др., 1992 г.). Было показано, что синтетические пептиды, соответствующие последовательности УАЗЕ, мешают АМНК стимулировать рост нейритов (Байги и др., 1997 г.). Кроме того, считается, что домен 1д4 АМНК образует связи с другой адгезионной молекулой клетки Б1, что обеспечивает его влияние на рост нейритов (Ногйкойе и др., 1993 г.). В отличие от иммобилизированных реагентов, АМНК-антитела или рекомбинантные домены замедляют рост нейритов при введении их в раствор. Пептиды, соответствующие гомофильным связующим участкам домена 1д3 или мутации в этой последовательности в домене 1д3, замедляли рост нейритов, стимулированный АМНК (Запб1д и др., 1994г.).

Однако, как было показано недавно, антитело к АМНК стимулирует рост нейритов (патент США № 5667978). Это антитело распознает домен 1д3 АМНК. Кроме того, было показано, что все домены АМНК влияют на пролиферацию глиальных клеток, клеток нейробластомы и фибробластов, причем самое большое влияние оказывает домен 1д3. Было показано, что для выполнения этой функций необходимо взаимодействие с МАР-киназой (Кш§йе1, 1998 г.). Показано, что различные лиганды 1д3-домена АМНК, оказывающие ингибирующее влияние, включая малые пептиды, которые соответствуют части последовательности 1д3-домена, могут замедлять глиальную пролиферацию (\УО 96/18103).

Исходя из этих данных, можно сделать вывод о том, что протеин АМНК или лиганды АМНК могут влиять на функции нервной системы и других тканей. Замедление глиальной пролиферации может оказаться полезным при дегенеративных состояниях (\УО 96/18103, патент США № 5625040, патент США № 5667978). С другой стороны, если можно стимулировать функции АМНК, в частности вызов роста нейритов, то возможно оказывать положительное влияние на функции мозга. Приводится описание стимулирования определенных ин-витро функций АМНК для антитела к 1д3-домену АМНК (патент США 5667978). Однако нет описаний малых лигандов АМНК, обладающих существенным стимулирующим влиянием на функции АМНК. Более того, не ясно, с какими доменами АМНК могут быть связаны такие лиганды. Большинство данных указывают на то, что 1д3-домен АМНК является самым ключевым доменом, который оказывает наибольшее влияние на адгезию гомофильных АМНК, в то время как цитоплазма АМНК вместе с РпШ-доменами испытывают наиболее сильное взаимодействие с сигнальными молекулами.

В работе АМНК и невральная платичность (Копп, 1997 г.) исследована роль АМНК в невральной пластичности. Для исследования влияния антител АМНК, слитых белков и других лигантов АМНК на роль АМНК были проведены различные анализы (системы тестирования), включая агрегирование невральных клеток, рост нейритов и долгосрочное потенцирование. Были исследованы лиганды АМНК из библиотеки случайных пептидов. Оказалось, то пептиды могут образовывать связь с 1д1-доменом. Как оказалось, один специфический пептид, который в дальнейшем не расматривается в этой работе, замедляет агрегирование невральных клеток и стимулирует рост нейритов. Делается вывод, что такие лиганды могут оказаться ценным инструментом в дальнейших попытках прояснить роль АМНК в развитии нервной системы, а также в синаптической пластичности. Возможное использование в медицине исследованных пептидов не является целью настоящей работы и поэтому не предполагается. Кроме того, последовательности исследованных пептидов в настоящей работе не рассматриваются.

Патент США № 5625040 относится к протеогликану хондроитинсульфата (фосфакан) и его использованию для улучшения регенерации нервов путем образования связи с АМНК. Последовательность фосфакана содержит 1616 аминокислотных остатков. Рекомбинантный фосфакан был получен путем клонирования кодирующего гена в соответствующий вектор. Ген изолировался с использованием затравок, подобранных в соответствии с идентифицированными аминокислотными последовательностями некоторых протеолитических фрагментов фосфакана. Ни один из фрагментов сам по себе не обладал биологическим действием.

Следует ожидать, что стимулирующее действие на возможный рост нейритов будет иметь положительное влияние на функции нервной системы, для чего необходима пластичность связей между нервными клетками. Эти функции включают обучение и память и регенерацию тканей. Поэтому идентифицирование веществ, способных влиять на подачу сигналов через АМНК, имеет существенное значение.

Краткое изложение сущности изобретения

В соответствии с настоящим изобретением предложены новые соединения, которые стимулируют рост нейритов в центральной и периферической нервной системе. Более конкретно, изобретение относится к соединениям, которые

а) образуют связь с 1д1-доменом АМНК и/или

- 3 006230

Ь) образуют связь с 1д2-доменом АМНК и могут стимулировать рост нейритов и/или обеспечить пролиферацию АМНК-представляющих клеток. С помощью 1д1-домена АМНК и 1д2-домена АМНК исследованы 1д1-полипептид АМНК и 1д2полипептид АМНК. Эти соединения включают а) группу, состоящую из 1д2-полипептидов АМНК, их фрагментов и мимик, и Ь) группу, состоящую из 1д1-полипептидов АМНК, их фрагментов и мимик.

Такие соединения могут состоять из природных, а также из синтезированных аминокислот, мономеров нуклеиновых кислот пептидов и/или пептидомимик.

В настоящем изобретении описан гомофильный связующий участок домена АМНК, образованный из комбинированного (объединенного) 1д1- и 1д2-домена, который ниже будет обозначаться как 1д1-1д2 АМНК или как 1д1-1д2-домен АМНК.

В изобретении описаны такие соединения, которые образуют связи либо с 1д1-доменом АМНК (что соответствует рассмотренному выше пункту а)), либо с 1д2-доменом АМНК (что соответствует рассмотренному выше пункту Ь)). Эти два домена образуют связующий участок для гомофильных АМНК.

В соответствии с настоящим изобретением соединения, указанные в пунктах а) и Ь), могут соответственно принадлежать трем описанным ниже группам соединений (группа соединений I, II и III), которые могут активизировать рост нейритов.

Что касается группы соединений I, то в качестве такого соединения может использоваться, в частности, пептид, который образует связь с первым доменом АМНК (Ед1 АМНК) через связующее звено, в состав которой входят по крайней мере 2 основных аминокислотных остатка, желательно не менее 2 аминокислотных остатков внутри последовательности из 10 аминокислотных остатков, а еще лучше не менее 2 основных аминокислотных остатков внутри последовательности из 3 аминокислотных остатков.

Интересующие пептиды включают следующую последовательность: (Хаа⁺)т-(Хаа)р-(Хаа⁺)-(Хаа¹)г-(Хаа⁺)-(Хаа)_ч-(Хаа⁺)п, где Хаа⁺ - основной аминокислотный остаток,

Хаа¹ - любой аминокислотный остаток,

Хаа - любой аминокислотный остаток, а т, п, р, с.| и г - независимо друг от друга принимают значение 0 или 1, и желательно, чтобы основными аминокислотными остатками были лизин или аргинин, а г принимало значение 1.

Природа аминокислотных остатков Хаа⁺ и Хаа¹ не важна. Очевидно, что на их месте могут быть любые аминокислотные остатки. Однако желательно, чтобы на месте Хаа¹ был пролин (Р) или глутаминовая кислота (Е).

Еще лучше, чтобы у пептидов г принимало значение 1 и хотя бы одно т и п было равно 1.

Желательно, чтобы пептиды по настоящему изобретению включали последовательность (К/В)_0-]К/В.-Х-К/В.), где Х имеет то же значение, что и Хаа¹, еще лучше, чтобы они включали последовательность К/В.-К/В.-Х-К/В. или К/В-Х-К./В, а еще лучше, чтобы они включали последовательность К/В.-Р-К/В, К/В.-К/В.-Р-К/В, К/В-К/В-Е-К/В или К/В.-К/В.-Е-К/В, но лучше всего, чтобы они включали последовательность К-Р-К, К-К-Р-К, К-К-Е-К или К-К-Е-В. Примерами могут служить последовательности Ά-8К-К-Р-К-В-Н-ЕК-А (последовательность № 1), А-К-К-Е-В-О-В-К-Э-Т-О (последовательность № 2) и АΚ-Λ-Ε-Ν-Χν-С-А-Р-К. (последовательность № 3).

Что касается группы соединений II, то в качестве такого соединения может использоваться пептид, который образует связь с той частью гомофильного связующего участка ΣβΕΣ^ АМНК, которая состоит из ^Едомена.

Связующий участок включает не менее 2 основных аминокислотных остатков и не менее 1 аполярной аминокислоты, но предпочтительно, чтобы связующий участок включал не менее 2 основных аминокислотных остатков и 1 аполярного аминокислотного остатка внутри последовательности из 12 аминокислотных остатков. Еще лучше, чтобы связующий участок включал не менее 2 основных аминокислотных остатков и не менее 1 аполярной аминокислоты внутри последовательности из 8 аминокислотных остатков. Но лучше всего, чтобы связующий участок включал не менее 2 основных аминокислотных остатков, разделенных 3 аминокислотами помимо 1 аполярной аминокислоты с 1 соседней кислой аминокислотой, отделенными одним из основных аминокислотных остатков и 1 аминокислотой. Такие пептиды соответствуют основной последовательности (Хаа⁺)-(Хаа)-(Хаа)-(Хаа)т-(Хаа⁺)-(Хаа^-)п-(Хаа^ь)-(Хаа)_о-(Хаа^ь)р, где Хаа⁺ - основной аминокислотный остаток,

Хаа^- - кислый аминокислотный остаток,

Хаа¹¹ - аполярный аминокислотный остаток,

Хаа - любой аминокислотный остаток, а т, п, о и р - независимо друг от друга принимают значение 0 или 1, и желательно, чтобы основными аминокислотными остатками были лизин или аргинин, кислыми аминокислотами были глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, в качестве аполярной аминокислоты был лейцин, изолейцин, валин или фенилаланин, а г принимало значение 1.

Желательно, чтобы пептиды по настоящему изобретению включали последовательность (К/В)-Х-ХХ-(К/В)-Х-(Е/Э)-(Е/[/У/Е)-Х-(Е/[/У/Е). где Х является любым аминокислым остатком, еще лучше, чтобы они

- 4 006230 включали последовательность (К/Я)-Х-(Е/О)-(ЬЛ/У/Е)-Х-(Ъ/1/У/Е), (К/К)-Х-Х-Х-(К/К)-Х-(Е/О), (К/К)-ХХ-(К/К.)-Х-(Е/Э) или (К/Е)-Х-(Ь/1/У/Е)-Х-(Е/1/У/Е), а еще лучше, чтобы они включали последовательности (К/Я)-Х-Х-Х-(К/Я)-Х-(Е/О)-(Ъ/1/У/Е), (К/Я)-Х-Х-(К/Я)-Х-(Е/О)-(Ь/1/У/Е) или (К/Е)-Х-Х-Х-(К/Я)-Х-(Ъ/1/У/Е), или еще лучше, чтобы они включали последовательности (К/К)-Х-Х-(К/К)-Х-(Е/П)-(Е/1/У/Р)-Х-(Ь/1/У/Е), (К/Е)-Х-Х-Х-(К/К)-Х-(Ь/1/У/Е)-Х-(Е/1/У/Е) или (К/К)-Х-Х-Х-(К/К)-Х-(Е/П)-(Е/1/У/Е)-(Ь/1/У/Е), но лучше всего, чтобы они включали последовательность СКТЕАКСЕЮТК (последовательность № 23).

Что касается группы соединений III, то в качестве такого соединения может использоваться пептид, который образует связь с той частью связующего участка гомофильных 1д1-1д2 АМНК, которая состоит из 1д2-домена.

Связующее включает не менее 2 основных аминокислотных остатков и не менее 1 аполярной аминокислоты, но предпочтительно, чтобы связующее включало не менее 2 основных аминокислотных остатков и 2 аполярных аминокислотных остатка внутри последовательности из 10 аминокислотных остатков. Еще лучше, чтобы связующее включало не менее 2 основных аминокислотных остатков и не менее 1 аполярной аминокислоты внутри последовательности из 9 аминокислотных остатков. Но лучше всего, чтобы связующее включало не менее 2 основных аминокислотных остатков, разделенных 4 аминокислотами, при этом одна из кислых аминокислот отделена 1 аминокислотой от основной аминокислоты и 2 соседних аполярных аминокислот. Такие пептиды соответствуют основной последовательности.

(Хаа^-)-(Хаа)-(Хаа)-(Хаа)_т-(Хаа)_п-(Хаа^-)-(Хаа)-(Хаа⁺)-(Хаа^ь)-(Хаа^ь)р, где Хаа⁺ - основной аминокислотный остаток,

Хаа^- - кислый аминокислотный остаток,

Хаа^ь - аполярный аминокислотный остаток,

Хаа - любой аминокислотный остаток, а т, п, о и р - независимо друг от друга принимают значение 0 или 1, и желательно, чтобы основными аминокислотными остатками были лизин или аргинин, кислыми аминокислотами были глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, в качестве аполярной аминокислоты был лейцин, изолейцин, валин или фенилаланин, а г принимало значение 1.

Желательно, чтобы пептиды по настоящему изобретению включали последовательность (Е/Э)-Х-ХХ-(Е/П)-Х-(К/К.)-(Е/1/У/Е)-Х-(Е/1/У/Е), где Х является любым аминокислым остатком, еще лучше, чтобы они включали последовательность (Е/П)-Х-(К/К)-(Е/1/У/Е)-Х-(Ь/1/У/Е), (Е/П)-Х-(К/К)-(Ь/1/У/Е)-(Е/1/У/Е), (Е/О)-Х-Х-Х-Х-(Е/О)-Х-(К/К)-(Ь/1/У/Е), (Е/О)-Х-Х-Х-(Е/П)-Х-(К/К)-(Ь/1/У/Е) или (Е/О)-Х-Х-(Е/О)-Х(К/К.)-(Ъ/1/У/Е), а еще лучше, чтобы они включали последовательности (Е/О)-Х-Х-(Е/О)-Х-(К/К.)-(Ь/1/У/Р)Х-(Ъ/1/У/Р) или (Е/П)-Х-Х-(Е/О)-Х-(К/К.)-(Ь/1/У/Е)-(Е/1/У/Е), или еще лучше, чтобы они включали последовательности (Е/О)-Х-Х-Х-Х-(Е/П)-Х-(К/К)-(Е/1/У/Е)-(Ь/1/У/Е), (Е/П)-Х-Х-Х-(Е/О)-Х-(К/Е)-(Ь/1/У/Е)-Х(ЪЛ/У/Е) или (Е/О)-Х-Х-Х-(Е/О)-Х-(К/К.)-(Е/1/У/Е)-(Е/1/У/Е). но лучше всего, чтобы они включали последовательность СЕ18УСЕ8КЕЕЬ (последовательность № 26).

Аббревиатуры аминокислот включают коды, состоящие из трех обычных букв и одной буквы: аланин (А1а, А), агринин (Агд, К), аспарагин (Акп, К), аспарагиновая кислота (Акр, Ό), цистеин (Сук, С), глутаминовая кислота (С1ц, Е), глутамин (С1п, О), глицин (С1у, С), гистидин (Н1к, Н), изолейцин (Не, I), лейцин (Ьеи, Ь), лизин (Ьук, К), метионин (Ме1, М), фенилаланин (Рйе, Е), пролин (Рго, Р), серии (8ег, 8), треонин (Т11Г Т), триптофан (Тгр, ^), тирозин (Туг, Υ) и валин (Уа1, У).

В настоящем контексте термин аминокислота обозначает как аминокислоты природного происхождения, так и аминокислоты неприродного происхождения. К аминокислотам неприродного происхождения можно отнести, например, модифицированную аминокислоту природного происхождения.

Например, пептиды могут быть модифицированы путем ацетилирования.

В настоящем изобретении рассматриваются также соединения, которыми являются антитела 1 домена анти-АМНК, которые имитируют связи Iд2-доменов с ^-доменами АМНК. К таким непептидным молекулам можно отнести, например, ΡΝΛ или пептидомиметики. Примеры пептидомиметиков приводятся в работе автора Магкйа11 С.К., Те1гайебгоп 49, 3547-3558 (1993г.) и включают олиго(азотзамещенные глицины), олигокарбаматы, олигосульфоны и олигосульфоксиды.

В настоящем изобретении рассматриваются также соединения, которые являются непептидными молекулами, которые имитируют связи Iд2-доменов с ^-доменами АМНК.

Еще в настоящем изобретении рассматриваются Iд2-полипептиды АМНК, их фрагменты и мимики для применения при обработке нормальных, дегенерированных или пораженных АМНК-представляющих клеток, при этом данная обработка включает стимулирование роста нейритов из АМНК-представляющих клеток, и/или пролиферации АМНК-представляющих клеток.

Под обработкой понимается лечение заболевания или состояния центральной и периферической нервных систем, мышечной ткани или различных органов. Под обработкой может также пониматься стимулирование обучения и памяти.

В настоящем контексте под термином состояние понимается любое состояние, для которого необходимо лечение, а эта необходимость связана с поражением, патологией или ожидаемой патологией или со стимулированием и/или улучшением нормального состояния.

- 5 006230

В настоящем изобретении также рассматривается применение 1д2-полипептидов АМНК, их фрагментов и мимик при изготовлении лекарственных препаратов для обработки нормальных, дегенерированных или пораженных АМНК-представляющих клеток.

В настоящем изобретении также рассматриваются фармацевтические соединения, включающие одно соединение или большее число соединений по настоящему изобретению.

Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается способ обработки нормальных, дегенерированных или пораженных АМНК-представляющих клеток, при этом данный способ включает введение одного соединения или большего числа соединений по настоящему изобретению в количестве, достаточном для эффективного воздействия.

Под обработкой может пониматься лечение патологий или состояний центральной и периферической нервной системы, к которым можно отнести, например, послеоперационное поражение нервов, травматическое поражение нервов, нарушенную миелинизацию нервных волокон, послеишемическое, например, в результате удара, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, слабоумие типа мультиинфарктной деменции, склерозов, дегенерации нервов, связанных с сахарным диабетом, нарушениями, влияющими на циркадный ритм или передачу сигналов между нейронами и мышечной тканью, и шизофрению; патологий или состояний мышечной ткани, включая состояния с нарушенными функциями нервно-мышечных связей типа генетических или травматических атрофических нарушений мышечной ткани; патологий или состояний различных органов типа дегенеративных состояний половых желез, поджелудочной железы типа сахарного диабета 1-го и 2-го типов, почек типа нефротического синдрома или сердца, печени или кишечника. Под лечением может также пониматься стимулирование способности к обучению и/или стимулирование памяти.

Настоящее изобретение также относится к простетическому проводнику нерва, который включает одно соединение или большее число соединений по настоящему изобретению.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 изображены различные формы адгезионной молекулы нервной клетки - АМНК (ЫСАМ).

A) Все главные формы АМНК имеют одинаковые внеклеточные части, состоящие из пяти доменов иммуноглобулина (1д-домены) и двух доменов фибронектина третьего типа (БпШ-домены). Три трансмембранные или прикрепляемые к мембране формы (ЫСАМ-120, -140 и -180) генерируются альтернативным сплайсированием. Кроме того, существуют различные растворимые формы АМНК. В) Отдельные домены АМНК нумеруются с Ν-конца (ΝΗ2), самый крайний домен Ν-конца обозначается 1д1-домен АМНК. УАЗЕ экзон, который может вводиться в область 1д4-домена АМНК, является важным альтернативно сплайсированньм экзоном. 1д5-домен может быть гликозилирован с полисиаловой кислотой (РЗА).

На фиг. 2 изображена идентификация нагруженных пептидами гранул, связывающих АМНКдомены. А) Библиотеки нагруженных декапептидами гранул культивируются с 1д1 -доменами рекомбинантной АМНК. Визуализация гранул, по которым связываются 1д1-домены АМНК, производится с помощью цветной реакции. Окрашенные гранулы изолированы и микросеквенированны (примеры 3 и 4).

B) После оценки связанных последовательностей пептиды, соответствующие этим последовательностям, синтезируются как мономеры, дендримеры (четырехмерные) или связанные с альбумином бычьей сыворотки двадцатимеры (пример 5). С) Структура дендримеров пептида. Четыре мономера пептида (пептид) связаны со скелетом макромолекулы, состоящей из трех молекул лизина.

На фиг. 3 изображены единичные клетки гиппокампа (пример 7 (2)), в присутствии (А) или отсутствие (В) С3й (5,4х10^-7 М).

На фиг. 4 изображены пептидные последовательности, идентифицированные по библиотекам гибридных пептидов. А) 22 последовательности, идентифицированные путем проверки гибридных библиотек с 1д1-доменом АМНК. В) Пептиды из пункта А), включающие части последовательности К/К-К/К-РΚ/Κ.-Ν/8, выделены жирным. Подчеркнут пептид С3. С) Пептиды, включающие части последовательности К/К.-К/К-Е-К/К.-Х-К/К.-К/К, выделены жирным. Подчеркнут пептид Ό3. Ό) Пептиды, включающие части последовательности О-Х-К/К-Р-К/К, выделены жирным. Подчеркнут пептид Ό4.

На фиг. 5 изображен ряд агрегаций первичных нейронов гиппокампа после нахождения в течение 24 ч в культуре в присутствии дендримера пептида С3 с концентрацией 1,07 мкМ и 2,15 мкМ (пример 7). Наблюдаемое увеличение числа агрегаций отражает замедление процесса агрегирования.

На фиг. 6 изображено число нейронных отростков в первичных нейронах гиппокампа после нахождения в течение 24 ч в культуре в присутствии дендримера пептида С3 с концентрацией 1,07 и 2,15 мкМ (пример 7).

На фиг. 7 обобщены пептиды, связывающие 1д1 -домены АМНК, и их влияние на рост нейритов и агрегирование в среде культур клетки первичных нейронов гиппокампа. Как описано в примере 7 (2), влияние на рост нейритов измерено в культурах диссоциированных нейронов. Для пеиг 0 обозначает, что нет никакого влияния, + обозначает, что оказывается стимулирующее влияние, ++ обозначает, что оказывается сильное стимулирующее влияние на рост нейритов. Для адд 0 обозначает, что нет никакого влияния, - обозначает, что оказывается замедляющее влияние, -- обозначает, что оказывается сильное замедляющее влияние на процесс агрегирования, при этом замедляющее влияние выражается увеличен

- 6 006230 ным числом образованных аггрегаций. Имена и/или числовые обозначения пептидов соответствуют пептидам последовательностей, изображенным на фигуре. Все пептиды испытывались как дендримеры.

На фиг. 8 показано влияние дендримера пептида С3 на рост нейритов в совместной культуре из нейронов и фибробластов (пример 7). Первичные нейроны гиппокампа выращивались на монослое фибробласта в присутствии Ν0’ΑΜ-14() (ЬВЫ) или без таковой (ЬУИ). Величина роста нейритов на ЬВЫ монослое из фибробласта была больше величины роста нейритов на ΕνΝ монослое из фибробласта. Это увеличение замедлялось С36 с концентрацией 0,54 или 5,4 мкМ. На ΕνΝ-монослях рост нейритов стимулировался С36.

На фиг. 9 показано влияние дендримеров пептидов Ό3 и Ό4 на рост нейритов из первичных нейронов гиппокампа, доза показана в мкМ.

На фиг. 10 показано влияние дендримера пептида С3 на рост нейритов из первичных нейронов гиппокампа, доза показана в мкМ. Рост нейритов измеряется по средней длине самого длинного нейрита (ахоп 1еп§111 - длина аксона). Первичные нейроны гиппокампа крыс Е18 выдерживались в течение 21 ч на фибронектине.

На фиг. 11 изображены данные измерений роста нейритов из нейронов, выдержанных на пластике. Влияние 036 и контрольных пептидов (фиг. 7) на рост нейритов при концентрации 0,54 мкМ.

На фиг. 12 показано влияние различных ингибиторов трансдукции сигналов на рост нейритов из первичных нейронов гиппокампа, выдержанных на фибронектине со стимуляцией 036 (0,54 мкМ, см. пример 7 (2)). νοτ верапамил (10 мкМ), Сопо: омега-конотоксин ΟνίΑ (0,27 мкМ), ρΐοορί: 1д1 -домен АМНК, приготовленный в РюЫа ракЮпк, как описано в примере 1, 0,54 мкМ.

На фиг. 13 показано влияние различных ингибиторов трансдукции сигналов на рост нейритов из первичных нейронов гиппокампа, выдержанных на фибронектине со стимуляцией С36 (0,54 мкМ, см. пример 7 (2)). ЕгЬ: аналог эрбстатина (0,2 мкМ), РегЫк: коклюшный токсин (0,27 мкг/мл), СНЭ: пептид, соответствующий домену гомологии адгезионной молекулы клетки в РОР-Р (175 или 350 мкМ).

На фиг. 14 показано влияние 1д2-домена АМНК, приготовленного в РюЫа ракЮпк, как описано в примере 2, на рост нейритов из первичных нейронов гиппокампа, выдержанных на фибронектине. 1д2-домен АМНК был добавлен, как показано, в концентрации, измеряемой в мкг/мл (1 мкг/мл соответствует 0,1 мкМ). Рост нейритов измеряется по средней длине самого длинного нейрита (ахоп 1епд1й - длина аксона).

На фиг. 15 показано влияние С36 и 1д1-домена АМНК, добавленных в определенном соотношении, на рост нейритов из первичных нейронов гиппокампа, выдержанных на фибронектине.

На фиг. 16 показано влияние С36, в концентрации, измеряемой в мкг/мл, на пролиферацию первичных нейронов гиппокампа, измеренное как включение Вг6И, как описано в примере 8.

На фиг. 17 показана прогнозируемая аминокислотная последовательность предшественника изоформы 140 КОа АМНК человека (8\У188-РРОТ: 1осик NСΑ1-НυΜΑN, ассеккюп № 13591).

На фиг. 18 показан димер первых двух доменов АМНК (1д1 и 1д2). А) Димер представлен на индикаторной бумаге. Светло-серым отмечены остатки связующих участков в 1д1 и 1д2. В) Модель пространственной упаковки двух первых доменов АМНК (1д1 и 1д2). Остатки связующих участков двух доменов показаны светло-серыми. Ключевые аминокислотные остатки в связующем между 1д 1 и 1д2 отмечены номерами, соответствующими их положению в последовательности АМНК. С) Димер представлен на индикаторной бумаге с изображением ключевых электростатического и гидрофобного взаимодействий, применяемых при моделировании структуры димера.

На фиг. 19 показано влияние 1д2-домена, мономерного 1д2-пептида и его производных на агрегации в первичных культурах диссоциированных клеток гиппокампа зародыша крысы (Е18). Культуры выращивали в течение 24 ч. Число агрегаций в культурах, обработанных соединениями, выражено в процентах числа агрегаций в культурах контрольных групп (100±10). Было выполнено четыре независимых эксперимента. Результаты представлены как среднее ± 8ЕМ. (а) Сравнение влияний 1д2-домена АМНК (1д2) и 1д2-пептида (1д2-р), исследование зависимости от дозы. (Ь) Сравнение влияний 1д2-пептида (1д2р) и 1д2-пептидов, в которых или аминокислотные остатки Агд-2, Агд-6 и 11е-9 (Р2-38), или аминокислотные остатки Агд-2, Агд-6, О1и-8 Ь 11е-9 (Р2-48) были замещены на серин. Пептиды применялись в концентрации 180 мкМ.

На фиг. 20 показано влияние 1д2-домена АМНК (1д2) и 1д2-пептида (1д2-р) на рост нейритов из первичных нейронов гиппокампа, выращиваемых в течение 24 ч. Длина нейритов в обработанных культурах выражена в процентах длины нейритов в культурах контрольных групп. Было выполнено четыре независимых эксперимента. Результаты представлены как среднее ± 8ЕМ.

На фиг. 21 показано влияние 1д2-пептида (1д2-р) и его производных (Р2-38 и Р2-48) на рост нейритов из первичных нейронов гиппокампа, выращиваемых в течение 24 ч. Длина нейритов в обработанных культурах выражена в процентах длины нейритов в культурах контрольных групп. Было выполнено четыре независимых эксперимента. Результаты представлены как среднее ± 8ЕМ.

На фиг. 22 представлен фазово-контрастный микроснимок 24-часовой культуры диссоциированных клеток с низкой плотностью из гиппокампа, выращенных при наличии (а) и отсутствии (Ь) 3,6 мкМ 1д2пептида (дендример), включающего аминокислотные остатки 192-202 1д2-домена АМНК.

- 7 006230

На фиг. 23 показано влияние 1д1-домена АМНК (1д1, 25 мкМ), антител ЕСЕК (α-ЕСЕК, разбавленный в пропорции 1:2000), домена гомологии адгезионной молекулы клетки (СНЭ, 200 мкМ) и ϋ-73122, ингибитора фосфолипазы Су (5 мкМ) на рост нейритов из нейронов гиппокампа. Культуры были выращены в отсутствие или в присутствии 3,6 мкМ 1д2-пептида (дендример, 1д-р6). Длина нейритов в обработанных культурах выражена в процентах длины нейритов в контрольных культурах. Было выполнено четыре независимых эксперимента. Результаты представлены как среднее ± 8ЕМ.

На фиг. 24 показано влияние 1д1-пептида (1д1-р) на агрегацию (слева, 250 мкг/мл) и рост нейритов (справа, 5 мкг/мл) из нейронов гиппокампа, выращенных в течение 24 ч. Число агрегаций и длина нейринов выражены как нормализованная величина по отношению к контрольным культурам. Было выполнено три независимых эксперимента. Результаты представлены как среднее ± 8ЕМ.

На фиг. 25 показано влияние мутаций в двойном 1д-домене (1д1-2) АМНК на рост нейритов из нейронов гиппокампа. В АМНК (20-208) были выполнены следующие мутации: К192А, К196А и Е198А. Длина нейритов в обработанных культурах выражена в процентах длины нейритов в контрольных культурах. Было выполнено пять независимых экспериментов. Результаты представлены как среднее ± 8ЕМ.

Подробное описание изобретения

При регенерации и обучении очень важной способностью является способность нервной системы воссоздавать связи между нервными клетками. Поэтому большой интерес представляет идентификация веществ, способных стимулировать такие процессы. Большие усилия были направлены на идентификацию веществ, способных стимулировать выживаемость нейронов и ин-витро рост нейритов, так как ожидается, что эти вещества будут обладать способностью стимулировать регенерацию и обучение. Очевидно, что для развития и воссоздания нейронных связей очень важна адгезионная молекула нервной клетки (АМНК), и поэтому представляет большой интерес идентификация лигандов, способных стимулировать функции АМНК. Как было показано ранее, антитела к 1д3-домену АМНК могут стимулировать рост нейритов.

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии сильного стимулирующего влияния 1д2-домена АМНК на рост нейритов из АМНК-представляющих клеток. Таким образом, было обнаружено, что 1д2-домен АМНК является лигандом 1д1 -домена АМНК. Было также обнаружено, что 1д2-домен АМНК стимулирует рост нейритов путем включения специальных каналов трансдукции сигналов.

Более того, настоящее изобретение описывает 1д1-домен АМНК как лиганд 1д2-домена АМНК, который может служит сильным стимулятором роста нейритов из АМНК-представляющих клеток, путем включения специальных каналов трансдукции сигналов.

Кроме того, авторы изобретения с помощью комбинаторной химии идентифицировали малые пептиды, которые стимулируют рост нейритов. Сначала были идентифицированы активные пептиды, отбранные из библиотеки пептидов, и затем было идентифицировано предполагаемое звено, содержащее два или более аминокислотных остатков. Было показано, что пептиды могут стимулировать те же специальные каналы трансдукции сигналов, что и 1д2-домен АМНК.

Как показывают результаты, лиганды 1д1-домена АМНК, либо 1д2-домен АМНК, либо его малые функциональные мимики, которые могут включать специальные каналы передачи сигналов, могут стимулировать рост нейритов и тем самым способствовать регенерации и обучению. Другие функциональные мимики 1д2-домена АМНК, такие как антитела и непептидные молекулы, могут действовать таким же образом. Поэтому в настоящем изобретении предложены соединения и соединения, которые сами являются малыми пептидами, полипептидами, антителами и непептидными молекулами или включают вышеперечисленные вещества, распознающие 1д1-домен АМНК. Эти соединения и составы могут применяться для стимулирования функций нервной системы, мышечной ткани и любых других тканей с присутствием АМНК, включая различные органы.

В более широком понимании настоящее изобретение относится к соединениям, которые образуют связь с 1д1-доменом АМНК и/или 1д2-доменом АМНК и которые могут стимулировать рост нейритов из АМНК-представляющих клеток и/или пролиферацию АМНК-представляющих клеток. Такими соединениями могут быть пептиды или последовательность ΡΝΛ. составляющие 1д2-домен АМНК, его фрагмент или мимику.

К тому же такими соединениями могут быть пептиды или последовательность ΡNΛ, составляющие 1д1-домен АМНК, его фрагмент или мимику.

В данном контексте под мимикой 1д1-домена АМНК и 1д2-домена АМНК следует понимать любое соединение, которое обеспечивает связь с 1д1-доменом АМНК или 1д2-доменом АМНК и через указанную связь стимулирует рост нейритов из АМНК-представляющих клеток и/или пролиферацию АМНКпредставляющих клеток. Мимиками могут быть пептиды, производные пептидов, антитела и непептидные соединения, а также малые органические соединения, сахара и жиры, а также пептидомиметики.

В настоящем изобретении предложены новые соединения, которые стимулируют рост нейритов центральной и периферической нервных систем. Неожиданно было обнаружено, что эти соединения могут стимулировать образование и пластичность нервных связей.

- 8 006230

Из вышесказанного ясно, что соединения по настоящему изобретению принадлежат к трем группам соединений (соединения групп I, II и III), которые могут образовывать связи с доменами 1д1 и 1д2 АМНК и тем самым активизировать рост нейритов.

Кроме того, что касается группы II, то на основе пептидной лаборатории было идентифицировано 22 пептида, которые могли образовывать ин-витро связи с рекомбинантным, меченым адгезионным соединением ^1 ([§1-домен АМНК) нервной клетки.

К 22 последовательностям относятся АБККРККЫКА (последовательность № 1), АККЕКОККЭТО (БЕОШОЭ). АКАЬЫ^САКРК (последовательность № 3), АСБАУКБКККА (последовательность № 4), АКУУБИШБ (последовательность № 5), ΑБΤККБМ^СI (последовательность № 6), АККАШМ^/Т/Ы)АЬ (последовательность № 7), АУтУКУИШ (последовательность № 8), АТЫККТСККРК (последовательность № 9), АККЫбРЬЕЫК! (последовательность № 10), АКИБУОКБЭСО (последовательность № 11), АКОКТМКРККБ (последовательность № 12), АСОУЫРОЕПК (последовательность № 13), АККТКЕККБКЭ (последовательность № 14), АБОАККККСРК (последовательность № 15), АРКЬПКМЬТКК (последовательность № 16), АККЕКРЫКРЫЭ (последовательность № 17), АОМСКОБЮКЫ (последовательность № 18), АЕССККККМКА (последовательность № 19), АКККЕОКОКЫА (последовательность № 20), АКБККСЫББЬМ (последовательность № 21), АККБКЭМТАК (последовательность № 22).

Эти пептиды - С3 (последовательность № 1), Ό3 (последовательность № 2) и Ό4 (последовательность № 3) (фиг. 4) были также исследованы на их способность образовывать связи с ^1 -доменом АМНК с использованием резонансного анализа поверхности плазмона (р1азтоп знгГасс гсзопапсс апа1уз13) и отобраны в соответствии с их способностью замедлять агрегирование нейронов и стимулировать рост нейритов. Путем анализа последовательностей пептидов и скремблированных пептидов могло быть идентифицировано звено, образующее связь с ^Едоменом АМНК. Это звено включает положительно заряженные аминокислоты в структуре относительно свободного порядка следования К/К (аа)0-8 К/К, желательно, чтобы было К/К (аа)_0-1 К/К, где К и К - лизин и аргинин соответственно, а положительно заряженные аминокислоты разделены аминокислотными (аа) остатками (до 8 остатков). Предпочтительно, однако, чтобы положительно заряженные аминокислоты соседствовали только с одним аминокислотным остатком или были разделены только одним аминокислотным остатком.

Анализ активных пептидов, отобранных из пептидной библиотеки, предполагает, что это звено может состоять из более чем двух положительно заряженных аминокислот, например из трех или четырех основных аминокислот.

Желательно, чтобы пептиды включали следующую последовательность: (Хаа⁺)т-(Хаа)р-(Хаа⁺)-(Хаа¹)г-(Хаа⁺)-(Хаа)ч-(Хаа⁺)п, где Хаа⁺ - основной аминокислотный остаток,

Хаа¹ - любой аминокислотный остаток,

Хаа - любой аминокислотный остаток, а т, п, р, с.| и г - независимо друг от друга принимают значение 0 или 1, и желательно, чтобы основными аминокислотными остатками были лизин или аргинин, а г принимало значение 1.

Природа аминокислотных остатков Хаа⁺ и Хаа¹ не важна. Очевидно, что на их месте могут быть любые аминокислотные остатки. Однако желательно, чтобы на месте Хаа¹ был пролин (Р) или глутаминовая кислота (Е).

Еще лучше, чтобы у пептидов г принимало значение 1 и хотя бы одно т и п было равно 1.

Пептиды по настоящему изобретению включают последовательность (К/К)_0-1-К/К-Х-К/К), где Х имеет то же значение, что и Хаа¹, еще лучше, чтобы они включали последовательность К/К-К/К-Х-К/К или К/К-Х-К/К, а еще лучше, чтобы они включали последовательность К/К-Р-К/К, К/К-К/К-Р-К/К, К/КК/К-Е-К/К или К/К-К/К-Е-К/К, но лучше всего, чтобы они включали последовательность К-Р-К, К-К-РК, К-К-Е-К или К-К-Е-К. Примерами могут служить последовательности А-Б-К-К-Р-К-К-Ы-ЕК-А (последовательность № 1), А-К-К-Е-К-О-К-К-Э-Т-О (последовательность № 2) и А-К-А-Е-Ы-\У-С-А-Р-1< (последовательность № 3).

В соответствии с настоящим изобретением пептиды, включающие приведенную выше последовательность, могут быть частью (в дальнейшем - фрагмент) ^1-домена АМНК или мимикой Iд2-домена АМНК. Кроме того, пептиды могут образовывать связь со связующим участком ^2 ^Едомена АМНК или с различными связующими участками на ^1 -домене АМНК. Если связующий участок не является нормальным связующим участком связь будет мимикой нормальной связи и приведет к росту нейритов и/или пролиферации АМНК-представляющих клеток.

Ясно, что пептиды по настоящему изобретению не ограничены декапептидами, идентифицированными и отобранными из библиотеки синтетических пептидов. Эти пептиды только служат инструментом для идентификации звена в пептидных лигандах, которые предположительно могут образовывать связи с ^-доменом АМНК.

В настоящем изобретении также описан малый синтетический пептид, обозначаемый Ю2-Р, и он неожиданно показал, что он может сильно стимулировать рост нейритов (см. фиг. 20-21). С помощью ядерного магнитного резонанса (см. фиг. 18) было показано, что ^2-домен АМНК принадлежит к Iнабору ^-доменов, как и 1-домен АМНК, который может образовывать связь с Iд2-доменом АМНК.

- 9 006230

Путем анализа химических сдвигов отдельных аминокислотных остатков между 1д1-доменом АМНК и 1д2-доменом АМНК был неожиданно обнаружен четкий участок взаимодействия. Было обнаружено, что общий участок взаимодействия состоял из аминокислотных остатков обоих 1д1- и 1д2-доменов АМНК. Таким образом, части этих двух доменов вместе образовали один четкий участок взаимодействия. В соответствии с результатами исследования химических сдвигов и показанной моделью оказалось, что для обеспечения связи в 1д2-домене АМНК очень важны, в частности, аминокислоты Лгд-192, Лгд-196, С1и198, 11-199 и РНе-201. Точно так же для обеспечения связи в 1д1-домене АМНК очень важны аминокислоты О1ц-30, 61и-35 и Ьу8-37, Рйе-38 и Рйе-39 (см. фиг. 18).

Дальнейшие исследования мутации аминокислот Лгд-192, Лгд-196, О1ц-198, О1ц-30, О1ц-35 и Ьу8-37 показали, что эти мутации замедляли функции связи 1д2-домена АМНК. На основании исследований структур 1д1- и 1д2-доменов АМНК методом ядерного магнитного резонанса авторами изобретения были созданы два пептида и было обнаружено, что очень важны два участка трехмерной структуры целого домена.

Поэтому была идентифицирована последовательность из 12 аминокислот из двумерной аминокислотной последовательности всего 1д2-домена АМНК (остатки 191-202) (см. фиг. 17) и последовательность из 12 аминокислот из 1д1-домена АМНК (остатки 29-40). Затем были синтезированы два пептида, соответствующие этим коротким последовательностям, которые оказывали стимулирующее действие на рост нейритов из нейронов в культурах клетки и таким образом оказывали стимулирующее действие на регенерацию тканей и другие формы структурной пластичности клетки и тканей, с присутствием АМНК.

Показано, что идентифицированный 1д2-пептид, обозначаемый Ю2-Р, имеет последовательность ΟΚΙΕΑΚΟΕΙΝΕΚ (последовательность № 23) и не имеет сходства с другими нейритогенными пептидами, ни с теми, которые переходят из целой АМНК-последовательности, ни с теми, которые образуют связь с АМНК. Кроме того, с целью обеспечения контроля, в изобретении предложено 2 последовательности (последовательность № 24 и последовательность № 25), которые переходят из последовательности Ι§2-ρ, пептиды которой не стимулируют рост нейритов. Применение этих полипеттидов для обеспечения контроля более детально объяснено в примере 5. Очевидно, что 1д1-пептид, обозначаемый Ю1-Р, имеет последовательность ΟΕΙδνΟΕδΚΡΕΕ (последовательность № 26), гомология которой не сходна с известными нейриногенными факторами. Было обнаружено четыре последовательности

6ΚΙΕΑΚ0ΕΙΝΡΚ (последовательность № 23),

ΟΚΙΕΑδΟΕδΝΡΚ (последовательность № 24), ΟΚΙΕΑΚΟδδΝΡΚ (последовательность № 25), ΟΕΙδνΟΕδΚΕΕΕ (последовательность № 26).

В настоящем изобретении предложены соединения или составы, включающие пептид Ю1-Р и/или пептид Ю2-Р или производные от них, например аналоги пептидов, фрагменты пептидов, полипептиды, включающие последовательность Ю1-Р или последовательность Ю2-Р или их аналоги, и непептидные молекулы, полученные из представленных здесь пептида Ю1-Р и пептида Ю2-Р, которые могут стимулировать рост нейритов из нейронов, линий или нейронных клеток или тканей.

Эти соединения и составы могут использоваться для обработки дегенеративных состояний, влияющих на периферическую или центральную нервную систему, мышечную ткань и другие ткани с присутствием АМНК, а также при других состояниях, в которых проявляется стимулирующая функция АМНК.

В настоящем изобретении присутствуют также дополнительные и неожиданные данные исследований, а именно были обнаружены специфические каналы трансдукции сигналов роста нейритов, которые, как оказалось, стимулируются [§1-доменом АМНК и его фрагментами и мимиками, а также [§1-доменом АМНК и его фрагментами и мимиками, а также малыми пептидами, включающими два или большее число аминокислотных остатков. Было также обнаружено, что эти специфические каналы трансдукции сигналов стимулируются также пептидами Ι§1-ρ и Ι§2-ρ, описанными выше. Таким образом, авторы изобретения идентифицировали связующий участок АМНК, вклад в который внесли ^-домен и Iд2-домен АМНК. Кроме того, было показано, что четыре лиганда, образующих связь со связующим участком состоят из Ι§1-Ι§2 доменов АМНК, а именно ^-домена АМНК, пептида Ι§ 1 -ρ, полученного из Ι§1последовательности АМНК и пептида С3 и связанных с ними пептидов, идентифицированных по библиотеке комбинаторных пептидов; все они стимулируют рост нейритов. Таким образом, все четыре Ι§1Ι§2 лиганда АМНК активизируют трансдукцию сигналов, приводящую к росту нейритов.

В общем, в настоящем изобретении описаны новые соединения, которые могут стимулировать и вызывать рост нейритов из АМНК-представляющих клеток в центральной и периферической нервной системе. Кроме того, оказывается, что новые соединения по настоящему изобретению способствуют образованию и пластичности нервных соединений. Как ясно из сказанного выше, авторы обнаружили, что соединения по настоящему изобретению принадлежат к трем группам соединений (группы соединений Ι, ΙΙ и ΙΙΙ), и после подробного описания группы состовов Ι будет описана группа соединений ΙΙ.

Группа соединений ΙΙ включает соединения, которые могут быть пептидами, связанными с той частью связующего участка Ι§1-Ι§2 ΑΜΗΚ, который состоит из Ι§1-домена ΑΜΗΚ. Как оказалось, такие пептиды имеют следующую основную последовательность, включающую любые функциональные производные из нее:

(Хаа+НХааНХааНХаа^ДХаа+НХааМХааЬНХааУДХааХ

- 10 006230 где Хаа⁺ - основной аминокислотный остаток,

Хаа^- - кислый аминокислотный остаток,

Хаа¹¹ - аполярный аминокислотный остаток,

Хаа - любой аминокислотный остаток, а т, п, о и р - независимо друг от друга принимают значение 0 или 1, и желательно, чтобы основными аминокислотными остатками были лизин или аргинин, кислыми аминокислотами были глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, в качестве аполярной аминокислоты был лейцин, изолейцин, валин или фенилаланин, а г принимало значение 1.

Пептиды по настоящему изобретению включают последовательность (Κ/Β)-Χ-Χ-Χ-(Κ/Β)-Χ-(Ε/ϋ)(Е/1/У/Р)-Х-(Ь/1/У/Р), где Х является любым аминокислым остатком, еще лучше, чтобы они включали последовательность (К/К)-Х-(Е/О)-(Ь/1/У/Е)-Х-(Е/1/У/Е), (Κ/Β)-Χ-Χ-Χ-(Κ/Β)-Χ-(Ε/Ο), (Κ/Β)-Χ-Χ-(Κ/Β)-Χ(Ε/ϋ) или (Κ/Β)-Χ-(Ε/Ι/ν/Ρ)-Χ-(Ε/^/Ε), а еще лучше, чтобы они включали последовательности (Κ/Κ.)-ΧΧ-Χ-(Κ/Β)-Χ-(Ε/ϋ)-(Ε/Ι/ν/Ε), (Κ/Β)-Χ-Χ-(Κ/Β)-Χ-(Ε/ϋ)-(Ε/Ι/ν/Ε) или (Κ/Β)-Χ-Χ-Χ-(Κ/Β)-Χ-(Ε/Ι/ν/Ε), или еще лучше, чтобы они включали последовательности (Κ/Β)-Χ-Χ-(Κ/Κ)-Χ-(Ε/ϋ)-(Ε/Ι/ν/Ρ)-Χ-(Ε/Ι/ν/Ε), (Κ/Β)-Χ-Χ-Χ-(Κ/Β)-Χ-(Ε/Ι/ν/Ε)-Χ-(Ε/Ι/ν/Ε) или (Κ/Β)-Χ-Χ-Χ-(Κ/Β)-Χ-(Ε/ϋ)-(Ε/Ι/ν/Ε)-(Ε/Ι/ν/Ε), но лучше всего, чтобы они включали последовательность ΟΚΙΕΑΚΟΕΙΝΕΚ (последовательность № 23).

Что касается группы соединений III, то в качестве такого соединения может использоваться пептид, который образует связь с той частью связующего участка гомофильных Ι§1-Ι§2 ΑΜΗΚ, которая состоит из ^-домена. Как оказалось, такие пептиды имеют следующую основную последовательность, включающую любые функциональные производные из нее:

(Хаа^-)-(Хаа)-(Хаа)-(Хаа)т-(Хаа)п-(Хаа^-)-(Хаа)-(Хаа⁺)-(Хаа^ь)-(Хаа^ь)р, где Хаа⁺ - основной аминокислотный остаток,

Хаа^- - кислый аминокислотный остаток,

Хаа¹ - аполярный аминокислотный остаток,

Хаа - любой аминокислотный остаток, а т, п, о и р - независимо друг от друга принимают значение 0 или 1, и желательно, чтобы основными аминокислотными остатками были лизин или аргинин, кислыми аминокислотами были глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, в качестве аполярной аминокислоты был лейцин, изолейцин, валин или фенилаланин, а г принимало значение 1.

Пептиды по настоящему изобретению включали последовательность (Ε/Ω)-Χ-Χ-Χ-(Ε/Ο)-Χ-(Κ/Β)(Ε/Ι/ν/Ε)-Χ-(Ε/Ι/ν/Ε), где Х является любым аминокислым остатком, еще лучше, чтобы они включали последовательность (Ε/ϋ)-Χ-(Κ/Β)-(Ε/Ι/ν/Ε)-Χ-(Ε/Ι/ν/Ε), (Ε/ϋ)-Χ-(Κ/Β)-(Ε/Ι/ν/Ε)-(Ε/Ψ/Ε), (Ε/ϋ)-Χ-Χ-ΧΧ-(Ε/ϋ)-Χ-(Κ/Β)-(Ε/Ι/ν/Ε), (Ε/Ο)-Χ-Χ-Χ-(Ε/ϋ)-Χ-(Κ/Β)-(Ε/Ι/ν/Ε) или (Ε/ϋ)-Χ-Χ-(Ε/Ο)-Χ-(Κ/Β)-(Ε/Ι/ν/Ε), а еще лучше, чтобы они включали последовательности (Ε/ϋ)-Χ-Χ-(Ε/ϋ)-Χ-(Κ/Β)-(Ε/Ι/ν/Ε)-Χ-(Ε/Ι/ν/Ε) или (Ε/ϋ)-Χ-Χ-(Ε/Ο)-Χ-(Κ/Β)-(Ε/Ι/ν/Ρ)-(Ε/Ι/ν/Ε), или еще лучше, чтобы они включали последовательности (Ε/ϋ)-Χ-Χ-Χ-Χ-(Ε/ϋ)-Χ-(Κ/Κ)-(Ε/Ι/ν/Ε)-(Ε/Ι/ν/Ε), (Ε/Ο)-Χ-Χ-Χ-(Ε/Ο)-Χ-(Κ/Β)-(Ε/Ι/ν/Ε)-Χ-(Ε/Ι/ν/Ε) или (Ε/ϋ)-Χ-Χ-Χ-Χ-(Ε/ϋ)-Χ-(Κ/Κ)-(Ε/Ι/ν/Ρ)-(Ε/Ι/ν/Ρ), но лучше всего, чтобы они включали последовательность ΟΕΙδνΟΕδΚΡΕΕ (последовательность № 26).

Соединения, предложенные в настоящем изобретении, включают также пептиды, которые образуют связи с ^-доменом АМНК и стимулируют рост нейритов.

Пептиды могут быть модифицированы, например, путем замещения одного или большего числа аминокислотных остатков. При этом могут использоваться как Ь-аминокислоты, так и Ό-аминокислоты. В другие модификации могут быть включены производные типа сложных эфиров, сахаров и т.п. Примерами могут служить сложные эфиры метила и ацетила. Одним из аспектов настоящего изобретения также является полимеризация типа повторяющихся последовательностей или прикрепление к различным хорошо известным носителям, например скелетам лизина или участкам протеина типа альбумина бычьей сыворотки (Β8Α).

В настоящем изобретении также рассматриваются непептидные мимики ^-домена АМНК или пептидов, рассмотренных выше. В данном контексте следует понимать, что такими мимиками являются соединения, которые образуют связи или как-то иначе взаимодействуют с ^-доменом АМНК или с Ι§2доменом АМНК и таким образом стимулируют рост нейритов из АМНК-представляющих клеток и/или пролиферацию АМНК-представляющих клеток.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединениям, которые являются антителами ^-домена анти-АМНК или антителами, распознающими ту часть Ι§2-домена, которая делает вклад в Ι§1-Ι§2 связующий участок АМНК.

Антитела могут быть моноклональными или поликлональными. Рекомбинантные антитела также являются частью настоящего изобретения.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к ^-полипетиду АМНК, его фрагменту или мимике для применения при обработке нормальных, дегенерированных или поврежденных АМНКпредставляющих клеток. Под обработкой понимается лечение патологии или состояния центральной и периферической нервной системы, мышечной ткани или различных органов. Реагировать на такую обработку могут только АМНК-представляющие клетки. Настоящее изобретение также относится к фарма

- 11 006230 цевтическим соединениям и лекарственным препаратам, в состав которых входит один или большее число описанных выше соединений.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ ин-витро или ин-виво обработки нормальных, дегенеративных или поврежденных АМНК-представляющих клеток, который включает введение одного или большего числа описанных выше соединений в количестве, достаточном для эффективного воздействия.

Под обработкой может пониматься лечение патологий или состояний центральной и периферической нервной системы, к которым можно отнести, например, послеоперационное поражение нервов, травматическое поражение нервов, нарушенную миелинизацию нервных волокон, послеишемическое, например, в результате удара, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, слабоумие типа мультиинфарктной деменции, склерозов, дегенерации нервов, связанных с сахарным диабетом, нарушениями, влияющими на циркадный ритм или передачу сигналов между нейронами и мышечной тканью, и шизофрению; патологий или состояний мышечной ткани, включая состояния с нарушенными функциями нервно-мышечных связей типа генетических или травматических атрофических нарушений мышечной ткани; патологий или состояний различных органов типа дегенеративных состояний половых желез, поджелудочной железы типа сахарного диабета 1-го и 2-го типов, почек типа нефротического синдрома или сердца, печени или кишечника.

Другим аспектом настоящего изобретения является применение соединений по настоящему изобретению в сочетании с простетическим проводником нерва.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является применение соединений по настоящему изобретению для стимулирования способности к обучению и/или стимулирования памяти.

Для обеспечения идентификации лигантов-кандидатов, способных стимулировать функцию АМНК, авторы изобретения разработали простую систему культур (агрегатные культуры), которая позволяет выполнить количественную оценку влияния различных лигантов. Клетки гиппокампа получали из эмбрионов крыс. Эти клетки выращивали в определенной среде, а диссоциированные клетки высевались на микротитрационном планшете. После 24 ч подсчитывалось число агрегаций. Непосредственно перед засевом клеток в микролунку к взвеси клеток добавлялись испытываемые соединения. Если во время агрегации клеток присутствуют лиганды, образующие связи с 1д1 -доменом АМНК, то при выполнении количественной оценки спустя 24 ч после высева клеток наблюдаются более мелкие, но в большем числе агрегации клеток. Ввиду того, что адгезионные свойства АМНК блокированы, замедляющее влияние лигандов приводит к блокировке образования крупных агрегаций из многочисленных малых агрегаций. Таким образом, в присутствии активных лигандов наблюдается образование малых по размеру агрегаций клеток, число которых возрастает.

Такой эффект наблюдался при наличии во время агрегации клеток различных лигантов 1д1-1д2домена АМНК. Таким образом, весь рекомбинантный 1д2-домен АМНК и синтетический пептид, полученные либо из [^-последовательности (1д2-р) (последовательность № 23), либо из 1д1последовательности (1д1-р) (последовательность № 26) и пептидных лигандов 1д1-домена АМНК, идентифицированных по библиотекам синтетических пептидов (последовательность № 1, последовательность № 2 и последовательность № 3), замедляли агрегирование в описанной системе клеточной культуры.

Эта система позволяет наблюдать адгезию клеток, миграцию клеток и формирование процессов в обработанных клетках, которые могут приводить к росту нейритов. Для этого можно исследовать рост нейритов из единичных нейронов. Клетки готовятся как при исследованиях агрегирований и высеваются на субстрат из пластика или фибронектина. Затем эти клетки выдерживаются в течение необходимого времени, а потом путем измерений удлинения нейритов анализируется их прирост, например, с помощью компьютерной программы анализа изображения. Если нейриты были длиннее 10 мкм (см. фиг. 2), то измерялась средняя длина самого длинного нейрита каждой клетки. Кроме того, определялось среднее число ветвлений на один нейрит и среднее число нейритов на одну клетку. Непосредственно перед высевом клеток добавлялись испытуемые лиганды 1д-1д2-доменов АМНК (последовательности №№ 1, 2, 3, 23, 26).

Точно так же непосредственно перед высевом клеток добавлялись пептиды, полученные из связующих участков 1д-1д2-доменов АМНК.

Для исследования механизмов влияния нейритогена добавлялся один из лигандов, пептид С3 (последовательность № 1), в сочетании с различными соединениями, о которых известно, что они замедляют зависимую от АМНК передачу сигналов. Было обнаружено, что к числу соединений, замедляющих стимулирующее влияние пептида С3 на удлинение нейрита, относятся верапамил (уе ингибитор Ь-типа зависимого от напряжения кальциевого канала), омега-конотоксин СУЗА (со ингибитор Ν-типа зависимого от напряжения кальциевого канала), пертуссис токсин (рейлк ингибитор определенного Спротеина), эрбстатин аналог (егЬ ингибитор определенной тирозинкиназы), антитело к асидбокс эпитоп в рецепторах фактора роста фибробласта (БСБ-К.8) (ингибитор образования связи и передачи сигналов М.’АМ-ЕСЕ-В).

Кроме того, при присутствии в растворе 1д1-домена АМНК пептид С3 полностью терял свое нейритогенное влияние. Эти результаты показали, что такие лиганды, как С3, стимулируют рост нейритов пу

- 12 006230 тем образования связей с 1д1-доменом АМНК и таким образом активизируют каналы передачи сигналов в нейроне, которые чувствительны к упомянутым выше соединениям-ингибиторам.

Было испытано влияние эндогенного лиганда 1д1-домена АМНК, 1д2-домена АМНК на рост нейрита из первичных нейронов гиппокампа, выдержанных на субстрате из фибронектина. Непосредственно перед высевом клеток в лунки с культурами были добавлены 1д1-домены АМНК. Было обнаружено, что 1д2-домены АМНК стимулируют рост нейритов так же, как и пептид С3. Было обнаружено, что максимальное нейритогенное влияние 1д2-доменов АМНК проявляется при той же концентрации, что и в случае с пептидом С3.

При испытаниях 1д2-домена АМНК совместно с соединениями, о которых известно, что они замедляют зависимую от АМНК передачу сигналов, как и в случае с пептидом С3, было отмечено, что нейритогенное влияние замедлялось таким же образом. Очевидно, что эндогенный лиганд 1д1-домена АМНК и искусственный лиганд С3 образовывали связи с 1д1-доменом АМНК и они оба, как 1д2-домен АМНК, так и пептид С3, стимулируют рост нейритов, что происходит, вероятно, благодаря активации идентичных каналов трансдукции сигналов.

При введении в клеточные культуры синтетических пептидов, полученных из связующего участка 1д1-домена АМНК или 1д2-домена АМНК, было отмечено, что происходило стимулирование роста нейритов. Таким образом, влияние 1д2-домена АМНК может быть имитироваться малыми синтетическими пептидами, из которых состоят фрагменты последовательности 1д1-1д2-доменов АМНК. Отсюда следует, что рост нейритов стимулируется, во-первых, неповрежденным 1д 1 -доменом АМНК в виде рекомбинантного полипептида, во-вторых, фрагментами 1д 1 -домена АМНК и 1д2-домена АМНК и, в-третьих, связывающими пептидами 1д1-домена АМНК, которые не имеют отношения к пептидам, полученным из данной последовательности. Таким образом, авторы изобретения продемонстрировали новизну и неожиданные принципы того, что рост нейритов стимулируется соединениями, которые образуют связи с 1д1доменом АМНК и/или с частями 1д1-1д2 АМНК, которые принимают участие в образовании связей гомофильных АМНК.

Для того чтобы обеспечит контроль за специфичность пептида 1д2 (1д2-р), были синтезированы два контрольных пептида Р2-3Б и Р2-4Б, которые, как оказалось, не имеют неритогенного влияния (см. пример 5). Последовательность пептида Р2-3Б, ΟδΙΤΑδΟΕδΝΤΚ (последовательность № 24), соответствует последовательности 1д2-р, в которой аминокислотные остатки Агд-2, Агд-6 и 11е-9 замещены на серины. Последовательность пептида Р2-4Б, ОБ1ЬАБОББ№К (последовательность № 25), соответствует последовательности 1д2-р, в которой Агд-2, Агд-6, О1ц-8 и 11е-9 замещены на серины, что говорит о том, что видоизмененные аминокислотные остатки важны для обеспечения нейритогенного влияния пептида 1д2-р.

Кроме того, было испытано влияние 1д2-домена АМНК и пептида С3 на рост нейритов, когда они вводились в сочетании. Было обнаружено, что их влияние носит неаддитивный характер. Результаты также показали, что механизмы стимулирования роста нейритов у 1д2-домена АМНК и пептида С3 одни и те же. Они оба образуют связи с 1д1-доменом АМНК и таким образом активируют идентичные каналы передачи сигналов, что приводит к росту нейритов.

Искусственные лиганды могут отбираться и идентифицироваться из пептидной или непептидной библиотек. Может использоваться любая пептидная бмблиотека. Для поиска полезных пептидов могут использоваться как библиотеки синтетических пептидов, так и библиотеки, включающие фрагментированные протеины природного происхождения. Могут также использоваться библиотеки, включающие непептидные соединения.

Пептиды - это короткие молекулы, состоящие из аминокислот линейной последовательности. Аминокислоты являются строительными блоками протеинов природного происхождения, которые состоят из длинных сложенных цепей аминокислот. Таким образом, пептиды, характеризующиеся наличием определенной последовательности аминокислот, могут имитировать определенную зону протеина. Протеины природного происхождения состоят из Ь-аминокислотных остатков. Однако искусственные пептиды могут также состоять из Ό-аминокислотных остатков или включать их. С помощью комбинаторной химии можно создать смеси из гранул, нагруженных пептидами равной длины, в которых каждая гранула несет пептиды уникальной последовательности (Ьат е! а1., 1991 г.). Такая смесь пептидов на гранулах называется пептидной библиотекой.

В настоящем изобретении пептиды были идентифицированы путем скрининга библиотек синтетических неупорядоченных пептидов, включающих органически связанные декапептиды с очищенными рекомбинантными 1д1-доменами АМНК. Синтез одногрануловой однопептидной библиотеки выполнялся с использованием методики деления на части и смешивания (Еигка А., БеЬеЧууеп Е., АкдеЬои М. и Όίϋο О., 1991 г., Ιηΐ. 1. Рер. Рго!: К.8. 37, 487-493). В течение всей реакции синтеза в качестве корпуса реактора использовались полиэтиленовые шприцы. Скрининги выполнялись путем инкубирования смолы с биотинилированным 1д1-доменом АМНК. После этого смола инкубировалась с авидиналкалинфосфатазой. В соответствии с процедурой, описанной в работе Ьат е! а1. (1992 г.), в качестве субстрата использовался ВСГР/ΝΒΤ (Сигма) и окрашенные гранулы изымались для микросеквенирования.

С помощью стереомикроскопа отбирались гранулы с наиболее интенсивной окраской, которые затем проходили секвенирование с использованием АВ1 470А, оснащенного устройством АВ1 120А для

- 13 006230 проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии. Были идентифицированы 22 последовательности пептидов, образующих связи с 1д1-доменом АМНК (фиг. 4(А), последовательности с № 1 по № 22).

Следует понимать, что не важно, какой способ используется для идентификации и отбора интересующих пептидов при идентификации предполагаемого звена.

Синтезируемая пептидная последовательность была отобрана путем создания групп последовательностей и проверки их на наличие повторов рисунка, выявляющих предполагаемые звенья (фиг. 4(В)-(П)).

Были синтезированы три пептида С3, Ό3 и Ό4 (фиг. 4(В)-(П)). и с использованием резонансного анализа поверхности плазмона (р1актоп кшТасе гекопапсе апа1укк) оценивалась их связь с 1д1 -доменом АМНК. Для выделения хотя бы одного пептида с целью обеспечения связи с 1д1-доменом АМНК в растворе использовались пептидные дендримеры (четыре пептида, связанных со скелетом лизина (фиг. 2(С)), фиксированные на сенсорном чипе. Все три пептида связывали 1д1-домены АМНК в растворе. Затем испытывалось влияние этих трех пептидов на рост нейритов. Все три пептида оказались сильными стимуляторами роста нейритов. Более того, пептиды замедляли агрегирование клеток.

Для исследования характеристик пептидов, важных с токи зрения этого влияния, были созданы и испытаны различные контрольные пептиды последовательности С3.

Для исследования роли отдельных остатков в последовательности С3 были созданы так называемые скремблированные пептиды, включающие такие же аминокислотные остатки, что и пептид С3, но расположенные в другой последовательности (на фиг. 7 - 121, 114 и С3ксг). Точно так же были созданы скремблированные пептиды, которые включали те же аминокислотные остатки, что и последовательности пептидов Ό3 и Ό4 (на фиг. 7 - скремблированные последовательности Ό3 и Ό4). Более того, для выяснения роли этих аминокислот были созданы пептиды, включающие последовательность пептида С3, в которой основные аминокислоты (Кк и Вк) были замещены аланином (на фиг. 7 - 116-119). Таким же образом был создан пептид, соответствующий последовательности пептида С3, в котором пролиновый остаток (Хаа¹) был замещен аланином, так как пролин, в общем, считается важным для структуры пептидов. При замещении пролина аланином влияние не пропадало. Точно так же влияние не пропадало и при замещении одной аминокислоты аланином.

В других случаях пептиды с замещением основных аминокислотных остатков на 2-4 аланина не обладали таким влиянием на агрегирование, показывая тем самым, что эти аминокислотные остатки являются важными для влияния С3. Для дальнейшего исследования роли основных аминокислотных остатков в пептиде С3 был получен пептид, включающий последовательность С3, в которой основные аминокислоты были модифицированы ацетилированием. С помощью ацетилирования удаляли заряды с этих остатков, сохраняя при этом способность образовывать водородные связи. Пептид с четырьмя основными аминокислотами модифицированными ацетилированием (на фиг. 7 - С3асе1у1. К(120)) замедлял агрегирование, так как последовательность С3 показала, что не только заряды, но и другие свойства основных аминокислот, как, например, способность образовывать водородные связи, важны для влияния пептида С3. В присутствии пептида С3 были приготовлены такие культуры, как мономер, дендример (С3й) или связанный с альбумином бычьей сыворотки двадцатимер. Были испытаны различные формы пептида С3. Было обнаружено, что мономерные, дендрименые и связанные с альбумином бычьей сыворотки формы пептида С3 обладают тем же влиянием на агрегацию. Дендример последовательности С3 является наиболее сильной формой, по-видимому, из-за способности связывать несколько рецепторных доменов. Для подтверждения того, что рецептор в действительности является 1д1-доменом АМНК, клетки выращивались с этим доменом, приготовленным в РюЫа рак1опк в растворе, как описано в примере 1. Присутствие 1д1-домена АМНК приводит к потере влияния пептида С3, что говорит об отрицательном влиянии клеточной адгезии пептида С3 посредством АМНК. Эти эксперименты показали, что идентифицированные здесь пептиды, образующие связи с 1д1-доменом АМНК, влияют на клеточную адгезию посредством АМНК и таким образом повышают число клеточных агрегаций и нейронных отростков, формирующихся в культурах первичных нейронов, выращенных с большой плотностью.

Замещение только двух основных аминокислот в последовательности пептида С3 привело к полной потере нейритогенного влияния. Таким образом, при замещении от 2 до 4 лизинов и аргининов в последовательности аланинами эффект стимулирования роста нейритов пропадал полностью. Это говорит о том, что для этого влияния присутствие основных аминокислот в последовательности пептида С3 является решающим. Оказалось, что пептиды, в которых те же аминокислоты были модифицированы ацетилированием, обладали некоторым влиянием на клеточную адгезию и рост нейритов, хотя и не в такой степени, как неповрежденный пептид С3, что говорит о том, что важны не только заряды, но и другие свойства основных аминокислот, например способность образовывать водородную связь. Кроме того, влияние неповрежденного пептида может быть блокировано эквимолекулярными концентрациями 1д1домена АМНК в растворе. Это говорит о том, что пептид работает путем образования связи с 1д1доменом АМНК, проявленной нейронами.

Испытывалось также влияние лигандов на пролиферацию и рост клеток. Было обнаружено, что пептид С3 сначала стимулирует пролиферацию и рост клеток. А после этого начального положительного влияния на пролиферацию пептиды стимулируют дифференцирование путем увеличения роста нейритов с одновременным подавлением пролиферации. Таким образом, влияние на пролиферацию зависит от

- 14 006230 состояния роста клеток. Влияние на пролиферацию было продемонстрировано на примере первичных клеточных культур из клеток гиппокампа и культур клеток феохромоцитомы крыс линии РС 12. Поэтому лиганды стимулировали рост нейритов из АМНК-представляющих клеток и/или пролиферацию АМНКпредставляющих клеток.

Как ясно из вышесказанного, в настоящем изобретении рассмотрены три группы соединений (группа I, группа II и группа III) и состав группы I по настоящему изобретению может быть пептидом, который образует связь с ^1 -доменом АМНК через связующее звено, в состав которой входит не менее 2 основных аминокислотных остатков. Пептиды, включающие не менее 2 основных аминокислотных остатков внутри последовательности из 10 аминокислотных остатков, лучше внутри последовательности из 3 аминокислотных остатков, очевидно, являются очень интересными соединениями для целей настоящего изобретения.

Как показал анализ изолированных пептидных остатков, лиганды могут включать более 2 основных аминокислот.

В соответствии с этим интересующие пептиды внутри группы I включают следующую последовательность:

(Хаа⁺)т-(Хаа)р-(Хаа⁺)-(Хаа')г-(Хаа⁺)-(Хаа)ч-(Хаа⁺)п, где Хаа⁺ - основной аминокислотный остаток,

Хаа' - любой аминокислотный остаток,

Хаа - любой аминокислотный остаток.

Желательно, чтобы основные аминокислотные остатки отбирались из лизина (К) и аргинина (К), а г принимало значение 1.

Природа аминокислотных остатков Хаа⁺ и Хаа¹ не важна. Очевидно, что на их месте могут быть любые аминокислотные остатки. Однако желательно, чтобы на месте Хаа был пролин (Р) или глутаминовая кислота (Е).

Еще лучше, чтобы у пептидов г принимало значение 1 и хотя бы одно т и п было равно 1.

Желательно, чтобы пептиды по настоящему изобретению включали последовательность (К/К)_0-1К/К-Х-К/К), где Х имеет то же значение, что и Хаа¹, еще лучше, чтобы они включали последовательность К/К-К/К-Х-К/К или К/К-Х-К/К, а еще лучше, чтобы они включали последовательность К/К-Р-К/К, К/К-К/К-Р-К/К, К/К-К/К-Е-К/К или К/К-К/К-Е-К/К, но лучше всего, чтобы они включали последовательность К-Р-К, К-К-Р-К, К-К-Е-К или К-К-Е-К. Примерами могут служить последовательности А-8К-К-Р-К-К-ХП-К-А (последовательность № 1), А-К-К-Е-К-О-К-К-Э-Т-О (последовательность № 2) и АК-А-Ь-Н-Ж-О-А-Р-К (последовательность № 3).

Можно предположить, что причина того, что расстояние между основными аминокислотными остатками является переменным фактором, состоит в том, что одним из важных свойств лиганда может быть воздействие кластера основного аминокислотного остатка, например эпитопа, включающего основные аминокислотные остатки. Такой кластер может быть создан последовательностью тесно связанных основных аминокислот или с чередованием укладок пептид/протеин. Хорошо, если основные аминокислотные остатки могут быть открыты со стороны носителя. В частности, многомерные пептиды типа дендримеров могут образовывать детерминанты конформационного типа или кластеры благодаря наличию множества гибких пептидных мономеров.

Как описано выше, в результате анализа активных пептидов, изолированных от пептидной библиотеки, можно предположить, что такое звено может состоять из более чем двух положительно заряженных аминокислот, например трех или четырех основных аминокислот. Прочность связи и уровень получаемого в результате исходящего сигнала, возможно, зависит от числа и/или положения основных аминокислот в пептиде, что приводит к образованию кластеров переменного уровня функциональности. Положение других аминокислот в пептиде может оказаться важным, особенно в случае пептидной укладки. Переменный уровень функциональности кластера может приводить к переменным константам связи и таким образом к передаче сигналов переменного уровня.

Не желая связывать себя определенной теорией, авторы изобретения полагают, что активными лигандами по отношению к ^-домену АМНК и/или ^-домену АМНК являются лиганды, которые образуют связь с ^-доменом АМНК и/или Iд2-доменом АМНК, обеспечивая таким образом конформационное переключение домена, что приводит к передаче каскада сигналов, которые оказывают воздействие на пролиферацию клеток и/или рост нейритов. Таким образом, в качестве подходящего лиганда может быть состав, обеспечивающий переключение ^Пдомен АМНКЛд^-домен АМНК, с передачей сигналов вниз по цепи.

Самыми интересными пептидами являются те, которые соответствуют части ^-домена АМНК, являются мимикой или фрагментом ^-домена АМНК.

Эти пептиды могут образовывать связь со связующим участком ^-домена АМНК на ^1 -домене АМНК или со связующим участком, отличным от связующего участка ^-домена АМНК. Следует полагать, что лиганды С3, Ό3 и Ό4 образуют связь с участком, отличным от связующего участка Iд2-домена АМНК или его фрагментов.

Также, помимо лигандов ^-домена АМНК интересны лиганды Iд2-домена АМНК, включающие лиганды той части связующего участка Iд1-Iд2, которая составлена Iд2-доменом АМНК.

- 15 006230

Другими соединениями, интересными с точки зрения настоящего изобретения, являются непептидные молекулы, имитирующие связи 1д1-домена АМНК, 1д2-домена АМНК или искусственных лигандов. Такие соединения могут выбираться из малых органических соединений, сахаров и липидов, а также из пептидомиметиков, пептоидов и пептомеров.

Библиотеки малых органических соединений могут проверяться с целью идентификации искусственных лигандов 1д1-домена АМНК, 1д2-домена АМНК и искусственных лигандов связующего участка 1д1-1д2, который составлен 1д1 -доменом АМНК и 1д2-доменом АМНК, при этом данные домены могут стимулировать активность АМНК. Обычно такие библиотеки или их соединения хорошо известны, и отбор интересующих лигандов по этим библиотекам может вестись в соответствии со способами отбора, описанными в данной работе, или способами, известными специалистам.

К таким другим соединениям могут принадлежать антитело 1д1-домена анти-АМНК, антитело 1д2домена анти-АМНК (моноклональное, поликлональное или рекомбинантное) или другое антитело, распознающее эпитопы в связующем участке или рядом с ним, который составлен из 1д1-домена АМНК и 1д2-домена АМНК, при этом антитело может быть химерным или гуманизированным. Получение поликлональных, а также а) моноклональных антител 1д1-домена анти-АМНК и/или Ь) моноклональных антител 1д2-домена анти-АМНК осуществляется в соответствии с известными методиками. Мыши или кролики могут служить первичным материалом для получения антител к 1д1-доменам АМНК или антител к 1д2-доменам АМНК, очищенные поликлональные антитела могут использоваться без дальнейшей обработки. В другом случае можно получать моноклональные антитела. Способ получения моноклональных антител также известен. Известны также способы получения рекомбинантных антител типа химерных и гуманизированных. Затем в соответствии с вышеизложенными или другими способами отбираются потенциально активные антитела.

Вещества, обеспечивающие возможность стимулировать рост нейритов, а также возможность выживания и пролиферации нейронных клеток в условиях влияния, например, определенных эндогенных трофических факторов, являются главными целями в поиске соединений, которые упрощают регенерацию нейронов и другие формы нейронной пластичности (Ри и Согбоп. 1997г.). Периферийные нервы обладают возможностью регенарации и восстановления функциональных связей со своими мишенями после различных поражений. Однако функциональное восстановление не часто бывает полностью завершенным, и поражение периферийных нервов создает существенные проблемы. Возможности регенерации центральной нервной системы очень ограничены. Поэтому большой интерес представляет идентификация веществ со способностью вызывать функциональную регенерацию центральной и периферической нервной системы. Для оценки возможности вещества вызывать регенерацию можно исследовать его способность стимулировать рост нейритов и пролиферацию и выживание нейронных клеток. Показано, что соединения, обеспечивающие связь с 1д1-доменом АМНК или 1д2-доменом АМНК по настоящему изобретению, вызывают рост нейритов и влияют на пролиферацию нейронов и поэтому являются наилучшими промоторами регенерации нейронных связей и, следовательно, функционального восстановления после поражений, а также, если необходимо, промоторами нейронных функций в других условиях.

Таким образом, настоящее изобретение относится к 1д1-доменам АМНК, 1д2-доменам АМНК и их фрагментам или мимикам для использования при обработке нормальных, дегенерированных или пораженных АМНК-представляющих клеток. Примером фрагмента 1д1-домена АМНК является 1д1-домен АМНК, который участвует в связующем участке 1д1-1д2-доменов АМНК. И, в частности, настоящее изобретение относится к 1д2-домену АМНК и его фрагменту или мимике для использования при обработке нормальных, дегенерированных или пораженных АМНК-представляющих клеток, при этом под обработкой понимается стимулирование роста нейритов из АМНК-представляющих клеток и/или пролиферации АМНК-представляющих клеток.

Под обработкой может пониматься лечение патологий или состояний центральной и периферической нервной системы, к которым можно отнести, например, послеоперационное поражение нервов, травматическое поражение нервов, нарушенную миелинизацию нервных волокон, послеишемическое, например, в результате удара, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, слабоумие типа мультиинфарктной деменции, склерозов, дегенерации нервов, связанных с сахарным диабетом, нарушениями, влияющими на циркадный ритм или передачу сигналов между нейронами и мышечной тканью, и шизофрению; патологий или состояний мышечной ткани, включая состояния с нарушенными функциями нервно-мышечных связей типа генетических или травматических атрофических нарушений мышечной ткани; патологий или состояний различных органов типа дегенеративных состояний половых желез, поджелудочной железы типа сахарного диабета 1-го и 2-го типов, почек типа нефротического синдрома или сердца, печени или кишечника. Под лечением может также пониматься стимулирование способности к обучению и/или стимулирование памяти.

Настоящее изобретение относится также к использованию 1д1-1д2-домена АМНК и/или использованию той части 1д1-домена АМНК, которая участвует в связующем участке 1д1-1д2-доменов АМНК, или его фрагмента или мимики в изготовлении лекарственных препаратов для обработки нормальных, дегенерированных или пораженных АМНК-представляющих клеток. Таким образом, настоящее изобретение относится к использованию 1д2-домена АМНК или его фрагмента или мимики в изготовлении ле

- 16 006230 карственных препаратов для обработки АМНК-представляющих клеток, для того чтобы обеспечить стимулирование роста нейритов из АМНК-представляющих клеток и/или пролиферации АМНК-представляющих клеток.

В частности, речь идет об использовании 1д2-домена АМНК или его фрагмента или мимики в изготовлении лекарственных препаратов для обработки нормальных, дегенерированных или пораженных АМНК-представляющих клеток, при этом лекарственные препараты используются для лечения патологий или состояний центральной и периферической нервной системы, к которым можно отнести, например, послеоперационное поражение нервов, травматическое поражение нервов, нарушенная миелинизация нервных волокон, послеишемическое, например, в результате удара, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, слабоумие типа мультиинфарктной деменции, склерозов, дегенерации нервов, связанных с сахарным диабетом, нарушениями, влияющими на циркадный ритм или передачу сигналов между нейронами и мышечной тканью, и шизофрению; патологий или состояний мышечной ткани, включая состояния с нарушенными функциями нервно-мышечных связей типа генетических или травматических атрофических нарушений мышечной ткани; патологий или состояний различных органов типа дегенеративных состояний половых желез, поджелудочной железы типа сахарного диабета 1-го и 2-го типов, почек типа нефротического синдрома или сердца, печени или кишечника. Под лечением может также пониматься стимулирование способности к обучению и/или стимулирование памяти.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическому составу, включающему одно или несколько соединений, описанных выше. В частности, состав по настоящему изобретению может включать соединение, которым является полипептид 1д2-домена АМНК, его фрагмент или пептидная мимика. В предпочтительном варианте настоящего изобретения эти пептиды могут быть разработаны как многомеры, например, связанные с носителями. Лучше, если пептиды будут разрабатываться как дендримеры как четыре пептида, связанных со скелетом лизина или соединенных с носителем полимера, например носителем протеина типа ВЗА. Такие разработки хорошо известны специалистам.

Настоящее изобретение также относится к способу ин-витро или ин-виво обработки нормальных, дегенеративных или поврежденных АМНК-представляющих клеток, который включает ин-витро или инвиво введение одного или большего числа описанных выше соединений или составов в количестве, достаточном для эффективного воздействия, для того чтобы обеспечить стимулирование роста нейритов из АМНК-представляющих клеток и/или пролиферации АМНК-представляющих клеток.

В способе по настоящему изобретению под обработкой понимается ин-виво лечение патологий или состояний центральной и периферической нервной системы, к которым можно отнести, например, послеоперационное поражение нервов, травматическое поражение нервов, нарушенную миелинизацию нервных волокон, послеишемическое, например, в результате удара, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, слабоумие типа мультиинфарктной деменции, склерозов, дегенерации нервов, связанных с сахарным диабетом, нарушениями, влияющими на циркадный ритм или передачу сигналов между нейронами и мышечной тканью, и шизофрению; патологий или состояний мышечной ткани, включая состояния с нарушенными функциями нервно-мышечных связей типа генетических или травматических атрофических нарушений мышечной ткани; патологий или состояний различных органов типа дегенеративных состояний половых желез, поджелудочной железы типа сахарного диабета 1-го и 2-го типов, почек типа нефротического синдрома или сердца, печени или кишечника.

Кроме того, способ по настоящему изобретению может быть таким, при котором лечение приводит к регенерации нервов. Соединения, в частности, используются в сочетании с простетическим устройством типа простетического проводника нерва. Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения относится к простетическому проводнику нерва, отличающемуся тем, что в его состав входит одно из вышеописанных соединений или большее число соединений или составов. Проводники нервов известны специалистам.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу стимулирования способности к обучению и/или стимулирования памяти, при этом данный способ включает введение одного соединения или большего числа соединений по настоящему изобретению в количестве, достаточном для эффективного воздействия.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к лекарственным препаратам для лечения патологий или состояний центральной и периферической нервной системы, мышечных тканей или различных органов, при этом данный лекарственный препарат включает одно соединение или большее число соединений по настоящему изобретению в количестве, достаточном для эффективного воздействия, в сочетании с фармацевтически приемлемыми добавками. Желательно, чтобы этот способ был разработан для введения через рот, подкожно, внутримышечно, для внутричерепного, внутрижелудочкового, интраназального или внутрилегочного введения.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к составу для использования при стимулировании обучения и/или стимулировании памяти, при этом состав включает одно соединение или большее число соединений по настоящему изобретению в количестве, достаточном для эффективного воздействия, в сочетании с одной или большим числом фармацевтически приемлемых добавок. Желательно, чтобы это соединение было разработано для введения через рот, подкожно, внутримышечно, для внутричерепного, внутрижелудочкового, интраназального или внутрилегочного введения.

- 17 006230

Как ясно из вышесказанного, следует полагать, что повышенная пластичность полезна для нервной системы в аспектах, включающих обучение и регенерацию тканей, и при других условиях за пределами нервной системы, включая дегенеративные функции АМНК. В настоящем изобретении влияние пептидов было исследовано применительно к регенерации, т.е. к росту нейритов из изолированных верхних нервных узлов шейного отдела. Было обнаружено, что пептиды, идентифицированного выше звена, стимулировали рост нейритов в сравнении с пептидами контрольной группы. Оказалось, что на обнаруженный эффект сильно влияет вводимая доза, что происходит предположительно ввиду активации каналов трансдукции сигналов связывающими соединениями 1д 1 -домена АМНК, в результате чего кривая зависимости роста нейритов от дозы препарата принимает колоколообразный вид (фиг. 8 и 13). Таким образом, колоколообразная кривая зависимости роста нейритов от дозы препарата ожидалась для влияния связывающих соединений 1д 1 -домена АМНК на регенерацию нейритов и другие формы пластичности, зависящие от активации каналов трансдукции сигналов через АМНК. Влияние связывающих соединений 1д1-домена АМНК на обучение может быть исследовано ин-виво путем внутрижелудочкового вливания соединений грызунам или другим животным с последующим обследованием на способность к обучению этих животных после инъекций различных доз связывающих соединений 1д 1 -домена АМНК. Инъекции должны выполняться перед или с различными временными интервалами после обучения, так как замедляющее влияние антител АМНК на определенные формы обучения было продемонстрировано, когда такие инъекции выполнялись через 5-8 ч после обучения (Зсйо1еу и др., 1993 г.). Модели благоприятного обучения для оценки влияния связывающих соединений 1д1-домена АМНК на обучение включают пассивное избегание и водяной лабиринт для грызунов и цыплят. Влияние связывающих соединений 1д1-домена АМНК на синаптическую пластичность, связанную с обучением, может исследоваться ин-витро или ин-виво путем измерения индукции или поддержания долгосрочного потенцирования после применения связывающих соединений 1д1-домена АМНК, как это было сделано для антител АМНК (Копп и др., 1995г.).

Неожиданно было обнаружено, что 1д2-домен АМНК и связывающие пептидные лиганды 1д 1 -домена АМНК с описанными выше характеристиками звена стимулируют передачу сигналов через АМНК. В частности, пептид С3, пептиды 1д 1 -р и 1д2-р стимулируют функции АМНК, включая рост нейритов путем взаимодействия с 1д1-доменом АМНК, включая трансдукцию сигналов.

Таким образом, следует полагать, что соединения по настоящему изобретению обладают полезным влиянием в условиях, когда функции АМНК приобретают важное значение.

Как отмечено выше, оказалось, что присутствие АМНК проявляется в нескольких тканях и органах. Таким образом, вмешательство в трансмембранную передачу сигналов АМНК может иметь положительное влияние при следующих болезнях и нарушениях:

1) патологии или состояния центральной и периферической нервной системы, для которых желательна повышенная возможность регенерации и синаптической пластичности, к которым можно отнести, например, послеоперационное поражение нервов, травматическое поражение нервов, нарушенную миелинизацию нервных волокон, послеишемическое нарушение, например, в результате удара, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, другие деменции, включая мультиинфарктную деменцию, склероз, дегенерацию нервов, связанную с сахарным диабетом, нарушениями, влияющими на циркадный ритм или передачу сигналов между нейронами и мышечной тканью, и шизофрению;

2) патологии мышечной ткани, включая состояния с нарушенными функциями нервно-мышечных связей типа генетических атрофических нарушений мышеных тканей и травматических атрофических нарушений мышечной ткани;

3) дегенеративные состояния различных органов типа дегенеративных состояний половых желез; дегенеративных состояний поджелудочной железы, включающих нарушения, связанные с β-клетками; сахарный диабет 1-го и 2-го типов; дегенеративные состояния почек типа нефротического синдрома; и дегенеративные состояния сердца, печени или кишечника.

Как сказано выше, настоящее изобретение также относится к лекарственным препаратам и составам. Стратегии развития технологии приготовления лекарственных препаратов и составов, основанных на соединениях по настоящему изобретению, в основном, соответствуют стратегиям технологии приготовления любой другой лекарственной продукции на основе протеина. Возможные проблемы и руководства, необходимые для преодоления этих проблем, рассмотрены в некоторых учебниках, например Технология приготовления терапевтических пептидов и протеина. Системы технологической обработки и доставки под ред. А.К. Банга, Техомик Паблишинг АГ, Базель, 1995 г. (Тйегареийс Рерйбек апб Рго1ею ЕотшкЮоп. Ргосекыпд апб Оейуегу ЗуЫепъ. Еб. А.К. Вапда, Тесйпот1к РиЬШЫпд АС, Ва§е1, 1995 г.).

Препараты для инъекций обычно приготавливаются в виде жидких растворов или взвесей, твердых форм, готовых для перевода в раствор или суспензию перед инъекцией. Этот препарат может быть также эмульгирован. Часто активный ингредиент смешивается с наполнителями, которые фармацевтически пригодны и совместимы с активным ингредиентом. Примерами подходящих наполнителей могут служить вода, соль, глюкоза, глицерин, этанол или подобные им вещества, а также их комбинации. Кроме того, при необходимости препарат может содержать небольшие количества дополнительных веществ

- 18 006230 типа увлажнителей или эмульгаторов, веществ, поддерживающих уровень рН или повышающих эффективность или транспортировку препарата.

Технологии приготовления соединений по настоящему изобретению могут быть созданы с применением известных специалистам методик. Эти технологии приготовления могут содержать фармацевтически приемлемые носители и наполнители, включая микросферы, липозомы, микрокапсулы, микрочастицы и т.п.

Такой препарат может вводиться путем инъекции, по выбору в то место, где активный ингредиент вызывает наибольший эффект. Кроме того, составы лекарственных средств могут вводиться суппозитарно, через нос, легкие и, в некоторых случаях, через рот. При суппозитарном введении препарата используются традиционные связующие и носители, включая полиалкиленгликоли и триглицериды. Такие свечи могут состоять из смесей, включающих активный ингредиент (ингредиенты) в количестве от 0,5 до 10%, предпочтительно от 1 до 2%. При введении через рот составы включают такие обычно используемые наполнители, как, например, фармацевтические виды маннитола, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и т.п. Эти составы образуют растворы, суспензии, таблетки, пилюли, капсулы или порошки и обычно включают от 10 до 95% активного ингредиента (ингредиентов), предпочтительно, чтобы это количество было в пределах от 25 до 70%.

Другие препараты могут вводиться через нос и легкие, например ингаляторы и аэрозоли.

Активное соединение может быть приготовлено в виде нейтрального вещества или соли. Фармацевтически приемлемые соли (образованные с участием свободных аминогрупп пептидного соединения) образуются с добавлением неорганических кислот, например соляной или фосфорной кислот, или таких органических кислот, как уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, миндальная кислота и т.п. Соли, образованные с участием свободной карбоксильной группы, могут также быть получены из неорганических оснований, таких как, например, натрий, калий, аммоний, кальций или гидроксид трехвалентного железа, и таких как органические основания, типа изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т.п.

Препараты вводятся в соответствии с дозировкой и в количестве, достаточном для эффективного терапевтического воздействия. Вводимое количество препарата зависит от пациента, которому предписано лечение, включая его вес и возраст, патологию и стадию болезни. Дозы препарата находятся в пределах нескольких сотен микрограмм активного ингредиента на одну вводимую дозу, но предпочтительно, чтобы эта величина составляла от 0,1 до 1000 мкг, еще лучше, чтобы она была в диапазоне от 1 до 300 мкг, но лучше всего, чтобы она была в диапазоне от 10 до 50 мкг. Препарат может вводиться 1 раз или многократно. Доза зависит от способа приема препарата и может меняться в зависимости от возраста и веса пациента, которому предписано лечение.

Некоторые из соединений по настоящему изобретению достаточно активны, но для других эффект может быть усилен, если в состав препарата ввести фармацевтически приемлемые добавки и/или носители. Специалистам известны такие добавки и носители. В некоторых случаях желательно в состав препарата включить соединение, которое может способствовать доставке активного вещества к цели.

В некоторых случаях необходимо многократное введение препарата. Введение препарата может осуществляться в виде непрерывного вливания, например как внутрижелудочковое вливание или введение многими дозами в течение дня, ежедневно, несколько раз в неделю, еженедельно и т.п. В связи с использованием препарата в проводниках нервов, введение может быть непрерывным или малыми порциями, на основе контролируемого выделения активного соединения (соединений). Кроме того, для контроля скорости выделения и/или участка выделения могут использоваться предшественники. Введение через рот других видов имплантированных примесей может также основываться на контролируемом выделении и/или использовании предшественников.

Обработка не обязательно должна осуществляться для лечения болезни после поставленного диагноза, но может применяться альтернативно как профилактическая мера, назначаемая пациентам, или в случаях высокого риска обнаружить у пациента болезнь из перечня указанных выше болезней.

Настоящее изобретение может быть проиллюстрировано на следующих примерах.

Примеры

Пример 1. Приготовление рецепторного 1д1-домена АМНК.

1д1-домен АМНК был получен в виде рекомбинантного протеина в РюЫа райопк. Фрагмент кДНК, задающей код аминокислоты 1-97 АМНК крысы, был синтезирован с помощью РСК, и амплифицированная кДНК была субклонирована на участок Х1о Ι/Ват Н1 плазмида рН1Ь-81 (корпорация Инвитроген (ΙπνίΙΐΌβοη Согрогабоп), Сан Диего, США). Трансформация осуществлялась с помощью штамма Тор 10 Е' (корпорация Инвитроген (1пуйгодеп Согрогабоп), Сан Диего, США). Рекомбинантный плазмид был линеаризован с помощью №ί I и использован для трансформации штамма Н18 4 С8-115 Е' (корпорация Инвитроген (1пуйгодеп Согрогабоп), Сан Диего, США), полученного в РюЫа ра^огЬ. Трансформация и селекция выполнялись в соответствии с руководством РюЫа Ехргекыоп Кй, поставляемым фирмойпроизводителем. Рекомбинантный протеин разрабатывался как 1д1 РР (иммуноглобулин типа 1д1-домена АМНК, получаемый в РюЫа райогю). Аутентичность 1д 1 РР была подтверждена секвенированием аминокислот и методов масс-спектрометрии МАЬП1-М8, подтвердившим ожидаемую молекулярную массу 11 кОа. Клетки выращивались строго с руководством РюЫа ЕхргекЫоп К11. После выделения супернатант

- 19 006230 из растущих клеток отводился через 0,21 мм фильтр, концентрировался с помощью ультрафильтрации и очищался с помощью гелевой фильтрации с использованием колонны ЗерЬабех С-50 (компания РЬатташа Вю1ес11 АВ, Швеция).

Пример 2. Приготовление Ц2-домена АМНК.

Циклическая ДНК, задающая код Ц2-домена АМНК, была синтезирована с помощью РСВ в соответствии с остатками 100-191. В качестве матрицы использовалась кДНК АМНК-120 крысы. Амплифицированный фрагмент кДНК был субклонирован на участок ЗиаВЕАутП плазмида рР1С9К (корпорация Инвитроген Циуйгодеи Согрогайои), Сан Диего, США). Рекомбинантный плазмид был линеаризован с помощью и использован для трансформации штамма Н1з 4 С8-115 РюЫа разЮпз (корпорация Инвитроген Циуйгодеи Сотротайои), Сан Диего, США) в соответствии с протоколом, представленным производителем. Рекомбинантный Ι§2-домен АМНК проявлялся после индукции в двухлитровом бродильном аппарате (МВВ М1ш Вюгеас1ог, МВВ ВюгеасЮг АС). С помощью ультрафильтрации полученная среда концентрировалась десятикратно. Ц2-домен АМНК очищался с помощью гель-фильтрации с использованием колонны ЗерЬабех С-25 (компания РЬагтааа Вю1ес11 АВ, Швеция), после чего он поступал на ионообменную хроматографию с использованием 5 мл колонны ШТгар 8Р (компания РНагшааа Вю1ес11 АВ, Швеция) с выходом готового продукта в количестве 10-15 мг на 1 л полученной среды. Аутентичность Ц2-домена АМНК подтверждалась секвенировнием аминокислот и массоспектроскопией. На Ν-конце в результате клонирования участков первичные аминокислотные остатки Ьуз-1 и Ьеи-2 были замещены на Туг-1 и Уа1-2.

Описываемая модель димеризации первых двух доменов АМНК была экспериментально продемонстрирована с помощью подхода групповой мутации, который рассмотрен ниже.

Были выполнены три следующие мутации, и мутантные домены АМНК (20-208) были получены в виде рекомбинантных протеинов: АМНК (20-208) с тремя мутациями домена-1 - Е30А, Е35А, К37А; АМНК (20-208) с тремя мутациями домена-2 - В192А, В196А, Е198А; и АМНК (20-208) с тремя мутациями домена-1 - Е30А, Е35А, К37А - и с тремя мутациями домена-2 - В192А, В196А, Е198А. Мутации на двух интересующих участках были выполнены с помощью РСВ с использованием затравки 5' длиной в 75 пар азотистых оснований и затравки 3' длиной в 72 пары азотистых оснований, включающих мутации (5' СТС САС СТА САТ АТТ СТТ ССС АСС САА ССА ССС АТС АСС СТТ ССА ССС ТСС ССС ТТС ТТС СТС ТСТ САА СТС ССА 3' аЫ 5' АТТ САС ААТ САС СТС ААТ СТС СТТ САА СТТ САТ ССС ССС ССС ССС САС САТ ССС ССС СТС АСА ССС СТА АСТ 3').

Были получены три мутанта АМНК (20-208). В первом мутанте аминокислотные остатки С1и-30, С1и-35 и Ьуз-37 из гомофильного связующего участка домена-1 были замещены на А1а. Во втором мутанте аминокислотные остатки Агд-192, Агд-196 и С1и-198 были замещены на А1а. В третьем мутанте шесть аминокислотных остатков С1и-30, С1и-35 Ьуз-37, Агд-192, Агд-196 и С1и-198 были замещены на А1а.

Затем следовало подтверждение наличия мутантов, выполняемое с помощью рестрикционного анализа и секвенирования ДНК; было подтверждено, что не было существенных изменений на уровне экспрессии или в характере очистки для мутантов в сравнении с немутантными АМНК (20-208). Как показала гельфильтрационная хроматография, элюирование АМНК (20-208) происходит как димера при ~ 46 кДа, что обеспечивает легкий и надежный способ контроля эффектов, вызванных мутациями на гомофильном связующем участке в сравнении со случаем, когда элюирование мутантных протеинов происходит в форме мономера при 23 кДа. Таким образом, было продемонстрировано, что мутации прекращают образование димера и, следовательно, один или несколько из шести мутантных остатков заняты в образовании димера.

На спектре ¹Н, полученном с помощью ядерного мангнитного резонанса для каждого из трех мутантных протеинов, было показано, что укладки как домена-1, так и домена-2 мутантных двойных доменов очень близки укладкам немутантных протеинов.

Пример 3. Синтез и скрининг библиотек органически связанных декапептидов.

Синтез одногрануловой однопептидной библиотеки выполнялся с использованием методики деления на части и смешивания (Ритка А., 8еЬез1ууеи Р., АздеЬои М. и Ь|Ьо С., 1991г., Ιώ. 1. Рер. Ргок Вз. 37, 487-493). В течение всей реакции синтеза и заключительного снятия защиты ТРА в качестве корпуса реактора использовались полиэтиленовые шприцы. Смола Теи1аСе1 (Варр Ро1утеге, ТиЬшдеи, Сегтаиу) делилась на 18 порций, и использовались протеиновые Ь-аминокислоты, за исключением цистеина и гистидина. Боковые цепи были защищены с помощью следующих защитных групп: Азр (1Ви), С1и (1Ви), Туг (1Ви), 8ет (1Ви), ТНг (1Ви), Ази (ίτΐ), С1и (ΐτΐ), Ьуз (Вос), Тгр (Вос), Агд (ртс). Аминокислоты, защищенные группой Ртос (5 экв.; М1Шдеи или ШуаЬюсНет), синтезировались в течение ночи с использованием 5 экв. ОК’ и 5 экв. НОВ1. Группа Ртос удалялась с помощью 25% пиперидина в ЬМР в течение 20 мин. Группа защиты боковой цепи удалялась с использованием 82,5% ТРА, 5% анизола, 5% Н₂О, 5% БОТ, 2,5% тиоанизола при комнатной температуре в течение 2,5 ч, после чего выполнялась промывка тетрагидрофураном и 1% НОАс, и затем смола лиофилизировалась. Скрининг выполнялся инкубированием 2 мл смолы (равно приблизительно 10⁶ гранул) с биотинилированным рецептором в буфере Тпз/НС1 (Тпз/НС1 - 0,025 М; рН 7,2; №1С1 - 0,25 М; Т\теег1 20-0,1% (мас./об.)), содержащем 0,1% желатина (Сигма) в течение 60 мин. Затем смола промывалась в буфере Тпз/НС1 и инкубировалась с добавлением авидиналкалинфосфатазы (разбавленной в соотношении 1:20000) в течение 30 мин. Затем в соответствии с

- 20 006230 процедурой, описанной Ьат и др. (1992 г.), добавлялись субстраты ВСЧР/ΝΒΤ и окрашенные гранулы извлекались для микросеквенирования. Библиотека подвергалась скринингу с рецепторным Ц1-РР АМНК (10 мл/мг).

Пример 4. Секвенирование гранул и отбор пептидов для синтеза.

С помощью стереомикроскопа отбирались гранулы с наиболее интенсивной окраской, которые затем проходили секвенирование с использованием ΛΒI 470А, оснащенного устройством АΒI 120А для проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии. На фиг. 4А показаны 22 полученные пептидные последовательности (последовательности с № 1 по № 22). В этих идентифицированных последовательностях, обеспечивающих связи ^-домена АМНК, преобладают основные аминокислоты лизин (К) и агринин (В). Пептидные последовательности для синтеза и использования в дальнейших исследованиях отбирались путем сравнительного анализа первиной структуры полученных последовательностей и проверки их на повторяемость рисунка, с выявлением таким образом предполагаемого звена. Эти звенья идентифицировались внутри пептидов. Первое звено составляло последовательность К/В-КВ-Р-К/ВК/К-Ν/δ, которая частино сохранилась в группе пептидов, включая пептиды С3, как показано на фиг. 4В. Второе звено составляло последовательность К/В-КВ-Е-К/В-Х-К/В-К/В, которая частино сохранилась в трех пептидах, включая пептиды Ό3 (фиг. 4С). Третье звено составляло последовательность С-Х-К/В-РК/В, которая была обнаружена в двух пептидах, включая Ό4 (фиг. 4Ό).

Пример 5. Синтез пептидов.

Ниже описан синтез одного пептида - Iд1-р (последовательность № 26), полученного из последовательности Ц 1-домена АМНК. Помимо этого, ниже дается также описание синтеза одного пептида - ^2-р (последовательность № 23), полученного из последовательности ^2-домена АМНК. С использованием гибридных библиотек идентифицированны 22 последовательности (последовательности с № 1 по № 22), обеспечивающие связи Ц1-домена АМНК.

Для дальнейшего анализа и синтеза на смоле Тсп1аСс1 с амидным линкером Втк (р-(П,8)-а-(1-(ОНфлуорен-9-ил)метоксиформамидо)-2,4-диметоксибензил)феноксиуксусная кислота (ЫоуаЬюсЬет)) при использовании аминокислот с Етос защитой (3 экв.) были отобраны три пептида - С3 (последовательность № 1), Ό3 (последовательность № 2) и Ό4 (последовательность № 3). Синтез осуществлялся в течение более чем 60 мин с участием ТВТи (3 экв.), НОВ! (3 экв.) и ОША (4,5 экв.) в ручном многоколоночном аппарате. Группа Етос удалялась с помощью 20% раствора пиперидина в ΌΜΕ в течение 10 мин. Синтез пептидных дендримеров осуществлялся путем соединения Етос-Ьу8(Етос)-ОН (ЫоуаЬюсПет) со смолой-линкером, после чего выполнялось удаление группы Етос с дальнейшим синтезом ЕтосЬу§(Етос)-ОН. После удаления группы Етос синтез пептидов выполнялся, как описано выше для мономерных пептидов. Защитные группы удалялись с гранул пептидильной смолы с использованием 90% ТЕА, 5% Н₂О, 3% ЕЭТ, 2% тиоанизола, затем гранулы осаждались в диэтиловом эфире и 3 раза промывались диэтиловым эфиром, растворенным в 5% растворе АсОН и лиофилизированным. Анализ аминокислоты выполнялся с использованием прибора фирмы Vаΐе^8 р1со!ад и насоса Vаΐе^8 501, подключенного к VI8Р 712. Прибор Vаΐе^8 600Е, оснащенный фотодетектором Vаΐе^8 996, использовался для аналитической и препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонне С₁₈ (Ое11а-Рак 100А 15 ит, МППроге). Анализ методом МАБ-ЭРМЗ выполнялся на спектрометре УС ТОЕ 8рес Е компании ЕШоп Iп8ΐ^итепΐ. По оценке, выполненной с помощью устройства для проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии, пепетиды обладали чистотой не менее 95%.

Для исследования роли важных остатков пептида Iд2, [д2-р. были созданы два пепдида контрольной группы, Р2-38 и Р2-48, последовательностей С8[^Λ8СЕ8NЕΚ (Р2-38) и С8[^Λ8С88NЕΚ (Р2-48). В пептиде Р2-38 (последовательность № 24) аминокислотные остатки Агд-2, Агд-6 и Пе-9 замещены на серины, соответствующие мутации аминокислотных остатков Агд-192, Агд-196 и Не-199 -домена АМНК. В пептиде Р2-48 (последовательность № 25) аминокислотные остатки Агд-2, Агд-6, С1и-8 и Пе-9 замещены на серины, соответствующие мутации аминокислотных остатков Агд-192, Агд-196, С1и-198 и Пе-199 ^-домена АМНК.

Для исследования роли отдельных аминокислотных остатков в последовательности пептида С3 были созданы так называемые скремблированные пептиды, включающие такие же аминокислотные остатки, что и пептид С3, но расположенные в другой последовательности (на фиг. 7 - 121, 114 и С3§сг). Точно так же были созданы скремблированные пептиды, которые включали те же аминокислотные остатки, что и последовательности пептидов Ό3 и Ό4 (на фиг. 7 - скремблированные последовательности Ό3 и Ό4). Более того, для выяснения роли этих аминокислот были созданы пептиды, включающие последовательность пептида С3, в которой основные аминокислоты (К 5 и В5) были замещены аланином (на фиг. 7 116-119). Таким же образом был создан пептид, соответствующий последовательности пептида С3, в котором пролиновый остаток (Хаа¹) был замещен аланином, так как пролин, в общем, считается важным для структуры пептидов. Для дальнейшего исследования влияния основных аминокислотных остатков последовательности пептида С3 был получен пептид, содержащий последовательность пептида С3, в которой основные аминокислоты были модифицированны ацетилированием (на фиг. 7 - С3асе1у1. К(120)).

Пример 6. Резонансный анализ поверхности плазмона.

- 21 006230

С использованием прибора ВШЕе (РЕагтааа Вюкепког ΑΒ, Швеция) в реальном масштабе времени выполнен анализ биомолекулярного взаимодействия. Все эксперименты проводились при 25°С с использованием забуференного соляного раствора Не]эе5 (Ηеρе8 ЬиГГегей §а1ше - НВ8: 10 мМ Не]эе5 с уровнем рН 7,4; 150 мМ №С1; 3,4 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты; 0,005% (об./об.) поверхностноактивного вещества Р20 (РЕагтааа Вюкепког ΑΒ, Швеция)) в качестве рабочего буферного раствора. Расход составлял 5 мл/мин. Дендримерные пептиды С3, Ό3 и Ό4 (четыре мономерных пептида, связанных со скелетом, включающим три лизина) были зафиксированы на сенсорном чипе СМ5 (РЕагтас1а Вюкепког ΑΒ, Швеция) с применением следующей процедуры: чип активировался с помощью 10 мл 0,05 М Ν-гидроксисукцинимида, 0,2 М №этил-№-(диметиламинопропил)карбодиимида; пептиды фиксировались с использованием 35 мл пептидного раствора в НВ8 с концентрацией 60 мкг/мл; наконец, чип блокировался с помощью 35 мкл 1 М этаноламингидрохлорида с уровнем рН 8,5. Использовалась связь Ι§1 с пептидными дендримерами: 50 мл Ι§1 или Ι§1Ι при индикаторной концентрации. Чип регенерировался с помощью 5 мл импульсов 5 мМ ΝηΘΗ. Было проведено два независимых эксперимента. Результаты подтвердили, что пептиды С3, Ό3 и Ό4 образовывали связи с ^-доменом АМНК.

Пример 7. Агрегирование и рост нейритов.

1) Влияние составов связи ^-домена АМНК на адгезию клеток, стимулированную АМНК.

Были приготовлены клетки гиппокампа внутриутробных эмбрионов крысы в возрасте 17-19 дней. Были приготовлены мозжечковые клетки постнатальных мышей в возрасте 4-7 дней. Клетки выращивались в заданной среде из ΌΜΕΜ/Ρ12 (61Ьсо, ВВЬ) с добавлением N2 (61Ьсо, ВРЬ) или №игоЬа§а1 с добавлением В27 (61Ьсо, ВВЬ), в обоих случаях с добавлением 20 мМ ΗΕΓΕδ (61Ьсо, ВВЬ), 0,4% (мас./об.) альбумина бычьей сыворотки (Сигма) и 100 иммунизирующих единиц на миллилитр пенициллинастрептомицина. Диссоциированные клетки высевались в 60 лунок микротитрационного планшета (50000 в 15 мл на одну лунку) так, как описано в работе Мааг и др., 1995 г. После 24 ч подсчитывалось число агрегаций. Непосредственно перед высевом клеток в микролунку к взвеси клеток добавлялись испытываемые соединения. Если во время агрегации клеток присутствовали пептиды С3 Ό3 и Ό4, образующие связи с ^-доменом АМНК, то при выполнении количественной оценки 24 ч спустя после высева клеток наблюдались более мелкие, но в большем числе агрегации клеток. На фиг. 5 показано число агрегаций, измеренное 24 ч спустя после высева клеток в присутствии С3й с начальной концентрацией, измеряемой в мкМ (концентрация подсчитывалась относительно числа пептидных мономеров, присутствующих на пептидных дендримерах). Кроме того, пептиды вызывали рост числа нейронных отростков (фиг. 6). Дендримеры Ό3 и Ό4 также вызывали рост числа агрегаций после выдержки в течение 24 ч. Скремблированные пептиды на основе последовательности пептида С3 замедляли агрегирование. На фиг. 7 показано влияние различных пепетидов. При замещении пролина на аланин влияние оставалось прежним. Точно так же, как и в случае с пептидами, при замещении одной основной аминокслоты на аланин не наблюдалось изменения влияния (обозначение 116 на фиг. 7). В других случаях пептиды с замещением основных аминокислотных остатков на 2-4 аланина не обладали таким влиянием на агрегирование, показывая тем самым, что эти аминокислотные остатки являются важными для влияния пептида С3. В присутствии пептида С3 были приготовлены такие культуры, как мономер, дендример или связанный с альбумином бычьей сыворотки двадцатимер. Были испытаны различные формы пептида С3. Было обнаружено, что мономерные, дендримерные и связанные с альбумином бычьей сыворотки формы пептида С3 обладают тем же влиянием на агрегацию. Однако дендример последовательности пептида С3 является наиболее сильной формой, по-видимому, из-за способности связывать несколько рецепторных доменов. Для подтверждения того, что рецептор в находился в ^-домене АМНК, клетки выращивались с этим доменом, приготовленным в РюЫа ρа8ΐо^^8 в растворе, как описано в примере 1, с концентрацией 5,4 или 54 мкг/мл. Присутствие ^-домена АМНК приводит к потере влияния пептида С3, что говорит об отрицательном влиянии пептида С3 на клеточную адгезию посредством АМНК. Эти эксперименты показали, что идентифицированные здесь пептиды, образующие связи с ^-доменом АМНК, влияют на клеточную адгезию посредством АМНК и таким образом повышают число клеточных агрегаций и нейронных отростков, формирующихся в культурах первичных нейронов, выращенных с большой плотностью.

В культурах агрегаций клеток гиппокампа, приготовленных, как описано выше, испытывалось влияние Iд2-домена АМНК и пептидов Ι§2-ρ (последовательность № 23) и ^-р (последовательность № 26). Очевидно, что при обработке культур различными концентрациями Iд2-домена ΑΜΗΚ число клеточных агрегаций возрастало в зависимости от дозы. В обработанных культурах агрегации были меньше в сравнении с культурами контрольной группы, что подтверждает утверждение о том, что наличие Iд2-домена ΑΜΗΚ приводит к ослаблению межклетоной адгезии. Пептид Ι§2-ρ также замедлял агрегирование клеток. При сравнении влияния Ι§2-домена ΑΜΗΚ и пептида Ι§2-ρ очевидно, что оба соединения сильно замедляли агрегацию, что зависело от концентрации соединений. Для проверки, было ли замедление агрегирования нейронов гиппокампа пептидом Ι§2-ρ специфическим, были испытаны пептиды, в которых несколько аминокислотных остатков, принимающих участие в образовании связи между Ι§1-доменом ΑΜΗΚ и ^-доменом ΑΜΗΚ, были замещены на серины. Пептид Р2-38 (последовательность № 24), в котором аминокислотные остатки Дгд-2. Лгд-6 и Пе-9 были замещены на серины, не имел замедляющего влияния. Пептид Ι§2-ρ, Р2-48 (последовательность № 25), в котором дополнительно на серин был заме

- 22 006230 щен аминокислотный остаток С1и-8, имел небольшое замедляющее влияние на агрегацию клеток гиппокампа. Эти результаты показали, что амикислотные остатки 1д2-домена АМНК, участвующие в образовании связи с 1д1 -доменом АМНК, очень важны для межклеточной адгезии, стимулированной АМНК. Было также испытано влияние пептида 1д1-р на агрегацию клеток. Этот пептид также замедлял агрегацию клеток, что говорит о том, что часть 1д2-домена АМНК, составляющая связующий участок 1д1-1д2доменов АМНК, важна для межклеточной адгезии, стимулированной АМНК.

2) Связывающие соединения 1д1-домена АМНК стимулируют рост нейритов.

Были приготовлены клетки гиппокампа внутриутробных эмбрионов крысы в возрасте 18 дней. На 8 предметных стекол с лунками (ЬаЬТек ТСмю СиНиге СкатЬег 81йе§) с поверхностью проращивания из пластика Регтапох (ΝΗΝΠ А/8, Дания) или фибронектина (сопутствующие культуры) высевались по 5000 клеток на лунку, что соответствовало приблизительно 4000 клеток на см², и выдерживались в течение 20 ч, как описано в примере 7 (1).

Для сопутствующих культур нейроны высевались на монослоях фибробластов либо Ь-клеток, либо клеток 3Е3 с экспрессией или без экспресии NСАМ-Β. Визуализация нейронов выполнялась с использованием иммуногистохимического окрашивания протеина 43 кЭа (САР43), связанного с ростом. Клетки выдерживались в течение 30 мин в 4% растворе параформальдегида в забуференномфосфатном соляном растворе (рко8рЬа1е ЬнГГегей §а1те - РВ8). В качестве первичного антитела применялся анти-САР43 кролика в растворе РВ8 с концентрацией 1:100 с добавлением 1% фетальной бычьей сыворотки (ЕВ8), 0,1% альбумина бычьей сыворотки (В8А), 50 мМ глицина, 0,02% NаNз, 2% сапонина с выдержкой в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. В качестве второго антитела применялись биотинилированные иммуноглобулины свиньи-анти-кролика в растворе РВ8 с концентрацией 1:100 с добавлением 1% альбумина бычьей сыворотки (В8А) с выдержкой в течение 1 ч при комнатной температуре. Между слоями выполнялась промывка в режиме 3х20 мин в растворе РВ8 с добавлением 1% альбумина бычьей сыворотки (В8А). Изображения живых или окрашенных клеток захватывались и анализировались с помощью программы анализа изображения ЬшеЬепдШ, созданной в Протеиновой Лаборатории. Предполагаемые аксоны идентифицировались как самые длинные нейриты каждой клетки. Рассматривались только нейриты длиннее 10 мм.

На фиг. 8 показано влияние пептида С3, добавленного к сопутствующим культурам первичных нейронов гиппокампа на монослоях из фибробластов со стабильной экспрессией NСАМ-140 (ЬВ№) или на монослоях из фибробластов без экспрессии АМНК (ΗνΝ). В этой модели экспрессия АМНК, вызванная трансфектными фибробластами, приводит к увеличению роста нейритов из нейронов. Средняя длина нейритов на фибробластах с экспрессией АМНК была больше средней длины нейритов на фибробластах без экспресии АМНК. В присутствии пептида С3 не наблюдалось разницы в длинах нейритов на фибробластах с экпрессией АМНК или без экспресии АМНК, что говорит об образовании связи пептида С3 с АМНК (0,54 или 5,4 мкМ) как в мозжечковых нейронах, так и в нейронах гиппокампа. Когда нейроны выдерживались на фибробластах без экспресии АМНК, рост нейритов стимулировался присутствием пептида С3, что видно из сравнения с контрольной группой без пептида С3. Это говорит о том, что пептид С3 стимулировал рост нейритов.

Для исследования стимулирующего влияния на рост нейритов клетки подготавливались, как описано выше, и высевались на субстрат из пластика или фибронектина. Затем клетки выдерживались в течение 21 ч, и рост нейритов анализировался с помощью компьютерного анализа изображения с использованием программы ЬтеЬепдЛг Для нейритов длиннее 10 мкм измерялась средняя длина самых длинных нейритов каждой клетки. Кроме того, определялось среднее число точек ветвления на один нейрит и среднее число нейритов на клетку. Непосредственно перед высевом клеток вводились пептиды С3, Ό3 и Ό4, связывающие 1д1-домен АМНК. На фиг. 9 и 10 представлены результаты измерений самых длинных нейритов на одну клетку, с концентрацией в мкМ. Такие же зависимости были получены при измерении числа нейритов на одну клетку и числа ветвлений нейритов. Скремблированные пептиды с таким же аминокислотным составом, но с другой последовательностью их расположения имели такое же влияние, что и пептиды С3, Ό3 и Ό4. На фиг. 7 показано влияние испытанных пептидов, образующих связи 1д1домена АМНК и различных контрольных групп пептидов на рост нейритов.

Для определения, какие из свойств пептидов, связывающих [д 1 -домен АМНК, важны для наблюдаемых нейриногенных эффектов с точки зрения их влияния на рост нейритов, были испытаны пептиды, соответствующие последовательности пептида С3, но с замещением основных аминокислот на аланин (фиг. 11). Длина самого длинного нейрита, число нейритов на одну клетку и число ветвлений нейритов сильно стимулировались пептидом С3 (0,54 мкМ). Пептид той же последовательности, но с замещением одной основной аминокислоты на аланин, имел такое же влияние. В других случаях пептиды с замещением аминокислот на 2, 3 или 4 аланина не обладали тем же влиянием. Для исследования механизма этого влияния добавлялся пептид С3 (0,54 мкМ) в сочетании с различными соединениями, о которых известно, что они замедляют зависимую от АМНК передачу сигналов (фиг. 12 и 13). Было обнаружено, что следующие соединения замедляют стимулирующее влияние пептида С3 на рост нейритов: 10 мкМ верапамила (уе ингибитор Ь-типа зависимого от напряжения кальциевого канала), 0,27 мкМ омегаконотоксина СУ1А (со ингибитор Ν-типа зависимого от напряжения кальциевого канала), 1 мкг/мл

- 23 006230 пертуссис токсина (регШз ингибитор определенного С-протеина), 0,2 мкМ аналога эрбстатина (егЬ ингибитор определенной тирозинкиназы), антитело к асидбокс эпитоп в рецепторах фактора роста фибробласта (ЕСЕ-Кз) (ингибитор образования связи и передачи сигналов ЫСАМ-ЕСЕ-К в соотношении 1:200), пептид, соответствующий так называемому гомологическому домену АМК (СНЭ - САМ 1юто1оду ботат). Кроме того, при присутствии в растворе ^1 -домена АМНК пептид С3 полностью терял свое нейритогенное влияние, как показано в примере 1. Эти результаты показали, что пептид С3 стимулирует рост нейритов путем образования связей с ^1 -доменом АМНК и таким образом активизирует каналы передачи сигналов в нейроне, которые чувствительны к упомянутым выше соединениям-ингибиторам.

Для исследований эндогенного лиганда ^1-домена АМНК в Р1сЫа разЮпз был приготовлен ^2домен АМНК (см. пример 2) и было испытано его влияние на рост нейрита из первичных нейронов гиппокампа, выдержанных на субстрате из фибронектина. Непосредственно перед высевом клеток в лунки с культурами были добавлены полипептиды, содержащие этот домен. На фиг. 14 показана средняя длина самого длинного нейрита, измеренного через 21 ч после высева первичных нейронов гиппокампа в присутствии полипептида ^2 АМНК (рЬоор2), в индикаторной конценрации. Показано, что Iд2-домен АМНК стимулирует рост нейритов, при этом зависимость роста нейритов от дозы препарата принимает колоколообразный вид, как и в случае с пептидом С3. Максимальный нейритогенный эффект Iд2-домена АМНК проявлялся при концентрации 5,4 мкг/мл, что соответствует концентрации домена 0,54 мкМ. Это та же концентрация, при которой проявлялся максимальный нейритогенный эффект пептида С3. После этого проходили совместные испытания -домена АМНК в сочетании с различными соединениями, о которых известно, что они замедляют зависимую от АМНК передачу сигналов, как и в случае с пептидом С3, о чем говорилось выше. Эти соединения также замедляют нейритогенное влияние ^-домена АМНК. Таким образом, оба, как ^-домен АМНК, так и пептид С3, образуют связи с ^-доменом АМНК, и оба, как ^-домен АМНК, так и пептид С3, стимулируют рост нейритов, что происходит, вероятно, благодаря активации идентичных каналов трансдукции сигналов. Кроме того, было испытано влияние ^2-домена АМНК и пептида С3 на рост нейритов, когда они вводились в сочетании. Было обнаружено, что их влияние носит неаддитивный характер. Результаты также показали, что механизмы стимулирования роста нейритов у Iд2-домена АМНК и пептида С3 одни и те же. Они оба образуют связи с ^-доменом АМНК и таким образом активируют идентичные каналы передачи сигналов, что приводит к росту нейритов.

Показано, что ^-домен АМНК и пептид, включающий аминокислотные остатки 191-202 Iд2-домена АМНК, влияют на рост нейритов в девяти направлениях. Клетки гиппокампа выращивались при низкой плотности и обрабатывались соединениями разной концентрации, что описано выше. Для измерения роста нейритов из нейронов гиппокампа применялась простая процедура, основанная на стереологических принципах. С помощью пакета прикладного программного обеспечения РгосеззЬепдЪ (Протеиновая Лаборатория, Университет Копенгагена) на изображение клеточной культуры накладывалась несмещаемая счетная рамка с сеткой, содержащей определенное число измерительных линий. Считалось число клеточных отростков с измерительными линиями и соотносилось с числом клеточных тел, таким образом определялась общая длина нейрита на одну клетку. Как ^-домен АМНК, так и пептид оказывали сильное стимулирующее влияние на рост нейритов из нейронов гиппокампа в зависимости от дозировки. Как описано выше, при замещении трех или четырех аминокислотных остатков серином в пептиде ^-р пептид ^-р теряет способность стимулировать рост нейритов. Для того чтобы увеличить влияние пептида ^-р на рост нейритов, был синтезирован дендример ЦдЕрб), состоящий из четырех мономеров, соединенных со скелетом лизина. Этот дендример обладает сильным нейритогенным эффектом, при этом зависимость роста нейритов от дозы препарата принимает колоколообразный вид в том же диапазоне концентраций, что и в случае с эффектом стимулирования -домена АМНК. Было обнаружено, что в культурах гиппокампа, обработанных дендримером при оптимальной концентрации 3,6 мкМ, степень морфологических различий нейронов была значительно больше, чем в контрольной группе. Таким образом был идентифицирован лиганд пептида, полученный из АМНК, с сильной нейритогенной активностью. Были испытаны пептиды, у которых несколько аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотным остаткам в составе связующего участка Iд2-домена АМНК и ^-домена АМНК, были замещены серином. Пептид Р2-3Б, в котором аминокислотные остатки Агд-2, Агд-6 и Пе-9 были замещены на серины, не имел стимулирующего влияния. Пептид ^-р, Р2-4Б, в котором дополнительно на серин был замещен аминокислотный остаток С1и-8, не имел стимулирующего влияния на рост нейритов из клеток гиппокампа. Таким образом, эти аминокислотные остатки важны с точки зрения нейритогенного влияния пептида ^-р. Следовательно, аминокислотные остатки Агд-192, Агд-196, С1и-198 и Пе-199 могут считаться важными с точки зрения нейритогенного влияния Iд2-домена АМНК.

Кроме того, культуры клеток гиппокампа выращивались в присутствии пептида ^-р и ^-домена АМНК. Показано, что добавление ^1-домена АМНК приводит к снижению нейритогенной активности пептида ^-р. Кроме того, показано, что антитела к ЕСЕК, гомологический домен АМК рецептора и специфический ингибитор фосфолипазы Су (РЬСу) замедляют рост нейритов, вызываемый пептидом ^2р. На самом деле, как антитела к ЕСЕК, так и гомологический домен АМК замедляли рост нейритов, в то время как ϋ-73122, ингибитор фосфолипазы Су, приводил к полной потере способности пептида ^-р

- 24 006230 вызывать рост нейритов. Эти данные показывают, что пептид 1д2-р стимулирует рост нейритов по каналу передачи сигналов АМНК-ЕСЕВ.

Пептид 1д1-р также стимулировал рост нейритов в культурах клеток гиппокампа, приготовленных, как описано выше. Это говорит о том, что последовательность, соответствующая части 1д1-домена АМНК в составе связующего участка 1д1-домена АМНК и 1д2-домена АМНК, может непосредственно оказывать стимулирующее влияние на рост нейритов.

Дополнительно было испытано влияние мутаций этих аминокислотных остатков на изменение активности 1д1-домена АМНК и 1д2-домена АМНК по отношению к росту нейритов. Показано, что нормальные 1д1 -домен АМНК и 1д2-домен АМНК имеют только небольшое влияние на рост нейритов или не имеют его вообще, что не удивительно, так как в димере все возможные связующие участки блокированы. В присутствии мутантного двойного домена рост нейритов из клеток гиппокампа замедлялся в зависимости от дозировки. Отсюда можно сделать вывод, что аминокислотные остатки с составе связующего участка между двумя 1д-доменами АМНК важны с точки зрения роста нейритов, стимулированного АМНК.

Пример 8. Пролиферация.

Путем введения 5-бромо-2'-деоксиуридина в систему пролиферации клеток ЕЫ8А (Атегкйат ЬТе 8с1епсе) в соответствии с процедурой фирмы-изготовителя исследовалась пролиферация клеток. Первичные нейроны гиппокампа высевались в микротитрационный планшет с плотностью высева 33000 клеток на лунку. В присутствии пептида С3й с концентрацией 0,8 мкМ было отмечено увеличение введенного препарата ВгйИ, что говорит о стимулировании пролиферации нейронов. Зависимость пролиферации от дозы препарата принимала колоколообразный вид (фиг. 16), таким образом при увеличении концентрации пептид С3 замедлял пролиферацию. Пептид С3 также стимулировал пролиферацию клеток нейробластомы. Однако совокупное влияние на пролиферацию зависит от состояния роста клеток. Следует отметить, что в клетках РС12 замедляющее влияние на пролиферацию проявлялось вместе с увеличением роста нейритов, что говорит о том, что пептид стимулировал дифференциацию этих клеток. Эти результаты показали, что связывающие соединения 1д1-домена АМНК могут влиять на пролиферацию нейронов. Совокупный эффект зависит от состояния роста клеток, но при определенных условиях приводит к стимулированию пролиферации.

Пример 9. Рост клеток.

Рост клеток является еще одним способом контроля пролиферации клеток. Первиные клетки гиппокампа высевались на микротитрационном планшете (Дипс А/8) с плотностью высева 20000 или 40000 клеток на лунку в определенной среде, как описано выше. Клетки выращивались в течение 48 ч, центрифугировались для удаления среды, фиксировались в растворе 3,7% формальдегида в РВ8 в течение 15 мин и в течение 15 мин окрашивались раствором 0,5% гексаметилпарарозанилина в 20% метаноле. Окрашенные клетки тщательно промывались очищенной водой, затем остаток краски растворялся 0,1 М дигидрата цитрата натрия в 50% этаноле с уровнем рН 4,2, и при 550 нм измерялась оптическая плотность. При добавлении к 0,8 мкМ только что высеянных клеток пептид С3 увеличивал рост клеток.

Пример 10. Определение структуры связующего участка 1д1-1д2-доменов АМНК.

С помощью спектра двух доменов АМНК, полученного с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР), и известных трехмерных структур этих доменов, определялось положение аминокислотных остатков, которые образуют связующий участок на поверхности двух доменов. В спектре ^|5Ν-Η800 протеина, меченного ¹⁵Ν, можно наблюдать сигнал каждого аминокислотного остатка, как с азотом пептида, так и с протоном. Определение изменений в химических сдвигах сигналов является способом определения местоположений участков в протеине, которые были изменены, например, в результате образования связи с другой молекулой. К образцу 1д1 -домена АМНК, меченному ¹⁵Ν, добавляли немеченый образец 1д2-домена АМНК для образования избытка 1д2-домена АМНК в 1д1-домене АМНК. Соответствущий эксперимент выполнялся и с 1д2-доменом АМНК, меченным ¹⁵Ν. В структурах 1д1-домена АМНК и 1д2-домена АМНК фиксировались изменения, соответствующие химическим сдвигам в спектрах ¹Н и ¹⁵Ν каждого аминокислотного остатка, с использованием отсечки при концентрациях 0,04 и 0,2 ч./млн соответственно, для нарушенного химического сдвига ¹Н и ¹⁵Ν соответственно. К числу аминокислотных остатков, подверженных большим нарушениям химического сдвига в 1д1-домене АМНК, принадлежат следующие: С1у-12, С1у-17, С1и-18, 8ег-19, Ьук-20; Рйе-22, Сук-24, Агд-51, Ьеи-64, 11е-66, Туг-67, А1а-69, 11е-71, Акп-94 и Ьук-96; а к числу аминокислотных остатков, подверженных большим нарушениям химического сдвига в 1д2-домене АМНК, принадлежат следующие: Тйг-131, 11е-132, С1и-173, С1у-174, 11е-176, Ьеи-177, А1а-178, С1у-180, С1и-181, 11е-182, Акп-183 и Рйе-184. Изменения химического сдвига сигналов ЯМР по скелету пептида для этих аминокислотных остатков в двух доменах показали, что наличие другого домена АМНК приводит к изменению химических условий на этих участках, что заставляет сделать предположение о наличии связи между этим другим доменом АМНК и окружением.

Картирование аминокислотных остатков с нарушениями, вызванными другим доменом, отчетливо показало, что эти аминокислотные остатки расположены в хорошо различимых и связанных очагах на каждой из поверхностей домена. Это хорошее доказательство того, что два очага аминокислотных остатков на поверхности являются либо частями связующего участка, обеспечивающего взаимодействия между двумя доменами, либо находятся рядом с этим участком.

- 25 006230

Эти образцы использовались при определении структуры (а) немеченого 1д2-домена АМНК в Н₂О, ~1 мМ; (Ь) немеченого 1д2-домена АМНК в Ό₂Ο, ~1 мМ; (с) 1д2-домена АМНК, меченного ¹⁵Ν, в Н2О, ~1 мМ. Во всех случаях в качестве буферного ратвора использовался №1С1 (50 мМ), фосфат калия (20 мМ) с уровнем рН 6,0. Были записаны и использованы для интерпертации следующие спектры ЯМР для 1д2домена АМНК: ТОС8У, соответственно в Н2О и Ό2Ο, в обоих случаях время перемешивания составляло 70 мс; ООЕСОУ, соответственно в Н2О и Э2О; NΟЕ8Υ, соответственно в Н2О и Ό2Ο, со временем перемешивания либо 100 мс, либо 200 мс; 'к-НЗРС; ¹⁵Ν ТОС8У-Н8РС со временем перемешивания 70 мс; и ¹⁵Ν КОЕ8У-Н8РС со временем перемешивания 100 мс. Эксперименты с использованием ЯМР выполнялись на спектрометре Вгикег АМ-600 МГц и спектрометре νηΓίηπ Ипйу 1поуа 750 МГц. Все спектры записывались при температуре 298 К. Интерпретация резонансных линий 'Н и ¹⁵Ν этих спектров выполнялась с использованием компьютерной программы РВОКТО. Для расчетов структур использовался XРЬОВ протокол матричной геометрии/моделированной гибридизации. Было рассчитано 100 структур, и 70 структур были восприняты протоколом Х-РЬОВ, который дискриминирует любую структуру с нарушениями ядерного эффекта Оверхаузера >0,5 А и/или нарушениями угла >5°. Из 70 структур для представления структуры 1д2-домена АМНК были выбраны 20 структур с наименьшей энергией. В расчете структур использовались 107 ультра- , 300 последовательных, 145 ближних и 466 дальних ядерных эффектов Оверхаузера, полученных из спектров 2Э-КОЕ8У и ¹⁵Ν КОЕ8У-Н8РС с верхними границами 2,7; 3,3; 4,3 и 5 А. Они были увеличены на 0,5 А, когда ядерный эффект Оверхаузера ограничивался группой метила. Двугранный угол 41 φ был ограничен величинами -120±40° и -50±40°, при коэффициенте связи ³1НКНа, полученном из спектров ЭРГСОУ и КОЕ8У, равном >8 Гц или <5 Гц соответственно. Значения двугранным углам 34 χ¹ были приписаны на основе оценки коэффициентов связи ³1_НоНр и интенсивностей ядерного эффекта Оверхаузера, полученных из спектров ЭРГСОУ и КОЕ8У соответственно. При заключительных расчетах структуры 78 граничных значений водородной связи были выбраны и применены в виде ограничений ядерного эффекта Оверхаузера в расчетах с верхними границами 2,1 А для интервала Н^К-О и 3 А для интервала Ν-О. Структуры 1д2-домена АМНК исследовались с использованием программы РВОСНЕСК_КМВ. Элементы второй структуры идентифицировались с использованием программ МОЬМОЬ и РВОСНЕСК_КМВ. Для исследований связи 1д1-домена АМНК и 1д2-домена АМНК были записаны шесть спектров А-НЗРС следующих образцов: а) спектр А-НЗРС 1д1-домена АМНК, меченного ¹⁵Ν (1 мМ и 0,5 мМ); Ь) спектр А-НЗРС 1д2-домена АМНК, меченного ¹⁵Ν (1 мМ и 0,5 мМ); с) спектр А-НЗРС 1д 1 -домена АМНК, меченного ¹⁵Ν, дополненный немеченым 1д2-доменом АМНК (соотношение 0,5 мМ:1 мМ); 6) спектр А-НЗРС 1д2-домена АМНК, меченного ¹⁵Ν, дополненный немеченым ί§1-доменом АМНК (соотношение 0,5 мМ:1 мМ). Титрование 1д1-домена АМНК и 1д2-домена АМНК выполнялось с записью изменений химического сдвига спектров А-НЗРС. Измерения на всех образцах выполнялись при уровне рН 6,0 и температуре 298 К с добавлением 50 мМ №1С1 и 20 мМ фосфата калия. Эксперименты с использованием ЯМР проводились на спектрометре νΗΓίΗΗ и п11у 1поуа 750 МГц. Спектры анализировались с использованием программы РВОКТО. В экспериментах по титрованию, в которых титрование 1д2-домена АМНК, меченного ¹⁵Ν, выполнялось совместно с титрованием немеченого 1д1-домена АМНК, было найдено сходство связей между 1д1-доменом АМНК и 1д2-доменом АМНК. При титровании по 14 точкам с немеченым 1д1-доменом АМНК изменения химического сдвига были выполнены для 10 аминокислотных остатков. Подбор кривой связи для каждого из этих аминокислотных остатков привел к той же константе диссоциации К^ равной (2,5±2)х10^-3 М. Сцепление фрагментов аминокислотных остатков с нарушенными связями на поверхностях двух доменов АМНК, а также идентичные константы связи, измеренные для участков с нарушенной связью в 1д1-домене АМНК, дают основание предполагать, что связь очень специфична, хотя и слаба в условиях измерений ЯМР. Титрование выполнялось с добавлением порций смеси немеченого 1д1-домена АМНК (2 мМ) и 1д2-домена АМНК (1 мМ), меченного ¹⁵Ν, в соотношении 2:1 к 1 мМ раствора 1д2-домена АМНК (1 мМ), меченного ¹⁵Ν. Таким образом, концентрация 1д2-домена АМНК (1 мМ), меченного ¹⁵Ν, поддерживалась на уровне 1,0 мМ, а концентрация ί§1-домена АМНК постепенно повышалась. Концентрация протеина определялась аминокислотным анализом. Подбор точек титрования для кривой связи двухкомпонентного взаимодействия выполнялся с использованием программы САКОО. Протокол Х-РЬОВ матричной геометрии/моделированной гибридизации и ограниченной динамики использовался для построения модели димера первых двух доменов АМНК (1д1-домена АМНК и 1д2-домена АМНК). В качестве ограничений использовались ограничения, полученные на основе измерений ядерного эффекта Оверхаузера и коэффициента связи ί§1-домена АМНК и 1д2-домена АМНК. В модель в качестве ограничений водородной связи были встроены межмолекулярные солевые мостики, которые применялись в качестве ограничений ядерного эффекта Оверхаузера в расчетах с верхними границами 2,1 А для интервала Н^К-О и 3 А для интервала Ν-О. Были рассчитаны двадцать структур и десять из них с самой низкой энергией были отобраны для оценки построения модели связи 1д1-домена АМНК и 1д2-домена АМНК.

Список источников

Апбегккоп, А.М. Вюсйешюа1 1оигпа1 1993; 290:641-8.

Веддк, Н.Е. Ν. 1онгпа1 о£ Вю1одюа1 Сйеш18!гу 1997, 272, по. 13: 8310-8319.

- 26 006230

Сагешш, З. Се11 & Т1ззие КезеагсН 1997; 287:3-9.

Сгетег, Η. Мо1еси1аг & Се11и1аг №игозаепсез 1997; 8:323-35.

Сгетег, Η. №1(иге 1994; 367:455-9.

1);пн1о1Т. БК. 1оита1 оГ Се11 Вю1о§у 1986; 103:929-45.

Эаз(оп, М.М. 1оита1 оГ №игозаепсе 1996; 16:5488-97.

ЭоНег(у, Р. №(иге 1992; 356:791-3.

ОоНег(у, Р. Мо1еси1аг апй Се11и1аг №игозаепсе 1996; 8:99-111.

Эоу1е, Е. 1оита1 оГ №игозаепсе КезеагсН 1992; 31:513-23.

Ейе1тап, О.М. Со1й Зрппд НагЬог Зутроз1а оп ОиапШаПуе Вт1оду. Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, 1990: 303-18.

ЕахеН, З. Зеттагз ш (Не №игозаепсез 1997; 8:367-77.

Р1е1йз, Κ.Ό. Тгепйз т №игозаепсез 1996; 19:473-80.

Еге1, Т. 1оита1 оГ Се11 Вю1о§у 1992; 118:177-94.

Ригка, А. 1п(егпа(юпа1 1оита1 оГ РерПйе & Рго!ет КезеагсН 1991; 37:487-493.

СаагйзуоН, Η. Еигореап 1оита1 оГ Се11 Вю1оду 1993; 61:100-7.

Ногз(ког(е, К. ТНе 1оита1 оГ Се11 Вю1оду 1993; 121, по 6:1409-21.

йискег, М. Вгат КезеагсН 1995; Мо1еси1аг Вгат Кезе: 149-56.

Казрег, С. 1опгпа1 оГ №игозаепсе КезеагсН 1996; 46:173-86.

К1зе1уоу, V. 1оита1 оГ Вю1од1са1 СНет1з!гу 1997, 272:10125-10134.

КшПеН Т. Атепсап 1оита1 оГ Ра(Но1оду 1996; 149:449-62.

КгизНеН Ь.А. Ргосеейтдз оГ (Не №топа1 Асайету оГ Заепсез оГ (Не Ипйей З(а(ез оГ Атепса 1998; 95:2592-6.

Ьаск1е, Р.М. Эеуе1ортеп( 1990; 110:933-47.

ЬаНйг, Р. 1оита1 оГ №игозаепсе КезеагсН 1997; 50:62-8.

Ьат, К.З. УПиге 1991, 354:82-84.

Ьат, К.З. 1ттипоте(Нойз 1992, 1, 11-15.

Ьапйтеззег, Ь. №игопе 1990; 4:655-67.

Ьи!Ы, А. УПиге 1994; 372:777-9.

Мааг, Т.Е. 1оита1 оГ №игозаепсе КезеагсН 1997, 47:163-172.

Маззаго, А.К. Накап 1оита1 оГ №иго1од1са1 Заепсез 1987; Зирр1. 6:85-8.

Мо11ег, С.1. Апа(оту & ЕтЬгуо1оду 1991; 184:541-8.

Мо11ег, С.1. Мо1еси1аг Епйосгто1оду 1992; 6:1332-42.

№еке, 1. ОйТегепНаПоп 1985; 30:141-51.

О1зеп, М. 1п(. 1. Эеу1. №игозаепсе 1995; 13:97-104.

Опо, К. №игопе 1994; 13:595-609.

Ро11егЬегд, О.Е. Эеуе1ортеп(а1 Вт1оду 1993; 156 (2):324-40.

КаЬтотейг, БЕ. Ргосеейтдз оГ (Не №топа1 Асайету оГ Заепсез оГ (Не Ипйей З(а(ез оГ Атепса 1996; 93:6421-4.

КапНе1т, Т.З. Ргосеейтдз оГ (Не №1Попа1 Асайету оГ Заепсез оГ (Не Ипйей З(а(ез оГ Атепса 1996, 93:4071-4075.

Као, Υ. 1оита1 оГ Се11 Вю1о§у 1992; 118:937-49.

Као, Υ. 1оита1 оГ Вт1од1са1 СНет1з!гу 1994; 269:27540-8.

Котапзка, Н.М. 1оита1 оГРей1а(пс Саз(гоеп(его1оду & №.1(пПоп 1996; 22:351-8.

Копп, Ь.С. Вгат КезеагсН 1995; 677:145-51.

Копп, Ь.С. РН. Ό. (Нез1з; ТНе Рго(ет ЬаЬога!огу апй ТНе 0Наз1оп оГ №игорйузю1оду, Ишуегзйу оГ СорепНадеп, 1997.

КийзНаизег, и. Тгепйз ш №игозаепсез 1996; 19:422-7.

Запй1д, М. 1ошпа1 оГ Вю1од1са1 СНет1з!гу 1994; 269:14841-8.

Запез, БК. 1оита1 оГ Се11 Вт1оду 1986; 102:420-31.

ЗсНт1Й, К.-З. 1оита1 оГ №игоЬт1оду 1999; 38:542-558.

ЗсНо1еу, А.В. №игозаепсе 1993; 55:499-509.

ЗсНисН, и. №игопе 1989; 3:13-20.

ЗНеп, Η. 1оита1 оГ №игозаепсе 1997; 17:5221-9.

З(аН11ш(, М. 1оигпа1 оГ №игозаепсе КезеагсН 1997; 48:112-21.

З(огк, О. Еигореап 1оита1 оГ №игозаепсе 1997; 9:1117-25.

ТНотзеп, КК. №1(иге З(гис(ига1 Вт1оду 1996; 3:581-5.

уап Каттеп, ΌΡ. Вю1од1са1 РзусЫаПу 1998; 43:680-6.

\Уа1зН, Р.З. №игозаепсе БеПегз 1985; 59:73-8.

ΖΙππίβ, Η. 1оита1 оГ №игозаепсе 1992; 12:3107-14.

- 27 006230

Claims (52)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Пептид, способный образовывать связи с ^1- и/или Iд2-доменами адгезионной молекулы нервной клетки (АМНК) и стимулировать или вызывать рост нейритов, экспрессирующих на своей поверхности АМНК, состоящий не более чем из 12 аминокислотных остатков АМНК и содержащий следующую последовательность:

   (К/К)_0-1-К/К-Х-К/К), где Х является любым аминокислотным остатком.
2. 2. Пептид, способный образовывать связи с ^1- и/или ^2-доменами адгезионной молекулы нервной клетки (АМНК) и стимулировать или вызывать рост нейритов, экспрессирующих на своей поверхности АМНК, состоящий не более чем из 12 аминокислотных остатков АМНК и содержащий следующую последовательность:

   (К/К.)-Х-Х-Х-(К/К.)-Х-(Е/О)-(ЕЛ/У/Е)-Х-(ЕЛ/У/Е), где Х является любым аминокислотным остатком.
3. 3. Пептид, способный образовывать связи с ^1- и/или ^2-доменами адгезионной молекулы нервной клетки (АМНК) и стимулировать или вызывать рост нейритов, экспрессирующих на своей поверхности АМНК, состоящий не более чем из 12 аминокислотных остатков АМНК и содержащий следующую последовательность:

   (Е/О)-Х-(К/К)-(ЬЛ/У/Е)-Х-(ЬЛ/У/Е), или (Е/П)-Х-(К/К)-(ЕЛ/У/Е)-(ЕЛ/У/Е), или (Е/О)-Х-Х-Х-Х(Е/П)-Х-(К/К)-(ЪЛ/У/Е), или (Е/П)-Х-Х-Х-(Е/О)-Х-(К/К)-(ЬЛ/У/Е), или (Е/О)-Х-Х-(Е/Э)-Х-(К/К)(ЪЛ/У/Е), где Х является любым аминокислотным остатком.
4. 4. Пептид по любому из пп.1-3, способный образовывать связи с доменом АМНК.
5. 5. Пептид по любому из пп.1-4, способный образовывать связи с той частью гомофильного связующего участка ^1-^2 АМНК, которая состоит из домена АМНК.
6. 6. Пептид по любому из пп.1-5, соответствующий участку [д2 домена АМНК.
7. 7. Пептид по п.6, способный образовывать связи с доменом АМНК через связующее звено, включающее не менее 2 основных аминокислотных остатков.
8. 8. Пептид по п.7, отличающийся тем, что указанное звено включает не менее 2 основных аминокислотных остатков в составе последовательности из 10 аминокислотных остатков.
9. 9. Пептид по п.7, отличающийся тем, что указанное звено включает не менее 2 основных аминокислотных остатков в составе последовательности из 3 аминокислотных остатков.
10. 10. Пептид по любому из пп.1, 4-9, содержащий последовательность К/К-Р-К/К, или К/К-К/К-РК/К, или К/К-К/К-Е-К/К, или К/К-К/К-Е-К/К.
11. 11. Пептид по п.10, содержащий последовательность К-Р-К, или К-К-Р-К, или К-К-Е-К, или К-К-Е-К.
12. 12. Пептид по любому из пп.10 или 11, содержащий последовательность А-Б-К-К-Р-К-К^Л-К-А (последовательность № 1), или А-К-К-Е-К-Р-К-К-Э-Т-Р (последовательность № 2), или А-К-А-Ь-Ν-^С-А-К-Р-К (последовательность № 3).
13. 13. Пептид по любому из пп.7-12, в котором остатки одной или более аминокислот модифицированы, в частности ацетилированы.
14. 14. Пептид по любому из пп.7-12, соответствующий участку домена АМНК.
15. 15. Пептид по любому из пп.7-14, способный образовывать связи со связующим участком доме- на АМНК на домене АМНК.
16. 16. Пептид по любому из пп.7-14, способный образовывать связи со связующим участком на домене АМНК, причем этот участок отличается от связующего участка ^2 домена АМНК.
17. 17. Пептид по п.16, отличающийся тем, что связующее звено содержит не более 12 аминокислотных остатков.
18. 18. Пептид по любому из пп.16-17, отличающийся тем, что связующее звено содержит не более 8 аминокислотных остатков.
19. 19. Пептид по любому из пп.14-18, содержащий последовательность (К/К)-Х-(Е/О)-(ЬЛ/У/Е)-Х(ЬЛ/У/Е), или (К/К)-Х-Х-Х-(К/К)-Х-(Е/Э), или (К/К)-Х-Х-(К/К)-Х-(Е/О), или (К/К)-Х-(ЬЛ/У/Е)-Х(ЬЛ/У/Е), где Х является остатком любой аминокислоты.
20. 20. Пептид по любому из пп.14-18, содержащий последовательность (К/К)-Х-Х-Х-(К/К)-Х-(Е/И)(ЬЛ/У/Е), или (К/К)-Х-Х-(К/К)-Х-(Е/О)-(ЬЛ/У/Е), или (К/К)-Х-Х-Х-(К/К)-Х-(ЬЛ/У/Е), где Х является остатком любой аминокислоты.
21. 21. Пептид по любому из пп.14-18, содержащий последовательность (К/К)-Х-Х-(К/К)-Х-(Е/И)(ЬЛ/У/Е)-Х-(ЬЛ/У/Е), или (К/К.)Х-Х-Х-(К/К.)-Х-(ЕЛ/У/Е)-Х-(ЬЛ/У/Е), или (К/К)-Х-Х-Х-(К/К)-Х-(Е/О)(ЬЛ/У/Е)-(ЬЛ/У/Е), где Х является остатком любой аминокислоты.
22. 22. Пептид по п.19, содержащий последовательность СКЛБАКСЕЮТК (последовательность № 23).
23. 23. Пептид по любому из пп.14-22, в котором остатки одной или более аминокислот модифицированы, в частности ацетилированы.
24. 24. Пептид по любому из пп.14-23, соответствующий или идентичный гомофильному участку ^1^2 АМНК, образованному ^2 доменом АМНК.
25. 25. Пептид по любому из пп.1-3, способный образовывать связи с ^2 доменом АМНК.

    - 28 006230
26. 26. Пептид по любому из пп.1-3, 25, способный образовывать связи с той частью гомофильного связующего участка Iд1-Iд2 АМНК, которая состоит из ^2 домена АМНК.
27. 27. Пептид по любому из пп.1-3, 25, 26, соответствующий участку ^1 домена АМНК.
28. 28. Пептид по любому из пп.25, 27, отличающийся тем, что связующее звено содержит по крайней мере 2 кислых аминокислотных остатка и по крайней мере 1 аполярную аминокислоту.
29. 29. Пептид по п.28, отличающийся тем, что связующее звено содержит не более 12 аминокислотных остатков.
30. 30. Пептид по любому из пп.19-22, отличающийся тем, что связующее звено содержит не более 9 аминокислотных остатков.
31. 31. Пептид по любому из пп.25-30, содержащий последовательность (Е/Э)-Х-Х-Х-(Е/Э)-Х-(К/К)(ЬЛ/У/Р)-Х-(ЬЛ/У/Р), где Х является остатком любой аминокислоты.
32. 32. Пептид по любому из пп.25-30, содержащий последовательность (Е/Э)-Х-Х-(Е/О)-Х-(К/К.)-(ЬЛ/У/Р)Х-(ЬЛ/У/Р) или (Е/П)-Х-Х-(Е/П)-Х-(К/К)-(ЬЛ/У/Р)-(ЬЛ/У/Р), где Х является остатком любой аминокислоты.
33. 33. Пептид по любому из пп.25-30, содержащий последовательность (Е/Э)-Х-Х-Х-Х-(Е/Э)-Х-(К/К)(ЬЛ/У/Р)-(ЬЛ/У/Р), или (Е/П)-Х-Х-Х-(ЕЮ)-Х-(К/К)-(ЬЛ/У/Р)-Х-(ЬЛ/У/Р), или (ЕЮ)-Х-Х-Х-(Е/П)-Х(К/К)-(ЬЛ/У/Р)-(ЪЛ/У/Р), где Х является остатком любой аминокислоты.
34. 34. Пептид по любому из пп.25-30, содержащий последовательность СЕШУСЕ^КВРЬ (последовательность № 26).
35. 35. Пептид по любому из пп.28-34, в котором остатки одной или более аминокислот модифицированы, в частности ацетилированы.
36. 36. Пептид по любому из пп.25-34, идентичный гомофильному участку ^1-^2 АМНК, образованному ^1 доменом АМНК.
37. 37. Применение пептида по любому из пп.1-36 для приготовления лекарственного средства для восстановления дегенерирующих или поврежденных клеток, экспрессирующих на своей поверхности АМНК.
38. 38. Применение по п.37 для приготовления лекарственного средства для стимуляции развития и/или пролиферации клеток, экспрессирующих на своей поверхности АМНК.
39. 39. Применение пептида по любому из пп.1-36 для приготовления лекарственного средства для лечения заболевания или состояния центральной и периферической нервной системы, мышечной системы и различных органов, опосредованных активностью клеток, экспрессирующих на своей поверхности АМНК.
40. 40. Применение по п.39, отличающееся тем, что заболевания включают послеоперационное поражение нервов, травматическое поражение нервов, нарушенную миелинизацию нервных волокон, послеишемическое нарушение, например, в результате инфаркта, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, другие деменции, включая мультиинфарктную деменцию, склероз, дегенерацию нервов, связанную с сахарным диабетом, нарушениями, влияющими на циркадный ритм или передачу сигналов между нейронами и мышечной тканью, и шизофрению.
41. 41. Применение по п.39 для приготовления лекарственного средства для лечения патологий мышечной ткани, включая состояния с нарушенными функциями нервно-мышечных связей, в том числе обусловленными генетическими атрофическими повреждениями мышечной ткани, а также травматическими атрофическими повреждениями мышечной ткани.
42. 42. Применение по п.39 для приготовления лекарственного средства для лечения дегенеративных состояний половых желез, дегенеративных состояний поджелудочной железы, включающих сахарный диабет 1-го и 2-го типов, дегенеративных состояний почек типа нефротического синдрома и дегенеративных состояний сердечной мышцы, печени или кишечника.
43. 43. Применение по п.39 для приготовления лекарственного средства для стимулирования способности к обучению и/или стимулирования памяти.
44. 44. Фармацевтический состав, содержащий пептид по любому из пп.1-36.
45. 45. Фармацевтический состав по п.44, отличающийся тем, что содержит пептид в форме мультимеров.
46. 46. Фармацевтический состав по любому из пп.44-45, отличающийся тем, что содержит пептид в форме дендримеров, например в форме четырех пептидов, связанных лизином или белковым носителем типа бычьего сывороточного альбумина (В8А).
47. 47. Фармацевтический состав по любому из пп.44-46 для перорального, подкожного, внутримышечного, внутричерепного, внутрижелудочкового, интраназального или внутрилегочного введения.
48. 48. Фармацевтический состав по любому из пп.44-47, содержащий пептид в количестве, достаточном для эффективного воздействия, и необязательно одну или большее число фармацевтически приемлемых добавок или носителей.
49. 49. Фармацевтический состав по любому из пп.44-48 для использования при стимулировании способности к обучению и/или стимулирования памяти субъекта, содержащий пептид в количестве, достаточном для эффективного воздействия, и необязательно одну или большее число фармацевтически приемлемых добавок или носителей.
50. 50. Фармацевтический состав по п.49 для перорального, подкожного, внутримышечного, внутричерепного, внутрижелудочкового, интраназального или внутрилегочного введения.

    - 29 006230
51. 51. Применение по п.39, отличающееся тем, что содержит пептид, соответствующий участку Ι§ 1 домена АМНК, а заболевание включает послеоперационное поражение нервов, травматическое поражение нервов, нарушенную миелинизацию нервных волокон, послеишемическое нарушение, например, в результате инфаркта, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, другие деменции, включая мультиинфарктную деменцию, склероз, дегенерацию нервов, связанную с сахарным диабетом, нарушениями, влияющими на циркадный ритм или передачу сигналов между нейронами и мышечной тканью, шизофрению; патологию мышечной ткани, включая состояния с нарушенными функциями нервно-мышечных связей, что обусловлено генетическими или атрофическими нарушениями и повреждениями мышечной ткани в результате травмы; дегенеративные состояния половых желез, дегенеративные состояния поджелудочной железы, включающие сахарный диабет 1-го и 2-го типов, дегенеративные состояния почек типа нефротического синдрома и дегенеративные состояния сердечной мышцы, печени или кишечника.
52. 52. Применение по п.39, отличающееся тем, что содержит пептид, соответствующий участку Ι§2 домена АМНК, а заболевание включает послеоперационное поражение нервов, травматическое поражение нервов, нарушенную миелинизацию нервных волокон, послеишемическое нарушение, например, в результате инфаркта, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, другие деменции, включая мультиинфарктную деменцию, склероз, дегенерацию нервов, связанную с сахарным диабетом, нарушениями, влияющими на циркадный ритм или передачу сигналов между нейронами и мышечной тканью, шизофрению; патологию мышечной ткани, включая состояния с нарушенными функциями нервно-мышечных связей, что обусловлено генетическими или атрофическими повреждениями мышечной ткани в результате травмы; дегенеративные состояния половых желез; дегенеративные состояния поджелудочной железы, включающие сахарный диабет 1-го и 2-го типов, дегенеративные состояния почек типа нефротического синдрома и дегенеративные состояния сердечной мышцы, печени или кишечника.