KR100715816B1

KR100715816B1 - 가물치 피부 조직 유래 신경성 펩티드 및 그 유사체

Info

Publication number: KR100715816B1
Application number: KR1020060022218A
Authority: KR
Inventors: 박남규; 고혜진; 홍용기; 김형락; 장영채
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2006-03-09
Filing date: 2006-03-09
Publication date: 2007-05-08

Abstract

본 발명은 가물치 (Ophicephalus argus) 피부 조직 유래 신경성 펩티드 (neuropeptide) 및 그 유사체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 평활근 수축활성 신경성 펩티드(SHFS), 서열번호 1의 N-말단 아미노산이 제거된 펩티드 및 서열번호 1의 2번째 잔기 또는 5번째 잔기가 치환된 펩티드 유사체에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 보양식품으로 많이 이용되고 있는 가물치의 피부 조직 유래 새로운 신경성 펩티드 (SHFS)는 별불가사리 DRM (dorsal retractor muscle)에 대한 수축반응을 나타내고, 그 크기가 작아 화학적 합성에도 적합하며, 대량생산이 용이하므로 의약 및 생물산업에 있어 신약 개발의 선도 물질 및 후보물질로서 유용하다.

가물치 피부 조직, 신경성 펩티드(SHFS), 유사체

Description

가물치 피부 조직 유래 신경성 펩티드 및 그 유사체 {A Novel Neuropeptide Originated from the Skin of Ophicephalus argus and Analogues Thereof}

도 1은 Sep-Pak C₁₈ 카트리지에 의하여 분리된 4가지 분획의 별불가사리 DRM (dorsal retractor muscle) (A)와 금붕어 장관 (B)에 대한 수축활성 효과를 나타낸 그래프이다. 여기서, D. W.는 0.1 % TFA가 포함된 H₂O, RM 10은 10 % MeOH, RM 60은 60 % MeOH, 및 RM 100은 100 % MeOH로 가물치로부터 추출된 물질을 각각 용출시켜 수축활성을 확인한 것이다.

도 2는 RM 60의 역상 HPLC 크로마토그래피와 별불가사리 DRM에 대한 수축활성을 나타낸 그래프로, 흑색 bar(■)는 활성분획을 나타낸 것이다.

도 3은 도 2의 활성분획의 양이온 HPLC 크로마토그래피와 별불가사리 DRM에 대한 수축활성을 나타낸 그래프로, 흑색 bar(■)는 활성분획을 나타낸 것이다.

도 4는 도 3의 활성분획의 음이온 HPLC 크로마토그래피와 별불가사리 DRM에 대한 수축활성을 나타낸 그래프로, ↓표는 활성분획을 나타낸 것이다.

도 5는 도 4의 활성분획의 분자량 HPLC 크로마토그래피와 별불가사리 DRM에 대한 수축활성을 나타낸 그래프로, ↓표는 활성분획을 나타낸 것이다.

도 6은 도 5의 활성분획의 마지막 정제단계의 역상 크로마토그래피 (A), 별불가사리 DRM에 대한 수축활성 (B) 및 활성 피크의 MALDI-TOF Mass 결과 (C)를 나타낸 그래프이다.

도 7은 PALAL-OH (●)와 PALAL-NH₂ (□)의 별불가사리 DRM에 대한 농도-의존적 수축활성 측정결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 PALAL-OH (●), PALAL-OH의 N-말단 아미노산이 제거된 유도체들인 ALAL (▽), LAL (■), AL (◇)의 별불가사리 DRM에 대한 농도-의존적 수축활성 측정결과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 PALAL-OH (●), PALAL-OH의 C-말단 아미노산이 제거된 유도체들인 PALA (▽), PAL (■), PA (◇)의 별불가사리 DRM에 대한 농도-의존적 수축활성 측정결과를 나타낸 그래프이다.

도 10은 PALAL-OH (●), PALAL에서 2번째 잔기가 치환된 유도체들인 PSLAL (▽), PTLAL (■), PYLAL (◇)의 별불가사리 DRM에 대한 농도-의존적 수축활성 측정결과를 나타낸 그래프이다.

도 11은 PALAL-OH (●), PALAL에서 5번째 잔기가 치환된 유도체들인 PALAY (◆), PALAV (○), PALAR (◇), PALAM (▽), PALAI (▼), PALAF (□), PALAT (■)의 별불가사리 DRM에 대한 농도-의존적 수축활성 측정결과를 나타낸 그래프이다.

신경전달물질은 일반적으로 아미노산계, 아민계 그리고 펩티드계의 물질들로 나누어진다. 첫 번째로 아미노산계는 절후신경 목적 세포막(postsynaptic target cell membrane)내의 이온채널을 활성화시키기 위해 그들의 수용체(receptor)와 결합하여 이들 절후신경 세포(postsynaptic cell)에 대해 빠른 촉진 또는 억제작용 역할을 한다. 두 번째로 아민계는 작용 수용체와 결합하여 목적 세포(target cell)의 세포질 (cytoplasm)에서 2차 메신저 (second messenger)등 일련의 화학적 변화를 활성화시켜 막전위(membrane potential)에 있어서 단기변화 (short-term change) 또는 세포구조에 있어서 장기변화 (long-term change)를 나타내는 역할을 하는 것으로 알려졌으나, 펩티드계는 아직 그 활성 기작이 명확히 증명되지 않았다.

신경성 펩티드는 뉴런으로부터 분비되는 신호분자 (signalling molecular)로 보통 4~30개 정도의 아미노산으로 구성된 물질이다. 이들은 중추신경계와 말초신 경계에 넓게 분포하며, 일반적으로 생체 내에서 호르몬 또는 비-호르몬으로서 평활근의 운동조절, 혈관 수축 및 이완, 통증전달 및 혈압조절 등의 역할을 담당하는 신경조절물질(neuromodulator) 및 신경전달물질(neurotransmitter)이다. 이들 신경성 펩티드는 신경조직에만 국한되지 않고, 내분비세포(endocrine cell)에서도 종종 동일하거나 유사한 분자들이 발현되며, 호르몬으로 작용하는 곳으로 분비된다.

한편, 1962년 낙지의 타액선으로부터 엘레도이신(eledoisin)이 발견된 이후, 신경계를 가진 모든 생물의 조직으로부터 많은 신경성 펩티드가 정제되었다. 이러한 신경성 펩티드는 아데노히포피시알 호르몬(adenohypophysial hormones)의 분비를 조절하는 호르몬 (hypothalamic releasing peptides), 뇌하수체후엽 호르몬 (neurohypophysial peptides), 아데노히포피시알 펩티드 (adenohypophysial peptides), 진통성 펩티드 (opioid peptides), 위장관계 펩티드 (gastrointesinal peptides), 성장인자 (growth factor)로 나누어지며, 이들은 척추동물 및 무척추동물에서 광범위하게 분리되어 종들 간의 상관관계와 진화과정에 관한 정보를 제공하고 있다. 현재 생체 내 존재하는 신경성 펩티드의 정확한 수는 밝혀져 있지 않으나, 외부자극에 대한 체외나 체내의 변화 정보를 어떤 특정한 기관에 전달하는 신경계에는 수많은 신경성 펩티드들이 존재한다고 알려져 있다.

가물치 (Ophicephalus argus)는 농어목 (Perciformes)에 속하는 경골어류로서, 우리나라 전 지역의 민물계에 널리 분포하고 있으며, 옛날부터 피로회복 및 산 부의 보혈약 등으로 이용되어 오고 있다. 가물치에 대한 종래의 연구는 가물치 어육의 단백질 및 아미노산 조성에 관한 연구와 정미성분 분석에 관한 연구로 이루어졌으며, 생체 내에 존재하는 신경성 펩티드에 관한 연구는 전무한 실정이었다.

이에 본 발명자는 담수어인 가물치를 대상으로 평활근 수축활성을 가지는 새로운 신경성 펩티드를 정제하여 제공하고자 노력하였으며, 그 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 담수어인 가물치 (Ophicephalus argus) 피부 조직 유래 평활근 수축활성을 가지는 새로운 신경성 펩티드 및 그 유사체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신경성 펩티드를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩티드; (b) 서열번호 1의 펩티드에서 1개의 N-말단 아미노산이 제거된 펩티드; (c) 서열번호 1의 2번째 잔기가 Ser, Thr 및 Tyr으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산으로 치환된 펩티드; 및 (d) 서열번호 1의 5번째 잔기가 Val, Ile, Met, Tyr으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산으로 치환된 펩티드로 구성된 군에서 선택된 평활근 수축활성을 가지는 신경성 펩티드를 제공한다. 상기 펩티드의 아미노산은 L-타입의 아미노산 또는 D-타입의 아미노산 어느 것이든 무방하게 본 발명의 요지에 따라 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 가물치 피부 조직으로부터 산 추출물을 수득한 다음, 이를 크로마토그래피에 통과시키는 것을 특징으로 하는 제1항의 펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 구성에 대해 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 있어, 표 1에 기재된 신경성 펩티드는 실시예 1에서 구체적으로 기재된 바와 같이 담수어인 가물치 (Ophicephalus argus)로부터 산 추출물을 얻고, 상기 추출물을 Sep-Pak C₁₈ 칼럼으로 조정제한 후, HPLC 시스템을 거침으로써 분리하였다.

상기 분리된 펩티드는 이완활성을 갖는 새로운 신경성 펩티드로 상기 HPLC 시스템을 거친 후, 아미노산 서열은 "MALDI-TOF mass spectrometer (Voyager-DE^TM STR spectrometer, Perseptive Biosystems, U.S.A.)" 및 "automated protein sequencer PPSQ-21A (Shimadzu, Ltd., Japan)"를 통해 표 1과 같이 결정되었다.

표 1에서 나타난 펩티드의 별불가사리 DRM (dorsal retractor muscle) 에 대한 수축활성을 측정한 결과, 펩티드의 C-말단이 자유로운(free) 형태인 PALAL-OH가 아미드화된 형태인 PALAL-NH₂보다 강한 수축활성을 확인할 수 있었다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

또한, 하기 실시예에서 상기 펩티드를 유효성분으로 하는 약학 조성물에 대해 기술하고 있지 않으나, 본 발명의 요지에 따라 상기 펩티드를 유효성분으로 하는 약학 조성물을 제조할 수 있음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

실시예 1: 가물치 피부조직 유래 평활근 수축활성을 가지는 새로운 신경성 펩티드의 분리

1-1: 실험동물

실험에 사용한 가물치 (Ophicephalus argus, 체장 50 - 70 cm)는 2002년 5월에 부산광역시 부전시장에서 구입하였고, 살아있는 상태의 가물치로부터 피부조직을 분리한 후, 액체 질소로 급속 동결시켜 실험에 사용하기 전까지 -75 ℃에서 보관하였다.

1-2: 가물치 피부 조직으로부터 평활근 수축활성을 가지는 펩티드의 추출

동결 보관한 가물치 피부조직 2.58 Kg을 12 L의 끓는 물에 10~15 분간 끓인 후, 냉각시켰다. 이에 5 % 초산용액을 첨가한 후, 블랜더 (Warning Heavy Duty Laboratory Blender, New Hartford, CONN., U.S.A.)로 조직을 파쇄한 뒤, 시료를 실온에서 30분 동안 10,000×g의 조건으로 원심분리하였다. 침전물은 다시 한 번 2.5 L의 5 % 초산용액을 첨가한 후, 균질기(homogenizer)로 파쇄하여 처음과 같은 조건으로 원심분리하였다. 상층액을 처음 분리한 상층액과 함께 농축시킨 다음, 시료:EtOH = 1:5 (v/v)의 비율로 에탄올을 첨가한 후, 4 ℃에서 15분 동안 8,000×g조건으로 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 그리고 상층액을 농축하여 시료:acetonitrile = 1:3 (v/v)의 비율로 아세토나이트릴(acetonitrile)을 첨가한 후, 4 ℃에서 20분 동안 10,000×g 조건으로 원심분리하여 침전물을 제거하였다.

얻어진 상층액에 시료:EtOH = 1:5 (v/v)의 비율로 에탄올을 첨가한 후, 4 ℃에서 20분 동안 10,000×g 조건으로 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상층액을 농축한 뒤, 시료:EtOH = 1:5 (v/v)의 비율로 에탄올을 첨가한 후, 4 ℃에서 20분 동안 10,000×g 조건으로 원심분리하여 얻어진 상층액을 농축하였다.

상기 농축액에서 부분적으로 물질을 분리하기 위해, 농축된 상층액을 Sep-Pak C₁₈ 카트리지(cartridge)에 주입하였다. 우선 Sep-Pak C₁₈ 칼럼을 0.1 % TFA (trifluoroacetic acid)가 포함된 100 % 메탄올로 활성화시킨 후, 0.1 % TFA가 포함된 H₂O로 충분히 평형화하였다. 충분히 평형화시킨 Sep-Pak C₁₈ 칼럼에 시료를 주입하여 0.1 % TFA가 포함된 H₂O (D. W.), 10 % MeOH (RM 10), 60 % MeOH (RM 60)과 100 % MeOH (RM 100)로 상기 농축액에서 물질들을 각각 용출시켰으며, 각 분획 의 1/500에 해당하는 양을 사용하여 별불가사리 DRM (dorsal retractor muscle)과 금붕어 장관에 대해 수축활성을 측정하였다 (도 1).

신경성 펩티드의 분리 및 정제

상기 가물치 피부조직 추출물 중 평활근 수축활성을 나타낸 60% MeOH 추출물을 하기와 같이 HPLC 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제하였다. 이때, 각 단계에서는 하기에 설명된 펩티드의 평활근 수축활성 측정방법에 따라 수축활성이 나타난 분획들을 분리하였으며, 활성이 나타난 분획들을 농축하여 다음 단계의 공정에 사용하였다.

C ₁₈ column 을 이용한 분리

가물치 피부조직 추출물 중 평활근 수축활성을 나타낸 RM 60을 역상 HPLC 칼럼 (Capcellpak C₁₈ _,10×250 mm)을 적용하여 다음과 같은 조건으로 분리하였다: A용매, 0.1 % TFA 수용액 (pH 2.2); B용매로서 0.1 % TFA를 포함한 100 % 아세토나이트릴 (pH 2.2); 농도구배, 0 → 100 % (100 min)의 B 용매; 유속, 2.0 mL/min; 온도, 40℃ (도 2). 도 2에서 흑색 bar(■)는 활성분획을 나타낸 것이다

양이온 교환 HPLC 를 이용한 분리

도 2의 활성분획을 모아 양이온 교환 칼럼인 TSK-gel SP-5PW (7.5×75 mm) 칼럼을 사용하여 다음과 같은 분리조건으로 정제하였다: A 용매, 10 mM Phosphate buffer (pH 6.5); B 용매, 1.0 M NaCl을 포함하는 10 mM의 phosphate buffer (pH 6.5); 농도구배, 0 → 0.7 M B용매 (70 min), 유속; 1.0 mL/min, 온도; 40 ℃; 분획량 (fraction volume), 2.0 mL (도 3). 도 3에서 흑색 bar(■)는 활성분획을 나타낸 것이다.

음이온 교환 HPLC 를 이용한 분리

도 3의 활성분획을 모아 음이온 교환 칼럼인 TSK-gel DEAE-5PW (7.5×75 mm) 칼럼을 사용하여 다음과 같은 분리조건으로 정제하였다: A 용매, 10 mM의 Tris-HCl buffer (pH 9.7); B 용매, 1.0 M NaCl을 포함하는 10 mM의 Tris-HCl buffer (pH 9.7); 농도구배, 0 → 0.5 M B용매 (50 min), 유속; 1.0 mL/min, 온도; 40 ℃ (도 4). 도 4에서 흑색 bar(■)는 활성분획을 나타낸 것이다.

Size exclusion column을 이용한 분리

도 4의 활성분획을 분자량 크기에 따라 분리하기 위해 Superdex Peptide HR 10/30 (10×300 mm) 칼럼을 이용하여 0.1 % TFA를 포함하는 30 % 아세토나이트릴 (acetonitrile) 조건에서 0.5 mL/min의 유속으로 분리를 행하였다. 평활근 수축활성을 측정한 결과, 화살표(↓)로 지시된 분획에서 수축활성을 확인하였다 (도 5).

신경성 펩티드의 최종정제

도 5의 활성분획을 최종적으로 19 % 아세토나이트릴의 아이소크래틱 (isocratic) 조건에서 218TP54 protein & peptide C₁₈(4.6×250 mm) 칼럼을 이용하여 정제하였다. 그 결과, 19.6분의 머무름 시간 (retention time, RT)을 가지는 하나의 순수한 물질을 최종 정제하였으며, 이 물질을 가물치 피부조직(SnakeHead Fish Skin)의 추출물로부터 정제하였으므로 편의상 SHFS (SnakeHead Fish skin)라고 명명하였다 (도 6).

천연 펩티드의 분자량 측정 및 아미노산 서열 결정

가물치 피부조직으로부터 정제한 별불가사리 DRM에 대한 수축활성을 가지는 펩티드의 분자량은 MALDI-TOF mass spectrometer (Voyager-DE^TM STR spectrometer, Perseptive Biosystems, U.S.A.)를 사용하여 측정하였다. 가물치 피부조직으로부터 정제한 펩티드의 아미노산 서열은 한국기초과학지원연구원의 ProcisecLC Sequencing System Model 492 cLC (Apply Biosystem, Foster city, CA, U.S.A.)를 사용하여 에드만(Edman) 분해법으로 분석하였다.

최종 정제한 서열번호 1 (SHFS)의 분자량은 484.7 Da이었고 (도 6C), 상기 펩티드의 일차 구조는 5개의 아미노산으로 구성된 펜타펩티드(pentapeptide)임을 확인하였다.

서열번호 1 : Pro-Ala-Leu-Ala-Leu

아미노산 서열분석기를 통한 아미노산서열 및 질량측정기를 통한 질량조사

사이클수	Phenylthiohydantion amino acid	m/z
1	Pro	484.7
2	Ala
3	Leu
4	Ala
5	Leu

기존에 알려진 신경성 펩티드와 본 발명의 펜타펩티드의 아미노산 서열의 유사성을 조사한 결과, 정제한 펩티드는 기존에 알려진 신경성 펩티드와 유사성을 갖지 않는 새로운 신경성 펩티드임을 확인하였다.

실시예 2: 펩티드의 합성 및 정제

펩티드의 합성

아미노산 서열분석과 분자량 분석결과에 따라, 실시예 1에서 정제한 신경성 펩티드(SHFS)와 동일한 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 Fmoc-법을 이용한 고상법으로 합성하였다 (Park, N.G., et. al., Bull. Korean Chem. Soc., 18:50, 1997). C-말단의 아미노산이 아미드화된 형태의 펩티드를 합성하기 위해 Fmoc-NH₂-PAL-resin (0.55mmole/g, Advanced Chem. Teck사, Louisville KY, USA)을, C-말단 아미노산이 자유로운(free한) 경우는 Fmoc-C말단 아미노산-Wang-resin을 각각 0.05 mmole 스케일(scale)로 사용하였다.

DMF로 수지 (resin)를 팽윤 (swelling) 시킨 후, 20 % piperidine/DMF를 이용하여 수지로부터 Fmoc-보호기를 절단시킨 다음, DIPCI (N,N'-diisopropylcarbodiimide)/HOBT (N-Hydroxybenzotriazole)을 이용하여 결합시키고자 하는 아미노산의 카르복실기를 에스테르 형태로 활성화시킨 후, 이를 Fmoc-아미노산 복합체와 반응시켰다. 첫 번째 반응이 완료된 수지는 DMF (dimetylformamide)로 세정하고, 다시 20 % piperidine/DMF로 첫 번째로 도입된 아미노산의 Fmoc-기를 절단하였다. 반응 후, DMF로 세정하고 두 번째 아미노산을 DIPCI/HOBT법으로 결합을 시켰다. 이와 같은 과정을 순차적으로 반복하여, 완전한 펩티드 사슬을 수지에 성장시켰다.

펩티드-수지의 절단과 보호기의 제거

합성 펩티드에 연결된 수지와 측쇄 (side chain)의 보호기를 제거하기 위해 절단시약 [TFA (5 mL): m-cresol (0.6 mL): thioanisole (1.7 mL): EDT (1,2-ethaneditiol) (0.9 mL)]을 상기 펩티드-수지 복합체에 사용하여 실온에서 90 분간 반응시켰다. 반응 후, 수지를 여과한 다음, 펩티드 용액을 진공 농축하였고, 농축액을 15 mL 튜브에 옮긴 후, 냉각된 에테르를 첨가하여 펩티드를 결정화하였다. 에테르혼합액을 원심분리한 뒤, 에테르층에 녹아있는 절단시약을 충분히 제거시켰다. 건조기에 남아있던 에테르를 완전히 휘발시킨 후, 5 % 초산용액으로 녹여 동결건조시켰다.

합성 펩티드의 정제

수지로부터 미정제 (crude) 펩티드들은 218TP510 Protein & peptide C₁₈ (9.2×250 mm)을 사용하여, 유속 3.0 mL/min으로 정제하였다. 0.1 % TFA가 포함된 아세토나이트릴을 5 → 65 %로 농도 구배를 주어 60분 동안 유속 3.0 mL/min의 조건으로 분리하였다.

천연물과 합성물의 비교

정제한 천연물과 합성물의 동일성은, 분자량 측정과 역상 (reverse-phase) 및 양이온-교환 (cation-exchange) HPLC 칼럼을 이용한 머무름시간 (retention time,RT)의 비교로 확인하였다. 정제한 천연물 SHFS (N)과 C-말단 아미노산이 free한 -OH 형태 (PALAL-OH (S))를 각각 218TP54 protein & peptide C₁₈column에 각각 19 % CH₃CN의 아이소크래틱 조건에서 0.5 mL/min의 유속으로 용출시켜 비교하였다.

또한, 천연물과 합성물의 동일성은, SP-5PW (7.5×75 mm) 칼럼을 사용하여 다음과 같은 조건으로 용출시켜 비교하였다: A 용매, 10 mM의 PBS 버퍼 (pH 6.5); B 용매, 1.0 M NaCl을 포함하는 10 mM의 PBS (pH 6.5); gradient, 0 → 0.3 M B 용매 (30 min); 유속, 1.0 mL/min; 온도, 40 ℃. 그 결과, 천연물 펩티드와 합성 펩티드인 PALAL-OH는 같은 시간에 용출되었으며, 상기 결과로부터 두 펩티드가 같은 화학적 성분을 가진다는 것을 확인하였다.

실시예 3: 유사체들의 디자인

가물치 피부조직으로부터 정제한 펩티드 SHFS (SnakeHead Fish skin, PALAL)의 정확한 일차구조를 조사하기 위해 C-말단의 아미노산이 아미드화된 PALAL-NH₂ 타입과 free한 상태인 PALAL-OH 타입을 합성하였다. 또한 SHFS의 구조와 평활근 수축활성 사이의 상관관계를 밝히기 위해, N-말단 아미노산이 순차적으로 제거된 ALAL-OH, LAL-OH 및 AL-OH의 SHFS 유도체, C-말단 아미노산이 순차적으로 제거된 PALA-OH, PAL-OH 및 PA-OH의 SHFS 유도체 및 PALAL-OH의 2번 또는 5번 잔기를 성질이 다른 아미노산으로 치환한 32종류의 SHFS 유도체를 합성하였다. 이러한 유도체들은 표 2에 나타내었다.

SHFS와 그 유사체들의 일차구조

Peptides	Sequences
SHFS	P-A-L-A-L-OH
SHFS-amide	P-A-L-A-L-NH2
N-terminal deleted analogs
Des[Pro1]SHFS	A-L-A-L
Des[Pro1-Ala2]SHFS	L-A-L
Des[Pro1-Leu3]SHFS	A-L
C-terminal deleted analogs
Des[Leu5]SHFS	P-A-L-A
Des[Ala4-Leu5]SHFS	P-A-L
Des[Leu3-Leu5]SHFS	P-A
PXLAL analogs
[D-Ala2]SHFS	P-D-A-L-A-L-OH
[Gly2]SHFS	P-G-L-A-L-OH
[Pro2]SHFS	P-P-L-A-L-OH
[Val2]SHFS	P-V-L-A-L-OH
[Ile2]SHFS	P-I-L-A-L-OH
[Met2]SHFS	P-M-L-A-L-OH
[Ser2]SHFS	P-S-L-A-L-OH
[Thr2]SHFS	P-T-L-A-L-OH
[Asn2]SHFS	P-N-L-A-L-OH
[Gln2]SHFS	P-Q-L-A-L-OH
[Phe2]SHFS	P-F-L-A-L-OH
[Tyr2]SHFS	P-Y-L-A-L-OH
[Trp2]SHFS	P-W-L-A-L-OH
[Lys2]SHFS	P-K-L-A-L-OH
[Arg2]SHFS	P-R-L-A-L-OH
[Asp2]SHFS	P-D-L-A-L-OH
[Glu2]SHFS	P-E-L-A-L-OH
PALAX analogs
[Gly5]SHFS	P-A-L-A-G-OH
[Pro5]SHFS	P-A-L-A-P-OH
[Val5]SHFS	P-A-L-A-V-OH
[Ile5]SHFS	P-A-L-A-I-OH
[Met5]SHFS	P-A-L-A-M-OH
[Ser5]SHFS	P-A-L-A-S-OH
[Thr5]SHFS	P-A-L-A-T-OH
[Asn5]SHFS	P-A-L-A-N-OH
[Gln5]SHFS	P-A-L-A-Q-OH
[Phe5]SHFS	P-A-L-A-F-OH
[Tyr5]SHFS	P-A-L-A-Y-OH
[Trp5]SHFS	P-A-L-A-W-OH
[Lys5]SHFS	P-A-L-A-K-OH
[Arg5]SHFS	P-A-L-A-R-OH
[Asp5]SHFS	P-A-L-A-D-OH
[Glu5]SHFS	P-A-L-A-E-OH

실시예 4: 별불가사리 DRM에 대한 수축활성 측정

가물치 피부조직 유래 추출물, HPLC 정제단계에서 얻은 분획 및 합성유도체들의 평활근 수축활성을 측정하기 위해, 별불가사리 (Asterina pectinifera) DRM (dorsal retractor muscle)을 사용하였다.

별불가사리의 아이스팟 (eye spot)을 제거한 후, 배면과 복면을 분리하였고, 상기 배면을 뒤집으면 5개 팔을 따라 중앙을 가로지르는 DRM이 있는데, 본 발명의 활성시험에 대한 표본을 만들기 위해서 상기 DRM 근육(muscle)을 메스로 분리한 후, 20 mm정도의 단편으로 만들었다. 모든 과정은 인공해수 (55 mM Mg²⁺, artificial sea water, ASW)하에서 행하였으며, 조성은 다음과 같다: NaCl 445 mM, KCl 10 mM, CaCl₂2H₂O 10 mM, MgCl₂6H₂O 55 mM, Glucose 10 mM 및 Tris-HCl 20 mM (pH 7.8).

준비된 DRM을 반응조 내의 지지대에 고정시키고, 위쪽은 아이소메트릭 트랜스듀서 (isometric transducer)에 연결한 뒤, 연결된 조직에 1.0×g의 장력을 가하였다. 상기 DRM 조직을 실온에서 15분 간격으로 인공해수 (55 mM Mg²⁺ artificial sea water)를 교체하며 휴지장력(resting tension)이 1.0×g가 되도록 30분간 평형화시킨후, 5×10^-7 M의 아세틸콜린을 투여하여 활성화시킨 후, 각 HPLC 정제단계에서 얻은 분획들 및 합성 펩티드를 투여하였다. 모든 과정은 인공 해수 하에서 행하였으며, 조성은 다음과 같다: NaCl 445 mM, KCl 10 mM, CaCl₂2H₂O 10 mM, MgCl₂6H₂O 55 mM, Glucose 10 mM 및 Tris-HCl 20 mM (pH 7.8). 시료들을 주입한 후, 수축활성을 측정하여 피지오그래프 (physiograph)상에 기록하였다.

수축활성은 5×10^-7 M 아세틸콜린의 최대수축에 대한 상대적 수축 %로 나타냈으며, 반응의 크기는 ED₅₀(최고 수축의 50 %를 나타낼 때의 농도) 및 E_max (10^-5M에서의 수축 %) 값을 비교하여 결정하였다. ED₅₀값은 최소제곱법(least square method)으로 계산하였으며, 통계적 처리는 스튜던트의 t검정 (student's t-test)을 이용하였으며, 모든 반응 값은 means± s.e.로 표시하였다.

그 결과, 도 7과 표 3에서 나타낸 바와 같이, 정제한 PALAL-OH는 10^-8M에서 0.41 %의 역치값을 나타냈으며, 10^-5M에서 294.8±45.4 %의 최대수축효과를 나타내었으며, ED₅₀값은 9.8×10^-7M이었다. 또한 PALAL-NH₂는 10^-5M에서도 수축활성을 나타내지 않았다.

도 8에서 나타난 바와 같이, PALAL-OH의 N-말단 아미노산이 순차적으로 제거된 유도체 중 ALAL-OH은 10^-8M에서 4.27 %의 역치값과 2.79×10^-7 M의 ED₅₀값을 나타내었다. ALAL-OH의 역치값 및 ED₅₀값은 PALAL-OH와 유사한 값을 가졌으나, 최대 수축활성에 있어서 10^-5 M에서 PALAL-OH의 최대수축활성보다 약한 184.90±21.30 %의 수축활성을 나타내었다. 반면, LAL-OH, AL-OH은 10^-5 M에서조차 전혀 수축반응을 나타내지 않았다.

PALAL-OH의 N-말단 아미노산을 순차적으로 제거할수록 역치농도에 있어서 현저한 차이를 나타냈으며, 수축활성은 크게 감소하였다. 상기 유도체의 수축활성 세기는 다음과 같다: PALAL-OH ≥ ALAL-OH ≫ LAL-OH, AL-OH (표 3).

또한, 도 9에서 나타난 바와 같이, C-말단 아미노산이 순차적으로 제거된 유도체 PALA-OH, PAL-OH 및 PA-OH는 모두 10^-5M에서도 별불가사리 DRM에 대해 수축활성을 전혀 나타내지 않았으며, 상기 유도체의 수축활성 세기는 다음과 같다: PALAL-OH ≫ PALA-OH, PAL-OH, PA-OH (표 3).

PALAL 및 그 유도체들의 별불가사리 DRM에 대한 수축활성 세기

	DRM
	TC (M)	ED50 (M)	Emax (%)
PALAL-OH	10-8	9.8×10-7	294.8±45.4
PALAL-NH2	NA*	NA	NA

N-terminal analogs
ALAL-OH	10-8	5.58×10-7	184.90±21.30
LAL-OH	NA	NA	NA
AL-OH	NA	NA	NA

C-terminal analogs
PALA-OH	NA	NA	NA
PAL-OH	NA	NA	NA
PA-OH	NA	NA	NA

*NA; no activity, TC; 필요 역치농도, ED₅₀; 최고수축의 50 %의 활성을 나타내는 농도, E_max; 최고수축활성

도 10에서 별불가사리 DRM에 대한 PALAL의 2번째 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 유도체들(PXLAL)의 수축활성을 농도의존곡선으로 나타내었으며, 이들의 활성 측정 결과는 표 4에 나타내었다. PSLAL-OH의 경우 10^-6M에서 18.11 %의 역치값을 나타내었으며, 10^-5 M에서 113.79±25.80 %의 활성을 나타내었고, ED₅₀값은 3.73×10^-5 M이었다. PTLAL-OH은 10^-6M에서 2.23 %의 역치값을 나타내었으며, 10^-5 M에서 15.56±15.5 %의 활성을 나타내었고, ED₅₀값은 4.31×10^-5 M이었다. PYLAL-OH는 10^-5 M에서 2.38±2.3 %의 수축활성을 보였으나, 활성을 보인 세 종류의 유도체 역치농도에 있어서 모두 PALAL-OH보다 약 100배 이상의 농도에서 약한 활성을 보였으나, 그 외 다른 유도체들은 별불가사리 DRM에 대해 활성을 나타내지 않았다.

PALAL 및 PXLAL 유도체들의 별불가사리 DRM에 대한 수축활성 세기

	DRM
	TC (M)	ED50 (M)	Emax (%)
PALAL-OH	10-8	9.8×10-7	294.8±45.4
PDALAL-OH	NA*	NA	NA
PGLAL-OH	NA	NA	NA
PPLAL-OH	NA	NA	NA
PVLAL-OH	NA	NA	NA
PILAL-OH	NA	NA	NA
PMLAL-OH	NA	NA	NA
PSLAL-OH	10-6	3.73×10-5	113.79±25.80
PTLAL-OH	10-6	4.31×10-5	15.56±15.56
PNLAL-OH	NA	NA	NA
PQLAL-OH	NA	NA	NA
PFLAL-OH	NA	NA	NA
PYLAL-OH	10-5	-	2.38±2.38
PWLAL-OH	NA	NA	NA
PKLAL-OH	NA	NA	NA
PRLAL-OH	NA	NA	NA
PDLAL-OH	NA	NA	NA
PELAL-OH	NA	NA	NA

도 11에서 나타난 바와 같이, PALAL의 5번째 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 유도체들(PALAX)의 수축활성을 농도의존곡선으로 나타내었으며, 이들의 활성 측정 결과는 표 5에 나타내었다. PALAX들의 농도의존곡선 및 수축활성 측정결과, PALAY-OH의 경우 10^-8M에서 2.13 %의 역치값을 나타내었으며, 10^-5 M에서 219.46±46.24 %의 활성을 나타내었고, ED₅₀값은 7.45×10^-6 M이었다. PALAL-OH의 농도의존곡선과 비교해 볼 때, PALAY는 별불가사리 DRM에 대해 PALAL-OH와 유사한 수축활성을 나타내었다. PALAR-OH은 10^-7M에서 19.94 %의 역치값을 나타내었으며, 10^-5 M에서 265.12±38.29 %의 활성을 나타내었고, ED₅₀값은 7.05×10^-6 M이었다.

PALAV-OH는 10^-6 M에서 24.63 %의 역치값을 나타내었으며, 10^-5 M에서 211.89±43.3 %의 수축활성과 ED₅₀값은 4.81×10^-5 M이었다. PALAI-OH는 10^-6 M에서 4.79 %의 역치값을 나타내었으며, 10^-5 M에서 70.44±15.35 %의 수축활성과 ED₅₀값은 4.42×10^-5 M이었다. PALAM-OH는 10^-6 M에서 4.07 %의 역치값을 나타내었으며, 10^-5 M에서 219.46±25.75 %의 수축활성과 ED₅₀값은 2.50×10^-5 M이었다. 그러나, 그 외 다른 유도체들은 수축활성을 나타내지 않았다.

	DRM
	TC (M)	ED50 (M)	Emax (%)
PALAL-OH	10-8	9.8×10-7	294.8±45.4
PALAG-OH	NA*	NA	NA
PALAV-OH	10-6	4.81×10-5	211.89±43.28
PALAI-OH	10-6	4.42×10-5	70.44±15.35
PALAM-OH	10-7	2.50×10-5	219.46±25.75
PALAS-OH	NA	NA	NA
PALAT-OH	10-5	-	6.98±1.79
PALAN-OH	NA	NA	NA
PALAQ-OH	NA	NA	NA
PALAF-OH	10-6	-	50.25±13.54
PALAY-OH	10-8	7.45×10-6	219.46±46.24
PALAW-OH	NA	NA	NA
PALAK-OH	NA	NA	NA
PALAR-OH	10-7	7.05×10-6	265.12±38.29
PALAD-OH	NA	NA	NA
PALAE-OH	NA	NA	NA

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위가 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 평활근 수축활성을 가지는 가물치 피부 조직 유래 새로운 신경성 펩티드 및 그 유사체를 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 의하면, 상기 펩티드는 보양식품으로 많이 이용되고 있는 가물치 (Ophicephalus argus)의 피부조직으로부터 분리되었고, 별불가사리 DRM에 대한 수축반응을 나타내며, 그 크기가 작아 화학적 합성에서도 적합하여 대량생산이 용이하므로 의약 및 생물 산업에 있어 신약 개발의 선도 물질 및 후보물질로서 유용할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

다음으로 구성된 군에서 선택된 평활근 수축활성을 가지는 신경성 펩티드:

(a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩티드;

(b) 서열번호 1의 펩티드에서 1개의 N-말단 아미노산이 제거된 펩티드;

(c) 서열번호 1의 2번째 잔기가 Ser, Thr 및 Tyr으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산으로 치환된 펩티드; 및

(d) 서열번호 1의 5번째 잔기가 Val, Ile, Met, Tyr으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산으로 치환된 펩티드.
가물치 피부 조직으로부터 산 추출물을 수득한 다음, 이를 크로마토그래피에 통과시키는 것을 특징으로 하는 제1항의 펩티드를 제조하는 방법.