JPH0491096A - 生理活性オリゴペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は軟体動物の筋の収縮を修飾するオリゴペプチド
に関する。さらに詳細には、本発明はコナガエン神経節
中に見出された神経ペプチドおよび該ペプチドの同族体
に関する。さらに本発明はこのようなオリゴペプチドの
製造方法および用途にも関する。

本発明のオリゴペプチドは、踊乳類動物における神経伝
達物質の放出を促進または抑制する作用を有し、生物学
や基礎医学の分野において信用な実験用試薬として利用
できるのみならず、これらペプチドをもとにして、農学
、水産学および医薬分野における有用な薬剤を開発する
ために利用できる。

（従来の技術） 哺乳類における神経伝達物質は大きく分けて、１）生体
アミン類、２）アミノ酸類、３）ペプチド類、４）プリ
ン類の４種類に分類できる。これらの神経伝達物質はシ
ナプス前部から放出されてシナプス後部へ作用し、各種
生体機能に関与している。例えば、生体アミン類に分類
される神経伝達物質セロトニンは、無を椎動物からを椎
動物にまたがる殆どの動物の神経系で重要な神経伝達物
質として働いており、特に人間の脳では極めて重要な物
質として情動などに深く関与していることが知られてい
る。従って、同物質の放出促進又は抑制、シナプス後部
への作用の促進又は抑制、同物質の生合成促進または抑
制等の観点から、種々の薬剤が開発されている。例えば
、ウワバインはセロトニンの放出を促進する薬剤であり
、ＬＳＤやクロロプロマシンはセロトニンの放出を抑制
する薬剤である。さらに、ｐ−クロルフェニルアラニン
はセロトニン生合成を阻害し、レゼルピンやテトラベナ
ジンなどは、セロトニン顆粒へのセロトニンの蓄積を阻
害して、セロトニンを放出させ、結果として神経末端部
の中のセロトニンを枯渇させる。さらに、ミアンセリン
やケタンセリンなどはセロトニンの作用を阻害する。

ところで、セロトニンの働きを修飾するものとして従来
知られている上記の物質は、いずれも非ペプチド性の化
合物であり、セロトニンの動態や作用を修飾するペプチ
ド性の物質は殆ど知られていない。ただ、軟体動物で、
ＦＭＲＦ　ａｍ　ｉ　ｄ　ｅ（Ｈ−Ｐｈｅ−Ｍｅ　ｔ−
Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２）系のペプチドがセロトニン放
出を促進することが示唆されており（京間および松浦（
Ｍｕｎｅ。

ｋａ、Ｙ、ａｎｄ　　Ｍａｔｓｕｕｒａ、Ｍ、）Ｃｏｍ
ｐ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、。

８１ｃ、６１−７０．１９８５）　、モしてイガイ抑制
性ペプチド（ＭＩＰ）類か、各種軟体動物の筋に於いて
収縮抑制効果を示すことが知られている（平田ら（Ｈｉ
ｒａｔａ、Ｔ、ｅｔ　　ａｌ、）。

Ｃｏｍｐ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈｙｓｉｏ１９３ｃ、３
８１−３８８，１９８９；特開平１２２１３９２）のみ
である。もっとも、後者はセロトニンか収縮増強効果を
示すのとは逆の作用である。

このように、神経伝達物質の修飾、特にセロトニンの放
出を抑制する生理活性ペプチドは、従来知られていなか
った。そこで、本発明者らはセロトニンを多量に有する
動物としてよく知られている軟体動物の筋肉を用いた生
物活性検定系を使って、セロトニンを中心とした神経伝
達物質の働きを制御する生理活性ペプチドを検索した。

その結果、生体アミン系やペプチド系の神経伝達物質の
働きを修飾する、Ｒ，Ｐ　ＣＨやＡＫＨと同族体の新規
オリゴペプチドおよびその誘導体を発見するに至った。

ＲＰＣＨ（赤色素胞凝集ホルモン・Ｒｅｄ　　Ｐｉｇｍ
ｅｎｔ　　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ　　Ｈｏｒｍｏ
ｎｅ）とは、１９７４年にフェルンランドによって、エ
ビから単離されたペプチド、その構造はｐＧｌｕ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−８ｅ１−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｇ　ｌ　ｙ
−Ｔ　ｒ　ｐ−ＮＨｚと決定されティる（Ｐ、Ｆｅｒｎ
ｌｕｎｄ；Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、３７エ、　　３０４　　（
１９７４））。また、ＡＫＨ（アジポカイネティックホ
ルモン：Ａｄｉｐｏｋｉｎｅｔｉｃ　　Ｈｏｒｍｏｎｅ
）は、１９７６年にストーンらによってバッタから単離
された脂肪動員ホルモンで、その構造はｐＧ　Ｉ　ｕ−
Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔ
ｒｐ−Ｇｌｙ−ＴｈｒＮＨ２と決定されている（Ｊ、Ｖ
、５ｔｏｎｅｅｔ　　ａｌ、；Ｎａｔｕｒｅ、２６３，
２０７　（１９７６））。これら２種の節足動物ホルモ
ンは、構造上明らかに同族体である。その後、この仲間
は続々と発見され、現在では合計１１種を数えている。

いずれも節足動物から発見された８個あるいはそれ以上
のアミノ酸残基からなるペプチドであり、ｐＧｌｕ’　
、Ｐｈｅ’　、Ｔｒｐ８およびＣ末端のＮＨ２はこれら
全てのペプチドに共通している。

さらに、ＲＰＣＨおよびＡＫＨの同族体が軟体動物に存
在する可能性も知られている。例えば、グリーンベルブ
らは、軟体動物前側類の心臓の活動がＲＰＣＨおよびＡ
ＫＨによって促進されること、および二枚貝の神経節の
粗抽出物がこれらホルモンに似た活性を示すことをみて
、軟体動物の神経系にもＲＰＣＨ−ＡＫＨ様のペプチド
が存在すると考えた（Ｍ、Ｊ、Ｇｒｅｅｎｂｅ　ｒｇ、
ｅｔ　　ａｌ、；Ｊ、Ｅｘｐ、Ｚｏｏｌ、、２３３゜３
３７　（１９８５））。また、斎藤および京間は、ＲＰ
ＣＨが二枚貝ムラサキイガイの足糸前牽引筋、収足筋、
心筋の収縮を修飾するが、ＡＫＨにはそのような効果が
ないことをみて、軟体動物のＲＰＣＨ−Ａ　Ｋ　Ｈ様ペ
プチドは、Ａ、ＫＨよりもＲＰＣＨに似た構造のもので
あろうと考えた（Ｓａｉｔｏｈ　　ａｎｄ　　Ｍｕｎｅ
ｏｋａ゛Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ　　Ｊ、Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、
、３５，３８９　（１９８６））。さらにサセクらは、
ＡＫＨの抗体に反応する物質がラットの脳に存在するこ
とを免疫組織化学的手法で示し、ＲＰＣＨ−ＡＫＨ様ペ
ジペプチド乳類中枢神経系にも存在することを示唆した
（Ｓａｓｅｋ、ｅｔ　　ａｌ、　；ＢｒａｉｎＲｅｓ、
、３４３，１７２　　（１９８５））、　　しかしなが
ら、今日にいたるまで、軟体動物および哺乳類からは、
どのような形のＲＰＣＨ−ＡＫＨ様ペジペプチド離され
ていない。

このように、従来、神経伝達物質の放出を制御する生理
活性ペプチドは知られていない。また、生体アミン系神
経伝達物質の放出を制御する神経ペプチドは十分に研究
されておらず、特にセロトニン放出を抑制する神経ペプ
チドは知られていない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的は、神経伝達物質の作用や機能を修飾する
生理活性ペプチド、特にセロトニンの放出を抑制する生
理活性ペプチドを提供することにある。また、本発明の
他の目的は、このペプチドの構造をもとにして、生物活
性を有する類似ペプチドを合成し、うつ病、精神分裂病
、老人性痴呆症等の各種精神疾患あるいは高血圧症、血
行障害などの循環器障害等の治療に有効な生理活性ペプ
チドを提供することにある。さらに本発明の別の目的は
、そのようなペプチドの製造方法や各種の用途を提供す
ることである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは軟体動物前側類のコナガニジの神経節の抽
出物から、この動物の歯舌牽引筋の収縮を増強するペプ
チドを単離し、その構造を決定した。この神経ペプチド
は、次のアミノ酸配列を有する。

Ｈ−Ａ　ｌ　ａ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｔ　ｒ　ｐ
−ＮＨ２以下、本明細書中でこのペプチドをＡＰＧＷａ
と表す。この表示中で最後のａはカルボキン末端アミド
を意味し、残りの大文字アルファベットはＩＵＰＡＣ−
ＬＵＢ　　Ｃｏｍｍ１ｓｓ＋ｏｎ　　。

ｎ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔ
ｕｒｅの提案によるアミノ酸の１文字記号にしたがうも
のである。本明細書中で他のペプチドも同様の１文字記
号で表す場合がある。また、アミノ酸は特に記載しない
限りＬ一体である。さらに、試薬類を含め、本明細書中
で下に示される略号が用られる場合がある。

Ｐｒｏ　（またはＰ）：Ｌ−プロリン Ｇｌｙ　（またはＧ）ニゲリシン Ａｌａ　（またはＡ）：Ｌ−アラニン Ｐｈｅ　（またはＦ）：Ｌ−フェニルアラニンＴｒｐ　
（またはＷ）：Ｌ−トリプトファンＴｒｐ（Ｆｏｒ）　
　　：Ｎ”−ホルミル−Ｌ−トリプトファン Ｂｏｃ　　：ｔ−ブチルオキシカルボニルＢＨＡ　　：
ペンズヒドリルアミン ＴＦＡ：　トリフルオロ酢酸 ＮＭＰ　　：Ｎ−メチルピロリドン ＤＣＣニジシクロへキシルカルボンイミドＨＯＢｔ：Ｎ
−ヒドロキシベンゾトリアゾールＡｃＯＨ：酢酸 ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド ＤＩＥＡニジイソプロピルエチルアミンＡＰＧＷａの構
造をＲＰＣＨ（赤色素胞凝集ホルモン、前記フェルンラ
ンド）およびＡＫＨ（脂肪動員ホルモン、前記ストーン
ら）と比較して示すと次のようになる・ ＡＰＧＷａ ）１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨ２ＰＣＨ ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨｚＫＨ ｐＧ　１　ｕ　−Ｌｅｕ　−Ａ　５ｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ
−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｇ　１ｙ−Ｔｈｒ−ＮＯ３
この比較かられかるように、ＡＰＧＷａはＲＰＣＨ−Ａ
　Ｋ　Ｈ関連ペプチドの１種である。自然界のペプチド
において、ＡｌａとＳｅｒが入れ代わっている関連ペプ
チドは多く見受けられる。これは、ＡｌａからＳｅｒへ
あるいはＳｅｔからＡｌａへの変化か点突然変異によっ
て容易に起こり得るためと思われる。そして、このよう
な変化が生じた時の２種のペプチドの間には大きな活性
の差がないのか普通である。そこで、ＡＰＧＷａのＡｌ
ａ’をＳｅｔで置換した形のペプチド（ＳＰＧＷ　ａ　
）を合成し、その活性をコナガニシ歯舌牽引筋の単一収
縮で調べた結果、これがＡＰＧＷａとほぼ同様の活性を
示すことがわかった。従って、本発明は、次式で表され
るオリゴペプチドの５ＰＧＷａにも関する。

）（−８ｅ　ｔ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｔ　ｒ　ｐ
−ＮＯ３なお、この５ＰＧＷａはＲＰＣＨのフラグメン
トペプチド（ＲＰＣＨ５−８）に相当する。ＡＰＧＷａ
と５ＰＧＷａの構造をＲＰＣＨと比較して示すと次のよ
うになる。

Ａ　Ｐ　Ｇ　Ｗ　ａ　　　　　Ｈ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨ２Ｓ　Ｐ　Ｇ　Ｗ　ａ　　　　Ｈ−
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨｚＰＣＨ ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−−Ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨｚところで、現在迄に発見され
ている節足動物のＲＰＣＨ−ＡＫＨ様ペジペプチドすべ
て４番目のアミノ酸残基としてＰｈｅを持っている。そ
こで、これら２種のペプチドのＮ末端にＰｈｅを付加し
たペプチドＦＡＰＧＷａとＦＳＰＧＷａ（これはＲＰＣ
Ｈ４−８に相当する）を合成し、その活性をコナガニジ
歯舌牽引筋の単一収縮（−回の刺激に対応する筋の収縮
）で調べたところ、共に活性を示すことがわかった。従
って、本発明は、次式で表されるオリゴペプチド Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＯ３
（Ｆ　Ａ　Ｐ　Ｇ　Ｗ　ａ　）Ｈ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨｚ　　（Ｆ　Ｓ　Ｐ　Ｇ　
Ｗ　ａ　）にも関する。

さらに、より短いオリゴペプチドも同様の生理活性を有
すると予測し、ＡＰＧＷａのＡｌａを除いたペプチドお
よびさらにＰｒｏを除いたペプチドも合成し、その活性
をフナガニン歯舌牽引筋の単一収縮で調べたところ、共
に活性を示すことがわかった。従って、本発明は次式で
表されるオリゴペプチド Ｈ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨｚ　　（Ｐ　Ｇ　Ｗ
　ａ　）Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＯ３（Ｇ　Ｗ　ａ　）
にも関する。

本発明のオリゴペプチドＡＰＧＷａ、５ＰＧＷａ、ＦＡ
ＰＧＷａＳＦＳＰＧＷａＳＰＧＷａおよびＧＷａは、す
べてコナガニジ歯舌牽引筋、ムラサキイガイ心臓、ハマ
グリ心臓において強い収縮増強活性を示し、活性濃度域
値は１０−”〜１゜−６Ｍである。なお、この生理活性
は、これらのオリゴペプチドが神経からのセロトニン放
出を抑制する性質と関連することが見いだされた。この
セロトニン放出抑制作用は、本発明の重要な主題を構成
する。

本発明のオリゴペプチドのうち、ＡＰＧＷａは後述の実
施例に記載されるように、例えばコナガニジ神経節の抽
出物をＨＰＬＣなとの吸着クロマトグラフィーやゲル漉
過等の通常の方法を適宜組み合せて精製して製造するこ
とかできる。抽出にはアセトンなどの有機溶剤が用られ
る。

また、本発明のオリゴペプチドは、後述の実施例にも示
されるように、通常のペプチド合成法などによっても合
成することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

実施例Ｉ　　ＡＰＧＷａの！−ＬＪＪ 軟体動物前鯛類（巻貝）のコナガニジは、広島湾で採取
したものを使用した。コナガニジにおいては内臓神経節
を除く他の神経節が一つの塊になって存在する。約１，
１００個体のコナガニジから神経節塊を分離し、ただち
にドライアイスで凍結し、−２０℃に保存した。凍結保
存しておいた神経節塊を氷冷したアセトンに入れ、ただ
ちにホモゲナイズし、ホモゲネートを遠心分離し、その
上清中のアセトンを減圧エバポレーターを用いて蒸発さ
せた。残った水溶物に塩酸を最終濃度がＯＩＮになるよ
うに加えて撹拌し、再び遠心分離して不溶物を除いた。

これをＣ−１８カートリツジカラム（Ｗａｔｅｒｓ、５
ｅｐ−Ｐａｋ）に通し、カートリッジを４％酢酸で洗っ
た後、保持物質をメタノールで溶出し、溶出物を凍結乾
燥させた。この試料を蒸留水に溶解し、セファデックス
Ｇ−１５カラム（２，６Ｘ４０ｃｍ）にのせ、０１Ｎ酢
酸を流して分画した。各両分は凍結乾燥したのち、生物
活性の検定に用いた。

生物活性検定は、コナガニジ両舌牽引筋を用いて行った
。約２−の実験容器に筋標本を取りつけ、電気刺激（２
０Ｖ　　２ｍ５ｅｃ、、　　０．　２Ｈｚ　　５パルス
）を与え、５個１組の単一収縮を生じさせ、この収縮に
及ぼす各両分の効果を調べた。以下に述べるペプチド純
化の各過程における生物検定も同様の方法で行った。

セファデックスＧ−１５によるゲル濾過で得られた各画
分を生物検定した結果、単一収縮増強の最大活性が２２
番目、４５番目、５０番目の両分にそれぞれ見られる３
つの興奮性ピークを得た。

また、両分２８−３０に最大活性を示す抑制活性のピー
クも得た。そこで、両分を２１−４０と４１−５４の２
つのグループに分けて、ＨＰＬＣを用いて以下の条件で
活性物質の純化を進めた。両分２２−４０からいくつか
のペプチド性活性物質を得たが、これらはいずれもＲＰ
ＣＨ−ＡＫＨ様ペジペプチドなかった。一方、画分４１
−５４からもいくつかのペプチド性活性物質を得ること
ができ、そのうちの一つは前記のＡ　Ｐ　Ｇ　Ｗ　ａで
あった。この物質の純化は次のように行った。

まず、画分４１−５４をＣ−１８逆相カラム（ＴＳＫ−
ゲル　ＯＤＳ−８０ＴＭ）に注入し、０１％ＴＦＡ　（
ｐＨ２，２）、　　○−６０％アセトニトリル（６０分
）の条件下でＨＰＬＣシステム（日本分光ＴＲＩ−Ｒｏ
ｔｅｒ　　ＩＶ）を用いて勾配溶出を行った。その結果
、２つの興奮活性を示すピーク（ピーク１．ＩＴ）と１
つの抑制活性を示すピーク（ピーク■）が得られた。次
にピークＩを陽イオン交換カラム（ＴＳＫ−ゲル　５Ｐ
−５ＰＷ）に注入し、１０＋ｎＭリン酸バッファー（ｐ
Ｈ６，８）、Ｏ−０，５Ｍ　　ＮａＣｌ　　（５０分）
の条件下で濃度勾配溶出を行い、２２０ｎｍの紫外線に
ほぼ完全な単一吸収ピークを示す収縮増強活性物質を得
た（第１Ａ図）。続いて、脱塩のために、もう−度上記
Ｃ−１８逆相カラムにのせ、０１％ＴＦＡ　（ｐＨ２，
２）、１５−２１％アセトニトリル（３０分）の条件で
勾配溶出を行い、活性物質の完全な単一吸収ピークを得
た（第１図Ｂ）。このピークのペプチド成分は、後述の
実施例２その他によりＡＰＧＷａであることを確認した
。

得られたピークのコナガニジ両舌牽引筋の単一収縮に対
する増強活性を測定した結果は第１図Ｃに示すとおりで
ある。この測定は、両舌牽引筋に２０Ｖ、　２ｍ５ｅｃ
、　０．　２Ｈｚ　　５パルスの電気刺激を１０分おき
に与え、刺激の８分前（図中上向きの矢印）にＡＰＧＷ
ａ　（４，５匹分を人工海水１−に溶解したもの）を作
用させ、刺激後すくに洗浄して（図中下向きの矢印）行
った。

実施例２　　ＡＰＧＷａの　造決定 実施例１で得られたペプチドピークは、その生物活性が
プロテアーゼ処理により消失すること、およびクロマト
グラフの挙動から、分子固か比較的小さいペプチドであ
ると予想されたため、下記のアミノ酸分析、アミノ酸配
列分析およびＦＡＢ質量分析を行い、その結果、ＡＰＧ
Ｗａの配列を有することが判明した。

（１）　　ヱ主又を■威 アミノ酸分析は、約０７ナノモルの試料を用い、減圧封
管中１００μｍの定沸点塩酸（０，１％フェノール含有
）で１１０’Ｃ，２４時間加水分解し、減圧乾固後０．
０２Ｎ塩酸１００μｌに溶解し、日立自動アミノ酸分折
機Ｌ−８５００型にて行った。結果を第１表に示す。な
お、表中、ＡＰＧＷａはＡ　Ｉ　ａ＝１として計算し、
カッコ内の数値は最も近い整数比を示す。

第２表　ＡＰＧＷａのアミノ　配置 サイクル数　検出された　　　　　収量ＰＴＨ−アミノ
酸　（ピコモル） アミノ酸 組成比 Ｇｌｙ　　　　　　　　　１．０４　　　（１）Ａｉａ
　　　　　　　　　１　　　　　　　（１）Ｐｒｏ　　
　　　　　　　０．８４　　　（１）１　　　　　　　
　Ａｌａ　　　　　　　　６５２　　　　　　　　Ｐｒ
ｏ　　　　　　　　６０３　　　　　　　Ｇｌｙ　　　
　　　　　５９４　　　　　　　　Ｔｒｐ　　　　　　
　　３４５以降 アミノ酸分析に用いたのと同毒の試料を自動プロティン
シーケンサ−（アプライド・バイオシステムズ社製　４
７７Ａ型）に供した。得られるフェニルチオヒダントイ
ン−アミノ酸（ＰＴＨ−アミノ酸）は、上記シーケンサ
−とオンラインで結ばれたＰＴＨ−アミノ酸分析機（ア
プライド・バイオシステムズ社製　１２０Ａ型）を用い
て同定した。結果を第２表に示す。

ＦＡＢ質量分析は、日本電子製のＦＡＢ質量分析機（Ｊ
ＥＯＬ　　ＪＭＳ　　ＨＸ−１００型）を用いて行った
。ＡＰＧＷａの（Ｍ＋　１　）＋イオンは４２９、　１
　（理論分子量４２８．２）に検出され、この結果Ａ　
Ｐ　Ｇ　Ｗ　ａの構造式は次のように推定された。

ＡＰＧＷａ： Ｈ−Ａ　ｌ　ａ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｔ　ｒ　ｐ
−ＮＨｚ実施例３　　ＡＰＧＷａおよびその　　　　Ｓ
ＰＧ実施例２で推定されたＡ　Ｐ　Ｇ　Ｗ　ａの構造を
合成によってさらに確認した。また前述した理由により
、ＡＰＧＷａの同族体である５ＰＧＷａ、ＦＡＰ　Ｇ　
Ｗ　ａおよびＦＳＰＧＷａ、さらにＰ　Ｇ　Ｗ　ａ　。

ＧＷａおよびＷａも生物活性を示すと考えられたので、
これらも合成してその活性を調べた。

本発明のペプチドは、標準的なペプチド合成法に従って
製造できる。−船釣な総説として、「生化学実験講座１
．タンパク質の化学■巻、第■部２０７頁から４９５頁
」　（東京化学同人）：「ペプチド合成の基礎と実験、
泉屋信夫他共著」　（丸善）などが挙げられる。本発明
ペプチドは、上記の文献に記載されている合成法に準し
て合成できる。

本実施例においては、本発明のペプチドのうちＨ−Ａｌ
ａ（又はＳｅｒ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨ２お
よびＨ−Ｐｈｅ−Ａｌａ　（又はＳｅ　ｒ）　−Ｐ　ｒ
　ｏ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｔ　ｒ　ｐ−ＮＨ２の合成は、いわ
ゆる「固相法」と呼ばれる方法で行い、Ｈ−Ｐ　ｒ　ｏ
−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｔ　ｒ　ｐ−ＮＨ２およびＨ−Ｇ　ｌ　
ｙ−Ｔ　ｒ　ｐ−ＮＨ２の合成は、水溶性カルボジイミ
ド−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール法により行った
。

合成例Ｉ　　Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌ−Ｔｒ
−ＮＨベンズヒドリルアミン樹脂（０，５ｍｍｏｌ、　
　０゜７ｍｅｑ　／　ｇ＋　　７１４ｍｇ）の塩酸塩に
、５％ＤＩＥＡ／ＣＨ２ＣＩ□　（２０ｍｆ）を加え、
中和させたのち、ＣＨ２Ｃｌ２　　（３０ｄＸ５）でグ
ラスフィルター上で吸引洗浄し、遊離型ＢＨＡ樹脂とし
た。

乾燥後Ｂｏｃ−Ｔｒｐ　（Ｆｏ　ｒ）−ＯＨ（６６４ｍ
ｇ、　　２ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ　　（２７０ｍｇ、　
　２ｍｍｏｌ）のＮＭＰ溶液（１５ｄ）を樹脂に加え、
均一混合物とした。このものにＩＭ　　ＤＣＣ／ＮＭＰ
を２−加え、３時間ゆるやかに振とうさせた。過剰の反
応液を濾去し、さらｌ：ｃＨ２Ｃ１２（３０１ＲＩｌＸ
５）　、５０％Ｍ　ｅ　ＯＨ／　ＣＨ２Ｃｌ　２　　（
３０ｙｉｄｌ×５）、ＣＨ２Ｃ１２（３０ｄｘ５）　で
順次樹脂を洗浄したのち、デシケータ−中で３０分間減
圧乾燥した。得られたＢｏＣ−Ｔｒｐ　（Ｆｏｒ）−Ｂ
ＨＡ樹脂を、５０％ＴＦＡ／ＣＨ，Ｃ１，で２０分間処
理し、濾取後、ＣＨ２Ｃｌ、（３０ｄｘ５）で洗浄した
。次に５％Ｄ　Ｉ　ＥＡ／ＣＨ，Ｃ１，でペプチド−樹
脂を５分間中和した後、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｄＸ７）で
洗浄し、Ｈ−Ｔｒｐ　（Ｆｏｒ）ＢＨＡ樹脂を得た。以
下、Ｔｒｐ　（Ｆｏｒ）の導入と同様にして、順次Ｂｏ
　ｃ−Ｇ　ｌ　ｙ−ＯＨ（３５０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、
ＢｏＣ−Ｐｒｏ−ＯＨ（４３０ｍｇ、　　２ｍｍｏｌ）
　、　　Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（３７８Ｈ＋ｇ、　　２
ｍｍｏｌ）　、そしてＢｏＣ−Ｐｈｅ−ＯＨ（５３０ｍ
ｇ、　　２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ法で縮合さ
せ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
　（Ｆｏｒ）−ＢＨＡを９００ｍｇ得た。

得られたペプチド−樹脂をｐ−クレゾール（１゜５−）
の存在下、弗化水素（８，５Ｍ１）で０℃。

１時間処理した。弗化水素を留去した後、残渣をエーテ
ル（５０ｄ）で処理し、生じたペプチドをＴＦＡ　（１
０−×３）で抽出した。ＴＦＡを留去して得られる油状
物にエーテル（１００ｄ）を加え、１５０■の粗Ｈ−Ｐ
ｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ　（Ｆｏｒ）　
−ＮＨｚを粉末として得た。次にこのＦｏｒ誘導体を１
Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液（５０ｗｉ）に溶かし、室
温で１２時間放置してＦｏｒ基を除去した。反応液を酢
酸で中和した後、Ｃ−１８カラム（２，ＯＸ２０ｃｍ）
に添加し、０．１％ＴＦＡから６０％ＣＨ，ＣＮ１０．
１％ＴＦＡまでの６０分間の直線勾配でペプチドを溶出
させた。メインビークを分取し、凍結乾燥を経て、３３
１′ＩＩｇの目的物を得た。

合成例２　　Ｈ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　−Ｔ　　−Ｎ
）＋２合成例１に準じて、０　、　５　ｍｍｏｌのＢＨ
Ａ樹脂（０、７ｍｅｑ　／　ｇ、　　７１４ｍｇ）に、
Ｄ　ＣＣ／）ＬＯＢｔ法により、順次Ｂｏｃ−Ｔｒｐ　
（Ｆｏｒ）−０Ｈ（６６４ｍｇ、　　２ｍｍｏｌ）、　
　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（３５０ｍｇ、　　２ｍｍｏｌ
）　、　　Ｂ　ｏ　ｃ−Ｐ　ｒ　ｏ−ＯＨ（４３０ｍｇ
、　　２ｍｍｏｌ）　、　　Ｂｏ　ｃ　−Ａ　ｌ　ａ−
ＯＨ（３７８ｍｇ、　　２　ｍｍｏｌ）を縮合させ、８
５０ｍｇのＢｏａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ　
（Ｆｏｒ）ＢＨＡ樹脂を得た。このペプチド−樹脂５０
０ｍｇを弗化水素／ｐ−クレゾール（８，５／１．５Ｍ
りで０℃、１時間処理し、合成例１に準じ、９０■の粗
Ｈ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｔ　ｒ　ｐ
　（Ｆｏ　ｒ）−ＮＨ２を粉末として得た。次に、常法
により、１Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液に、上記のＦｏ
ｒ−誘導体を溶かし、室温に１２時間放置して、Ｆｏｒ
基を除去した。反応液を中和した後、Ｃ−１８カラム（
２，ＯＸ２０ｃｍ）に添加し、合成例１と同様の溶出を
行い、メインピークを分取した後、凍結乾燥して、１５
ｍｇの目的物を得た。

Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ３，０４ｇ　　（１０ｍｍｏｌ）
をジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと略す）１０−
に溶解し、アンモニウムクロリド６４２ｍｇ　（１２ｍ
ｍｏｌ）およびＨＯＢｔ　　１．４９ｇ　（１１ｍｍｏ
ｌ）を加え、−２０℃に冷却した。これに１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（
以下、ＥＤＣと略す）　２ＩＩＩｆ（１１ｍｍｏｌ）を
滴下し、室温まで徐々に温度を上昇させながら撹拌し、
さらに室温で一夜撹拌した。反応液に水を加えて酢酸エ
チルで抽出した。有機層を１０％クエン酸、５％炭酸水
素ナトリウムの順に洗浄し、さらに飽和食塩水で洗浄し
た。無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥後、減圧濃縮し
て無色固体を得た。塩化メチレンから再結晶し、無色針
状晶２．６ｇを得た。

ｉｉ）　Ｈ−Ｇ　Ｉ　　−Ｔ　ｒ　　−ＮＨ２Ｂ　ｏ　
ｃ−Ｔ　ｒ　Ｉ）−ＮＨ２９１０ｍｇ　（３ｍｍｏｌ）
を塩化メチレン５−に溶解し、水冷下トリフルオロ酢酸
（以下、ＴＥＡと略す）５−を加え、水冷下に１時間撹
拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣にベンゼンを加えて
数回減圧濃縮し、水酸化カリウム上で減圧不乾燥した。

このＴＥＡ塩、ＢｏｃＧｌｙ−ＯＨ５２６ｍｇ（３ｍｍ
ｏｌ）およびＨＯＢｔ　（３，３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ５
−に溶解し、−２０℃でＥＤＣ０，６ｄ、　（３，３ｍ
ｍｏｌ）を滴下した。

室温まで徐々に温度を上昇させながら撹拌し、さらに室
温で一夜撹拌した。反応液を同様に処理し、Ｂｏ　ｃ−
Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｔ　ｒ　ｐ−ＮＨ２を１．ＯＯｇ得た。収
率９３％。このうちの２５０■を取り、水冷下ＴＦＡ−
塩化メチレン（１：１）にて脱ＢＯＣ化し、Ｈ−Ｇ　Ｉ
　ｙ−Ｔ　ｒ　ｐ−ＮＨ２のＴＦＡ塩を得た。このＴＦ
Ａ塩の一部を高速液体クロマトグラフィーにより精製し
た。カラムに和光純薬工業製ＷＡＫＯ８ＴＬ　　５Ｃ１
８−２００（ＩＯＸ３００ｍｍ）を用い、次の方法で展
開した。溶媒Ａを０．１％ＴＦＡ−水、溶媒Ｂを０．１
％ＴＦＡ−６０％アセトニトリル−水とし、２５分間で
溶媒Ａ中のＢの比率を１５−４０％に直線的に変える（
流速４−７分）。精製したペプチドは上記と同一の条件
で展開すると単一の対称なピークを示した。

合成例４　　）１−Ｐｒｏ−Ｇｌ−Ｔｒ−ＮＨ２ＰＧＷ
ａＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨ２７２０ｍｇ（２Ｈｏ
ｌ）を水冷下ＴＦＡ−塩化メチレン（１二１）にて脱Ｂ
ｏｃ化し、前記と同様に処理してＴＦＡ塩を得た。この
ＴＦＡ塩、Ｂｏ　ｃ−Ｐ　ｒ　ｏ−０Ｈ４、３０ｍｇ　
（２ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ　　２８４ｍｇ（２，１
ｍｍｏｌ）をＤＭＦ５−に溶解し、−２０℃でＥＤＣＯ
，４＋ａｌ’　（２，１ｍｍｏｌ）を滴下した。以下、
同様に反応させ、処理して、Ｂｏｃ−Ｐｒ。

−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｔ　ｒ　ｐ−ＮＨ２を６００ｍｇ得た。

収率６４％。このうち１５０ｍｇを水冷下ＴＦＡ−塩化
メチレン（１：　１）にて脱Ｂｏｃ化し、ＴＦＡ塩を得
た。一部を前記と同様の条件で高速液体クロマトグラフ
ィーにて精製した。

合成例１〜４で得たペプチドについて、逆相系高速液体
クロマトグラフィーにより純度検定を行った後、６Ｎ塩
酸（０，１％フェノール含有）１１０℃、２４時間の加
水分解後のサンプルのアミノ酸組成比分析（日立アミノ
酸分折機８３５−５０型またはＬ−８５００型使用）、
アミノ酸シークエンサー（アプライド・バイオシステム
ズ社４７７Ａ型使用）によるアミノ酸配列分析、および
質量分析装置（日本電子ＪＥＯＬ　　ＪＭＳ　　ＨＸ＝
１００型または日立Ｍ−８０Ｂ型）による質工分析の結
果から、構造を確認した。

生惣造挫悶検足 天然ＡＰＧＷａと合成ＡＰＧＷａの活性をコナガニジ両
舌牽引筋における単一収縮増強効果で調べ、両者の濃度
−活性関係の一致を確認した。域値は５ｘｌＯ−１０Ｍ
程度であった。なお、このときの天然ＡＰＧＷａの濃度
はアミノ酸分析の結果から算出して決定した。

次に、合成ＡＰＧＷａの活性をムラサキイガイの足系前
牽引筋（ＡＢＲＭ）、　コナガニジの両舌伸出筋、セト
ウチマイマイの味のうで調べた。ＡＢＲＭでは、反復電
気刺激による一過性収縮や同刺激による緊張性収縮弛緩
（Ｃａｔｃｈの弛緩）が、合成ＡＰＧＷａにより抑制さ
れた。しかしながら、アセチルコリンによる収縮やセロ
トニンによるＣａ　ｔ　ｃｈの弛緩はＡＰＧＷａの影響
を受けなかった。両舌伸出筋の場合、両舌牽引筋と異な
り、単一収縮は増強されず、逆に抑制された。味のうで
は自動収縮が強く抑制された（第１図）。

反復電気刺激によるＡＢＲＭのＣａｔｃｈの弛緩は、電
流が筋組織中の神経繊維を刺激し、弛緩神経からの弛緩
性伝達物質セロトニンを放出させることによって起こる
ことがわかっている（トワログおよびコール（Ｂ、Ｍ、
Ｔｗａｒｏｇ　　ａｎｄ　　Ｒ，Ａ、Ｃｏ１ｅ）、Ｃｏ
ｍｐａｒａｔ＋ｖｅ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　
ａｎｄ　　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、４６Ａ、８３１−８
３５　（１９７３））。このことと、ＡＰＧＷａが投与
したセロトニンによるＣａｔｃｈの弛緩を抑制しないと
いう事実から、反復電気刺激によるＣａ　ｔ　ｃｈの弛
緩のＡ　Ｐ　Ｇ　Ｗ　ａによる抑制は、このペプチドが
セロトニン放出を抑えた結果であると考えられる。

セロトニンはＡＢＲＭの一過性収縮を増強する作用も持
っているが、ＡＰＧＷａによる一過性収縮抑制もセロト
ニン放出抑制の結果である可能性が強い。そこで電気化
学検出器を用いて、１個のＡＢＲＭから外液中に放出さ
れるセロトニンの量を測定した。まず、正常液中で反復
電気刺激（１５Ｖ、　　３ｍ５ｅｃ、　　１０Ｈｚ、　
　５秒間）を１分置きに１０回筋に与え、そのときのセ
ロトニン放出囲を測ったところ、約０　、　６　ｐｍｏ
ｌｅｓであった。次に、１０−６ＭのＡＰＧＷａ存在下
で同様の実験を行ったことろ、放出量は約０　、　２　
ｐｍｏｌｅｓと減少した。さらにＡＰＧＷａを除いて、
再び正常液中で測ったところ、放出量は約０　、　３　
ｐｍｏｌｅｓであった。つまり、Ａ　Ｐ　Ｇ　Ｗ　ａの
作用の少なくとも１つはセロトニン放出抑制であると言
える。

ＡＰＧＷａの作用にセロトニン放出抑制があるとすると
、コナガニジ歯舌筋に対する効果も説明できる。セロト
ニンは歯舌牽引筋の収縮を抑制し、歯舌伸出筋の収縮を
増強するが、電気刺激時にセロトニンが放出されている
とすれば、このセロトニン放出はＡＰＧＷａの存在下で
抑えられ、従って、牽引筋の単一収縮は増強され、伸出
筋のそれは逆に抑制されることになる。ＡＰＧＷａのセ
ロトニン放出抑制は、ＡＢＲＭにおいてばかりでなく、
他の組織でもおこる可能性が強い。

次に、Ａ　Ｐ　Ｇ　Ｗ　ａの同族体を合成し、それらの
効果をＡＢＲＭのＣａｔｃｈの反復電気刺激による弛緩
と味のうの自動収縮において調へた。結果を第３表に示
す。

第３表　ＡＰＧＷａ　　びその　　　の生　活性ＦＡＰ
ＧＷａ　　１／３〜１／１０ Ｆ　Ｓ　Ｐ　ＧＷ　ａ　　１／３〜１／１０ＡＰＧＷａ
　　　　　　ｌ ５ＰＧＷａ　　　　　　Ｉ Ｐ　Ｇ　Ｗ　ａ　　１／１０００〜ｌ／３０００ＧＷａ
　　　　１　〜２ Ｗａ　効果なしく≦１０−’Ｍ） １７３〜１／１０ １／３〜１／１０ １／１０００〜１／３０００ １〜２ 効果なしく≦１０−’Ｍ） 第１表の結果かられかるように、ＡＰＧＷａと５ＰＧＷ
ａはぼぼ同じ程度の効力を示し、Ｎ末端にＰｈｅを付加
すると効力はやや落ちる。ＡＰＧＷａのＡｌａを除いた
ＰＧＷａにも効力はあるが大きく減少する。ところが興
味深いことに、さらにＰｒｏを除いたＧＷａの効力はＡ
　Ｐ　Ｇ　Ｗ　ａのそれと同等か少し強い。Ｗａになる
とまったく効果を示さない。

ＧＷａという単純な形のジペプチドが強い効力を持つと
いうことは、このジペプチドを変形したペプチドは本発
明の他のペプチドを含めて、セロトニン作動系に働く薬
物の開発に有用であることを示唆している。セロトニン
はヒトの脳、消化管、血液中で重要な役を果たしており
、単に実験試薬ばかりでなく、医療に用いることのでき
る薬の開発へ発展させることが期待できる。

（発明の効果） ＲＰＣＨ−ＡＫＨ系ペプチドは、昆虫、甲殻類中に存在
し、今回、軟体動物にも存在することがわかった。また
、哺乳類の脳にも存在することが示唆されている（Ｂｒ
ａｉｎ　　Ｒｅｓ、　　　３４３１７２　（１９８５）
）。一方、一般に神経ペプチドは筋系のみならず、神経
系においても作用を示す。従って、本発明のオリゴペプ
チドは、上記の動物における神経−筋系の生理を明らか
にするための有用な実験薬として、生物学や基礎医学の
分野で使用できる。また、軟体動物の神経系のニューロ
ンには良く研究されたものが多く存在し、人間の脳の機
能（例えば、記憶や学習機能）を調べるためのよいモデ
ル系として実験に用いられているが（科学、５１．１０
　（１９８１）；科学、５１．１０９　（１９８１））
、本発明のオリゴペプチドはこれらの実験において有用
な試薬として使用できる。

さらに、本発明のオリゴペプチドは、セロトニンをはじ
めとするモノアミン系神経伝達物質や、ペプチド系神経
伝達物質が関与する反応を制御できる医薬として使用す
ることができる。本発明により、向精神薬としては、抗
うっ病、抗錬うつ病、抗精神分裂、抗老人性痴呆症、抗
不安等に有効なペプチド化合物か提供される。また、循
環系薬としては、抗偏頭痛、抗高血圧症、抗血小板凝集
、抗血付障害等、更に覚醒、睡眠リズムや摂食行動に異
常をきたしている症状に効果を有するペプチド化合物が
提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ａ　Ｐ　Ｇ　Ｗ　ａの純化の過程のＨＰ　Ｌ
　Ｃ第２段階目の陽イオン交換カラムを使用したクロマ
ドグラフィーで、矢印で示す吸収ピーク部分に活性が認
められたこと示す図である。 第２図は、ＡＰＧＷａの純化の最終過程の逆相カラムを
使用したクロマトグラフィーで、矢印で示す吸収ピーク
部分に活性が認められたこと示す図である。 第３図は、コナガニジ両舌筋の単一収縮に対する最終精
製ＡＰＧＷａの増強効果を示すグラフである。 特許出願人　サントリー株式会社 紘頬υ２′２−０−遺ｌ Ｔ’ｔ）　＝ｒ−１ソノ（７７メ ｏＣＩ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式 I またはII： Ｘ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨ＿２（ I ） （式中、ＸはＨ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｈ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ
   、Ｈ−ＰｒｏまたはＨを表す）またはＨ−Ｐｈｅ−Ｙ−
   Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨ＿２（II）（式中、ＹはＡｌａ−
   ＰｒｏまたはＳｅｒ−Ｐｒｏを表す） で表されるペプチドを含有するセロトニン放出抑制剤組
   成物。 ２、次式 I またはII： Ｘ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨ＿２（ I ） （式中、ＸはＨ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｈ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ
   またはＨ−Ｐｒｏを表す）またはＨ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ｇｌ
   ｙ−Ｔｒｐ−ＮＨ＿２（II）（式中、ＹはＡｌａ−Ｐｒ
   ｏまたはＳｅｒ−Ｐｒｏを表す） で表されるオリゴペプチド。 ３、コナガニシの神経節を有機溶媒で抽出した液から、
   吸着クロマトグラフィーおよびゲル漉過を含む工程によ
   り、Ｈ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨ＿２で
   表されるオリゴペプチドを取得する方法。