KR20040063224A

KR20040063224A - 먹장어로부터 분리한 평활근 수축용 신경성 펩타이드 및이를 코딩하는 ｄｎａ, ｒｎａ 염기서열

Info

Publication number: KR20040063224A
Application number: KR1020030000562A
Authority: KR
Inventors: 이인선; 박남규; 김현수; 김현철; 장영채; 김찬휘; 김은정
Original assignee: 학교법인 계명기독학원
Priority date: 2003-01-06
Filing date: 2003-01-06
Publication date: 2004-07-14
Also published as: KR100491742B1

Abstract

본 발명은 원구류로부터 분리한 평활근 수축활성을 가진 새로운 신경성 펩타이드에 관한 것으로, Gly-Thr-Ala-Gly-Ile-Gly-Pro-Phe-Arg (875.8 Da)로 구성되며, 먹장어 장관에 대하여 기존에 알려졌던 브래디키닌(bradykinin; BK)보다 강한 수축활성을 나타내고, 그 크기도 작아 화학적 합성에도 적합하여 대량생산이 용이한 뛰어난 효과가 있다.

Description

먹장어로부터 분리한 평활근 수축용 신경성 펩타이드 및 이를 코딩하는 ＤＮＡ, ＲＮＡ 염기서열 {A neuropeptide from Eptatretus burgeri and its coding DNA, RNA sequence therefrom}

본 발명은 신경성 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 먹장어 피부로부터 분리한 평활근 수축활성을 지닌 새로운 신경성 펩타이드에 관한 것이다.

최근 생체조절 기능에 대한 관심이 높아지면서 생체내에 존재하는 각종 생리활성물질에 관한 연구가 광범위하게 진행되고 있다. 생리활성물질은 척추 및 무척추동물의 중추신경계와 위장관계에서 조절제어 및 정보전달 등의 역할을 한다. 한 개의 신경세포는 수천 개의 신경세포와 신호를 주고 받는데, 이러한 전달을 담당하고 있는 것이 바로 화학물질인 신경전달물질 (neurotransmitter)이다. 신경전달물질인 신경성 펩타이드 (neuropeptide)는 중추신경계와 말초신경계에 넓게 분포하고 있으며, 자극에 대한 반응 전달, 심혈관계와 위장관과 같은 각 기관에 특이적인 조절 기능을 가진다. 또한, 이들은 신경내분비계 (neuroendocrine system), 자율신경계 (autonomic nervous system), 중추신경계 (central nervous system)에서 신경전달물질과 신경조절물질 (neuromodulator)의 기능을 가진다.

지금까지 알려진 신경성 펩타이드에 대한 연구는 포유류, 조류, 양서류, 파충류 및 곤충 등 육상 생물을 중심으로 많은 연구가 진행되었다. 최근들어 해양생물에 대한 관심이 증대되면서 이들에 관한 연구가 광범위하게 진행되고 있다.

해양생물 중 어류는 생물종의 다양함과 특이한 생태계로 인하여 많은 연구가 수행되었다. 돔발상어 (Scyliorhinus canicula)의 장관으로부터 'scyliorhinin Ⅰ'과 'scyliorhinin Ⅱ'가 처음으로 정제되어졌으며, 돔발상어 (Scyliorhinus canicula)의 뇌에서는 포유류의 'Substance P (SP)'보다 3배나 강력한 활성을 갖는 SP-관련 펩타이드가 분리되었다. 대구 (Gadus morhua)와 송어 (Oncorhynchus mykiss)의 뇌에서 각각 SP 와 뉴로키닌(neurokinin) A가 분리되었고, 일본 잉어 (Carassius auratus langsdorfii)의 뇌에서 'RFamide'가 정제되었다.

그러나, 본 발명에서 실험동물로 사용한 먹장어에 관한 연구는 현재까지 기존의 알려진 생리활성물질들의 존재를 확인하는데 그치고 있으며, 더욱이 이러한 물질들에 대한 생리활성효과의 검증이나 분리, 정제 및 구조활성과의 연관성 연구는 극히 제한되어 있었다.

이에, 본 발명자는 해양생물인 먹장어 피부를 대상으로 평활근 수축활성을 지니는 새로운 신경성 펩타이드를 정제하여 제공하고자 예의 노력하여 왔으며, 그 결과 원구류인 먹장어 (Eptatretus burgeri) 피부로부터 메탄올-산 추출물을 얻고,상기의 추출물을 세파덱스 G-25와 CM 셀룰로오스 컬럼 크로마토그래피로 조정제한 후, HPLC 시스템을 거쳐 평활근 수축활성을 갖는 새로운 신경성 펩타이드를 분리하고, 'Peptide sequence analysis (Shimazu PPSQ-21A protein sequencer)' 및 'MALDI-TOF MASS (Voyager-DETM STR, Perseptive Biosystems)'을 통해 아미노산의 일차구조와 분자량을 규명함으로 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적는 해양생물인 먹장어 피부를 대상으로 평활근 수축활성을 지니는 새로운 신경성 펩타이드를 정제하여 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 신경성 펩타이드를 코딩하는 DNA 및 RNA 염기서열을 제공하는 것이다.

도 1은 Sep-pak C18 카트리지에 의하여 분리된 4가지 분획의 먹장어 장관 평활근 수축활성 측정 실험 결과를 나타낸다.

도 2는 역상 HPLC 크로마토그램 (A)과 활성분획의 먹장어 장관 평활근 수축활성 (B)을 나타낸다 ( ■는 활성분획을 나타냄).

도 3은 도 2의 활성 분획의 양이온 교환수지 크로마토그램 (A)과 활성분획의 먹장어 장관 평활근 수축활성 (B)을 나타낸다 ( ■는 활성분획을 나타냄).

도 4는 도 3의 활성 분획의 역상 HPLC 크로마토그램 (A)과 활성분획의 먹장어 장관 평활근 수축활성 (B)을 나타낸다 ( ■는 활성분획을 나타냄).

도 5는 도 4의 활성 분획의 친화도 HPLC 크로마토그램 (A)과 활성분획의 먹장어 장관 평활근 수축활성 (B)을 나타낸다 ( ■는 활성분획을 나타냄).

도 6은 도 5의 활성 분획의 역상 HPLC 크로마토그램 (A)과 활성분획의 먹장어 장관 평활근 수축활성 (B)을 나타낸다 ( ■는 활성분획을 나타냄).

도 7은 도 6의 활성 분획의 역상 HPLC 크로마토그램 (A)과 활성분획의 먹장어 장관 평활근 수축활성 (B)을 나타낸다 ( ■는 활성분획을 나타냄).

도 8은 도 7의 활성 분획의 역상 HPLC 크로마토그램 (A)과 활성분획의 먹장어 장관 평활근 수축활성 (B)을 나타낸다 ( ■는 활성분획을 나타냄).

도 9는 도 8의 활성 피크의 MALDI-TOF Mass 결과를 나타낸다.

도 10은 먹장어 BK와 표유류 BK의 농도 의존적 약리활성의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 영역을 포함하는 DNA 또는 RNA로 구성된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

이하, 본 발명의 구성에 대해 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 있어, 서열번호 1에 기재된 신경성 펩타이드는 실시예 1에 구체적으로 기재된 바와 같이 원구류인 먹장어 (Eptatretus burgeri) 피부로부터 메탄올-산 추출물을 얻고, 상기의 추출물을 세파덱스 G-25와 CM 셀룰로오스 컬럼 크로마토그래피로 조정제한 후, HPLC 시스템을 거침으로써 분리된다.

상기 분리된 펩타이드는 평활근 수축활성을 갖는 새로운 신경성 펩타이드로 상기의 HPLC 시스템을 거친 후, 'Peptide sequence analysis (Shimazu PPSQ-21A protein sequencer)'를 통해 아미노산 서열이 서열번호 1과 같이 결정된다.

서열번호 1의 펩타이드를 가지고 먹장어 장관 평활근에 대한 수축반응의 ED₅₀값을 측정해 본 결과, 혈관이완, 기관지 수축 및 소화관 수축의 활성을 가짐이 보고된 바 있는 브래디키닌보다 약 10³배 낮게 나타나며, 이는 본 발명의 신경성 펩타이드가 브래디키닌보다 강한 활성을 가짐을 의미한다.

또한, 본 발명의 신경성 펩타이드들은 아미노산 서열의 C-말단이 카르복시화 또는 아민화된 것이 바람직하며, N-말단의 아민기에 아세틸기 또는 알킬기가 치환될 수 있다.

또한, 서열번호 1의 아미노산은 L-타입의 아미노산 또는 D-타입의 아미노산 어느 것이든지 무방하게 사용된다.

한편, 본 발명의 신경성 펩타이드들은 먹장어 피부로부터 분리 및 정제하여 얻을 수 있을 뿐만 아니라 펩타이드 합성기를 이용하여 화학적 방법에 의하여 제조될 수도 있다. 또한, 상기의 신경성 펩타이드를 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 함유하고 상기 펩타이드를 발현하기에 적합한 클론을 유전자 재조합 기술에 의하여 제조한 후 이를 이용하여 제조할 수도 있다.

이하, 본 발명의 구성에 대해 하기 실시예를 통해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 먹장어로부터 새로운 신경성 펩타이드의 분리

실험에 사용된 먹장어 (Eptatretus burgeri, 10.8 kg)는 민락동 해변시장에서 구입하였다. 살아있는 상태의 먹장어로부터 피부를 분리한 후, 즉시 액체질소로 동결시켜서, 실험에 사용하기 전까지 -70℃에 보관하였다.

먹장어 피부로부터 신경성 펩타이드 추출

동결된 먹장어 피부를 메탄올 추출액 (MeOH : 5% acetic acid (v/v) =94 : 6)으로 4 ℃에서 48 시간 추출하여 조직을 파쇄한 후 원심분리 (10,000 ×g, 20 min, 4 ℃)를 행하였다. 이후, 상층액만을 모아서 감압농축기를 이용하여 농축하였다. 농축된 시료 3000 ml (ℓ/g = 1 : 15) 에 NaCl 45 g을 첨가하여 4 ℃ 냉장고에서 9 시간 동안 보관하였으며, 보관된 시료액은 원심분리 (13,000 ×g, 30 min, 4 ℃)하여 상층액만 모아서 농축하고, 이써(ether)를 첨가하여 (v / v = 1 : 1) 분별깔대기를 이용하여 연속추출하여 물층만을 받아내어 농축하였다. 농축된 시료는 다시 원심분리 (20,000 ×g, 30 min, 4 ℃)하여 상층액만 취해서 농축시키고 1.0 N HCl을 첨가하여 최종농도가 0.1 N HCl이 첨가된 시료로 만들었다. 9 시간 동안 4 ℃ 냉장고에서 보관한 후 원심분리 (20,000 ×g, 30 min, 4 ℃)하여 상층액만 취해서 농축하여 'Sep-pak C₁₈cartridge'을 이용하여 분리하였다.

Sep-pak C₁₈cartridge (20 ml, Waters)는 0.1%트리플루오르아세트산(trifluoracetic acid; TFA)가 포함된 100% 메탄올로 활성화시키고, 0.1% TFA로 세척한 후, 시료를 주입시켰다.

먼저 0.1% TFA (pH 2.2)로 씻은 후, 흡착된 시료는 0.1% TFA가 포함된 물층 (D.W.), 10% 메탄올 (RM 10), 60% 메탄올 (RM 60)과 100% 메탄올 (RM 100)로 물질들을 각각 용출시켜 동결건조하였다. 용출된 D. W., RM 10, RM 60과 RM 100의 평활근에 대한 수축활성을 조사하기 위해 먹장어 (Eptatretus burgeri)의 장관 (intestine)을 이용하였다. 그 결과는 도 1과 같다.

신경성 펩타이드의 분리 및 정제

먹장어 장관에 대해 강한 수축활성을 나타낸 RM 60은 농도 구배법에 따라 0 M, 0.5 M과 1.0 M NaCl를 포함하는 20 mM 인산 버퍼 용액(phosphate buffer solution; PBS) (pH 6.0)을 이용하여 CM-셀룰로오스(CM-cellulose) 칼럼으로 분리하였다.

CM-셀룰로오스를 사용하여 분리된 시료들은 먹장어 장관을 이용하여 수축반응을 측정하였다. 이 후 실험은 먹장어 장관에 가장 좋은 수축활성을 가지는 NaCl이 포함되지 않는 20 mM PBS (pH 6.0)에서 분리되어진 시료를 이용하였다. 순수한 단일물질을 얻기 위해서 연속적인 8단계의 HPLC를 수행하였다. 각각의 HPLC 정제를 통해 얻어진 분획들은 먹장어 장관에 대해 수축활성 측정되었고, 얻어진 활성분획들은 농축 후 다시 다음 단계의 HPLC 정제를 위하여 사용하였다.

C ₁₈ column을 이용한 HPLC 분리

'Reversed-phase HPLC (Vydac C₁₈, 7.5×250 mm) column'에 적용하여 A 용매로 0.1% TFA 수용액 (pH 2.2)과 B 용매로서 0.1% TFA를 포함한 100% 아세토나트라일(acetonitrile) (pH 2.2) 사용하여 0 →100%의 B 용매로 농도경사를 주었고 유속은 2.0 ml/min으로 200 분간 분리하였다(도 2).

양이온 교환 HPLC를 이용한 분리

HPLC 정제는 첫 번째 역상 HPLC에서 활성을 나타낸 활성분획들을 농축시켜, 양이온 교환 HPLC에 적용하였다. 컬럼으로는 TSKgel SP-5PW (7.5 ×75 mm, Tosho)를 사용하였으며, A 용매로 10 mM PBS (pH 6.0)와 B 용매로서 1.0 M NaCl 용액을 포함하는 10 mM PBS (pH 6.0)을 사용하여 0 →1.0 M NaCl로 농도경사를 주었고 유속은 0.5 ml/min으로 200 분간 분리를 행하였다(도 3).

C ₁₈ column을 이용한 HPLC 분리

양이온 교환 HPLC에서 활성 분획을 모아 세 번째 'reversed-phase HPLC'는 'μ-Bondapak C₁₈(3.9×300 mm, Waters) 컬럼'을 이용하였으며 첫 단계 'reversed-phase HPLC'에서 사용한 A 용매와 B 용매를 사용하여 5 →35%의 B 용매 농도경사로 유속 1.0 ml/min으로 60 분간 분리를 행하였다(도 4).

친화도(affinity) 칼럼을 이용한 HPLC 분리

'Affinity 컬럼'을 사용하여 분리하였으며, 이 때 사용한 컬럼은 'Heparin-5PW (7.5 ×75 mm, Tosho)'이고 두 번째 단계와 동일한 조건에서 분리를 행하였다. HPLC 수행에 이용된 용매는 A 용매로 Tris-HCl 완충액 (pH 6.1)과 B 용매로 1.0 MNaCl 용매가 첨가된 Tris-HCl 완충액 (pH 6.1)를 사용하였다(도 5).

C ₁₈ column을 이용한 HPLC 분리

'μ- Bondapak C₁₈(3.9×300 mm, Waters) 컬럼'을 이용하여 세 번째 단계에서 사용한 A 용매와 B 용매를 사용하여 0 →15%의 B 용매로 농도 경사를 주어 75 분간 피크(peak) 별로 분리하였다(도 6).

양이온 교환 HPLC를 이용한 분리

양이온 교환 (TSKgel SP-5PW, 7.5 ×75 mm, Tosho, Japan) HPLC를 이용해서 두 번째와 같은 조건, 동일 컬럼과 동일 용매 하에서 피크 별로 분리하였다.

C ₁₈ column을 이용한 HPLC 분리

'Spherisorb ODS2 (4×125 mm, HEWLETT PACKARD)'를 수행하였다. 다섯번째 'reversed-phase HPLC'에서 사용한 A 용매와 B 용매를 사용하여 5 →45%의 B 용매로 농도 경사를 주고 유속 0.5 ml/min 조건에서 피크 별로 분리하였다(도 7).

신경성 펩타이드 최종정제

역상 HPLC C₁₈(Spherisorb ODS2, 4 ×125 mm, HEWLETT PACKARD) 컬럼에 적용하여 유속 0.5 ml/min의 조건으로 0.1% TFA를 포함하는 19% 아세토나이트라일 용매하에서 아이소크래틱(isocratic)하게 용출시켰다(도 8). 순수하게 분리된 신경성 펩타이드는 편의상 HFS-OH로 명명하였다.

천연 펩타이드의 분자량 측정 및 아미노산 서열 결정

먹장어 피부로부터 정제되어 먹장어 장관에 대해 수축활성을 가지는 펩타이드는 'MALDI-TOF MASS (Voyager-DE^TMSTR, Perseptive Biosystems)'를 통해 분자량을 측정하였고, 먹장어 피부로부터 정제되어 먹장어 장관에 대해 수축활성을 가지는 펩타이드는 펩타이드 시퀀스 분석(Shimazu PPSQ-21A protein sequencer)을 사용하여 에드만 (Edman) 분해법으로 아미노산 서열을 결정하였다.

최종 정제한 펩타이드의 분자량은 875.8 Da이였고(도 9), 아미노산서열은 Gly-Thr-Ala-Gly-Ile-Gly-Pro-Phe-Arg로 구성된 노나펩타이드(nonapeptide)로 밝혀졌다(표 1).

아미노산 서열분석기를 통한 아미노산 서열과 질량측정기를 통한 질량조사

사이클 번호	Phenylthiohydantion amino acid	수율(pmol)	m/z
1	Gly	67	875.8 Da
2	Thr	38
3	Ala	70
4	Gly	30
5	Ile	33
6	Gly	18
7	Pro	15
8	Phe	27
9	Arg	3

상기 노나펩타이드의 아미노산 서열의 유사성을 조사한 결과, 정제한 펩타이드는 기존에 알려진 BK들과 유사성을 지니고 있었다(표 2).

다양한 척추동물로부터 분리된 BK-관련 펩타이드의 일차적 구조의 조성비교

종류	아미노산 시퀀스	참고문헌
포유동물	Arg	-	Pro	-	Pro	-	Gly	-	Phe	-	Ser	-	Pro	-	Phe	-	Arg	1)
닭	-^*		-		-		-		-		Thr		-		Leu		-	2)
악어	-		-		-		-		-		Thr		-		-		-	3)
거북이	-		-		-		-		-		Thr		-		-		-	4)
도마뱀	-		-		-		-		-		Thr		-		-		-	5)
불스네이크(Bullsnake)	Val		-		-		-		-		Thr		-		-		-	6)
암피우마(Amphiuma)	Phe		Ile		-		-		Leu		-		-		-		-	6)
폐어	Tyr		Gly		-		-		-		-		Ala		Pro		-	6)
송어	-		-		-		-		Trp		-		-		Leu		-	7)
대구	-		-		-		-		Trp		-		-		Leu		-	8)
보우핀(Bowfin)	-		-		-		-		Trp		-		-		-		-	8)
동갈치(Gar)	-		-		-		-		Trp		-		-		-		-	8)
철갑상어	Met		-		-		-		Met		-		-		-		-	6)
먹장어	Gly		Thr		Ala		-		Ile		Gly		-		-		-
^*Dash (-) 는 동일함을 의미.1) Schluter, H., D. Mentrup, I. Grpb, H. E. Meyer, B. Spengler, R. Kaufmann and W. Zidek. 1997. Identification of endogenous Des-Arg9-[Hyp3]-bradykinin in human plasma with post-source-decay matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Anal. Biochem., 246, 15∼19.2) Werle, E., K. Hochstrasser and I. Trautschold. 1966. Studies of bovine plasma kininogen, ornitho-kallikrein and ornitho-kini. In: Erdos E. Bace N., Sicuteri F., Wilde, AF., editors. Hypotensive peptides, New York : Springer-verlag, pp. 105∼115.3) Erdos E. G., I. Miwa and W. J. Graham. 1967. Studies on the evolution of plasma kinins : reptilian and avian blood. Life Sci., 6, 2433∼2439.4) Seki, T., I. Miwa, T. Nakajima and E. G. Erdos. 1973. Kallikrein-kinin system in nonmammalian blood : evolution aspects. Am. J. Physiol., 224, 1425∼14305) Li, Z., M. P. Smith, D. W. Duff, B. A. Barton, K. R. Olson and J. M. Conlon. Purification and cardiovascular activity of [Met1, Mat5]-bradykininfrom the plasma of a sturgeon (Acipenseriformes). Peptides, 19, 635∼6416) Li, Z., S. M. Secor, V. A. Lance, M. Masii, M. Vallarino and J. M. Conlon. 1998 Characterization of bradykinin-related peptides generated in the plasma of six sarcopterygian species (African lungfish, amphiuma, coachwhip, bullsnake, gila monstar and gray's monitor). Gen. Comp. Endocrinol., 112, 108∼114.7) Conlon, J. M., J. C. Le Mevel, D. Conklin, L. Weaver, D. W. Duff and K. R. Olson. 1996. Isolation and cardiovascular activity of a second bradykinin-related peptide ([Arg0, Trp5, Leu8] bradykinin)from trout. Peptides, 17, 531∼537.8) Platzack, B. and J. M. Conlon. 1997. Purification, structural characterization and cardiovascular activity of cod bradykinins. Am. J. Physiol., 272, R710∼717.

따라서, 본 발명에서 먹장어 피부로부터 정제된 펩타이드는 BK-관련 펩타이드로 판명되었다. 포유류 BK와 본 연구에서 정제한 먹장어 BK를 비교했을 때 Arg¹→ Gly, Pro²→ Thr, Pro³→ Ala, Phe⁵→ Ile 및 Ser⁶→ Gly로 다섯 개의 아미노산이 각각 치환되어 있으며, Gly⁴와 C말단에 존재하는 3개의 아미노산은 잘 보존되어 있었다. 포유류 BK의 아미노산 서열과 다른 동물 유래의 BK-관련 펩타이드와의 아미노산 서열을 비교하였을 때(상기 표 2), 원구류인 먹장어 피부에서 유래된 먹장어 BK에서 더욱 더 많은 아미노산의 치환이 일어났음을 알 수 있다. 이전의 연구에 의하면 포유류 BK에서 Gly⁴와 C말단의 Phe⁸은 토끼 대동맥, 경정맥(jugular vein) (Regoli, D. and J. Barabe. 1980. Pharmacology of bradykinin and related kinins. Pharmacol. Rev., 32, 1∼46.) 및 쥐 자궁(Stewart, J. M. 1979. Chemistry and biologic activity of peptides related to bradykinin. Handb. Exp. Pharmacol. 25, 227∼272.)에 대해서 활성을 나타내기 위해 중요한 역할을 한다고 제시된 바가 있다. 따라서 Gly⁴와 C 말단부가 잘 보존된 먹장어 BK도 여러 조직들에 대해 포유류 BK와 유사한 생리활성을 나타낼 수 있다는 것을 제시한다고 할 수 있었다.

실시예 2: 펩타이드의 합성 및 정제

아미노산 서열분석과 분자량 분석 결과에 따라 정제한 펩타이드는 Fmoc-법을 이용한 고상법으로 합성하였다(Park, N. G., J-K. Seo, H-J. Ku, S. Lee, G.Sugihara, K-H. Kim, J-S. Park and S-W. Kang. 1997. Conformation and biological activity of mastoparan B and its analogs Ⅰ. Bull. Korean Chem. Soc., 18, 50∼56). HFS-OH는 Fmoc-Arg (Pmc)-Alko PEG Resin (0.19 mmol/g)을 0.1 mmol 스케일(scale)로 사용하여 DMF로 팽윤 (swelling)을 시킨 후, 20%의 piperidine/DMF를 이용하여 Fmoc-보호기를 떼어내었다. DIPCI/HOBT법을 이용하여 결합시키고자 하는 아미노산의 카르복실기를 에스테르 형태로 활성화시켜, 수지에 도입을 하여 도입이 완료된 수지는 DMF로 세정을 한 후, 다시 20% piperidine/DMF를 이용해서, 도입된 아미노산의 Fmoc-기를 떼어 낸 후, DMF로 세정하고, 다음의 아미노산을 DIPCI/HOBT법을 이용하여 결합을 시켰다. 이와 같은 과정을 순차적으로 반복하여, 완전한 펩타이드 사슬을 수지에 성장시켰다. 각 아미노산의 축합단계에 필요한 조작과정은 표 3에 요약하였다.

고상법에 의한 펩타이드 합성을 위한 과정

단계	리에이전트	오퍼레이션	혼합시간/분
1	DMF	3×Washing	3
2	20% piperidine/DMF	2×Deprotection1×Deprotection	320
3	DMFFmoc-amino acid	6×Washing	1
4	HOBt/DMFDIPCI in DMF	coupling	90
5	DMF	3×Washing	1

펩타이드-수지의 절단과 탈보호- 합성 펩타이드에 연결되어있는 수지와 측쇄 (side chain)의 보호기를 제거하기 위해서 절단시약 (TFA :m-cresol :thioanisole : EDT = 5 : 0.6 : 1.7 : 0.9)을 사용하여 실온에서 90 분 동안 반응을 시켰다. 반응 후, 수지를 여과한 다음 펩타이드 용액을 진공농축하였다. 계속해서 농축액에 차가운 에테르를 첨가하여 펩타이드를 결정화시켰다.

합성펩타이드의 정제- 수지로부터 단리한 미정제 (crude) 펩타이드들은 10% 초산으로 평형화된 세파덱스(Sephadex) G-25 컬럼 (2.6 ×110 cm)을 이용하여 부분적으로 정제하였고, 유속 90 ml/h, 흡광도 254 nm, 부피 15 ml/fraction의 분리조건이었다. 부분 정제한 펩타이드를 동결 건조한 후, 'μ-Bondapak C18 (7.8 ×300 mm) 컬럼'을 사용하여 A 용매로 0.1% TFA 수용액 (pH 2.2)과 B 용매로서 0.1% TFA를 포함한 100% 아세토나이트라일 (pH 2.2) 사용하여 10 →30%의 B 용매로 40 분간 농도 경사를 걸어 유속 3.0 ml/min의 조건에서 분리하였다. 두 번째 HPLC 정제는 양이온 교환 HPLC에 적용하였다. 컬럼으로는 TSKgel SP-5PW (7.5 ×75 mm, Tosho)를 사용하였으며, A 용매로 10 mM PBS (pH 6.0)와 B 용매로서 1.0 M NaCl 용액을 포함하는 10 mM PBS (pH 6.0)을 사용하여 0 →0.3 M NaCl 용매 농도 경사를 주었고 유속은 0.5 ml/min으로 60 분간 분리를 행하였다. 합성 펩타이드들을 최종정제하기 위해 아이소크래틱(isocratic)한 용출방법으로 스페리소르브(Spherisorb) ODS2 (4 ×125 mm) 컬럼을 사용하였다.

천연물과 합성물의 비교

천연물과 합성물의 동일함을 비교하기 위해 동일 조건하에서 천연물 펩타이드와 합성 펩타이드를 각각 용출시켜 피크의 단일화 및 머무름 시간(rentention time)을 비교하였다. 그 결과, 천연물 펩타이드와 합성 펩타이드는 같은 시간에 용출이 되었다. 따라서, 두 펩타이드가 같은 화학적 성분을 가진다고 할 수 있었다.

실험예 1 : 평활근 수축활성 측정

먹장어 (Eptatretus burgeri) BK의 평활근 수축활성을 조사하기 위하여 먹장어 장관 평활근을 이용하였으며, 비교 물질로는 기존에 알려져 있는 포유류 BK를 사용하였다. 먹장어 장관의 표본을 만들기 위해 배측부를 항문 쪽으로부터 절개한 후, 항문 쪽으로부터 0.5 cm 떨어진 부위로부터 위쪽으로 장관을 3 ∼ 4 cm 길이로 재빨리 적출하였다. 적출된 장관의 결체조직을 제거하고 면실로 10 ∼ 15 mm 정도의 길이로 양끝을 묶은 후, 아래쪽 말단을 반응조 내의 지지봉에 고정하고 다른 한 쪽 끝을 아이소메트릭 트랜듀서(isometric tranducer)에 연결하였다. 연결된 장관에 1.0 g의 장력을 준뒤, 실온에서 15 분 간격으로 인공해수 (55 mM Mg ASW)를 교체하며 평형화시켰다.

수축반응의 양성 대조구로서는 콜린작동성 수용체 길항물질(cholinergic receptor agonist)인 카르바콜(carbachol)에 대한 수축반응으로 확인하였다. 활성 측정시 사용한 인공 해수 완충액의 조성은 다음과 같다; (mM) NaCl 445, KCl 10, CaCl₂·2H₂O10, MgCl_2·6H₂O 55, 글루코스 10, 0.5 M Tris-HCl 완충액 (pH 7.8) 20 ml. 수축활성 측정은 실온에서 반응조 내에 공기를 주입하면서 각 HPLC 정제단계에서 얻은 분획들을 반응조에 주입하였다. 분획들을 주입한 후 생체반응측정기로 수축활성을 측정하였다.

농도의존적으로 약리활성의 측정은 행하였으며, 포유류 BK 및 먹장어 BK의 수축활성 측정은 5×10^-7M 카르바콜의 최대수축에 대한 상대적인 수축 %로서 나타내었다. 모든 약리활성은 ED₅₀(최고수축의 50%를 나타낼 때의 농도) 및 Emax(최고 수축%)로써 비교하였다. ED₅₀값은 최소자승법으로 계산하였으며, 통계적 처리는 'student's t-test'로서 하였다. 모든 반응은 평균±S.E로 표시하였다.

그 결과, 도 10에서 나타내듯이 먹장어 BK는 10^-11M에서 역치값을 보였지만, 포유류 BK는 먹장어 BK보다 약 100배 높은 10^-9M에서 역치값을 나타냈다. 또한 수용체에 대해 친화도를 나타내는 척도인 ED₅₀은 먹장어 BK가 2.0×10^-10M, 포유류 BK가 1.2×10^-7M의 값으로 먹장어 BK가 1,000배 정도 낮게 나타났기 때문에 먹장어 BK가 먹장어 장관에 대해 수용체 친화도가 현저하게 높음을 알 수 있었다. 최대 반응 역시 먹장어 BK가 141±11%로 포유류 BK 보다 약 22% 높게 나타났기 때문에 먹장어 BK가 포유류 BK보다 먹장어 장관에 대해서 특이적인 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

이상, 상기와 같이, 본 발명은 원구류인 먹장어 (Eptatretus burgeri) 피부로부터 분리되고, 먹장어 장관 평활근에 대한 수축반응의 ED₅₀값이 혈관이완, 기관지 수축 및 소화관 수축의 활성을 가짐이 보고된 바 있는 포유류 브래디키닌보다 약 10³배 낮게 나타나며, 그 크기가 작아 화학적 합성에도 적합하여 대량생산이 용이한 Gly-Thr-Ala-Gly-Ile-Gly-Pro-Phe-Arg 함유 펩타이드를 제공하므로 의약 및 생물산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

<110> EDUCATIONAL FOUNDATION KEIMYUNG CHRISTIAN ACADEMY <120> A neuropeptide from hagfish, Eptatretus burgeri and its coding DNA, RNA sequence therefrom <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 1 Gly Thr Ala Gly Ile Gly Pro Phe Arg 1 5

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 평활근 수축용 신경성 폴리펩타이드.
제 1항에 있어서,

상기 아미노산 서열의 C말단은 카르복실화 또는 아마이드화 된 것을 특징으로 하는 평활근 수축용 신경성 펩타이드.
제 1항에 있어서,

상기 아미노산 서열은 N 말단은 아민기에 알킬 또는 아세틸기가 치환된 것을 특징으로 하는 평활근 수축용 신경성 펩타이드.
제 1항에 있어서,

상기 아미노산 잔기들은 L-타입 또는 D-타입인 것을 특징으로 하는 평활근 수축용 신경성 펩타이드.
서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 영역을 포함하는 DNA 또는 RNA로 구성된 것을 특징으로 하는 평활근 수축용 신경성 펩타이드 코딩 폴리뉴클레오타이드.