CN1904150B - 一种人胰高血糖素样肽-1衍生物及其固相化学合成 - Google Patents

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Abstract

一种具有人胰高血糖素样肽-1活性的人胰高血糖素样肽-1衍生物及其制备和应用，属于生物工程技术领域。该衍生物的分子结构式为以下的三种结构式：GLP-1(7-37)-Xaa38(Seq ID No.2)，GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39(Seq ID No.3)和GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39-Xaa40(Seq ID No.4)之一，其中Xaa38，Xaa39和Xaa40分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一个氨基酸。采用固相化学合成制备该衍生物。该衍生物具有长于GLP-1的半衰期；通过固相化学合成制备，生产步骤少，生产成本低，特别适于在制备治疗糖尿病的药物中作该药物的活性成分。

Description

一种人胰高血糖素样肽-1衍生物及其固相化学合成
技术领域
本发明涉及一种具有人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)活性的人胰高血糖素样肽-1衍生物(GLP-1衍生物)及其固相化学合成，属于生物工程技术领域。
背景技术
1929年，Zunz和Labbare将一类从肠道中分离出来的、可以促进葡萄糖刺激胰岛素分泌的体液因子命名为肠降糖素(incretin)，GLP-1是其中的主要成分。GLP-1在体内有两种形式，一种为GLP-1(7-36)-NH2，由30个氨基酸残基组成，另一种为GLP-1(7-37)，由31个氨基酸残基组成，二者有相同的生物学活性。GLP-1是进食后由远端回肠、结肠和直肠的L细胞分泌释放的氨基酸的多肽激素，对糖代谢和胃肠道运动及分泌有很强的作用。GLP-1通过与胰岛β细胞表面的特异受体相互作用，使葡萄糖诱导的胰岛素分泌作用显著增强，同时还具有维持并增加胰岛β细胞数目、抑制肠胃排空及抑制胰高血糖素的分泌等作用。GLP-1的促胰岛素分泌作用依赖于葡萄糖的浓度，当血糖浓度高于6mmol/L时，GLP-1显著促进胰岛素分泌，而一旦血糖恢复至正常值则不再继续作用，因此，用其治疗糖尿病不会发生低血糖，对于II型糖尿病的预防和治疗具有良好的应用前景。
但是，GLP-1在体内很容易被二肽酰基肽酶IV(DipeptidylPeptidase 4，DPP IV)降解为脱去His7-Ala8-残基的无活性的GLP-1(9-37)或GLP-1(9-36)-NH2。静脉注射GLP-1在体内的半衰期仅为3～5分钟。因此GLP-1在临床应用上还是存在很大的缺陷，迫切需要开发半衰期较长的具有更好临床使用价值的GLP-1衍生物。
目前GLP-1治疗糖尿病的研究方向之一是通过对GLP-1的结构进行改变，得到GLP-1衍生物，用该衍生物治疗糖尿病，达到延长药物在体内的药效时间的目的。已有的GLP-1衍生物都显示出稳定性增加，且体内生物活性仍能维持的性质。如在C端进行脂肪酸修饰制备的GLP-1衍生物具有与血浆白蛋白结合能力增强的特性，能延长其生物活性，与天然GLP-1相比，半衰期已显著延长，但是，仍然存在制备和纯化困难等缺陷。
背景技术采用DNA重组技术制备GLP-1衍生物，见本申请人申请的申请号和发明名称分别为“200610024355.X”和“一种人胰高血糖素样肽-1衍生物及其制备和应用”的发明专利。背景技术虽能制备GLP-1衍生物，但有以下缺点：利用大肠杆菌作为GLP-1衍生物表达的宿主菌，在后续纯化过程中，需要检测和控制大肠杆菌内毒素以及大肠杆菌DNA的残留量，增加了生产步骤和生产成本。
发明内容
GLP-1在体内有两种形式，一种为GLP-1(7-36)-NH2，由30个氨基酸残基组成，另一种为GLP-1(7-37)，由31个氨基酸残基组成，二者有相同的生物学活性。本发明涉及的GLP-1指GLP-1(7-37)，其序列(Seq ID No.1)罗列如下：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly。
本发明提出的GLP-1衍生物具有以下三种结构：GLP-1(7-37)-Xaa38(Seq ID No.2)，GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39(Seq ID No.3)和GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39-Xaa40(Seq ID No.4)之一，所述的GLP-1衍生物具有Seq ID No.2结构时，Xaa38＝Cys，所述的GLP-1衍生物具有Seq ID No.3结构时，Xaa38和Xaa39分别＝Cys和Gly，或Gly和Cys，所述的GLP-1衍生物具有Seq ID No.4结构时，Xaa38，Xaa39和Xaa40分别＝Cys、Ala和Gly，Ala、Cys和Gly，或Ala、Gly和Cys。该衍生物不仅保持了天然GLP-1在体内的活性，还明显延长了体内药效时间，体内药效时间至少可持续3小时，具有良好的临床使用价值。
本发明的目的是提供固相化学合成上述衍生物的方法。
固相化学合成法在制备少于40个氨基酸的小肽工艺十分成熟，具有快速、纯化简便等优点，且在后续处理过程中不存在检测内毒素等问题，生产步骤少，生产成本低。为实现上述目的，本发明的技术方案选用固相化学合成法来制备GLP-1衍生物。
现详细说明本发明的技术方案。
一种GLP-1衍生物的固相化学合成方法，其特征在于，所述的GLP-1衍生物具有以下三种结构：GLP-1(7-37)-Xaa38，即Seq IDNo.2，GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39，即Seq ID No.3和GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39-Xaa40，即Seq ID No.4之一，所述的GLP-1衍生物具有Seq ID No.2结构时，Xaa38＝Cys，所述的GLP-1衍生物具有Seq ID No.3结构时，Xaa38和Xaa39分别＝Cys和Gly，或Gly和Cys，所述的GLP-1衍生物具有Seq ID No.3结构时，Xaa38，Xaa39和Xaa40分别＝Cys、Ala和Gly，Ala、Cys和Gly，或Ala、Gly和Cys，具体操作步骤：
(1)用的带保护基的氨基酸单体共有17个，它们是：Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Leu-OH  、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，其中缩写表示：
Fmoc：9-芴基甲氧羰基
Boc：叔丁氧羰基即tert-butyloxycarbonyl
Trt：三苯甲基即trityl
OtBu：叔丁基酯
tBU：叔丁基即tert-butyl
Pbf：2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-苯磺酰基；
(2)需用的仪器设备及试剂
仪器：SYMPHONY型12通道多肽合成仪，型号：SYMPHONY，美国产品；
试剂：N-甲基吡咯烷酮，二氯甲烷，六氢吡啶，甲醇，二甲氨基吡啶即Dimethylaminopyridine/DMF，N，N-二异丙基乙胺即N，N-diisopropylethylamine/NMP，HBTU 100mmol/0.5M HOBT in DMF，N，N-二环己基碳二亚胺即N，N-Dicyclohexylcarbodiimide/NMP，其中：DMF为N，N-二甲基甲酰胺
NMP为N-甲基吡咯烷酮
HOBT为1-羟基苯并三唑
HBTU为2-(1氢苯并三唑基)-四甲基脲六氟磷酸盐(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluroniumhexafluoropho sphate)；
(3)操作
第一步 多肽树脂的合成
以0.25mmol规模为例，称取王氏树脂0.25g，置入SYMPHONY型12通道多肽合成仪上的反应器中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列即Seq ID No.2，Seq IDNo.3或Seq ID No.4从C-端向N-端排列在所述的合成仪中，25℃下，由计算机程序控制自动进行脱Fmoc保护、活化、连接，然后再进行下一轮循环，如此完成合成，得到带侧链保护基的多肽树脂，在所述的合成仪上吹干、称重；
第二步 脱保护基及切断树脂
将第一步得到的带侧链保护基的多肽树脂置于具塞三角烧瓶，加入下列裂解试剂：0.25mL水、0.25mLEDT，即1，2乙二硫醇、1mL TIS，即三乙丙基硅烷、9.45mL三氟乙酸
，然后在30℃下，电磁搅拌反应2小时，过滤，收集滤液，树脂用三氟乙酸洗涤，合并收集液与洗涤液，加入乙醚产生沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤，干燥，得粗品；
第三步HPLC分离纯化、冷冻干燥
将第二步得到的粗品用制备型HPLC进行分离纯化，再经冷冻干燥，得产品GLP-1衍生物。
制得的产品GLP-1衍生物具有上述提出的GLP-1衍生物的氨基酸序列。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步详述本发明的技术方案。说明书及以下实施例中所用带保护基的氨基酸单体以及其他化学试剂等，均可以从相关公司购买获得，未注明具体条件的实验方法，可按常规条件进行，或按商品供货商所建议的条件进行。所有的实施例均使用发明内容中的合成方法规定的仪器设备及试剂和按照发明内容中的合成方法规定的步骤进行操作，这里就不重复，所有的实施例仅罗列与各自产品有关的关键步骤。
实施例1固相化学合成法合成本发明的GLP-1衍生物，该衍生物氨基酸序列为GLP-1(7-37)-Xaa38即Seq ID No.2，其中Xaa38＝Cys，操作步骤：
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列即Seq ID No.2，从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品GLP-1衍生物，该产品的氨基酸序列为Seq ID No.2，在该序列中，第38位上的氨基酸为Cys。
实施例2固相化学合成法合成本发明的GLP-1衍生物，该衍生物氨基酸序列为GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39即Seq ID No.3，其中Xaa38＝Cys，Xaa39＝Gly，操作步骤：
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列即Seq ID No.3，从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：
Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品GLP-1衍生物，该产品的氨基酸序列为SeqID No.3，在该序列中，Xaa38＝Cys，Xaa39＝Gly。
实施例3 固相化学合成法制备本发明的GLP-1衍生物，该衍生物氨基酸序列为GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39即Seq ID No.3，其中Xaa38＝Gly，Xaa39＝Cys，操作步骤：
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.3)，从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品GLP-1衍生物，该产品具有本发明提出的GLP-1衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.3)，在该序列中，Xaa38＝Gly，Xaa39＝Cys。
实施例4固相化学合成法制备本发明的GLP-1衍生物，该衍生物具有以下结构：GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39-Xaa40(SeqID No.4)，其中Xaa38＝Cys，Xaa39＝Ala，Xaa40＝Gly，操作步骤：
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.4)，从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：
Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品GLP-1衍生物，该产品具有本发明提出的GLP-1衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.4)，在该序列中，Xaa38＝Cys，Xaa39＝Ala，Xaa40＝Gly。
实施例5固相化学合成法制备本发明的GLP-1衍生物，该衍生物具有以下结构：GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39-Xaa40(Seq IDNo.4)，其中Xaa38＝Ala，Xaa39＝Cys，Xaa40＝Gly，操作步骤：
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.4)，从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：
Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品GLP-1衍生物，该产品具有本发明提出的GLP-1衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.4)，在该序列中，Xaa38＝Ala，Xaa39＝Cys，Xaa40＝Gly。
实施例6固相化学合成法制备本发明的GLP-1衍生物，该衍生物具有以下结构：GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39-Xaa40(Seq IDNo.4)，其中Xaa38＝Ala，Xaa39＝Gly，Xaa40＝Cys，操作步骤：
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.4)，从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品GLP-1衍生物，该产品具有本发明提出的GLP-1衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.4)，在该序列中，Xaa38＝Ala，Xaa39＝Gly，Xaa40＝Cys。
实施例7 GLP-1衍生物的降血糖作用。
实验材料与方法：
雄性健康昆明小鼠(清洁级，上海复旦大学医学院动物中心提供)；
50％葡萄糖溶液；
0.9％NaCl溶液；
GLP-1；
mGLP-1，具有实施例1-6所述GLP-1衍生物的结构；
血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司出品)。
雄性健康昆明小鼠禁食过夜，分为8组(n＝8)。1，葡萄糖对照组；2，GLP-1给药对照组；3～8，mGLP-1给药组，具体的序列结构是实施例1-6中所述的结构。GLP-1给药对照组2腹腔注射100μL50％葡萄糖溶液和0.4μg的GLP-1，mGLP-1给药组3～8，每组分别腹腔注射100μL 50％葡萄糖溶液和0.4μg的mGLP-1，记此时为零时刻。分别于10、30、60、90、120、150、180分钟进行小鼠尾静脉取血10μL，用血糖测试仪测定血糖浓度。为长时间观察mGLP-1降血糖作用，于60、150分钟小鼠尾静脉取血后立即再次给予50μL 50％葡萄糖溶液，以检验mGLP-1降血糖作用。葡萄糖对照组只注射50％葡萄糖溶液，不给予GLP-1和mGLP-1，按相同时间间隔测定血糖。
结果如表1所示，所示数值均为n＝8的均值。表1中所示的降糖率按如下方法计算：降糖率(％)＝(葡萄糖对照组血糖值-给药组血糖值)/葡萄糖对照组血糖值。与葡萄糖组小鼠相比，在给药后30分钟之内，GLP-1给药对照组能降低小鼠血糖，而mGLP-1给药组在180分钟内仍能降低小鼠血糖，药效持续时间比GLP-1延长。结果还显示，当小鼠体内血糖较低时，mGLP-1显示出较低的降血糖活性，见表1中60、120、150分钟的结果，而当小鼠体内血糖较高时，mGLP-1显示出较高的降血糖活性，见表1中30、90分钟的结果，提示mGLP-1不会引起低血糖，用于治疗糖尿病更加安全。结果还显示，按本发明方法制备出的mGLP-1均表现出与DNA重组技术制备的mGLP-1具有相似的降血糖活性，而且较之GLP-1具有更加长效的降血糖的生物学活性。
表1mGLP-1的降血糖作用
本发明涉及的GLP-1衍生物的氨基酸序列计有以下4条。现详细示于以下序列表。
序列表
<110>华东师范大学
<120>一种人胰高血糖素样肽-1衍生物及其制备和应用
<160>4
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
                 5                  10                  15
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
                 20                 25                  30
Gly
<210>2
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(32)
<223>Xaa＝Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr
<400>2
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
                 5                  10                  15
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
                 20                 25                  30
Gly Xaa
<210>3
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(32，33)
<223>Xaa＝Cys或Ala，Gly，His，Ser，Thr
<400>3
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
                 5                  10                  15
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
                 20                  25                 30
Gly Xaa Xaa
<210>4
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(32，33，34)
<223>Xaa＝Cys或Ala，Gly，His，Ser，Thr
<400>4
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
                 5                  10                  15
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
                 20                 25                  30
Gly Xaa Xaa Xaa

Claims (7)

1.一种GLP-1衍生物的固相化学合成方法，其特征在于，所述的GLP-1衍生物具有以下三种结构：GLP-1(7-37)-Xaa38，即Seq ID No.2，GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39，即Seq ID No.3和GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39-Xaa40，即Seq ID No.4之一，所述的GLP-1衍生物具有Seq ID No.2结构时，Xaa38＝Cys，所述的GLP-1衍生物具有Seq ID No.3结构时，Xaa38和Xaa39分别＝Cys和Gly，或Gly和Cys，所述的GLP-1衍生物具有Seq ID No.4结构时，Xaa38，Xaa39和Xaa40分别＝Cys、Ala和Gly，Ala、Cys和Gly，或Ala、Gly和Cys，具体操作步骤：
(1)需用的带保护基的氨基酸单体共有17个，它们是：Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，其中缩写表示：
Fmoc：9-芴基甲氧羰基
Boc：叔丁氧羰基，即tert-butyloxycarbonyl
Trt：三苯甲基，即trityl
OtBu：叔丁基酯
tBU：叔丁基，即tert-butyl
Pbf：2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-苯磺酰基；
(2)需用的仪器设备及试剂
仪器：SYMPHONY型12通道多肽合成仪，型号：SYMPHONY，美国产品
试剂：N-甲基吡咯烷酮，二氯甲烷，六氢吡啶，甲醇，二甲氨基吡啶即Dimethylaminopyridine/DMF，N，N-二异丙基乙胺即N，N-diisopropylethylamine/NMP，HBTU 100mmol/0.5M HOBT inDMF，N，N-二环己基碳二亚胺即N，N-Dicyclohexylcarbodiimide/NMP，
其中：DMF为N，N-二甲基甲酰胺
NMP为N-甲基吡咯烷酮
HOBT为1-羟基苯并三唑
HBTU为2-(1氢苯并三唑基)-四甲基脲六氟磷酸盐，即2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluronium hexafluorophosphate；
(3)操作：
第一步  多肽树脂的合成
以0.25mmol规模为例，称取王氏树脂0.25g，置入SYMPHONY型12通道多肽合成仪上的反应器中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列，即Seq ID No.2，Seq IDNo.3或Seq ID No.4从C-端向N-端排列在所述的合成仪中，25℃下，由计算机程序控制自动进行脱Fmoc保护、活化、连接，然后再进行下一轮循环，如此完成合成，得到带侧链保护基的多肽树脂，在所述的合成仪上吹干、称重；
第二步脱保护基及切断树脂
将第一步得到的带侧链保护基的多肽树脂置于具塞三角烧瓶，加入下列裂解试剂：0.25mL水、0.25mLEDT即1，2乙二硫醇、1mL TIS即三乙丙基硅烷、9.45mL三氟乙酸，然后在30℃下，电磁搅拌反应2小时，过滤，收集滤液，树脂用三氟乙酸洗涤，合并收集液与洗涤液，加入乙醚产生沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤，干燥，得粗品；
第三步HPLC分离纯化、冷冻干燥
将第二步得到的粗品用制备型HPLC进行分离纯化，再经冷冻干燥，得产品GLP-1衍生物。
2.根据权利要求1所述的GLP-1衍生物的固相化学合成方法，其特征在于，制备的GLP-1衍生物氨基酸序列为Seq ID No.2，在该序列中，Xaa38＝Cys，具体操作步骤：
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列，即Seq ID No.2，从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品GLP-1衍生物，该产品的氨基酸序列为SeqID No.2，在该序列中，第38位上的氨基酸为Cys。
3.根据权利要求1所述的GLP-1衍生物的固相化学合成方法，其特征在于，制备的GLP-1衍生物氨基酸序列为Seq ID No.3，在该序列中，Xaa38＝Cys，Xaa39＝Gly，具体操作步骤：
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列，即Seq ID No.3，从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：
Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品GLP-1衍生物，该产品的氨基酸序列为SeqID No.3，在该序列中，Xaa38＝Cy s，Xaa39＝Gly。
4.根据权利要求1所述的GLP-1衍生物的固相化学合成方法，其特征在于，制备的GLP-1衍生物氨基酸序列为Seq ID No.3，在该序列中，Xaa38＝Gly，Xaa39＝Cys，具体操作步骤：
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列，即Seq ID No.3，从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品GLP-1衍生物，该产品的氨基酸序列为SeqID No.3，在该序列中，Xaa38＝Gly，Xaa39＝Cys。
5.根据权利要求1所述的GLP-1衍生物的固相化学合成方法，其特征在于，制备的GLP-1衍生物氨基酸序列为Seq ID No.4，在该序列中，Xaa38＝Cys，Xaa39＝Ala，Xaa40＝Gly，具体操作步骤：
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列，即Seq ID No.4，从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：
Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品GLP-1衍生物，该产品的氨基酸序列为SeqID No.4，在该序列中，Xaa38＝Cys，Xaa39＝Ala，Xaa40＝Gly。
6.根据权利要求1所述的GLP-1衍生物的固相化学合成方法，其特征在于，制备的GLP-1衍生物氨基酸序列为Seq ID No.4，在该序列中，Xaa38＝Ala，Xaa39＝Cys，Xaa40＝Gly，具体操作步骤：
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生的氨基酸序列，即Seq ID No.4，从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：
Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品GLP-1衍生物，该产品的氨基酸序列为SeqID No.4，在该序列中，Xaa38＝Ala，Xaa39＝Cys，Xaa40＝Gly。
7.根据权利要求1所述的GLP-1衍生物的固相化学合成方法，其特征在于，制备的GLP-1衍生物氨基酸序列为Seq ID No.4，在该序列中，Xaa38＝Ala，Xaa39＝Gly，Xaa40＝Cys，具体操作步骤：
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列，即Seq ID No.4，从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品GLP-1衍生物，该产品的氨基酸序列为SeqID No.4，在该序列中，Xaa38＝Ala，Xaa39＝Gly，Xaa40＝Cys。
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