CN102675410A - 一种分支多肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分支多肽的制备方法，包括如下步骤：a.选择目标肽链的羧基端的第一个氨基酸，在其氨基被保护的条件下将其羧基以共价键的形式与固体载体相连得到氨基酸树脂；b.以步骤a中连接到固体载体上的第一个氨基酸为合成的起点，通过不断重复以下三步骤依次完成目标肽的每一个氨基酸的连接：①氨基端脱保护，洗涤过滤；②在氨基和侧链均保护的条件下与相邻氨基酸的羧基发生缩合酰化反应，形成肽键；③再次过滤洗涤；其中分支部分则是采用含有两个氨基的赖氨酸来实现的；c.通过切割反应和后处理，将目标肽链与氨基酸树脂以及所有的侧链保护基分离，得到目标肽的粗品。本发明利于工艺过程控制和放大；原材料来源稳定，后处理方法简单。

Description

一种分支多肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种分支多肽的制备方法，具体地说是一种属于中长肽的分支多肽的制备方法。
背景技术
RNA病毒的高变异能力对生产针对这类病毒感染的疫苗是极大的挑战，这些病毒主要包括流感病毒、HIV和HCV等。由不同型别流感病毒引起的流感大流行时刻威胁着全球，而现有流感疫苗的保护效果受到疫苗毒株与实际流行株的匹配程度的制约。所以为了研制对甲型流感病毒各种亚型或突变株都有效的通用疫苗，人们将目光投向了流感病毒较为保守的核蛋白(NP)和基质蛋白2(M2)(GS Jimenez，R Planchon，Q Wei，Hum Vaccin，3(5)：157-64，2007；M Schotsaert，M De Filette，W Fiers，Expert Rev Vaccines，8(4)：499-508，2009)。
抗病毒疫苗的保护效果除了与针对的病毒蛋白有关，还与疫苗的类型有关。合成肽疫苗，尤其是筛选病毒的抗原表位并采用人工合成方法制成的表位肽疫苗具有很多优点：可避免不利于免疫应答的表位而选择有利于免疫应答的表位，在保持抗原特异性的基础上诱导免疫应答；可用化学合成的方法制备，研发时间短、工艺简单并且制备过程安全，获得病毒抗原序列信息后可很快完成制备过程，因此适宜应对新发、突发传染病。但抗原表位多是短肽，分子量小，抗原性和免疫原性都很弱，采用中长肽才能发挥疫苗的作用。
对于中长肽的合成，液相合成法的最大障碍在于合成步骤极多(超出100多步)；其次工艺过程过于复杂，变量太多，难以控制和放大；而且原材料来源也受限制。为此，需要研究一种适于属于中长肽的分支多肽的制备方法，以提供一种免疫原性高的分支多肽。该方法有利于工艺过程控制和放大；原材料来源稳定，后处理方法简单(过滤和洗涤)。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种分支多肽的制备方法。该方法适于中长肽的制备，有利于工艺过程控制和放大；原材料来源稳定，后处理方法简单(过滤和洗涤)。尤其适用于制备一种免疫原性高的分支多肽。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
一种分支多肽的制备方法，包括如下步骤：
a.选择目标肽链的羧基端的第一个氨基酸，在其氨基被保护的条件下将其羧基以共价键的形式与固体载体相连得到氨基酸树脂；
b.以步骤a中连接到固体载体上的第一个氨基酸为合成的起点，通过不断重复以下三步过程依次完成目标肽的每一个氨基酸的连接：①氨基端脱保护，洗涤过滤；②在氨基和侧链均保护的条件下与相邻氨基酸的羧基发生缩合酰化反应，形成肽键；③再次过滤洗涤；其中分支部分则是采用含有两个氨基的赖氨酸来实现的；
c.通过切割反应和后处理，将目标肽链与氨基酸树脂以及所有的侧链保护基分离，从而得到目标肽的粗品。
进一步，所述分支多肽自氨基端到羧基端的结构式如下：
(AAN)8-(Lys)4-(Lys)2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg；或
(AAN)4-(Lys)2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg；
其中AAN为甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区，上述分支多肽的羧基端序列Thr-Lys-Pro-Arg为免疫活性肽Tuftsin。
进一步，所述甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区自氨基端到羧基端的的序列如下：
Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp。
进一步，所述步骤c为：加入各组分为分析纯，在常温下按体积比混合的如下切割液TFA∶TA∶EDT∶TIS∶H2O∶苯酚＝7∶1∶1∶0.1∶0.35∶0.5，室温下振荡3-5h；抽滤将氨基酸树脂与滤液分离；再用体积比为20％TFA/DCM洗涤氨基酸树脂3次，洗涤液并入抽滤出的切割液；冰浴下，向滤液中加入0℃的乙醚沉淀出粗肽，抽滤除去溶剂，并用无水乙醚洗涤沉淀3-4次，抽滤去除乙醚，干燥后得目标肽粗品。
进一步，在步骤c之后采用反相高效液相色谱法对目标肽粗品进行纯化，冰冻干燥得目标肽纯品。
进一步，其中氨基酸树脂的取代常数为0.35mmol/g。
进一步，在步骤b中采用茚三酮定性显色法来监测偶合反应终点，其试剂包括：A)5％茚三酮的正丁醇溶液；B)20％苯酚的正丁醇溶液；C)吡啶溶液。
进一步，在步骤b中，以DIC/HOBT的组合作为羧基活化剂，以进行缩合反应。
进一步，在步骤c中，用30％六氢吡啶为去保护剂使保护基分离。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明的分支多肽的制备方法适于中长肽的制备，有利于工艺过程控制和放大；原材料来源稳定，后处理方法简单，仅需过滤和洗涤。尤其适用于制备一种免疫原性高的分支多肽。
附图说明
图1为本发明的分支多肽的制备方法的较佳实施例的制备路线示意图；
图2为本发明的分支多肽的制备方法的较佳实施例的工艺流程图；
图3为本发明的分支多肽的制备方法的较佳实施例的目标产品的精制图谱；
图4为本发明的分支多肽的制备方法的较佳实施例的目标产品的质量检测报告(RP-HPLC)；
图5为本发明的分支多肽的制备方法的较佳实施例的目标产品的质量检测报告(Maldi-TOF MS)；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
下面以名称为H9901的由99个氨基酸组成的四分支多肽作为目标产品为例对本发明的方法进行详细阐述，其氨基酸组成序列如下：
单字母：「(SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD)2-K」2-KTKPR
三字母：「(H-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-
         Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp)2-Lys」2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-OH
化学结构：
Figure BDA0000049595210000041
该目标产品的分支多肽能与M2多克隆抗体特异性结合，能与巨噬细胞特异结合，提高了抗原呈递细胞的工作效率。
本发明的分支多肽的制备方法以固相合成中的Fmoc氨基保护法为基础。以下步骤按中试规模30g氨基酸树脂(取代常数为0.35mmol/g)的用量来进行。生产规模扩大为1kg氨基酸树脂时，应按比例扩大投料量，并适当延长反应时间。
本发明的分支多肽的制备方法的较佳实施例的详细反应式如下：
Figure BDA0000049595210000051
Figure BDA0000049595210000061
Figure BDA0000049595210000071
Figure BDA0000049595210000081
Figure BDA0000049595210000091
Figure BDA0000049595210000101
图1为本发明的分支多肽的制备方法的较佳实施例的制备路线示意图；图2为本发明的分支多肽的制备方法的较佳实施例的工艺流程图；结合图1、图2及上述的反应式，一种分支多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1).准确称取30g Fmoc-Arg(Pbf)-Wang氨基酸树脂，置于1000ml反应器中，加入200ml DCM，振荡溶胀0.5-1h，抽滤除去溶剂。
(2).加150ml 30％Piperidin/DMF(含0.1％HOBt)，室温振荡，反应10min，共3次，去掉N端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，分别用DMF、MeOH、DCM各200ml交替清洗氨基酸树脂各1次，再用DMF、DCM交替清洗氨基酸树脂各3次，每次振荡3min。用茚三酮反应检测，若氨基酸树脂呈现深蓝色，则表明去保护完全，抽滤除去溶剂。
(3).称取10.63g Fmoc-Pro-OH、4.25g HOBt，用DMF和DCM混合溶剂(DMF∶DCM＝1∶3)溶解，加入DIC 3.32ml混合后将混合液加入反应器(反应器内氨基酸树脂∶氨基酸∶DIC∶HOBt＝1∶3∶3∶3，mol)，室温振荡反应3h。用茚三酮反应检测缩合反应是否完全，若溶液呈现黄色，氨基酸树脂无色，证明已无自由氨基，反应完全。抽滤除去反应液后，再分别用DMF、MeOH、DCM交替清洗氨基酸树脂各4次，并抽滤除去溶剂。若茚三酮反应检测缩合反应结果为蓝色，则需要重新进行上述偶合步骤。
(4).重复2、3步，除第3步中加入的氨基酸为14.76gFmoc-Lys(Boc)-OH，其它条件不变，步骤相同。
(5).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为12.52gFmoc-Thr(tBu)-OH以外，其它条件不变，步骤相同。
(6).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为19.68gFmoc-Lys(Fmoc)-OH以外，其它条件不变，步骤相同。
(7).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为39.36gFmoc-Lys(Fmoc)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(8).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为25.92gFmoc-Asp(OtBu)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(9).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为24.16gFmoc-Ser(tBu)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(10).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为24.16gFmoc-Ser(tBu)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(11).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为25.92gFmoc-Asp(OtBu)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(12).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为37.59gFmoc-Asn(Trt)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(13).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为36.90gFmoc-Cys(Trt)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(14).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为40.87gFmoc-Arg(Pbf)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(15).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为36.90gFmoc-Cys(Trt)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(16).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为18.73gFmoc-Gly-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(17).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为33.17gFmoc-Trp(Boc)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(18).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为26.80gFmoc-Glu(OtBu)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(19).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为37.59gFmoc-Asn(Trt)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(20).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为40.87gFmoc-Arg(Pbf)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(21).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为22.26gFmoc-Ile-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(22).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为21.25gFmoc-Pro-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(23).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为25.04gFmoc-Thr(tBu)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(24).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为26.80gFmoc-Glu(OtBu)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(25).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为21.38gFmoc-Val-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(26).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为26.80gFmoc-Glu(OtBu)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(27).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为25.04g Fmoc-Thr(tBu)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(28).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为22.26gFmoc-Leu-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(29).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为22.26gFmoc-Leu-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(30).重复第2、3步，除第3步中加入的氨基酸为25.04gFmoc-Thr(tBu)-OH，HOBt量为8.51g和DIC体积为6.63ml以外，其它条件不变，步骤相同。
(31).加入100ml 30％Piperidine/DMF，室温振荡，反应10min，共3次，去掉N端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用DMF、MeOH、DCM各200ml交替清洗氨基酸树脂各1次，再用DMF、DCM交替清洗氨基酸树脂各3次，每次振荡3min，并抽滤除去溶剂。再用200ml DCM洗涤3次，抽滤除去溶剂。
(32).称量干燥后的氨基酸树脂，并计算氨基酸树脂增重。将氨基酸树脂转移到500ml锥形瓶中，加入200ml切割液(TFA∶TA∶EDT∶TIS∶H2O∶苯酚＝7∶1∶1∶0.1∶0.35∶0.5，以上各组分为分析纯，在常温下按体积比混合。)，室温下振荡3-5h，抽滤将氨基酸树脂与滤液分离。再用20％TFA/DCM(v/v)洗涤氨基酸树脂3次，洗涤液并入抽滤出的切割液。冰浴下，向滤液中加入OoC的乙醚3000ml，沉淀出粗肽，抽滤除去溶剂，并用无水乙醚洗涤沉淀3-4次，抽滤去除乙醚。干燥后得H9901粗品。
上述实施例中所用的原料及试剂的说明如下表1
表1
  原料及试剂名称   规格   生产厂家
  Fmoc-Leu-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Glu(OtBu)-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Lys(Fmoc)-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Gly-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Ile-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Asp(OtBu)-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Val-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Pro-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Arg(Pbf)-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  Fmoc-Trp(Boc)-OH   分析纯   Advanced ChemTech
  二甲基甲酰胺(DMF)   色谱纯   美国杜邦
  二氯甲烷(DCM)   分析纯   德国Merck
  甲醇(MeOH)   分析纯   德国Merck
  六氢吡啶(PIPE)   分析纯   北京化工厂
  1-羟基苯并三唑(HOBT)   分析纯   Advanced ChemTech
  N，N′-二异丙基碳酰亚胺(DIC)   分析纯   Advanced ChemTech
  二异丙基乙胺(DIEA)   分析纯   J & K CHEMICA
  二巯基乙醇(EDT)   分析纯   百灵威
  苯甲硫醚(TA)   分析纯   SIGMA
  三异丙基硅烷(TIS)   分析纯   ACROS
  乙腈(CH3CN)   分析纯   J.T.Baker
  三氟乙酸(TFA)   分析纯   J.T.Baker
  乙醚(Et2O)   分析纯   北京化工厂
  苯酚(Phenol)   分析纯   北京化工厂
  Fmoc-Arg(Pbf)-wang树脂   Advanced ChemTech
偶合反应终点监测方法
多肽固相合成中，需要对每步偶合反应的缩合率进行监测，这对最终产物的纯度有极大影响，因此非常重要。固相多肽合成中，通常采用茚三酮定性显色法，即Kaiser法[3]来监测偶合反应终点。用茚三酮颜色反应可以快速测定氨基酸树脂上的氨基，从而判定酰化反应是否完全。Kaiser试剂包括：A).5％茚三酮的正丁醇溶液；B).20％苯酚的正丁醇溶液；C).吡啶溶液。
检测过程为：取少量氨基酸树脂，加入A、B、C各2滴，105oC下加热5min，如果溶液有蓝色，或氨基酸树脂出现兰色，红褐色，表明还有游离氨基，否则说明连接完全。用茚三酮法检测聚苯乙烯氨基酸树脂氨基的敏感性可达到5umol氨基/g氨基酸树脂。这个敏感性已可以检测出缩合反应是否进行了99％以上。茚三酮检测时，由于末端氨基酸残基以及序列不同，出现的颜色强弱不同。Asp、Asn和Gln，有时包括Gly、Pro会产生较弱的蓝色或淡棕色，需特别注意。
改进说明
原工艺中氨基酸树脂的取代常数为0.66，优化后改为0.35，减小取代常数可以减小空间位阻，有利于合成后期反应的进行，得到较高纯度的粗品，从而也有利于纯化。
切割后用乙醚沉淀粗肽时，由原工艺的离心沉淀粗肽改为抽滤得粗肽沉淀。原因在于离心去上清不能完全去除乙醚，而乙醚中尚有部分溶解杂质，将残留在粗肽沉淀中。改为抽滤后，一方面能够充分去除乙醚及溶于乙醚中的杂质，另一方面由于DCM易于挥发，也可以充分去除DCM及其他挥发性杂质。
原工艺中使用了羧基活化剂组合HBTU/DIEA，但此法在缩合过程中会释放大量的热量，对氨基酸树脂造成一定程度的影响，同时也会对合成的粗肽纯度有影响。优化工艺后，采用DIC/HOBT的组合作为羧基活化剂以进行缩合反应，有效避免了放热现象，并且DIC/HOBt法的缩合效率更高，能够使反应更加完全，提高粗肽纯度。而去保护剂由20％六氢吡啶改为30％六氢吡啶，更加适合中试规模的生产。
精制方法及其依据
固相多肽合成的主要副产物是由合成过程中氨基酸缺失造成的。由于各种氨基酸分子的相似性，副产物的理化性质(如分子量、溶解性，疏水性等)与目标产品差别非常小，使得常规化学合成中常用的分离方法无法达到分离目的。目前，反相高效液相色谱法(RP-HPLC))为多肽合成领域最常用的纯化方法。它具有梯度洗脱能力和分辨率高的特点，不但能将相差仅有一个氨基酸的大分子蛋白分开，甚至能将分子量完全相同仅在构象上有区别的多肽分子分开。因此，我们在多肽H9901的纯化精制工作中选择了这种纯化方法。
冻干的H9901粗肽样品3g溶于20ml 30％乙腈水溶液，用反相高效液相色谱系统，经梯度洗脱分离后，收集H9901肽主峰组分，合并后冷冻抽干得到纯化的目标肽纯品。具体色谱条件如表2所示。
表2.反相高效液相色谱的纯化条件
Figure BDA0000049595210000171
图3为H9901样品的精制图，实际操作中从43min开始收集组分，每25ml一管，直到50min结束。经检测跟踪，选出纯度合格的组分，合并后冷冻干燥得纯品310mg，收率10.3％。图4是H9901精品的质量检测报告(RP-HPLC)。图5为H9901精品的质量检测报告(Maldi-TOFMS)。理论值：11312D；实际值：11558D。其纯度达到98％以上。
中试放大试验结果
为考察本工艺的可行性及重现性，进行了三批中试放大试验，三批中试产品的产量，收率以及纯品纯度信息如下表3所示：
表3三批中试放大试验结果
  批号   重量(g)   收率(％)   纯度(％)
  H990101   96.3   10.3   99.7
  H990102   101.0   9.70   99.2
  H990103   102.5   11.1   98.7
结论：由上述三批试验以及成品质量检验结果可知，本工艺稳定，产品符合规定。
反应中的“三废”处理措施
1.反应中涉及到的有机溶剂DMF、甲醇、二氯甲烷分类集中，交由专业的试剂回收公司回收处理，以达到综合利用，降低成本，避免环境污染的目的。
2.产生的酸、碱废水，中和后排入污水池。
3.反应中产生的废渣、废液少量的封存，积累到一定数量后统一处理。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种分支多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.选择目标肽链的羧基端的第一个氨基酸，在其氨基被保护的条件下将其羧基以共价键的形式与固体载体相连得到氨基酸树脂；
b.以步骤a中连接到固体载体上的第一个氨基酸为合成的起点，通过不断重复以下三步过程依次完成目标肽的每一个氨基酸的连接：①氨基端脱保护，洗涤过滤；②在氨基和侧链均保护的条件下与相邻氨基酸的羧基发生缩合酰化反应，形成肽键；③再次过滤洗涤；其中分支部分则是采用含有两个氨基的赖氨酸来实现的；
c.通过切割反应和后处理，将目标肽链与氨基酸树脂以及所有的侧链保护基分离，从而得到目标肽的粗品。
2.根据权利要求1所述的分支多肽的制备方法，其特征在于，所述分支多肽自氨基端到羧基端的结构式如下：
(AAN)8-(Lys)4-(Lys)2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg；或
(AAN)4-(Lys)2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg；
其中AAN为甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区，上述分支多肽的羧基端序列Thr-Lys-Pro-Arg为免疫活性肽Tuftsin。
3.根据权利要求2所述的分支多肽的制备方法，其特征在于，所述甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区自氨基端到羧基端的的序列如下：
Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp。
4.根据权利要求1所述的分支多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤c为：加入各组分为分析纯，在常温下按体积比混合的如下切割液TFA∶TA∶EDT∶TIS∶H2O∶苯酚＝7∶1∶1∶0.1∶0.35∶0.5，室温下振荡3-5h；抽滤将氨基酸树脂与滤液分离；再用体积比为20％TFA/DCM洗涤氨基酸树脂3次，洗涤液并入抽滤出的切割液；冰浴下，向滤液中加入0℃的乙醚沉淀出粗肽，抽滤除去溶剂，并用无水乙醚洗涤沉淀3-4次，抽滤去除乙醚，干燥后得目标肽粗品。
5.根据权利要求1所述的分支多肽的制备方法，其特征在于，在步骤c之后采用反相高效液相色谱法对目标肽粗品进行纯化，冰冻干燥得目标肽纯品。
6.根据权利要求1所述的分支多肽的制备方法，其特征在于，其中氨基酸树脂的取代常数为0.35mmol/g。
7.根据权利要求1所述的分支多肽的制备方法，其特征在于，在步骤b中采用茚三酮定性显色法来监测偶合反应终点，其试剂包括：A)5％茚三酮的正丁醇溶液；B)20％苯酚的正丁醇溶液；C)吡啶溶液。
8.根据权利要求1所述的分支多肽的制备方法，其特征在于，在步骤b中，以DIC/HOBT的组合作为羧基活化剂，以进行缩合反应。
9.根据权利要求1所述的分支多肽的制备方法，其特征在于，在步骤c中，用30％六氢吡啶为去保护剂使保护基分离。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103961685A (zh) * 2014-01-09 2014-08-06 中国人民解放军总医院第一附属医院 一种用于脓毒症治疗的t-肽免疫调节剂
CN105646659A (zh) * 2016-01-28 2016-06-08 山东深海生物科技股份有限公司 一种修复畜禽消化道损伤的多肽、其生产方法及应用
EP3315508A4 (en) * 2015-06-26 2019-08-28 Beijing Coislitong Industrial Co., Ltd. POLYPEPTIDE COMPOUND AND MANUFACTURING METHOD AND USE THEREOF

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101314612A (zh) * 2008-05-08 2008-12-03 吉尔生化（上海）有限公司 固相多肽合成海沙瑞林的方法
CN101607984A (zh) * 2008-06-18 2009-12-23 北京中天康泰生物科技有限公司 一种多拷贝多肽及其应用
CN1904150B (zh) * 2006-08-01 2010-07-28 华东师范大学 一种人胰高血糖素样肽-1衍生物及其固相化学合成
CN101835487A (zh) * 2007-08-21 2010-09-15 戴纳瓦克斯技术公司 制备和使用流感蛋白质的组合物和方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101307097A (zh) * 2007-05-17 2008-11-19 北京中天康泰生物科技有限公司 一种增强肽段免疫活性的制备方法和用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1904150B (zh) * 2006-08-01 2010-07-28 华东师范大学 一种人胰高血糖素样肽-1衍生物及其固相化学合成
CN101835487A (zh) * 2007-08-21 2010-09-15 戴纳瓦克斯技术公司 制备和使用流感蛋白质的组合物和方法
CN101314612A (zh) * 2008-05-08 2008-12-03 吉尔生化（上海）有限公司 固相多肽合成海沙瑞林的方法
CN101607984A (zh) * 2008-06-18 2009-12-23 北京中天康泰生物科技有限公司 一种多拷贝多肽及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨炀: "基于Loloatin C药核结构的系列线性多肽的设计合成及其抑菌活性研究", 《万方数据库》, 28 July 2010 (2010-07-28) *
郑彦慧等: "Fmoc保护氨基酸与Wang树脂的缩合反应", 《高等学校化学学报》, no. 9, 30 September 2008 (2008-09-30), pages 1769 - 1772 *
郑彦慧等: "Rink Amide 树脂结构对多肽合成的影响研究", 《离子交换与吸附》, vol. 24, no. 6, 20 December 2008 (2008-12-20), pages 563 - 569 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103961685A (zh) * 2014-01-09 2014-08-06 中国人民解放军总医院第一附属医院 一种用于脓毒症治疗的t-肽免疫调节剂
CN103961685B (zh) * 2014-01-09 2016-05-11 中国人民解放军总医院第一附属医院 一种用于脓毒症治疗的t-肽免疫调节剂
EP3315508A4 (en) * 2015-06-26 2019-08-28 Beijing Coislitong Industrial Co., Ltd. POLYPEPTIDE COMPOUND AND MANUFACTURING METHOD AND USE THEREOF
US10597426B2 (en) 2015-06-26 2020-03-24 Beijing Coislitong Industrial Co., Ltd. Polypeptide compound and preparation method and use thereof
CN105646659A (zh) * 2016-01-28 2016-06-08 山东深海生物科技股份有限公司 一种修复畜禽消化道损伤的多肽、其生产方法及应用

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