CN103961685A - 一种用于脓毒症治疗的t-肽免疫调节剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于脓毒症治疗的T-肽免疫调节剂；所述调节剂的结构为(Thr-Lys-Pro-Arg-AAN)4-(Lys-AAN)2-Lys-AAN，其中N为自然数，本发明通过动物实验研究发现，T-肽具有调节效应性T细胞增殖、分泌功能，以及通过结合调节性T细胞表面分子神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1，Nrp-1)缓解调节性T细胞负向免疫调控作用。所述的T-肽能够通过上述机制缓解脓毒症引起的免疫抑制状态，特别是细胞免疫抑制，进而达到改善脓毒症小鼠生存率以及脓毒症症状的作用，可以用于脓毒症的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及T-肽及其应用，更具体地，涉及T-肽在制备治疗脓毒症药物中应用，所述T-肽通过抑制调节性T细胞负向免疫调控、缓解细胞免疫抑制机制，增加脓毒症机体的生存率和改善脓毒症症状。
背景技术
脓毒症(sepsis)是由感染诱发的全身性炎症反应综合征。脓毒症并非单纯的失控性炎症反应，同时还存在着严重的、逐渐加重的免疫抑制，且以细胞免疫抑制最为突出。具体表现为不能清除病原体，容易造成二次感染以及潜伏病毒的复活等，甚至会在脓毒症患者痊愈后的一段时期存在，引起出院后生活质量的下降以及死亡率的增加[Winters BD，Eberlein M，Leung J，et al.Long-term mortality and quality of life in sepsis：a systematic review.CritCare Med，2010，38(5)：1276-1283]。大多数脓毒症患者能够幸存于过度的炎症反应，而最终死于院内感染、条件致病菌感染、体内潜伏病毒的复活和多器官衰竭等[Hotchkiss RS，Coopersmith CM，McDunn JE，et al.Tilting toward immunosuppression：Nat Med，2009，15(4)：496-497；Limaye AP，Kirby KA，Rubenfeld GD，et al.Cytomegalovirus reactivation in critically ill immunocompetent patients.JAMA，2008，300(4)：413-422]。分析脓毒症患者死亡后脾脏病理改变发现，病程越长，B淋巴细胞和效应性T细胞丢失越多；严重脓毒症患者，效应性T细胞针对特异性抗原，表现为无反应性，即不能增殖和分泌相应的细胞因子。Heidecke等[Heidecke CD，Hensler T，Weighardt H，et al.Selective defectsof T lymphocyte function in patients with lethal intraabdominal infection.Am J Surg，1999，178(4)：288-292]通过对严重脓毒症患者的研究发现，患者不仅辅助性T细胞(Th)1类反应降低，同时Th2类反应也未见增加，并且与病死率密切相关。通过对脓毒症患者的血液样本检测发现，淋巴细胞存在着明显的凋亡，19例脓毒症患者中有15例淋巴细胞数的绝对值低于正常值下线[Hotchkiss RS，Swanson PE，Freeman BD，et al.Apoptotic cell death in patients with sepsis，shock，and multiple organ dysfunction.Crit Care Med，1999，27(7)：1230-1251]；脓毒症诱导的免疫抑制是造成高死亡率和严重并发症的根源[Boomer JS，ToK，Chang KC，et al.Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure.JAMA，2011，306(23)：2594-2605]。减少效应性T细胞凋亡、促进效应性T细胞增殖以及升高干扰素(IFN)-γ等促炎细胞因子水平可明显改善脓毒症动物的生存率[Muenzer JT，Davis CG，Chang K，et al.Characterization and modulation of the immunosuppressive phase of sepsis.Infect Immun，2010，78(4)：1582-1592]。促炎性和抗炎性反应的水平，均与脓毒症的严重性相关，白细胞介素(IL)-10水平可以预测脓毒症患者预后，调节IL-10表达水平可影响动物预后，但完全消除IL-10则加重器官损害并增加死亡率[Kalechman Y，Gafter U，Gal R，et al.Anti-IL-10therapeutic strategy using the immunomodulator AS101 in protecting mice from sepsis-induced death：dependence on timing of immunomodulating intervention.J Immunol，2002，169(1)：384-392]。因此，针对炎症反应亢进的抗炎治疗与针对免疫抑制的免疫调节治疗并举可作为脓毒症治疗的合理方案[姚咏明，黄立锋，林洪远.进一步提高对脓毒症免疫机制及调理策略的认识.创伤外科杂志，2007，9(1)：4-7]。
尽管CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)在CD4+T淋巴细胞中的比例为5％-10％，但其在脓毒症诱导的细胞免疫抑制中发挥着重要的负向免疫调控作用。叉头翼状转录因子-3(Foxp3)特征性表达于Treg内，在其增殖分化以及发挥负向免疫调控中具有重要意义，Foxp3表达水平与Treg活性明显相关。Treg主要通过T淋巴细胞毒性相关抗原-4(CTLA-4)、膜相关转化生长因子(TGF)-β及糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)介导的细胞接触机制和分泌TGF-β、IL-10和IL-35等抑制性细胞因子发挥负向免疫调控作用[Vignali DA，Collison LW，Workman CJ.How regulatory T cells work.Nat Rev Immunol，2008，8(7)：523-532]。在脓毒症诱导的细胞免疫抑制中，Treg表面分子CTLA-4、TGF-β以及特征性标志物Foxp3表达明显增强，细胞因子TGF-β和IL-10等分泌明显升高，Treg发挥负向免疫调控的具体机制主要是抑制效应性T细胞增殖、促进效应性T细胞凋亡以及促进Thl／Th2反应功能性漂移，Treg发挥负向免疫调控的本质取决于其与效应性T细胞的数目比例[Venet F，Chung CS，Monneret G，et al.Regulatory T cell populations in sepsis andtrauma.J Leukoc Biol，2008，83(3)：523-535；Saito K，Wagatsuma T，Toyama H，et al.Sepsis is characterized by the increases in percentages of circulating CD4+CD25+regulatory T cells and plasma levels of soluble CD25.Tohoku J Exp Med，2008，216(1)：61-68；Heuer JG，Zhang T，Zhao J，et al.Adoptive transfer of in vitro stimulated CD4+CD25+regulatory T cells increases bacterial clearance and improves survival in polymicrobialsepsis.J Immunol，2005，174(11)：7141-7146；Choileain NN，MacConmara M，Zang Y，et al.Enhanced regulatory T cell activity is an element of the host response toinjury.J Immunol，2006，176(1)：225-236；MacConmara MP，Maung AA，Fujimi S，etal.Increased CD4+CD25+T regulatory cell activity in trauma patients depresses protective Th1 immunity.Ann Surg，2006，244(4)：514-523]。
神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1，Nrp-1)是一种跨膜糖蛋白，早期研究主要集中在神经系统、心血管系统和肿瘤，具有调节神经发育、血管生成以及肿瘤生长的作用，因此归于轴突导向分子(semaphorins，Semas)受体家族和血管内皮生长因子(VEGF)受体家族[RoskoskiR Jr.Vascular endothelial growth factor(VEGF)signaling in tumor progression.Crit Rev Oncol Hematol，2007，62(3)：179-213；Roskoski R Jr.VEGF receptor protein-tyrosine kinases：structure and regulation.Biochem Biophys Res Commun，2008，375(3)：287-291；Barr MP，Byrne AM，Duffy AM，et al.A peptide corresponding to the neuropilin-1-binding site VEGF165induces apoptosis of neuropilin-1-expressing breast tumour cells.Br J Cancer，2005，82(2)：328-333]。近年来研究发现，Nrp-1亦具有免疫调节效应，Nrp-1高表达于Treg，而Tregl／Th3和效应性T细胞则低表达或不表达，Treg表面分子Nrp-1能够辅助性增强其与树突状细胞之间的相互作用，同时亦有研究发现Nrp-1有助于Treg胸腺内发育[Weiss JM，Bilate AM，Gobert M，et al.Neuropilin1is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells，but not mucosa-generated induced Foxp3+T reg cells.J Exp Med.2012；209(10)：1723-1742；Yadav M，Louvet C，Davini D，et al.Neuropilin-1distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.J Exp Med，2012，209(10)：1713-1722]。小鼠Nrp-1能够协同性激活Treg分泌的游离态无活性潜伏肽(LAP)-TGF-β，CD4+CD25-Nrp-1-T淋巴细胞结合Nrp-1-Fc后能够增强其结合TGF-β的能力[Glinka Y，Prud′homme GJ.Neuropilin-1is a receptor for transforming growth factor beta-1，activates its latent form，and promotes regulatory T cell activity.J Leukoc Biol，2008，84(1)：302-310]。Glinka等通过对小鼠黑色素瘤或乳腺癌研究发现，高表达Nrp-1的小鼠肿瘤细胞，其细胞膜相关TGF-β亦明显上调；而Nrp-1敲除明显抑制肿瘤的生长，初步提示Nrp-1与细胞膜相关TGF-β具有协同效应[Glinka Y，Stoilova S，Mohammed N，et al.Neuropilin-1exerts co-receptor function for TGF-beta-1on the membrane of cancer cells and enhances responsesto both latent and active TGF-beta.Carcinogenesis，2011，32(4)：613-621]；同时我们的研究也发现Treg表面分子Nrp-1能够协同性促进膜相关TGF-β的表达[高玉雷，姚咏明，柴艳芬，等.神经纤毛蛋白-1与膜相关转化性生长因子-β共表达对调节性T细胞免疫抑制功能的影响.中国中西医结合急救杂志，2013，4：205-209]。
由于脓毒症发病率较高，如果不能有效治疗严重时可危及患者的生命，所以临床上迫切需要能有效治疗脓毒症的药物。本发明提供了一种T-肽能有效治疗脓毒症。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种多肽药物，通过调节机体细胞免疫反应，缓解脓毒症引起的细胞免疫抑制，用于治疗脓毒症。
本发明的另一目的是提供一种多肽药物，通过作用于调节性T细胞表面分子Nrp-1，缓解调节性T细胞负向免疫调控作用。
本发明的另一目的是提供一种治疗脓毒症的多肽药物，所述多肽药物为T-肽，其化学结构为：(Thr-Lys-Pro-Arg-AAN)4-(Lys-AAN)2-Lys-AAN，其中N为自然数。
本发明提供了一种治疗脓毒症的优选T-肽，所述T-肽的结构式为：(Thr-Lys-Pro-Arg)4-(Lys)2-Lys，所述T-肽的制备方法按照专利号为CN200610002074.4所述的方法制备。
本发明通过上述T-肽治疗脓毒症小鼠模型，结果显示所述的T-肽能够够明显增加小鼠脓毒症模型的生存率，改善小鼠脓毒症模型症状，特别是制模后分别于12h和24h皮下给予1mg／kg T-肽2次组，较其他时间点开始给药2次组效果更为明显。
本发明通过体外实验研究了所述T-肽治疗脓毒症的机制，结果显示所述的T-肽能够直接作用于效应性T细胞和调节性T细胞。进一步研究表明，所述的T-肽对效应性T细胞增殖功能具有双向调节作用，低浓度能够促进细胞增殖，而中-高浓度主要表现为促进效应性T细胞凋亡。
本发明通过体外实验研究表明，T-肽能够随着浓度的增加表现为促进效应性T细胞IFN-γ分泌和抑制IL-4分泌，低浓度能够将IFN-γ/IL-4维持在抗-CD3／CD28刺激水平，而中浓度能够将IFN-γ／IL-4维持在正常细胞分泌水平。
本发明通过体外实验研究表明，T-肽对效应性T细胞IL-2的分泌亦具有双向调节作用，具体表现为低-中浓度能够促进正常细胞分泌IL-2，低浓度能够在脂多糖(LPS)诱导下进一步促进IL-2分泌。
以上所述的T-肽低浓度为1μg／ml；中浓度为10μg/ml；高浓度为100μg／ml。综合上述T-肽对效应性T细胞的作用，体外实验使用T-肽干预效应性T细胞的剂量优选1-10μg／ml。
本发明通过体外实验研究表明，所述的T-肽能够直接抑制调节性T细胞活性，具体表现为抑制特征性标志物Foxp3和表面分CTLA-4的表达，促进膜相关TGF-β和Nrp-1的表达，其中中-高浓度均已经达到最大效应；体外研究实验还表明，所述的T-肽能够明显抑制游离TGF-β的分泌，中-高浓度效应无明显差异，中浓度T肽自12h便已经开始发挥作用，24h达到最大效应，T肽对IL-10的分泌无明显影响，综合上述T肽对调节性T淋巴细胞的作用可以看出中-高浓度效应无明显差异。其中以上所述的T肽低浓度为1μg/ml；中浓度为10μg/ml；高浓度为100μg／ml。
本发明通过调节性T细胞与效应性T细胞共培养可以进一步明确，T肽能够明显缓解调节性T细胞负向免疫调控作用，并且这一作用至少是通过调节性T细胞表面分子Nrp-1发挥作用。
根据本发明的实施例，本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持T-肽活性即可。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。
根据本发明的实施例，所述药物还包含药学可接受的辅助剂。具体地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持T-肽活性即可。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和／或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1：皮下给予T-肽治疗脓毒症小鼠7天内的生存率结果：皮下给予0.25、1和4mg／kg T-肽对脓毒症小鼠7天内生存率的影响，1mg／kg T-肽能够明显增加脓毒症小鼠生存率；
图2：不同时间点皮下给予1mg／kg T-肽对脓毒症小鼠生存率的影响结果：分别于脓毒症小鼠制模后12h和24h给药组能够明显增加小鼠生存率；
图3：T-肽对效应性T细胞增殖率的影响：在有或者无LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，分别给予1、10和100μg／ml T-肽直接干预效应性T细胞12、24和48h后，对效应性T细胞增殖率的影响；
3-1：12h后对效应性T细胞增殖率的影响；3-2：24h后对效应性T细胞增殖率的影响；3-3：48h后对效应性T细胞增殖率的影响；
A：对照组；B：抗-CD3／CD28；C：抗-CD3／CD28+T-肽(1μg／ml)；D：抗-CD3／CD28+T-肽(10μg／ml)；E：抗-CD3／CD28+T-肽(100μg／ml)；F：LPS；G：LPS+抗-CD3／CD28；H：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(1μg／ml)；I：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(10μg/ml)；J：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(100μg／ml)；
图4：T-肽对效应性T细胞凋亡的影响：在有或者无LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，分别给予1、10和100μg／ml T-肽直接干预效应性T细胞24h后，对效应性T细胞凋亡的影响；
A：对照组；B：抗-CD3／CD28；C：抗-CD3／CD28+T-肽(1μg／ml)；D：抗-CD3／CD28+T-肽(10μg/ml)；E：抗-CD3／CD28+T-肽(100μg／ml)；F：LPS；G：LPS+抗-CD3／CD28；H：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(1μg／ml)；I：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(10μg／ml)；J：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(100μg／ml)；
图5：T-肽对效应性T细胞凋亡影响的凋亡率流式细胞仪分析图；
图6：T-肽对效应性T细胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4功能的影响：在有或者无LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，分别给予1、10和100μg／mlT-肽直接干预效应性T细胞24h后，对效应性T细胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4功能的影响；
6-1：对效应性T细胞分泌IFN-γ功能的影响；6-2：对效应性T细胞分泌IL-2功能的影响；6-3：对效应性T细胞分泌IL-4功能的影响；
A：对照组；B：抗-CD3／CD28；C：抗-CD3／CD28+T-肽(1μg／ml)；D：抗-CD3／CD28+T-肽(10μg／ml)；E：抗-CD3／CD28+T-肽(100μg／ml)；F：LPS；G：LPS+抗-CD3／CD28；H：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(1μg／ml)；I：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(10μg／ml)；J：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(100μg/ml)；
图7：T-肽对效应性T细胞IFN-γ/IL-4平衡的影响；
A：对照组；B：抗-CD3／CD28；C：抗-CD3／CD28+T-肽(1μg／ml)；D：抗-CD3／CD28+T-肽(10μg/ml)；E：抗-CD3／CD28+T-肽(100μg／ml)；F：LPS；G：LPS+抗-CD3／CD28；H：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(1μg／ml)；I：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(10μg/ml)；J：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(100μg/ml)；
图8：100μg／ml T-肽对效应性T细胞分泌IFN-γ的影响：在有或者无LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，给予100μg／ml T-肽直接干预效应性T细胞12、24和48h后，对效应性T细胞分泌IFN-γ的影响；
8-1：抗-CD3／CD28+T-肽(100μg/ml)对效应性T细胞分泌IFN-γ的影响；8-2：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(100μg／ml)对效应性T细胞分泌IFN-γ的影响；
图9：10μg／ml T-肽对对效应性T细胞分泌IL-2的影响：在无LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，给予10μg／ml T-肽直接干预效应性T细胞12、24、48和72h后，对效应性T细胞分泌IL-2的影响；
图10：T-肽对调节性T细胞特征性标志物Foxp3、表面分子CTLA-4、膜相关TGF-β和表面分子Nrp-1表达的影响：在有或者无LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，分别给予1、10和100μg／ml T-肽直接干预调节性T细胞24h后，对调节性T细胞特征性标志物Foxp3、表面分子CTLA-4、膜相关TGF-β和表面分子Nrp-1表达的影响；
10-1：对调节性T细胞特征性标志物Foxp3表达的影响；10-2：对调节性T细胞表面分子CTLA-4表达的影响；10-3：对调节性T细胞膜相关TGF-β表达的影响；10-4：对调节性T细胞表面分子Nrp-1表达的影响；
A：对照组；B：抗-CD3／CD28；C：抗-CD3／CD28+T-肽(1μg／ml)；D：抗-CD3／CD28+T-肽(10μg/ml)；E：抗-CD3／CD28+T-肽(100μg／ml)；F：LPS；G：LPS+抗-CD3／CD28；H：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(1μg／ml)；I：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(10μg／ml)；J：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(100μg／ml)；
图11：T-肽对调节性T细胞特征性标志物Foxp3表达率影响的流式分析图；
图12：T-肽对调节性T细胞表面分子CTLA-4表达率影响的流式分析图；
图13：T-肽对调节性T细胞膜相关TGF-β表达率影响的流式分析图；
图14：T-肽对调节性T细胞表面分子Nrp-1表达率影响的流式分析图；
图15：T-肽对调节性T细胞分泌游离TGF-β和IL-10的影响：在有或者无LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，分别给予1、10和100μg／ml T-肽直接干预调节性T细胞24h后，对调节性T细胞分泌游离TGF-β和IL-10的影响；
15-1：对调节性T细胞分泌游离TGF-β的影响；15-2：对调节性T细胞分泌IL-10的影响；
A：对照组；B：抗-CD3／CD28；C：抗-CD3／CD28+T-肽(1μg／ml)；D：抗-CD3／CD28+T-肽(10μg／ml)；E：抗-CD3／CD28+T-肽(100μg／ml)；F：LPS；G：LPS+抗-CD3／CD28；H：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(1μg/ml)；I：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(10μg/ml)；J：LPS+抗-CD3／CD28+T-肽(100μg／ml)；
图16：10μg/ml T-肽对调节性T细胞分泌游离TGF-β的影响：在LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，给予10μg/ml T-肽直接干预调节性T细胞12、24和48h后，对调节性T细胞分泌游离TGF-β的影响；
图17：T-肽对调节性T细胞抑制效应性T细胞增殖功能的影响，以及抗-Nrp-1干预：将调节性T细胞使用10μg/ml的抗-Nrp-1封闭1h后，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，继续予以10μg／ml T-肽直接干预调节性T细胞24h，分别洗涤各组，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，各组与正常的效应性T细胞共培养24h后，观察对效应性T细胞增殖功能的影响；
A：对照组；B：抗-CD3／CD28；C：抗-CD3／CD28+Treg；D：抗-CD3／CD28+Treg+T-肽；E：抗-CD3／CD28+Treg+抗-Nrp-1；F：抗-CD3／CD28+Treg+抗-Nrp-1+T-肽；
图18：T-肽对调节性T细胞促进效应性T细胞凋亡的影响，以及抗-Nrp-1干预：将调节性T细胞使用10μg／ml的抗-Nrp-1封闭1h后，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，继续予以10μg／ml T-肽直接干预调节性T细胞24h，分别洗涤各组，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，各组与正常的效应性T细胞共培养24h后，观察对效应性T细胞凋亡的影响；
A：对照组；B：抗-CD3／CD28；C：抗-CD3／CD28+Treg；D：抗-CD3／CD28+Treg+T-肽；E：抗-CD3／CD28+Treg+抗-Nrp-1；F：抗-CD3／CD28+Treg+抗-Nrp-1+T-肽；
图19：T-肽对调节性T细胞促进效应性T细胞凋亡的影响的流式分析图；
图20：T-肽对调节性T细胞调节效应性T细胞分泌功能的影响：将调节性T细胞使用10μg/ml的抗-Nrp-1封闭1h后，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，继续予以10μg／ml T-肽直接干预调节性T细胞24h，分别洗涤各组，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，各组与正常的效应性T细胞共培养24h后，观察对效应性T细胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的影响；
20-1：对效应性T细胞分泌IFN-γ的影响；20-2：对效应性T细胞分泌IL-2的影响；20-3：对效应性T细胞分泌IL-4的影响；
A：对照组；B：抗-CD3／CD28；C：抗-CD3／CD28+Treg；D：抗-CD3／CD28+Treg+T-肽；E：抗-CD3／CD28+Treg+抗-Nrp-1；F：抗-CD3／CD28+Treg+抗-Nrp-1+T-肽；
图21：在T-肽干预下调节性T细胞对效应性T细胞IFN-γ/IL-4平衡的影响；
A：对照组；B：抗-CD3／CD28；C：抗-CD3／CD28+Treg；D：抗-CD3／CD28+Treg+T-肽；E：抗-CD3／CD28+Treg+抗-Nrp-1；F：抗-CD3／CD28+Treg+抗-Nrp-1+T-肽；
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明以下实施例所述的T-肽，选择优选的T-肽，其结构为：(Thr-Lys-Pro-Arg)4-(Lys)2-Lys，所述T-肽的制备方法按照专利号为CN200610002074.4所述的方法制备。
实施例1：T肽对小鼠脓毒症模型生存率的影响
1.实验动物和主要试剂
雄性BALB／c小鼠，6-8w，20+2g，购自中国医学科学院实验动物研究所(动物合格证号：SCXK京2009-0007)。适应性饲养1周，自由进食水，室温25℃，昼夜节律为12h。
盐酸氯胺酮注射液(上海第一生化药业公司，中国)：速眠新II注射液(军事医学科学院军事兽医研究所研制，中国)：0.9％生理盐水(山东鲁欣药业集团，中国)体积比为2∶2.5∶4.5。T-肽：1mg／支，①将4mg T-肽溶于10ml 0.9％生理盐水内，充分混匀，用于4mg／kg组；②取①溶液2.5ml，定容到10ml，用于1mg／kg组；③取②溶液2.5ml，定容到10ml，用于0.25mg／kg组。根据电子秤测量结果给予相应体积的药物，假伤组和盲肠结扎穿孔术(CLP)组给予相应体积的生理盐水。
2.给药方法：
①麻醉药物按照2ml／kg方式后肢外侧肌肉麻醉。
②假伤组以及通过CLP制作的小鼠脓毒症模型均于造模完成后按照40ml／kg给予0.9％生理盐水，防止失血性休克发生。
③研究T-肽量效关系时，T-肽治疗组分别于制模后以及制模后12h给予0.25、1和4mg/kg T-肽2次，采用颈背部皮下给药方式，并且第一次给药时应该避开给予0.9％生理盐水部位；研究T-肽时效关系时，T-肽起始给药时间分别是制模后0、12和24h，12h后各组追加给药1次，共给药2次。
3.实验步骤：
①量效分析：将126只雄性BALB／c小鼠分为：对照组、假伤组、CLP组以及T-肽(0.25、1和4mg／kg)组，各组21只。将CLP组与T-肽组按照2min／只的速度制作CLP模型，假伤组仅翻动肠管。按照相应体重给予药物。放回鼠笼内，给予充足食水，保持室温25℃。每12h观察一次小鼠生存情况。不同剂量T-肽对小鼠7天内生存率的影响见图1，1mg／kgT-肽能够明显增加脓毒症小鼠生存率。
②时效分析：将120只雄性BALB／c小鼠分为：对照组、假伤组、CLP组以及T肽(0、12和24h开始给药)组，各组20只。将CLP组与T-肽组按照2min／只的速度制作CLP模型，假伤组仅翻动肠管。按照相应体重给予药物。放回鼠笼内，给予充足食水，保持室温25℃。每12h观察一次小鼠生存情况。不同时间点给予T-肽对小鼠7天内生存率的影响见图2，1mg／kg T-肽于12h和24h各给药1次组能够明显增加脓毒症小鼠生存率。
4.结果评价：
通过量效分析表明1mg／kg T-肽较CLP组和其他给药组能够明显改善小鼠脓毒症模型生存率以及小鼠症状。进一步对1mg／kg给药时间的研究发现，于CLP后12h开始给药效果最佳。
实施例2：T肽对效应性T淋巴细胞活性的影响
1.实验动物和主要试剂
雄性BALB/c小鼠，6-8w，20±2g，购自中国医学科学院实验动物研究所(动物合格证号：SCXK京2009-0007)。适应性饲养1周，自由进食水，室温25℃，昼夜节律为12h。
T肽：1mg／支，①将1mg T-肽溶于含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone公司，美国)RPMI-1640培养基(北京索莱宝公司，中国)内，充分混匀，用于100μg／ml组；②取①溶液100μl，定容到1ml，用于10μg／ml组；③取②溶液100μl，定容到1ml，用于1μg／ml组。根据各组需要，使用含有10％胎牛血清RPMI-1640培养基进一步稀释到所需浓度。
纯化的抗小鼠-CD3／CD28：eBioscience公司，美国：根据需要将纯化的抗小鼠-CD3配制成5μg／ml，将纯化的抗小鼠-CD28配制成2μg／ml。
LPS(来源于大肠杆菌0111：B4)：Sigma公司，美国：根据需要配置终体积为100ng／ml溶液。
CCK-8(Cell counting kit-8，500test)：dojindo公司，日本。
Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(100test，内含1ml Annexin-V-FITC、500μl PI(Propidium iodide)以及binding buffer和PBS各80ml)北京宝赛生物技术有限公司，中国。小鼠CD4+CD25+Treg分离试剂盒(含有生物素-抗体鸡尾酒、抗生物素磁珠、藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)-抗CD25、抗PE磁珠)：Miltenyi Biltec GmbH公司，德国。
IFN-γ、IL-4和IL-2ELISA试剂盒：上海依科赛公司，中国。
2.实验步骤：
①断颈处死小鼠，无菌条件下分离脾脏，使用小鼠CD4+CD25+Treg分离试剂盒分离小鼠调节性T细胞和效应性T细胞。②将效应性T细胞按照1×106／ml重悬于含有10％胎牛血清RPMI-1640培养基内，按照2×105／孔种植于96孔培养板内，终体积200μl。③将细胞分为对照组、抗CD3／CD28组、T-肽(1、10和100μg／ml)组，有或者无LPS(100ng／ml)诱导，各组重复孔5个。④培养24h后收集部分上清，用于检测细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-2，细胞用于检测增值率和凋亡率。不同剂量T-肽对效应性T细胞增值率、凋亡率以及分泌功能的影响见图3-9：
T-肽对效应性T细胞增殖功能具有双向调节作用，具体表现为低浓度促进细胞增殖，而中-高浓度抑制细胞增殖，这一作用从12h便已经开始，能够持续到24h(图3)；
在有或者无LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，分别给予1、10和100μg／ml T-肽直接干预效应性T细胞24h后，对效应性T细胞凋亡的影响，结果显示中-高浓度T-肽能够明显诱导效应性T细胞凋亡，其凋亡率明显增加(图4、5)；
在有或者无LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，分别给予1、10和100μg／ml T-肽直接干预效应性T细胞24h后，对效应性T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4功能的影响，结果显示不同浓度的T-肽能够促进IFN-γ的分泌，抑制IL-4的分泌；T-肽对IL-2的分泌具有双向调节作用，具体表现为低-中浓度能够促进正常细胞分泌IL-2，而高浓度能够抑制IL-2分泌，在LPS诱导下，中-高浓度均能抑制IL-2分泌(图6)；
中浓度的T肽能够将效应性T细胞IFN-γ/IL-4平衡维持在细胞正常水平(图7)；高浓度的T肽自12h便能够明显促进IFN-γ的分泌，这一效应能够持续到48h(图8)；
在无LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，给予10μg／ml T-肽直接干预效应性T淋巴细胞12、24、48和72h后，对效应性T细胞分泌IL-2的影响；结果显示中浓度能够促进正常细胞IL-2的分泌，这一作用自12h便已经开始，能够持续到72h(图9)。
3.结果评价：
T肽有促进效应性T淋巴细胞增殖，促进IFN-γ、IL-2分泌，抑制IL-4分泌，维持IFN-γ／IL-4平衡的作用，其中低-中浓度效果较可，尽管中浓度有促进效应性T淋巴细胞凋亡作用。其中所述T肽低浓度为1μg／ml；中浓度为10μg／ml；高浓度为100μg／ml。
实施例3：T肽对调节性T细胞活性的影响
1.实验动物和主要试剂
雄性BALB／c小鼠，6-8w，20±2g，购自中国医学科学院实验动物研究所(动物合格证号：SCXK京2009-0007)。适应性饲养1周，自由进食水，室温25℃，昼夜节律为12h。
T-肽：1mg/支，①将1mg T-肽溶于含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone公司，美国)RPMI-1640培养基(北京索莱宝公司，中国)内，充分混匀，用于100μg/ml组；②取①溶液100μl，定容到1ml，用于10μg／ml组；③取②溶液100μl，定容到1ml，用于1μg／ml组。根据各组需要，使用含有10％胎牛血清RPMI-1640培养基进一步稀释到所需浓度。
纯化的抗小鼠-CD3／CD28：eBioscience公司，美国：根据需要将纯化的抗小鼠-CD3配制成5μg/ml，将纯化的抗小鼠-CD28配制成2μg/ml。
LPS(来源于大肠杆菌0111：B4)：Sigma公司，美国：根据需要配置终体积为100ng／ml溶液。
小鼠CD4+CD25+Treg分离试剂盒(含有生物素-抗体鸡尾酒、抗生物素磁珠、藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)-抗CD25、抗PE磁珠)：Miltenyi Biltec GmbH公司，德国。
APC-抗小鼠／大鼠Nrp-1：R＆D Systems公司，美国；FITC-抗小鼠／大鼠Foxp3；eBioscience公司，美国；APC-抗小鼠TGF-β：R&D Systems公司，美国；FITC-抗小鼠CD152／CTLA-4：SouthemBiotech公司，美国。
TGF-β和IL-10ELISA试剂盒：上海依科赛公司，中国。
2.实验步骤：
①同于实施例2。②将调节性T细胞按照1×106／ml重悬于含有10％胎牛血清RPMI-1640培养基内，按照2×105／孔种植于96孔培养板内，终体积200μl。③将细胞分为对照组、抗CD3／CD28组、T-肽(1、10和100μg／ml)组，有或者无LPS(100ng／ml)诱导，各组重复孔5个。④培养24h后收集部分上清，用于检测细胞因子TGF-β和IL-10，细胞用于检测表面分子CTLA-4、TGF-β、Nrp-1和特征性标志物Foxp3。不同剂量T-肽对调节性T细胞活性分子表达和分泌功能的影响见图10-16：
在有或者无LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，分别给予1、10和100μg／ml T-肽直接干预调节性T细胞24h后，对调节性T细胞表面分CTLA-4、膜相关TGF-β、Nrp-1和特征性标志物Foxp3表达的影响，结果显示不同浓度的T肽能够抑制CTLA-4、Foxp3的表达，同时促进膜相关TGF-β、Nrp-1的表达，其中中-高浓度作用最强(图10-14)；
在有或者无LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，分别给予1、10和100μg／ml T-肽直接干预调节性T细胞24h后，对调节性T细胞分泌游离TGF-β和IL-10的影响，结果显示T-肽能够抑制游离TGF-β的分泌，其中高浓度对正常细胞作用最强，中-高浓度对LPS诱导下的细胞效应无明显差异，而不同浓度T-肽对IL-10的分泌无明显影响(图15)；
在LPS诱导下，使用抗-CD3／CD28为共刺激分子，给予10μg/l T-肽直接干预调节性T细胞12、24和48h后，对调节性T细胞分泌游离TGF-β的影响，结果显示T-肽自12h便能明显抑制调节性T细胞分泌TGF-β，这一效应能够持续到24h(图16)。
其中所述T肽低浓度为1μg/ml；中浓度为10μg／ml；高浓度为100μg／ml。
3.结果评价：
T-肽能够明显抑制调节性T细胞活性特征性标志物Foxp3和CTLA-4表达以及抑制其游离TGF-β分泌，同时能够促进表面分子Nrp-1和膜相关TGF-β表达，中-高浓度效应较强，其中中浓度已经明显抑制其活性特征性标志物的表达，然而并不能明显影响IL-10的分泌。
实施例4：T肽对调节性T细胞负向免疫调控作用的影响
1.实验动物和主要试剂
雄性BALB／c小鼠，6-8w，20±2g，购自中国医学科学院实验动物研究所(动物合格证号：SCXK京2009-0007)。适应性饲养1周，自由进食水，室温25℃，昼夜节律为12h。
T-肽：1mg／支，①将1mg T-肽溶于含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone公司，美国)RPMI-1640培养基(北京索莱宝公司，中国)内，充分混匀；②取①溶液100μl，定容到1ml，用于10μg／ml组。
纯化的抗小鼠-CD3／CD28：eBioscience公司，美国：根据需要将纯化的抗小鼠-CD3配制成5μg/ml，将纯化的抗小鼠-CD28配制成2μg/ml。
纯化的抗小鼠／大鼠Nrp-1：R＆D Systems公司，美国：根据需要配置10μg/ml试剂。
CCK-8(Cell counting kit-8，500test)：dojindo公司，日本。
Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(100test，内含1ml Annexin-V-FITC、500μl PI(Propidium iodide)以及binding buffer和PBS各80ml)北京宝赛生物技术有限公司，中国。小鼠CD4+CD25+Treg分离试剂盒(含有生物素-抗体鸡尾酒、抗生物素磁珠、藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)-抗CD25、抗PE磁珠)：Miltenyi Biltec GmbH公司，德国。
IFN-γ、IL-4和IL-2ELISA试剂盒：上海依科赛公司，中国。
2.实验步骤：
①同于实施2部分。②将调节性T细胞按照1×106／ml重悬于含有10％胎牛血清RPMI-1640培养基内，使用10μg／ml抗-Nrp-1封闭1h，按照2×105／孔种植于96孔培养板内，终体积200μl。进一步使用10μg／ml T-肽刺激24h，收集细胞，按照1∶1与效应性T细胞共培养24h。③将细胞分为对照组、抗CD3／CD28组、抗CD3／CD28+调节性T细胞组、抗CD3／CD28+调节性T细胞+T-肽组各组重复孔5个。④培养24h后收集部分上清，用于检测细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-2，细胞用于检测增值率和凋亡率。10μg／ml T-肽对调节性T细胞负向免疫调控作用的影响见图17-21：
调节性T细胞能够明显抑制效应性T细胞增殖，而经10μg／ml T-肽干预后，能够明显缓解这一抑制效应；T-肽干预经抗-Nrp-1封闭后的调节性T细胞不能发挥这一作用(图17)；
调节性T细胞能够明显促进效应性T细胞凋亡，而经10μg／ml -T肽干预后，能够缓解这一促进效应；T-肽干预经抗-Nrp-1封闭后的调节性T细胞不能发挥这一作用，但是较正常细胞仍有明显统计学意义，考虑可能存在调节性T细胞凋亡(图18)；
调节性T细胞能够明显抑制效应性T细胞分泌IFN-γ和IL-2，而经10μg／ml T-肽干预后，能够缓解这一抑制效应；调节性T细胞能够进一步促进IL-4的分泌，而经10μg／ml T-肽干预后，这一作用有所增强；T肽干预经抗-Nrp-1封闭后的调节性T细胞不能发挥上述调节作用(图20)：
经10μg／ml T-肽干预后的调节性T细胞能够恢复效应性T细胞IFN-γ／IL-4平衡，而T-肽干预经抗-Nrp-1封闭后的调节性T细胞不能发挥这一作用(图21)。
3.结果评价：
T肽能够缓解调节性T细胞负向免疫调控作用，是通过结合调节性T细胞表面分子Nrp-1发挥这一调节作用
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种T-肽在制备治疗脓毒症药物中的应用，其中所述的T-肽的化学结构为(Thr-Lys-Pro-Arg-AAN)4-(Lys-AAN)2-Lys-AAN，其中N为自然数。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的T-肽其化学结构为(Thr-Lys-Pro-Arg)4-(Lys)2-Lys。
3.权利要求1或2中任意一项所述的T-肽在制备双向调节效应性T细胞增殖试剂中的应用。
4.权利要求1或2中任意一项所述的T-肽在制备促进效应性T细胞分泌IFN-γ试剂中应用。
5.权利要求1或2中任意一项所述的T-肽在制备抑制效应性T细胞分泌IL-4试剂中应用。
6.权利要求1或2中任意一项所述的T-肽在制备双向调节效应性T细胞分泌IL-2的试剂中的应用。
7.权利要求1或2中任意一项所述的T-肽在制备抑制效应性T细胞活性试剂中的应用。
8.权利要求1或2中任意一项所述的T-肽在制备抑制调节性T细胞活性试剂中的应用。
9.权利要求1或2中任意一项所述的T-肽在制备抑制调节性T细胞表达Foxp3、CTLA-4和分泌TGF-β试剂中的应用。
10.权利要求1或2中任意一项所述的T-肽在制备促进调节性T细胞表面分子Nrp-1和膜相关TGF-β表达试剂中的应用。
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