JP6963560B2 - T細胞の拡張及び活性化の方法 - Google Patents
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Description
(連邦政府支援研究に関する記載)本発明は、米国立衛生研究所のHHSN268201000010Cによる補助の下に政府の支援を受けて達成された。前記政府は本発明に一定の権利を有する。
ある実施態様では、T細胞は、白血球含有細胞混合物及び精製T細胞集団から成る群から選択される。ある実施態様では、白血球含有細胞混合物又は精製T細胞集団は、対象者の末梢血のアフェレーシスから入手される。別の実施態様では、白血球含有細胞混合物又は精製T細胞集団は、人間の対象者の末梢血単核球から入手される。
ある実施態様では、活性化T細胞集団は、活性化CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の少なくとも1つを含む。別の実施態様では、細胞傷害性CD8+ T細胞が活性化T細胞集団から優先的に拡張される。
いくつかの実施態様では、T細胞でBAFF-R受容体活性を低下させる方法は、BAFF-Rアンタゴニストの存在下でT細胞を培養する工程、及びT細胞をBAFF-R特異的shRNAと接触させる工程から成る群から選択される。ある実施態様では、BAFF-RアンタゴニストはBAFF-R中和抗体である。
本発明のいくつかの実施態様では、T細胞でキメラ抗原受容体を提供する工程は、キメラ抗原受容体をT細胞に導入する工程及びキメラ抗原受容体をコードする核酸ベクターをT細胞にトランスフェクトしてT細胞に前記キメラ抗原受容体を発現させる工程から成る群から選択される。
別の特徴では、本明細書に記載の方法にしたがって調製されるヒトT細胞を含むex vivo培養T細胞集団が本明細書で提供される。
別の特徴では、その必要がある対象者で疾患を治療する方法が本明細書で提供される。前記方法は、本明細書に記載の方法によって作製されるT細胞集団の治療的に有効な量を前記対象者に投与する工程を含み、ここで、投与工程は対象者の疾患を治療し、前記疾患は癌及び感染症から成る群から選択される。
いくつかの実施態様では、癌は血液の悪性疾患である。いくつかの実施態様では、血液の悪性疾患は白血病又はリンパ腫である。いくつかの実施態様では、感染症は、細菌性、ウイルス性、真菌性、及び寄生動物性から成る群から選択される。いくつかの実施態様では、T細胞は医薬組成物として投与される。ある実施態様では、T細胞は静脈内注射によって投与される。
(参照による取り込み)本明細書に記載される全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許及び特許出願の各々が、参照により取り込まれると特別にかつ個々に指示されたと同じ程度に参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書で初めて記載するように、MSC由来BAFF/APRIL又は組換えBAFF/APRILのインターフェロンガンマ活性化MSC培養への添加は、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO1)酵素の発現及び活性を高めることができる(前記酵素は必須アミノ酸L-トリプトファンのN-フォルミルキヌレインへの分解を触媒する)。BAFF及びAPRILはIDO1発現のためのトグルスイッチとして機能するように思われる。いかなる特定の理論にも拘束されないが、発現を増大させるBAFF/APRIL受容体を特異的に遮断することによるIDO1のダウンレギュレーションは白血球機能を低下させ、エフェクターT細胞の分裂を高めるであろうと考える。
したがって、本開示は、養子細胞療法の細胞集団及び組成物を調製するための方法、細胞、及び組成物に関する。特に、遺伝子操作及び養子T細胞免疫療法のためのT細胞集団を確実に拡張及び活性化する効率的で効果的な方法を提供する。本発明の方法は、特定のT細胞集団を選択的に活性化することによって治療的方法で使用されるT細胞を提供する。さらにまた、前記方法によって作製される細胞及び組成物、並びにそれらを使用する方法が提供される。本開示はまた、T細胞のin vivo活性化及び拡張の刺激、及び抗BAFF-R剤のin vivo投与のための方法に関する。
第一の特徴では、ex vivoでT細胞を拡張及び活性化することによる、T細胞の集団を調製する確実な方法が本明細書で提供される。本明細書で用いられるように、“ex vivo”という用語は生物の外部で生じる状態を指す。本開示の関係では、免疫細胞のex vivo処置は、そのような細胞をある種の生物学的分子(例えばアゴニスト、アンタゴニスト)にin vitro(すなわち生物の外部)で、好ましくは無菌的条件下で暴露することを意味する。いくつかの事例では、ex vivo方法は、人間から単離した免疫細胞を同じ人間の対象者に投与し直す前に培養する工程を追加的に含む。
第一の工程では、BAFF受容体はT細胞の集団でダウンレギュレート又は遮断され、それによってBAFF受容体の活性は消失又は低下する。BAFF受容体は、当業界で公知の適切な方法又は技術によってダウンレギュレート又は遮断され得る。遺伝子発現のダウンレギュレーション又は受容体活性の低下のための公知の方法には、CRISPR、ミクロRNA、shRNA、RNAi、中和抗体、小分子阻害因子、下流のシグナリング経路を遮断する化学的阻害因子などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、BAFF受容体活性又は遺伝子発現は、1%−100%の間で(すなわち、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%)低下する。ある実施態様では、T細胞はBAFF受容体アンタゴニストの存在下で培養される。ある実施態様では、T細胞をBAFF-R特異的shRNAと接触させてBAFF-R遺伝子発現を低下させる。
ある実施態様では、T細胞はBAFF受容体アンタゴニストの存在下で培養される。例示的な実施態様では、BAFF受容体アンタゴニストは、B細胞活性化因子受容体(BAFF-R)と反応する中和抗体である。ヒト抗BAFF-R抗体は、市場の供給業者(例えばR&D Systems及びInvitrogen)から入手できる。
ある実施態様では、T細胞をBAFF-R特異的shRNAと接触させてBAFF-R遺伝子発現を低下させる。本発明に適するshRNAは、相補性BR3 mRNAの切断及びその後の分解を指令できるものである。適切なshRNA構築物はダーマコン社から購入できる。
T細胞の活性化のために適切な条件は、T細胞の生存能力の維持に適する任意の培地、並びに抗CD3抗体及びCD28抗体をT細胞と接触させることができる前記抗体の任意の処方を含む。いくつかの実施態様では、抗CD3及び抗CD28抗体は固体基材(例えばビーズ又はプレート表面)に固定できる。いくつかの実施態様では、抗CD3及び抗CD28抗体は可溶性である。ある実施態様では、白血球培養の例示的培養液はRPMI1640細胞培養液又は同様な細胞培養液である。場合によって、培地は約25%までの熱不活化ヒト血清アルブミンを含むことができる。BAFF-Rアンタゴニストを培養液に添加し、任意の適切な温度(例えば4℃、25℃又は37℃)でBAFF-Rアンタゴニストとのインキュベーションを実施することができる。好ましくは、BAFF-Rアンタゴニストインキュベーションは37℃で実施される。便利には当業者が適切な処置時間を最適化することができる。好ましくは、処置時間は約1時間から約24時間である。白血球との接触のための例示的BAFF-Rアンタゴニスト量には約0.1μg/mLから約100μg/mLが含まれる。当業者は有用なBAFF-Rアンタゴニスト量を容易に決定してBAFF-R活性を低下又は消失させることができる。
ex vivo操作手順の間に用いられる試薬及び他の物質(例えば抗体、サイトカイン、血清、他の化学品、又は固体支持体(例えばビーズ))及び特にウイルス系遺伝子ベクターは、治療用細胞プロダクトの無菌的製造に適合していなければならない。
いくつかの事例では、PBMC物からT細胞を同時に単離及び活性化(刺激)するのが有利であり得る。例えば、抗CD3及び抗CD28被覆磁性ビーズ(すなわちCTSダイナビーズCD3/CD28)を大きな磁石と一緒に用いて、磁性ビーズ結合細胞を磁性ビーズに結合しないものから分離することができる。
さらにまたT細胞をin vivoで活性化及び拡張するために、対象者に抗BAFF-R剤を投与する方法が本明細書で意図される。本明細書で用いられるように、“抗BAFF-R剤”は、BAFF-R受容体の活性又は遺伝子発現を阻害し又は低下させるものを指す。抗BAFF-R剤には、阻害性抗BAFF-Rモノクローナル抗体、小分子阻害剤、shRNA、shRNAベクター、ミクロRNA、ミクロRNAベクターなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。本明細書で提供する方法にしたがって入手されるT細胞の拡張集団を利用する治療手段は、T細胞のin vivo活性化のための補充となるか、又は代用となり得る。
本明細書で提供する方法にしたがって入手されるT細胞は、感染の治療のために養子細胞療法の方法で用いることができる。本明細書で用いられるように、“感染”という用語は、微生物又は他の感染性因子が健康な細胞に侵入する病的状態を指し、細菌性、ウイルス性又は寄生性(例えば原生動物)感染因子によって引き起こされる任意の様態又は病的状態が含まれる。例えば、“ウイルス感染”という用語は健康な細胞のウイルス(例えばHIV)による侵入を指し、この場合、ウイルスは細胞の増殖機構を使用して増加又は複製し、最終的には細胞を溶解させて細胞死、ウイルス粒子の放出、及び新規生成子孫ウイルスによる他の細胞の感染をもたらす。感染に関しては、“治療”という用語はさらに治療薬の適用又は投与を指し、この場合、その目的は、治癒(cure, heal)、緩和、軽減、改変、修復、好転、改善、又は前記感染、前記感染に関係する任意の症状もしくは感染発症素因に影響を与えることである。
いくつかの事例では、本明細書で提供する方法にしたがって入手されるT細胞を医薬組成物として投与することができ、前記組成物は、治療薬剤として(すなわち治療的な適用のために)有効な量のT細胞を含む。本明細書で用いられるように、“医薬組成物”という用語は、哺乳動物への投与に適する化学的又は生物学的組成物を指す。そのような治療的な適用に適する組成物の例には、非経口投与、皮下、経皮、皮内、筋肉内、冠状動脈内、心筋内、脳内、腫瘍内、腹腔内、静脈内(例えば注射可能)、又は気管内投与のための調製物(例えば無菌的懸濁物、乳濁液及びエーロゾル)が含まれる。気管内投与は、治療的に有効な量のT細胞を含む医薬組成物に肺組織(例えば肺胞)を接触又は暴露する工程を必要とする。いくつかの事例では、治療的な適用に適した医薬組成物は、1つ以上の医薬的に許容できる賦形剤、希釈剤又は担体(例えば滅菌水、生理学的食塩水、グルコースなど)との混合物中に存在し得る。例えば、本明細書に記載するT細胞は、食塩水溶液を含む医薬組成物として対象者に投与され得る。例示的な実施態様では、本明細書で提供する方法にしたがって拡張されるT細胞は、対象者に投与されるとき所望の治療的又は予防的効果を誘発することができる。
好ましいルートは、例えば、対象者の病理学的状態もしくは体重、又は対象者の治療方法に対する応答、又は状況に見合う治療方法により変動し得る。処方物はまた2つ以上のルートによって投与することが可能であり、この場合、デリバリーの方法は本質的に同時であるか、或いは組成物が対象者に投与される時間において本質的に時間的オーバーラップがほとんどないかもしくは全くない。
最初の投与及び更なる投与のための又は連続投与のための適切なレジメンもまた変動可能であり、最初の投与とその後に投与が続くレジメンが含まれ得るが、それにもかかわらず、当業者は、本開示、本明細書に引用する資料及び当業界の知識から適切なレジメンを確認することができる。
いくつかの実施態様では、T細胞は、その必要がある対象者に輸液、局部適用、外科的移植又は埋め込みを用いて投与される。例示的な実施態様では、投与は全身性である。そのような事例では、T細胞は、その必要がある対象者に静脈内投与に適合させた医薬組成物として対象者に投与される。典型的には、静脈内投与用組成物は無菌的な等張水性緩衝液中の溶液である。そのような緩衝液及び希釈剤の使用は当業界で周知である。必要な場合には、組成物はまた局所麻酔剤を含み、注射部位のいずれの痛みも緩和することができる。一般的には、成分は別々に供給されるか、又はユニット投薬形として(例えば密閉容器(例えば活性薬剤の量を示すアンプル)中の冷凍保存濃縮物として)一緒に混合される。組成物が輸液によって投与される場合、組成物は無菌的な医薬等級水又は食塩水を含む輸液瓶に分注できる。組成物が注射によって投与される場合は、注射用滅菌水又は食塩水のアンプルを提供し、組成物を投与前に混合することができる。いくつかの事例では、本発明のT細胞を含む組成物は投与前には冷凍保存される。
有効な量は、投与に際して細胞の作用を改変する多様な要因及び細胞に対する対象者の生物学的応答(例えば患者の年齢、性別及び食事、炎症の重篤度、投与時期、並びに他の臨床的要因)によって影響を受けるであろう。本明細書で提供する方法にしたがって入手されるT細胞の治療的に有効な量を対象者に投与することができる。
個々の任意の対象者について、規定の投薬レジメンは、各個体の必要性及びT細胞を投与する者又は投与を監督する者の専門的な判断にしたがって時間をかけて調整されねばならないことは理解されるべきである。例えば、個々の対象者のT細胞投薬量は、より低い用量が検出可能な又は十分な改善を引き出さない場合には増加させることができる。
いくつかの事例では、T細胞の治療的に有効な量は、所望の症候緩和レベルに達するまで投薬量を徐々に増加させることにより治療薬の効果を対象者で測定することによって決定できる。持続投与又は反復投与レジメンもまた、所望の結果の達成又は維持のために用いることができる。当業界で公知の任意の他の技術も同様に用いて有効な量の範囲を決定することができる。もちろんのこと、規定の有効量は、治療される個々の様態、対象者の生理的様態、治療される動物のタイプ、治療期間、及び任意の同時実施療法の性質のような要件により変動するであろう。本明細書に記載の疾患もしくは様態の影響下にあるか、又はそれら疾患もしくは様態を発生させやすいか又は発生の蓋然性が高い個々の対象者へのT細胞の投与に続いて、臨床症状又は前記疾患もしくは様態の特質における正又は負の変化について前記対象者を観察及び評価する。例えば、対象者で癌を治療する方法の場合、治療の間又は治療後の正又は負の変化は、当業者に公知の任意の手段(腫瘍サイズの変化の測定を含むが、ただし前記に限定されない)によって決定され得る。
対象者への投与は、局所注射もしくは全身注射によるか、又は局部適用によることができる。例えば、T細胞は、静脈内注射(例えば点滴輸液)、筋肉内注射、腹腔内注射、器官内注射、又は皮下注射によって投与され得る。いくつかの事例では、対象者は、組織の維持、組織の修復もしくは機能、又は全体的な様態に関して観察もしくは評価される。
別の特徴では、本発明は養子細胞療法に有用な製造物品を提供する。いくつかの事例では、本発明のキットは人間のT細胞を収納する1つ以上の容器を含む。具体的な実施態様では、本明細書で提供する方法にしたがって拡張及び活性化される細胞がキットとして提供され、いくつかの事例では、前記細胞がキットの唯一の成分であり得る。キットは追加的に試薬及び材料を含むことができ、前記は、本明細書で提供するT細胞を拡張及び活性化して所望の細胞プロダクトを得るために有用である。例えば、キットは1つ以上のBAFF-Rアンタゴニストを含むことができる。
場合によって、キットはさらに1つ以上の試薬又は他の成分を含むことができ、前記は、本発明の方法にしたがってT細胞をその必要がある人間の対象者に投与するために必要である。いくつかの事例では、医薬的に許容できる冷凍保存料中の冷凍アリコットとしてT細胞を提供することは適切であり得る。
いくつかの事例では、本明細書で提供するT細胞に加えて、キットはまた第二の治療薬(例えば化学療法剤、ホルモン治療剤及び/又は免疫治療剤)を含む。キットは、ある個体の特定の癌に合わせて仕立て直し、前記個体のために対応する第二の治療薬を含むことができる。いくつかの事例では、キットはさらに、1つ以上の活性薬剤(例えば抗炎症剤、抗サイトカイン剤、鎮痛剤、解熱剤、抗生物質及び抗ウイルス剤)とともに増殖因子並びに免疫調節薬剤のアゴニスト、アンタゴニスト及び調節物質を含む(例えば、TNF-α、インターロイキン2(IL-2)、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、IFN-α、IFN-γ、BAFF、CXCL13、IP-10、VEGF、EPO、EGF、HRG、肝細胞増殖因子(HGF)、ヘプシジン、(前述のいずれかに対して反応する抗体、及びそれらの受容体のいずれかに対して反応する抗体を含む))。癌治療に有用な医薬クラスには以下が含まれる(ただしこれらに限定されない):グルココルチコイド(例えばプレドニソロン)、免疫抑制剤(例えばシクロスポリン、メトトレキセート、タクロリムス、ピメクロリムス、シロリムス、ミコフェノレート、モフェチル、ビジリズマブ、抗胸腺細胞グロブリン(ATG))、抗新生物剤(例えばペントスタチン)、及び抗リウマチ剤(例えばヒドロキシクロロキン、インフリキシマブ、エタネルセプト)。そのような活性な薬剤の適切な組合せを含むキットもまた意図される。そのような容器とともに、人間への投与のための指示及び生物学的製剤の製造、使用又は販売に関する規制庁の所定の形式の通知が提供される(前記通知は人間への投与について官庁の製造、使用又は販売の承認を示す)。
本発明は、以下の非限定的な実施例を考慮するときより完全に理解されるであろう。本明細書に開示する全ての成書、論文及び特許は参照によってその全体が本明細書に含まれる。
実施例
以下の例についてこれから述べる。これらの例は、上記の説明と一緒になって本発明を非限定的な態様で解説するであろう。
我々は、間葉系幹細胞(MSC)由来BAFFがMSC媒介T細胞抑制をin vitroで妨げるか否かを決定するために、健康なドナーの骨髄由来MSCを調べてきた。我々は、‘免疫潜在能アッセイ’を設計し(Bloom et al., 2015.Cytotherapy 17:140-151)、健康なドナーから入手してカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識した末梢血白血球(PBL)を滴定数のMSCと共培養した。PBL環境内のT細胞を可溶性抗CD3/抗CD28で刺激した。T細胞サブセットの分裂をフローサイトメトリーで測定した。MSC非存在下の活性化T細胞の陽性コントロールに対してMSC媒介阻害を計測した。TACI-Fc(Atacicept)は、BAFF及びAPRILと効果的に結合する可溶性TACI受容体である。PBL:MSC共培養に添加したとき、TACI-FcはCD4+ T細胞阻害を逆転させた。T細胞阻害に対するMSC-BAFF下方調整の効果を測定した。
PBL共培養を伴う5つの実験(5つの異なるMSC株を用いる)の各々で、7つの異なるBAFF特異的shRNAプラスミドを用いた。驚くべきことに、MSC-BAFFのサイレンシングはT細胞抑制を逆転させた。BAFFレベルはCD4+ T細胞分裂と逆の相関性を示した(R2=0.81、図1A)。しかしながら、MSCによるIL-6の発現はBAFFの下方調整の影響を受けず(図1B)、MSC生存率にも変化はなかった。IDO1(インドールアミン-ピロール2,3-ジオキシゲナーゼ)mRNAレベル及び酵素活性の低下は下方調整BAFFレベルと相関性を示し、BAFFがこのT細胞抑制因子の発現を調節することを示唆する。
次に、BR3中和抗体(R&D Systems, Inc.)を用いてBR3機能を遮断した。4日間の共培養アッセイで、我々は、抗BR3はMSC共培養でCD4+ 分裂を増大させるが、MSC非存在下T細胞活性化PBLのCD4+ 分裂もまたPBLドナーに応じて様々な程度で強化されることを見出した。これらのデータは、BR3は少なくとも1つのCD4+ 細胞サブセットの正常な恒常的抑制を制御していることを示唆する。
総合すれば、これらのデータは、BAFFはIDO1の発現を増大させること、さらにBR3は、細胞傷害性(CD4+及びCD8+)T細胞分裂、IFN-γ発現及びグランザイムB生成の主要な負の調節因子であることを強く示している。我々は、細胞傷害性T細胞活性化のBR3媒介抑制のメカニズムの1つはIDO1発現を強化するその能力であると仮説を立てる。我々のin vitroデータは、BAFFは免疫抑制因子発現を媒介するという仮説を支持する。末梢血リンパ球がT細胞刺激抗体(抗CD3及び抗CD28)で刺激されるとき、CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の両方の分裂が増加する。BAFF受容体BR3を特異的に中和する抗体を添加したとき、CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の両方の分裂が顕著に増加する。興味深いことに、データはまた、BR3の遮断はIFN-γ生成とともにCD8+ T細胞毒素グランザイムBの生成及び/又は分泌を強化することを明示した。これらのデータは、BR3がCD8+ 細胞傷害性T細胞活性化及び分裂の必須の抑制因子の1つであることを強く示唆する。
末梢血白血球の調製:健康な個体から採取した血液からPBLを単離した。アフェレーシスプロダクト又は全血を用いてもよい。細胞をフィコール-パークグラジエントに適用して、以前に記載されたように赤血球及び血小板夾雑物から白血球を精製する(Corkum et al., 2015.BMC Immunol.Aug 26;16:48)。PBLが生存可能なようにDMSOを用いてバイアルで凍結し液体窒素中で冷凍保存した。
抗体及び試薬:抗CD3εは、ヒトT細胞上のTCR複合体のエプシロン鎖を刺激するモノクローナル抗体である。クローンUCHT1をR&Dシステムズ社(cat# MAB100)から購入した。凍結乾燥生成物を500μg/mLでPBSに再懸濁し、適量ずつに分けて-20℃で長期間保存した。
抗CD28は、抗CD3εと一緒になってヒトT細胞を共刺激するモノクローナル抗体である。。クローン37407をR&Dシステムズ社(cat# MAB342)から購入した。凍結乾燥生成物を500μg/mLでPBSに再懸濁し、適量ずつに分けて-20℃で長期間保存した。
抗BAFF-R遮断抗体はヒトBR3を遮断する。前記はR&Dシステムズ社(cat# AF1162)から購入したヤギモノクローナル抗体である。凍結乾燥生成物を200μg/mLでPBSに再懸濁し、適量ずつに分けて-20℃で長期間保存した。
ヤギIgGコントロールはR&Dシステムズ社(cat# AB-108-C)から購入した。凍結乾燥生成物を200μg/mLでPBSに再懸濁し、適量ずつに分けて-20℃で長期間保存した。
完全RPMI培養液: 10%FBS(55℃で30分間熱不活化(Atlanta Biologicals))、グルタミン、非必須アミノ酸、HEPES、ピルビン酸ナトリウムを含むRPMI-1640。ペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/Strep)は決まって用いられるわけではなく、その添加は結果を左右しない。培養液を使用前にろ過滅菌した。
CFSE(カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル):DMSO中に1mMのストック濃度。蛍光色素はInvitrogenから購入した。
フローサイトメトリーのための抗huCD4 APC標識抗体及び抗huCD8 APC標識抗体はR&Dシステムズ社から購入した。
実施例2に記載する実験は、分裂アッセイで使用される非精製T細胞でBR3遮断を達成するために使用される方法を提示する。末梢血白血球(PBL)を含むバイアルを37℃の水浴で迅速に(約2分間)融解してPBLを無菌的に15mLの円錐状チューブに移し、完全RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培養液に再懸濁した。チューブを1200rpmで10分間遠心分離した。上清を細胞ペレットから吸引除去した。Ca2+又はMg2+を含まないD-PBSの10mLを細胞ペレットに添加し細胞を洗浄した。この細胞を1200rpmで10分間遠心分離した。上清を細胞ペレットから吸引除去し、10x106細胞につき1mLを超えないPBSを添加した。細胞1mLにつき2μLのCFSE(1mM)を添加して混合し、暗所で10分間37℃にてインキュベートした。等体積の冷(4℃)PBSを添加してCFSE標識を停止した。細胞を洗浄し、約4x105細胞に対応する細胞懸濁物200μLが48ウェルプレートの各ウェルに添加できるように調製した。
抗BR3抗体又はコントロールヤギ抗IgG抗体を48ウェルプレートの各ウェルに添加した。5%のCO2を含むインキュベーターで細胞と抗体を37℃で30分間インキュベートした。
抗BR3又はIgGコントロール抗体とともにインキュベートした後、抗CD3/CD28刺激抗体(好ましくは5:1の比)を前記細胞培養に添加し、培養を3−4日間インキュベートしてT細胞拡張を進行させた。分裂を分析するために、各ウェルから細胞を採集し遠心チューブに入れて上清を分離し、細胞ペレットを収集した。更なる分析のために上清を別々に-20℃で保存した。抗CD4 APC又は抗CD8 APCフロー抗体のどちらかにサンプルを導入し、FL1(CFSE)及びFL4(APC)チャネルを用いてフローサイトメーターで分析した。非刺激コントロール(すなわち細胞分割を経た細胞の全パーセンテージ)に対して細胞を全分裂について分析した。標準的フローサイトメトリーデータ分析及びモデリングソフト(FlowJoTM又はModFit LTTM)を用いて、細胞分裂を分析した。
白血球アフェレーシスの1日目又は2日目に収集したドナー白血球プロダクトに由来する細胞のアリコットをDLIの前にex vivo拡張のために取り出す。コールターマルチサイザー3(Coulter Multisizer3(Beckman Coulter, Fullerton, CA))でゲートコントロールしたとき、単球が白血球(WBC)の20%以上を構成する場合、閉鎖系での単球の磁性ビーズ枯渇を用いて洗浄アフェレーシスプロダクトをリンパ球について濃縮する。適切なFDAガイドライン及び適正製造基準に合致する態様でT細胞を処理する。
以下を補充したX VIVO 15(Cambrex, Walkersville, MD)含む気体浸透性フラスコに細胞を播種する:5%正常ヒトAB血清(Valley Biomedical, Winchester, VA)、2mLのL-グルタミン(Cambrex)、及び20mM HEPES(Cambrex)。抗CD3(OKT3;Ortho Biotech, Bridgewater, NJ)及び抗CD28(クローン9.3)モノクローナル抗体を結合させた磁性ビーズ(Dynal, Brown Deer, WI)をビーズ/CD3+細胞比3:1で添加し、輸液のために採集及び調製する前に12日まで前記培養を維持する。細胞培養完了後、磁性細胞分離系を用いて磁性ビーズを除去し、細胞を洗浄及び濃縮して100から250mLのプラズマライトA(PlasmaLyte A(Baxter Oncology))/5%デキストロース0.45%NaCl(1%のヒト血清アルブミン(Baxter Oncology)を含む)に再懸濁した。輸液される全てのT細胞プロダクトは、T細胞表現型、細胞生存率、発熱性、無菌性、及びビーズ夾雑フリーについて指定された放出基準に合致することが要求される。
材料と方法
細胞培養及び精製:初代ヒトT細胞を以下の業者(AllCells, LLC(Alameda, CA)又はKey Biologics, LLC(Memphis, TN))から購入した白血球アフェレーシスから入手した。到着時に、PBLをフィコール分離により単離し、将来の使用に向けて生存可能なように凍結した。T細胞実験のために、融解したPBLを活性化アッセイに直接用いるか、又は磁性ビーズ仕分けによってT細胞サブセットを精製した。精製のために、CD4又はCD8ビーズ(Miltenyi Biotec, Inc.(San Diego, CA))を製造業者のプロトコルにしたがって用いた。ビーズ仕分けのためにオートマックスソーター(AutoMacs sorter(Miltenyi Biotec))を用いた。CD4及びCD8 T細胞集団は典型的には90−95%の純度であった。全てのT細胞アッセイをRPMI(10%FBS、グルタミン、HEPES、ピルビン酸ナトリウム、NEAA、及びPen/Strepを含む)で実施した。メラノーマ株U266をRPMI(10%FBS、グルタミン、HEPES、ピルビン酸ナトリウム、NEAA、及びPen/Strepを含む)で培養した。付着性メラノーマ株A375をアルファ-MEM(10%FBS、グルタミン、NEAA、及びPen/Strepを含む)で拡張した。A375細胞は継代前に70−80%コンフルエンシーまで増殖させた。
フローサイトメトリー:全てのフローサイトメトリー実験を、4色分析のために2つのレーザーを有するアクリC6(Accuri C6(BD Biosciences, Inc.))で実施した。用いた抗体は以下の通りであった:抗BR3 PE、クローン11C1(BD Biosciences);抗CD25 FITC-バイオレット及びAPC、クローン3H3(Miltenyi Biotec);抗IFN-g APC、クローンB27(BD Biosciences);抗Granzyme B PE、クローンGB11(BD Biosciences);抗CRTAM PE、クローンCr24.1(Biolegend, Inc.)。分析は、CFlowPlus(BD Biosciences)又はFlowJo(TreeStar, Inc.)ソフトを用いて実施した。
抗BR3中和アッセイ:BAFF受容体遮断抗体(抗BR3(cat# AF1162)、抗TACI(cat# AF174)及び抗BCMA(cat# AF193))は、R&Dシステムズ社(Minneapolis, MN)から購入した。3つはいずれもヤギポリクローナル抗体である。いずれも凍結製品として受け取った。全てを推奨濃度でPBSに再懸濁し、小分けし、製造業者の指示にしたがって凍結した。抗体製品の使用については1回だけ融解するように注意を払った。遮断アッセイのために、CD4及びCD8 T細胞サブセットをビーズ選別し完全RPMI(上記参照)に1x10e6/mLに再懸濁した。10μg/mLの各中和抗体又は正常ヤギIgGコントロール(cat# AB-108-C)とともに細胞を25℃で30分間予備インキュベートした。2x10e5細胞/ウェルを96ウェル平底組織培養処理プレートに添加し、2x10e5/mLを48ウェルプレートに添加した。1μg/mLの抗CD3e(クローンUCHT1、R&D Systems, Inc.)及び0.2μg/mLの抗CD28(クローン37407、R&D Systems, Inc.)でプレートを37℃で8時間予め被覆し、続いてPBSで洗浄した。繰り返せば、抗CD3/CD28抗体は1回だけ融解するように注意した。37℃のインキュベーターで21−24時間T細胞の活性化及びインキュベーションを5%CO2下で実施した。内径が広いピペットチップを用いて細胞を穏やかに採集し、上清を収集して-20℃で保存した。
BR3 shRNA下方調整:ヒトBAFF-Rに特異的な4つのshRNAプラスミド構築物を業者(Dharmacon, Inc.)から購入した(GIPZ shRNAコントロールプラスミドを含む)。各プラスミドの1−2μgを2−4x10e6 CD4又はCD8 T細胞にアマクサ社(Amaxa)系ヌクレオフェクションを用いて導入した。ヒトT細胞トランスフェクションに特異的なアマクサキットは業者(Lonza, Inc.)から購入した。プログラムV24を製造業者の指示にしたがってエレクトロポレーションのために用い、その後で細胞を予め温めた完全RPMIを含む12ウェルプレートで養生させた。続いて細胞を穏やかに採集し、生死について分析し、さらに1x10e6生細胞/ウェルで12ウェルプレートに添加した(前記プレートは抗CD3/CD28(上記の通りそれぞれ1μg/mL及び0.2μg/mL)で予め被覆されている)。トランスフェクト細胞を21−24時間活性化した。続いて細胞を採集し、上記に記載したようにBR3、CD25及びIFN-gについて分析した。
細胞傷害性アッセイ:当業界で以前に記載されたCSFE/ヨウ化プロピジウムアッセイを用いて、細胞傷害性/標的殺滅を測定した。簡単に記せば、CFSE標識A375メラノーマ細胞を、精製したCD4+及びCD8+ T細胞と30:1−5:1の範囲のTeff:標的比で共培養した。続いて細胞を採集し、CFSE陽性ゲートで陽性PIパーセントについてフローサイトメトリーによって分析した。T細胞は抗CD2 APCでゲートアウトした。
ELISA:上記に記載したアッセイから21−24時間後に組織培養上清を採集し、-20℃で凍結した。上清は1か月以内に利用した。培養上清中のヒトIFN-g濃度をELISAキット(Thermo-Pierce, Inc.)により測定した。ヒトグランザイムBは以下の業者のELISAキットを用いて測定した(eBioscience, Inc.(Platinum ELISA)及びR&D Systems, Inc.(DuoSet))。
結果
BR3は休止T細胞及び抗CD3/CD28活性化T細胞で発現される:休止及び抗CD3/抗CD28活性化T細胞がそれらの細胞表面でBR3をどの程度発現するかを我々の系で調べることによって分析を開始した(BR3特異的抗体クローン1C11をフローサイトメトリーで用いた)。ビーズ選別によって精製したCD4+及びCD8+ T細胞を24時間休止させるか、又はプレート結合刺激抗体を用いて活性化させた。一連の異なる健康な血液ドナーを用い、我々は、休止CD4+ BR3+細胞では表面BR3レベルに顕著な変動性(10+/-8%)があるが、休止CD8+ BR3+細胞パーセンテージは変動性が顕著に低い(10+/-1%)ことを見出した(図4A)。抗CD25(抗IL-2α)抗体クローン4E3(Miltenyi Biotec, Inc.)を用いたとき、BR3発現は休止CD4+ CD25hi細胞分画で検出されたが、全休止CD4+集団の1%を超えることはなかった(データは示されていない)。休止CD8+ CD25hi細胞は検出されなかった。プレート結合抗CD3/CD28で24時間刺激したとき、BR3発現は、CD4+ T細胞で平均25%、CD8+ T細胞で12%まで増加した。
CD25及びCD69は確立されたT細胞活性化マーカーである。我々の系では、プレート結合刺激抗体(1μg/mLの抗CD3及び0.2μg/mLの抗CD28)を用いたとき、30−50%のT細胞がCD25を24時間で発現した。CD25+細胞の90%を超えるものがCD69を同時発現した。しかしながら、BR3+細胞のきわめてわずかな部分がCD25+/CD69+であった。平均して、CD4+BR3+ T細胞の30%がCD25を同時発現し、一方、CD8+BR3+細胞の20%だけがCD25を発現した(代表的ドットプロットは図4B、平均は図4C)。これは、BR3は活性化T細胞で普遍的に発現されるわけではないことを示唆している。重要なことに、CD4+BR3+及びCD8+BR3+集団の大半がIFN-γを活性化24時間後に産生しなかった(細胞内フローサイトメトリーで決定)(図4D)。IFN-γ+細胞の75−90%がCD25+BR3-であった。これは、我々の系では、BR3は最も機能的に活性なエフェクター細胞で発現されないことを示唆している。
重要なことに、我々は、活性化CD4+及びCD8+リンパ球でBAFF受容体BCMA及びTACIを検出できた。フローサイトメトリー分析は、刺激後24時間に10−20%のBCMA+ T細胞及び2−5%のTACI+細胞を示した(データは示されていない)。PCR分析は相対的なBCMA及びTACIタンパク質レベルを立証した(データは示されていない)。したがって、3つのBAFF受容体はいずれも本実験の活性化ヒトT細胞で発現された。
抗CD3/CD28で21−24時間刺激する前に、精製CD4+及びCD8+ T細胞を各中和抗体で30分間予めインキュベートした。CD25発現はフローサイトメトリー及び半定量PCRによって測定した。CD25発現のフロー分析は、抗BR3遮断はCD4+CD25+CD69+細胞及びCD8+CD25+CD69+細胞のパーセントを増加させ、CD25のメディアンチャネル蛍光(MCF)を顕著に増加させることを示した(図5A)。ヤギIgGコントロール、抗TACI及び抗BCMAはCD25発現に顕著な影響を与えなかった。CD25 mRNA発現は、CD4+細胞については2−6倍、及びCD8+細胞については2−3倍増加した(図5B)。CD69のMCFはCD69 mRNA発現と同様にBR3遮断で変化することはなかった(データは示されていない)。
これらのデータはBR3がT細胞活性化を抑制し続け得ることを示唆した。しかしながら、我々は、活性化T細胞によって発現され放出される内因性BAFFの結合を24時間にわたって遮断していた。したがって、可溶性BAFFレベルは比較的低かった(培養上清では10−30pg/mLの範囲)(データは示されていない)。我々は、CD25発現は、高濃度(2ng/mL)(前記濃度は自己免疫疾患及び腫瘍のミクロ環境で典型的に検出されるレベル)の可溶性組換えヒトBAFFの存在下でBR3遮断により低下するのではないかと考えた。T細胞を抗BR3遮断抗体で予備処理し、続いて1−2ng/mLのrhBAFFの存在下で抗CD3/CD28で刺激した。図2Cに示すように、CD25発現は、CD4+細胞及びCD8+細胞でBR3中和により顕著に増加した。これらの実験は、BR3は高濃度の可溶性BAFFの存在下ですらT細胞活性化を抑制することを示唆する。
3つのBR3特異的shRNA構築物(Dharmacon, Inc.)をコントロールshRNA GIPZプラスミドとともに試験した。簡単に記せば、精製T細胞をヌクレオポレーション(Amaxa, Inc.)を介してトランスフェクトし、20時間養生し、続いてプレート結合抗CD3及び抗CD28で24時間活性化した(材料と方法の項を参照されたい)。BR3 shRNA構築物のうち、2つが、フローサイトメトリーによる分析でコントロールshRNAと比較して70%を超える効果的なBR3発現低下を示した(図7A)。BR3発現を低下させたこの2つのうち、構築物85のみがCD4+細胞及びCD8+細胞の両方でCD25発現を増加させた(図7B)。BR3特異的shRNAをトランスフェクトした活性化細胞のフォワードスキャターもまた増加した(データは示されていない)。
我々は、IFN-γ発現についても同様にBR3 shRNA構築物を細胞内フローサイトメトリーを用いて分析した。トランスフェクトT細胞をブレフェルジンAの存在下で5時間活性化した。図7Cに示すように、IFN-γ発現は、コントロールshRNAと比較して活性化BR3サイレンシングT細胞で顕著に増加した。これらのデータはさらに、BR3は抗CD3/CD28 T細胞活性化を阻害できるという仮説を支持する。
我々は次に細胞傷害性T細胞マーカーCRTAMを用い、活性な細胞溶解性T細胞がBR3中和により活性化を増加させるか否かを判定した。図8Bに示すように、CRTAM+CD4+細胞及びCRTAM+CD8+細胞(ただしその程度は劣るが)の両方が、抗BR3の存在下でCD25発現を有意に増加させた。これは、BR3がT細胞の細胞溶解性機能を増大し得ることを示唆した。
抗BR3がT細胞の殺滅機能を増加できるか否かを判定するために、我々は、メラノーマ細胞株A375を活性化CD4及びCD8 Tエフェクター細胞の標的として用いた。A375細胞は内皮に由来する株であり、HLAクラスI及びクラスIIの両方を発現する。健康なドナーの精製Tエフェクター細胞(前記は抗CD3/抗CD28で活性化された総T細胞である)は、A375メラノーマ腫瘍細胞を殺滅することができた。抗BR3による予備インキュベーションとその後の総T細胞活性化は、A375殺滅をCFSE-ヨウ化プロピジウムアッセイで4倍強化した。培養4日後に、線維芽細胞様A375細胞は顕著に減少した(図8D)。総合すれば、これらのデータは、抗BR3はCD4+及びCD8+の両細胞のT細胞細胞傷害性を強化することを示唆する。
図8Cはミエローマ株U266の溶解を示し、細胞溶解性CD4+ T細胞は抗BR3の存在下でU266をより効率的に殺滅できることを表している。これは、それが、抗BR3の使用及びBR3活性の低下は単に古典的CD8+ CTLだけでなくCD4+ CTLの殺滅機能を増大できることを示しているので重要である。U266の殺滅はそのよい例である。なぜならば、前記アッセイで、CD4+ CTLはおそらくU266 B細胞上のクラスII(HLA-DR)不適合分子を標的としているからである。おそらく、CD4+ CTLが標的とすることが可能なクラスIIによって提示される多くの腫瘍抗原が存在するであろう。抗BR3は、このT細胞サブセットの活性化及び殺滅機能を顕著に増大させる有益な治療薬となろう。
本明細書に提示したデータは、ヒトCD4及びCD8 T細胞で発現されるBAFF-R/BR3は抗CD3/CD28媒介活性化及び細胞傷害性を制限できることを示す。BAFFとBR3との結合の阻害又はその発現の下方調整はIFN-γ及びグランザイムBの発現を増大させる。加えて、抗BR3による中和は腫瘍細胞株A375の殺滅をin vitroで促進する。
我々は、リガンドBAFFはCD4+ T細胞分裂を強化し抑制しないということを示す以前の報告は知っている。例えば、BAFFは、いくつかの実験で、CD28シグナリングの非存在下でネズミ及びヒトT細胞の両方でTCR活性化を共刺激した。これらの報告は、いくつかの明確な様式で我々の実験と相違する。第一に、マイクログラムレベルのプレート結合BAFFが活性化アッセイで用いられ、一方、我々は、活性化T細胞そのものによって発現される膜結合及び可溶性BAFFに依拠した。したがって、可溶性BAFFレベルはピコグラムレベルであった(前記レベルは正常なヒト血清のものにより類似する)。さらにまた、活性化及び分裂は刺激後72時間で測定され、最適活性化時間の24時間よりはるかに後である。最後に、これらのグループは特異的にBR3を下方調整したわけではなかった。その代わりに、BR3は、TACI及びBCMAの非発現に基づいてT細胞の活性化/分裂の増大を媒介するBAFF受容体と称された。我々は、BCMA特異的mRNAを増幅して活性化T細胞の細胞表面でBCMAを検出することができた。加えて、低レベルのTACI mRNAもまた我々の活性化T細胞で検出され、TACIはCD4及びCD8細胞の両方で発現された。したがって、BR3がヒトT細胞活性化をin vitroで抑制し得ることを決定するために、BR3の下方調整と同様にその特異的遮断が要求される。
in vivo実験では、BAFF-/-マウスは、心臓移植モデルの同種異系移植の生存で控えめな延長を示した。さらに、ある種のTH1応答はBAFF及びBAFF-Rトランスジェニックマウスで強化される。しかしながら、BAFFは単にT細胞活性化を強化するだけであるという考えは確定的というには程遠い。なぜならば、BAFF-/-マウスもまた正常なTH1応答を示すからである。さらにまた、ネズミのEAEモデルでは、BAFF-R欠損は疾患重篤度の悪化をもたらした。さらに、自己免疫疾患(例えば多発性硬化症)のために抗BAFF治療薬を用いた臨床試験では、数症例を超える疾患重篤度の悪化が見られた。したがって、T細胞に対するBAFF作用の二元的な性質の可能性を再度精査することが重要であった。我々のデーターの主要部を考慮して、我々は、BAFF/BR3は細胞傷害性T細胞機能を抑制することを提唱する。我々の知るかぎりでは、これは、ヒト細胞溶解性CD4+及びCD8+細胞に対するBR3の機能に注目した最初の報告である、
シグナリングという観点から見れば、TACI及びBCMAを除いて何がBR3を規定するのであろうか。3つのBAFF受容体のいずれも直接的及び間接的NF-kB経路を介してシグナルを発するが、BR3のみはPKC-δシグナリングを抑制することが示されている。PKC-δ(BR3によって抑制される)が抗BR3媒介中和により増加することは可能であり得る。PKC-δはCTLでリソソーム活性を高めることが示された。したがって、これはこの遮断抗体の作用の1つの可能な態様であり得る。PKC-δシグナリングはBR3媒介Tc抑制と連携しているか否かを決定する実験は現在進行中である。
本発見に対し多くの治療的示唆が存在する。癌、自己免疫疾患、及び免疫不全におけるBAFFレベルの増加はCTLを抑制し得る。したがって、自己免疫疾患及び移植のいくつかの例では、治療薬BAFFリガンド競合物質はBR3機能を中和して、自己反応性及び他家反応性T細胞の活性の有害な増加をもたらし得る。しかしながら、いくつかの癌及び免疫不全(例えばエイズ)の例では、リガンド競合物質又はBR3標的抗体によるBR3の遮断は、CTL機能を高め、疾患の矯正を助けることができよう。
BR3中和のための1つの明確な適用は、CAR-T又はTIL系癌免疫療法のためのex vivo Tcリンパ球活性化の適用である。これまでは、キメラT細胞及び腫瘍浸潤T細胞の活性化及び拡張は、主として、抗CD3及び抗CD28で細胞を刺激し続いてIL-2による拡張を実施することによって実行される。低親和性IL-2鎖CD25の発現増加を示す我々のデータが与えられるならば、我々は、抗BR3中和抗体の添加は活性化CD4+及びCD8+ CTLの拡張を強化し得るという仮説を提示する。活性化T細胞への抗BR3の添加がより有効な腫瘍殺滅プロダクトを生じるか否かを試験する実験は現在進行中である。
Claims (12)
- T細胞の集団を調製する方法であって、以下の工程、
(a)前記T細胞におけるBAFF-R受容体活性を低下させる工程、及び
(b)抗CD3抗体又はそのCD3結合フラグメント及び抗CD28抗体又はそのCD28結合フラグメントの存在下で、工程(a)のT細胞を3〜14日間、培養する工程、
を含み、前記低下工程及び培養工程が、前記T細胞を活性化し、得られた活性化T細胞の増殖を誘発して、前記活性化T細胞を含む集団を生成することを特徴とする方法。 - 前記T細胞が、白血球含有細胞混合物及び精製T細胞集団から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記白血球含有細胞混合物又は精製T細胞集団が、人間の対象者の末梢血アフェレーシスから入手されたものである、請求項2に記載の方法。
- 前記白血球含有細胞混合物又は精製T細胞集団が、人間の対象者の末梢血単核球から入手されたものである、請求項2に記載の方法。
- 前記集団が、活性化CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞傷害性CD8+ T細胞が、前記活性化T細胞集団から拡張される、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)の方法が、以下の工程、
(i)BAFF-Rアンタゴニストの存在下でT細胞を培養する工程、及び
(ii)T細胞をBAFF-R特異的shRNAと接触させる工程、
から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。 - 前記BAFF-Rアンタゴニストが、BAFF-R中和抗体である、請求項7に記載の方法。
- 下記工程、
(c)前記T細胞においてキメラ抗原受容体を提供して、前記キメラ抗原受容体を含む活性化T細胞の集団を生成する工程、
を追加的に含む、請求項1に記載の方法。 - 提供工程(c)が、以下の工程、
(i)前記キメラ抗原受容体を前記T細胞に導入する工程、及び
(ii)前記キメラ抗原受容体をコードする核酸ベクターを前記T細胞にトランスフェクトし、それによって前記T細胞が、前記キメラ抗原受容体を発現する工程、
から成る群から選択される工程を含む、請求項9に記載の方法、 - 低下工程(a)が、以下の工程、
(i)BAFF-Rアンタゴニストの存在下でT細胞を培養する工程、及び
(ii)T細胞をBAFF-R特異的shRNAと接触させる工程、
から成る群から選択される工程を含む、請求項9に記載の方法。 - 前記BAFF-Rアンタゴニストが、BAFF-R中和抗体である、請求項11に記載の方法。
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