CN102666580A - 抗原性glp-1类似物的糖链加成物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种GLP-1类似物，该GLP-1类似物是通过改良高抗原性GLP-1类似物以在不降低其血糖值抑制活性的情况下降低其抗原性而获得的。具体地说，本发明公开了一种具有GLP-1活性的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其通过使抗原性GLP-1类似物中至少1个氨基酸被糖链加成氨基酸取代而获得。

Description

抗原性GLP-1类似物的糖链加成物

技术领域

本发明涉及一种抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，在GLP-1类似物的中的具有高抗原性的那些GLP-1类似物中加成糖链。

背景技术

GLP-1(类胰高糖素肽-1：glucagon-like peptide-1)是一种源于肠道的肽，其与糖稳态的调控极有关联。GLP-1是作为胰高糖素前驱物的前胰高糖素蛋白原(preproglucagon)经组织特异性转译后修饰作用(post-translationalprocessing)，在肠道的L细胞中合成的，其对进食作出反应，并在循环系统中释出。该肽是肠胰岛轴(enteroinsular axis)的首要介体(mediator)，通过与特定受体(receptor)结合而作用。

已知GLP-1主要在胰腺中作用，以与葡萄糖浓度相关的方式促进β细胞释出胰岛素。此外，还教导称，它可抑制胰高糖素分泌，延缓胃排空作用，提高末梢葡萄糖处理。

在施用GLP-1时，在非胰岛素依赖型糖尿病患者中可以使其饭后葡萄糖浓度趋于正常，因此显示GLP-1作为治疗药的可能性。GLP-1在胰岛素依赖型糖尿病患者中，对血糖的控制亦具有改善作用。此外，因GLP-1的胰岛素释出促进作用依赖于血浆中葡萄糖浓度，在血浆葡萄糖浓度低时，由GLP-1介导的胰岛素释出作用降低，因此其具有不会导致严重低血糖症的优点。因此，一般认为其可依照需要控制血液中GLP-1量，故在治疗糖尿病上可能具有高安全性。但GLP-1在血液中的半衰期极短，为2至6分钟，因此在作为治疗剂的可能性上会有受其限制的问题。

因此，作为此问题的解决手段，已有各种改变GLP-1的试验。例如，在专利文献1中，已揭示由至少1个聚乙二醇(PEG)分子共轭键合在GLP-1化合物上的聚乙二醇化GLP-1化合物。在该聚乙二醇化GLP-1化合物中，各PEG键合在GLP-1化合物中的Cys或Lys氨基酸、或在其羧基末端氨基酸。该聚乙二醇化GLP-1化合物具有至少1小时的排出半衰期。

依照专利文献1中所述，其可比非聚乙二醇化肽延长其半衰期，因此可成为一种清除(clearance)延迟化的生理活性肽。同时，其中亦揭示，此聚乙二醇化GLP-1化合物及组合物，具有降低糖尿病、肥胖、过敏性肠综合症、降血糖，以及抑制胃和/或肠道运动的作用，抑制胃和/或肠道内容物排泄的作用，及抑制食物摄入的作用等，因此可用于健康状态的治疗(例如非专利文献1)。

但由于PEG并非可体内代谢的化合物，持续施用聚乙二醇化GLP-1化合物时，会有PEG蓄积在体内，对身体造成药物引起的损害的风险(非专利文献1)。

其次，为延长其半衰期，亦有提议在GLP-1及其改性体中加入糖链的方法(例如专利文献2及3)。另一方面，在专利文献2中，曾揭示以分子量200KDa左右的透明质酸修饰物键合在GLP-1类似物的方法。然而，此类巨型透明质酸分子在大量制造时，要使其长度及结构均一并不容易，一般所知的实际情形是各透明质酸的结构及长度存在相当程度的差异。然而，在作为医药品时，在肽上加成的糖链须要其长度及结构为均一。另一方面，在专利文献3中，曾揭示在GLP-1的第26位、第34位、和/或第37位导入糖链加成氨基酸的方法等，但其糖链的种类及糖链加成的位置却未必是最优的。

再者，本发明人等亦已开发出改变糖链种类及加成位置，以得到血中半衰期延长、活性高的糖链加成GLP-1(例如专利文献4)。

另一方面，作为具有类似于GLP-1的结构、同样的活性，且血中稳定性高的化合物，在墨西哥希拉毒蜥(Heloderma)的唾液中发现的促胰岛素分泌肽-4(exendin-4)(非专利文献2)已在美国上市。但该促胰岛素分泌肽-4为非人类型序列，比其他GLP-1类似物具有更高抗原性，因此在长期施用时存在中和抗体及伴随药效减低的顾虑(非专利文献3至5)。

另一方面，已开发在GLP-1上键合脂肪酸的利拉鲁肽(Liraglutide)，其亦为GLP-1类似物之一(例如参考非专利文献6至8)。键合脂肪酸时，可提高与白蛋白之亲和性。由于与白蛋白键合的利拉鲁肽可向血液中缓释，因此期待具有半衰期约10小时的长时间作用。由于1日1次皮下注射即足够，故便利性亦高。同时，其不仅可并用亦可用在单独疗法。

然而，由于利拉鲁肽具有与天然型不同之结构，其与促胰岛素分泌肽-4同样有抗原性之顾虑。特别由于利拉鲁肽所施用量的约99％与白蛋白结合，须增加其施用量，因此在这点上必须先尽量降低该化合物之抗原性。

专利文献1 日本特表2006-520818号公报

专利文献2 日本再表2006-095775号公报

专利文献3 国际公开第2007/063907号小册子

专利文献4 国际公开第2008/155900号小册子

非专利文献1 Bendele，A.et al.：Toxicological Science，1998，42：152-157

非专利文献2 Journal of Biological Chemistry，1992，267：7402-7405

非专利文献3 Schnabel，C.A.et al.：Vascular Health and RiskManagement，2006，2：69-77

非专利文献4 Amori，R.E.et al.：The Journal of the American MedicalAssociation，2007，298：194-206

非专利文献5 Wajchenberg，B.L.：Endocrine Reviews，2007，28：187-218

非专利文献6 Marre，M.et al.：Diabetic Medicine，2009，26(3)：268-278

非专利文献7 Deacon，C.F.：Vascular Health and Risk Management，2009，5：199-211

非专利文献8 Larsen，P.J.et al.：Diabetes，2001，50：2530-2539

发明内容

本发明所要解决的问题

本发明的目的在于提供一种GLP-1类似物，该GLP-1类似物是通过改良高抗原性GLP-1类似物，以在不降低其血糖值抑制活性的情况下降低抗原性而获得的。

解决问题之手段

本发明人为解决上述问题，经再三研究，结果发现通过在例如促胰岛素分泌肽-4等具有抗原性的GLP-1类似物中加成糖链，可在不降低血糖值抑制活性的情况下降低抗原性，因此完成了本发明。

亦即，本发明涉及：

[1]具有GLP-1活性的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，所述抗原性GLP-1类似物中的至少1个氨基酸被糖链加成氨基酸所取代；

[2]如上述[1]中所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，前述糖链加成氨基酸为糖链加成Asn或糖链加成Cys；

[3]如上述[1]或[2]中所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，在前述糖链加成氨基酸中，所述糖链与所述氨基酸是经由连接子(linker)键合的；

[4]如上述[1]至[3]中任1项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，前述糖链为由4个或多于4个的糖所构成的糖链；

[5]如上述[1]至[4]中任1项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，前述糖链为双股链复合型糖链；

[6]如上述[5]所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，前述糖链为从由二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、diGlcNAc糖链及二甘露糖链所组成的组中选择的糖链；

[7]如上述[5]所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，前述糖链为如下所示的糖链：

[式中，R¹和R²为相同或不同，并表示下述基团：

其中，Ac表示乙酰基]。

[8]如上述[1]至[7]中任1项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，前述抗原性GLP-1类似物为促胰岛素分泌肽-4(Exendin-4)；

[9]如上述[8]中所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，由所述糖链加成氨基酸所取代的部位为在序列编号：2中所记载的氨基酸序列中的第30位；

[10]如上述[8]中所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，由序列编号：2所记载的氨基酸序列所构成的肽中，第30位的Gly被糖链加成Cys取代，前述糖链为如下式所示的二唾液酸糖链：

且在前述糖链加成Cys中，前述糖链与前述Cys是经由连接子键合的；

[11]如上述[1]至[7]中任1项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，前述抗原性GLP-1类似物为利拉鲁肽(Liraglutide)；

[12]如上述[11]所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，由前述糖链加成氨基酸取代的部位为在序列编号：3中记载的氨基酸序列中的第30位；

[13]如上述[11]所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，由序列编号：3中所记载的氨基酸序列所构成的肽中，第30位的Arg被糖链加成Cys所取代，前述糖链为下式所示的二唾液酸糖链：

或为下式所示的去唾液酸糖链：

且在前述糖链加成Cys中，前述糖链与前述Cys是经由连接子键合的；

[14]如上述[1]至[13]中任1项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中前述糖链为实质均一的糖链；

[15]如上述[1]至[13]中任1项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中前述糖链中的99％或多于99％为均一的糖链；

[16]如上述[1]至[15]中任1项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其抗原性与无糖链加成的抗原性GLP-1类似物相比，小于或等于1/2；

[17]如上述[1]至[16]中任1项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其抗原性比无糖链加成的该抗原性GLP-1类似物降低，且GLP-1活性比天然型GLP-1提高；

[18]药物组合物，其含有如上述[1]至[17]中任1项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物作为有效成分；

[19]如上述[18]所述的药物组合物，其是用以治疗或预防GLP-1相关疾病的药物组合物；

[20]如上述[19]所述的药物组合物，其中，前述GLP-1相关疾病是糖尿病；

[21]GLP-1相关疾病的治疗或预防方法，其特征为施用有效量的如上述[1]至[17]中任1项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物。

[发明效果]

本发明的抗原性GLP-1类似物糖链加成物通过加成糖链，可在不降低血糖值抑制活性的情况下降低抗原性。因此，可使血中稳定性高且血糖值抑制活性亦高的促胰岛素分泌肽-4的优势得以保持，并可使因具有缓释性而施用次数少的利拉鲁肽的优势得以保持，由此可提供安全的医药品。

同时，其中加成的糖链在体内亦容易分解，因此不会因蓄积而造成药物不良反应。

此外，本发明中所使用的糖链多为比较短的糖链，因此不须经由复杂的制造步骤即可制成结构均一的制品。因此，可以大规模且稳定地制得药品级的高质量的抗原性GLP-1类似物糖链加成物。

附图说明

图1所示为第30位Cys-去唾液酸糖链加成利拉鲁肽(序列编号：8)的HPLC色谱图。

图2所示为实施例4中利拉鲁肽的第30位的Arg以Cys取代的肽(序列编号：14)的HPLC色谱图。

图3所示为第30位Cys-二唾液酸糖链加成利拉鲁肽(序列编号：9)经由HPLC的精制色谱图。

图4所示为评估糖链加成促胰岛素分泌肽-4的降低抗原性作用的结果。以糖链加成及非糖链加成的促胰岛素分泌肽-4刺激小鼠致敏时，糖链加成促胰岛素分泌肽-4的抗体效价与非糖链加成促胰岛素分泌肽-4比较，约为其1/4。

图5所示为糖链加成促胰岛素分泌肽-4的经口葡萄糖耐受性试验(OGTT)的结果。糖链加成促胰岛素分泌肽-4显示具有与非糖链加成促胰岛素分泌肽-4同等的血糖值上升抑制作用。

图6所示为使用db/db小鼠评估糖链加成促胰岛素分泌肽-4的血糖值降低作用的结果。糖链加成促胰岛素分泌肽-4显示具有与非糖链加成促胰岛素分泌肽-4同等的强血糖值降低作用。

图7所示为糖链加成利拉鲁肽的经口葡萄糖耐受性试验(OGTT)的结果。糖链加成利拉鲁肽显示比非糖链加成利拉鲁肽有更高的血糖值上升抑制作用。

图8所示为使用db/db小鼠评估糖链加成利拉鲁肽的血糖值降低作用的结果。糖链加成利拉鲁肽显示具有与非糖链加成利拉鲁肽同等的血糖值降低作用。

具体实施方式

本说明书中的“GLP-1”是表示类胰高糖素-1(glucagon-like peptide-1)，并指GLP-1(7-37)。

GLP-1(7-37)具有下列氨基酸序列：

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(序列编号：1)

本说明书中的“GLP-1类似物”，是指具有与GLP-1类似结构的肽和/或与GLP-1重复结构的肽，其例如：GLP-1中的一个或多个氨基酸缺失、取代或加成的肽；GLP-1中的一个或多个氨基酸被保留性地取代的肽；GLP-1的改性体；具有GLP-1活性的GLP-1的片段(fragment)；具有GLP-1活性的伸长GLP-1等。

本说明书中的“抗原性GLP-1类似物”，是指GLP-1类似物之中具有抗原性的那些GLP-1类似物。抗原性是指在被施用该抗原性GLP-1类似物的个体中的抗原性，但并不究其程度。该抗原性可以按本领域技术人员一般所知的方法或以之为依据的方法评估，此类方法可列举如对小鼠以抗原性GLP-1类似物致敏，之后测定该小鼠的血液中的抗GLP-1类似物的抗体的效价等这样的方法。

抗原性GLP-1类似物的实例，可列举如促胰岛素分泌肽-4(以下有时亦称为“Ex-4”。)、利拉鲁肽(Liraglutide)、他司鲁肽(Taspoglutide)(别名为BIM-51077，Giannoukakis，N.：Curr.Opin.Investig.Drugs，2007，8：842-848)、及ZP-10A(Thorkildsen，C.et al.：J.Pharmacol.Exp.Ther.，2003，307：490-496)等，但并不限定于此。

本说明书中的“促胰岛素分泌肽-4”，除非特别限定，是指具有序列编号：2中所记载的氨基酸序列的肽、以及具有与该肽类似的结构的肽和/或具有与该肽重复之结构的肽，其例如该肽中的一个或多个氨基酸缺失、取代或加成的肽；该肽的氨基酸中的一个或多个氨基酸被保留性地取代的肽；该肽的改性体；具有与促胰岛素分泌肽-4同等活性的该肽的片段；具有与促胰岛素分泌肽-4同等活性的该肽的伸长肽等，亦包括与上述GLP-1类似物相对应的物质。

进一步地，本说明书中的“利拉鲁肽(Liraglutide)”，除非特别限定，是指具有序列编号：3中所记载的氨基酸序列的肽、以及具有与该肽类似的结构的肽和/或具有与该肽重复的结构的肽，其例如该肽中的一个或多个氨基酸缺失、取代或加成的肽；该肽的氨基酸中的一个或多个氨基酸被保留性地取代的肽；该肽的改性体；具有与利拉鲁肽同等活性的该肽的肽片段；具有与利拉鲁肽同等活性的该肽的伸长肽等，亦包括与上述GLP-1类似物相对应的物质。

进一步地，本说明书中的“BIM-51077”，除非特别限定，是指具有序列编号：18中所记载的氨基酸序列的肽、以及具有与该肽类似的结构的肽和/或具有与该肽重复的结构的肽，其例如该肽中的一个或多个之氨基酸缺失、取代或加成的肽；该肽的氨基酸中的一个或多个氨基酸被保留性地取代的肽；该肽的改性体；具有与BIM-51077同等活性的该肽的肽片段；具有与BIM-51077同等活性的该肽的伸长肽等，亦包括与上述GLP-1类似物相对应的物质。

本说明书中的“氨基酸”，是用以指代其最宽泛的意义，其中不仅包括天然氨基酸，亦包括例如氨基酸变异体及衍生物等非天然氨基酸。本领域技术人员可考虑其广义定义，因此可理解在本说明书中的氨基酸可列举如天然蛋白质原性的L-氨基酸；D-氨基酸；氨基酸变异体及衍生物等经化学修饰的氨基酸；正亮氨酸(norleucine)、β-丙氨酸、鸟氨酸等天然非蛋白质原性氨基酸；及具有氨基酸之特征而其特性为本领域技术人员一般已知之化学合成化合物等。其中的非天然氨基酸的实例如α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、D-氨基酸、类组氨酸氨基酸(例如2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-组氨酸及α-甲基-组氨酸等)、侧链上包含额外的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)及氨基酸侧链上的羧酸官能团为磺酸基替换的氨基酸(半胱氨酸等)。一些抗原性GLP-1类似物中亦已知包含非天然氨基酸。在一优选实施方案中，本发明的化合物中所包含的氨基酸，只有天然氨基酸。

本说明书中在提到“一个或多个氨基酸缺失、取代或加成”时，其取代等的氨基酸个数，只要使本发明抗原性GLP-1类似物的糖链加成物可保持GLP-1活性即可，并无特别限定，但优选为1至9个氨基酸，更优选为1至5个氨基酸，进一步优选为1至3个氨基酸左右，或为总长度的20％以内为优选，10％以内为更优选。取代或加成的氨基酸优选为天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸类似物，更优选为天然氨基酸。

本说明书中的“氨基酸中的一个或多个氨基酸被保留地取代”，是指氨基酸被取代时，取代原先氨基酸的氨基酸是亲水性指数和/或疏水性指数与原先氨基酸类似的氨基酸，且该取代为在取代前后GLP-1活性并未发生明显降低或消失的取代。

本说明书中的GLP-1、Ex-4及利拉鲁肽(以下总称为“GLP-1等”)的“改性体”是指GLP-1等的天然或人工改性化合物，此类改性的实例可列举如GLP-1的一个或多个氨基酸残基的烷基化、酰基化(如乙酰化)、酰胺化、羧基化、形成酯、形成双硫键合、糖基化、脂质化、磷酸化、氢氧化、标记成分的结合等。其包括例如C末端酰胺化之肽。

本说明书中的“具有GLP-1活性的GLP-1等的片段”，是指原先的GLP-1等的N末端和/或C末端的一个或多个氨基酸缺失，且保持其GLP-1活性的GLP-1等。

本说明书中的“具有GLP-1活性的伸长肽”，是指在原先的GLP-1等的N末端和/或C末端再加成一个或多个氨基酸，且保持其GLP-1活性的肽(可参照例如Endocrinology，125：3109-14(1989))。

本说明书中的“抗原性GLP-1类似物的糖链加成物”的特征为在抗原性GLP-1类似物中，至少1个氨基酸由糖链加成氨基酸所取代。进一步地，“抗原性GLP-1类似物的糖链加成物”在下文中亦可称为“糖链加成抗原性GLP-1”。

本发明中的糖链加成抗原性GLP-1类似物亦包括其盐。本说明书中的盐，可为任何的酸加成盐或碱加成盐。酸加成盐的形成，一般使用的酸为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等无机酸及对甲苯磺酸、甲烷磺酸、草酸、对溴苯磺酸、羧酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等有机酸。碱加成盐的实例可列举如由氢氧化铵或碱或碱土类金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等无机碱衍生的盐。其中特别以其药理上允许的盐为佳。

本说明书中的“糖链加成氨基酸”，是指键合糖链的氨基酸，其中糖链与氨基酸亦可经由连接子键合。糖链与氨基酸键合的部位并无特别限定，但以在糖链的还原末端上键合氨基酸较佳。

糖链键合氨基酸的种类并无特别限定，可使用任何天然氨基酸、非天然氨基酸。但从糖链加成氨基酸具有与体内存在的糖肽(糖蛋白)相同或类似结构的方面来说，该糖链加成氨基酸优选是如糖链加成Asn等N-键合型糖链、如糖链加成Ser及糖链加成Thr等O-键合型糖链，特别优选是糖链加成Asn。

糖链与氨基酸经由连接子键合时，从连接子键合的容易性的角度来说，优选糖链加成氨基酸中的氨基酸为例如天冬氨酸及谷氨酸等其分子内含两个或多于两个羧基的氨基酸；例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸等其分子内含两个或多于两个氨基的氨基酸；例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等其分子内含羟基的氨基酸；例如半胱氨酸等其分子内含硫醇基的氨基酸；例如天冬酰胺、谷氨酰胺等其分子内含酰氨基的氨基酸。特别是在反应性的观点上，更优选是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺，特别优选是半胱氨酸及赖氨酸。

进一步地，本发明的任意糖链加成抗原性GLP-1类似物中，糖链结构、糖链以外之结构、糖链加成部位及糖链加成之数目相同时，在糖链加成氨基酸为糖链加成Asn(未经由连接子)时及糖链加成Cys(经由连接子)时，本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物的血糖值上升抑制活性未显示有较大差异。

糖链与氨基酸经由连接子键合时，其中的连接子可广泛地使用该范围中常用的连接子，其例如是-NH-(CO)-(CH₂)_a-CH₂-(式中的a为整数，在不妨碍其目的之作为连接子的功能下并无任何限定，但优选为整数0至4)、C_1-10聚亚甲基、-CH₂-R-(其中的R表示在选自由烷基、具有取代基的烷基、烯基、具有取代基的烯基、炔基、具有取代基的炔基、芳基、具有取代基的芳基、烃环基、具有取代基的烃环基、杂环基及具有取代基的杂环基所组成的组中的基团中脱去1个氢原子而产生的基团)、-(CO)-(CH₂)_a-(CO)-(式中的a为整数，在不妨碍其目的之作为连接子的功能下并无任何限定，但优选是整数0至4)等。

糖链加成抗原性GLP-1类似物的糖链加成氨基酸中，在糖链与氨基酸未经由连接子键合时，比糖链与氨基酸经由连接子键合时，可降低该糖链加成抗原性GLP-1类似物的抗原性。糖链加成抗原性GLP-1类似物的糖链加成氨基酸中，在糖链与氨基酸经由连接子键合时，比糖链与氨基酸未经由连接子键合时，可提高该糖链加成抗原性GLP-1类似物的血中稳定性。

本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物，并未限定于其制造方法中描述的那些(例如“氨基酸被糖链加成氨基酸取代的糖链加成抗原性GLP-1类似物”之类的记载)，“氨基酸被糖链加成氨基酸所取代的糖链加成抗原性GLP-1类似物”中包括以后述的A法至C法中所有方法制造的糖链加成抗原性GLP-1类似物。此外，其他例如由未与氨基酸键合的糖链与肽上的氨基酸直接或经由连接子键合的糖链加成抗原性GLP-1类似物；糖链加成抗原性GLP-1类似物中加成的糖链上再加成糖或糖链而使已加成的糖链再伸长的糖链加成抗原性GLP-1类似物；糖链加成氨基酸中的氨基和/或羧基再键合一个或多个氨基酸，再于其上连接一个或多个GLP-1类似物的片段的糖链加成抗原性GLP-1类似物等，只要其最终结构均一，均包括于本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物之中。

抗原性GLP-1类似物中的氨基酸被糖链加成氨基酸取代的数目，可依照在血中稳定性及血糖值抑制活性等生理活性、由最终在糖链加成抗原性GLP-1类似物中存在的氨基酸个数及糖基化前后的糖链加成抗原性GLP-1类似物的分子量等适当调整。其例如优选是1至5个取代，更优选是1至3个氨基酸取代。但考虑到简便性，如以1个取代可得到所期望的活性时，则以选择1个取代较佳。一般而言，在抗原性GLP-1类似物中的1个氨基酸被糖链加成氨基酸取代的糖链加成抗原性GLP-1类似物中，其除了该糖链加成氨基酸以外的1个或多个氨基酸再被糖链加成氨基酸所取代时，会有血中稳定性增加和血糖值抑制活性减少的倾向(但血中稳定性增加亦可能补偿减少的血糖值抑制活性)。

本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物中，氨基酸由糖链加成氨基酸取代的部位并无特别限定，本领域技术人员可在赋予降低抗原性的活性，且不使其血中稳定性及血糖值抑制活性比GLP-1低的部位之中适当地选择。

本发明的一个实施方案中，其中抗原性GLP-1类似物中的氨基酸为糖链加成氨基酸所取代之氨基酸，可依所期望的活性而选择抗原性GLP-1类似物的任意部位。例如，在抗原性GLP-1类似物中，是与在序列编号：1中所记载的GLP-1肽中的氨基酸序列的第12、14、16、20、24、28、30及32位(＝第31位氨基酸上加成该糖链加成氨基酸)之中选择的一个或多个部位对应的部位，优选是与第12、20、24、28及30位之中选择的一个或多个部位对应的部位，特别优选是与第24及30位之中选择的一个或多个部位对应的部位。

其中的“在抗原性GLP-1类似物中，与序列编号：1中所记载的GLP-1肽中的氨基酸序列的第X位对应的位置”，是指在各种抗原性GLP-1类似物的氨基酸序列中，与序列编号：1中所记载的GLP-1肽中的氨基酸序列的第X位对应的位置，该部位可由本领域技术人员容易地各自依照其周围的氨基酸序列等来决定。

例如作为抗原性GLP-1类似物的Ex-4及利拉鲁肽的氨基酸序列与序列编号：1中所记载的GLP肽的氨基酸序列，对应如下。

【表1】

序列编号：1中的部位

1

2

3

4

5

6

7

GLP-1(序列编号：1)

His

Ala

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ex-4(序列编号：2)

His

Gly

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

利拉鲁肽(序列编号：3)

His

Ala

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
										Ser	Asp	Val	Ser	Ser	Tyr	Leu	Glu	Gly	Gln

Ser

Asp

Leu

Ser

Lys

Gln

Met

Glu

Glu

Glu

Ser

Asp

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Glu

Gly

Gln

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

Ala

Ala

Lys

Glu

Phe

Ile

Ala

Trp

Leu

Val

Ala

Val

Arg

Leu

Phe

Ile

Glu

Trp

Leu

Lys

Ala

Ala

Lys

Glu

Phe

Ile

Ala

Trp

Leu

Val

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

Lys

Gly

Arg

Gly

Asn

Gly

Gly

Pro

Ser

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Arg

Gly

Arg

Gly

38	39
Pro	Ser-NH2

在Ex-4及利拉鲁肽的氨基酸序列中无加成、取代、缺失时，上述表中直列排列的氨基酸为“对应的位置(部位)”的氨基酸。但在有加成、取代、缺失时，本领域技术人员可各依照其周围的氨基酸序列等，容易地决定“对应的位置(部位)”。

本发明的一个实施方案中，就降低糖链加成抗原性GLP-1类似物的抗原性来说，其氨基酸被糖链加成氨基酸所取代的部位优选在例如抗原性GLP-1类似物中的抗原识别部位周围。例如，在与序列编号：1中所记载的GLP-1肽的第30位对应的部位上加成糖链时，是有效的。

本发明的一个实施方案中，就糖链加成抗原性GLP-1类似物的血中稳定性来说，其氨基酸被糖链加成氨基酸所取代的部位，例如是与在序列编号：1中所记载的GLP-1肽中的第3、4、5、6、8、10、12、13、14、16、18、19、20、21、22、24、26、28、30及32位(＝第31位氨基酸上加成该糖链加成氨基酸)之中选择的一个或多个部位对应的部位，优选是与第3、4、5、6、8及22位之中选择的一个或多个部位对应的部位，特别优选是与第3、4、5及6之中选择的一个或多个部位对应的部位。其中，特别优选取代接近GLP-1的N末端部位的氨基酸。特别是，氨基酸被糖链加成氨基酸取代的部位的实例可包括例如分别对应于第12位与第30位、第20位与第28位、第16位与第24位、第16位与第30位、第24位与第30位的各部位等。

本发明的一个实施方案中，就糖链加成抗原性GLP-1类似物的血糖值抑制作用来说，其氨基酸被糖链加成氨基酸取代的部位例如是与在序列编号：1中所记载的GLP-1肽中的第12、14、16、20、24、28、30及32位(＝第31位氨基酸上加成该糖链加成氨基酸)之中选择的一个或多个部位对应的部位，优选是与第12、20、24、28及30部位之中选择的一个或多个部位对应的部位，更优选是与第24及30位之中选择的一个或多个部位对应的部位。其中两个或多于两个的氨基酸被糖链加成氨基酸取代的部位的实例，可列举例如对应于第12位与第30位、第20位与第28位、第16位与第24位、第16位与第30位、第24位与第30位的各个部位等。

本发明的一个实施方案中，就糖链加成抗原性GLP-1类似物的GLP-1活性中cAMP合成能力而言，氨基酸被糖链加成氨基酸所取代的部位优选是例如与在序列编号：1中所记载的GLP-1肽中的第16、20、21、24、28、30及32位(＝第31位氨基酸上加成该糖链加成氨基酸)之中选择的一个或多个部位对应的部位，更优选是与第16、20、24、28、30及32位之中选择的一个或多个部位对应的部位。

本发明的一个实施方案中，氨基酸被糖链加成氨基酸所取代的部位是从由序列编号：1中所记载的氨基酸序列所构成的GLP-1的除第2、3及6位以外的部位之中选择的一个或多个部位。

本发明的一个实施方案中，氨基酸被糖链加成氨基酸所取代的部位是在GLP-1的除第1、4、7、9、13、15及23位以外的部位之中选择的一个或多个部位，特别是从除第1、4及9位以外的部位之中选择的一个或多个部位。

本发明的一个实施方案中，氨基酸被糖链加成氨基酸所取代的部位可由GLP-1与GLP-1受体的结合部位中决定。

本发明的一个实施方案中，两个或多于两个的氨基酸被糖链加成氨基酸取代时，氨基酸被糖链加成氨基酸所取代的部位，可以采用上述任何组合，但并不限定于此。例如其中1个部位从上述的优选部位中选择、其他部位从抗原性GLP-1类似物之中任意部位选择的组合；1个部位从上述优选部位中选择、其他部位从抗原性GLP-1类似物的C末端再加成的一个或多个氨基酸的任意部位之中选择的组合等亦为本发明的一个优选实施方案中。

本发明的一个实施方案中，除糖链加成氨基酸以外的氨基酸发生缺失、取代或加成的部位优选为从由序列编号：1中所记载的氨基酸序列所构成的GLP-1中除第1、4、7、9、13、15、22及23位以外的部位之中选择的一个或多个部位，例如从除第1、4、9及22位以外的部位之中选择的一个或多个部位(Structure-Activity Studies of Glucagon-like Peptide-1，THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，Vol.269，No.9，Issue of March 4，pp.6276-6278，1994)。

本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物可列举例如在具有以下氨基酸序列的促胰岛素分泌肽-4中加成糖链而获得的物质：

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂(序列编号：2)

糖链加成促胰岛素分泌肽-4可列举例如由下述通式(1)表示的物质：

通式(1)

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaa₁₂-Gln-Xaa₁₄-Glu-Xaa₁₆-Glu-Ala-Val-Xaa₂₀-Leu-Phe-Ile-Xaa₂₄-Trp-Leu-Lys-Xaa₂₈-Gly-Xaa₃₀-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

[式中，Xaa₁₂表示Lys、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；Xaa₁₄表示Met、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；Xaa₁₆表示Glu、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；Xaa₂₀表示Arg、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；Xaa₂₄表示Glu、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；Xaa₂₈表示Asn、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；Xaa₃₀表示Gly、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；Xaa₁₂、Xaa₁₄、Xaa₁₆、Xaa₂₀、Xaa₂₄、Xaa₂₈及Xaa₃₀中的至少1个为糖链加成Cys或糖链加成Asn](序列编号：4)

其中，Xaa₂₄优选为糖链加成Cys。

进一步地，在例如促胰岛素分泌肽-4等原本其C末端已被酰胺化的肽中，在该C末端的氨基酸加成糖链以合成糖链加成氨基酸时，也有C末端未被酰胺化的情形。

本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物，亦可列举例如在具有以下氨基酸序列的利拉鲁肽中加成糖链而获得的物质：

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys₂₀-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly(序列编号：3)

其中的Lys₂₀如下述式所示，经由谷氨酸与棕榈酰基(palmitoyl)键合。

糖链加成利拉鲁肽例如有下述通式(2)所示的物质：

通式(2)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa₁₂-Tyr-Xaa₁₄-Glu-Xaa₁₆-Gln-Ala-Ala-Lys₂₀-Glu-Phe-Ile-Xaa₂₄-Trp-Leu-Val-Xaa₂₈-Gly-Xaa₃₀-Gly

[式中的Xaa₁₂表示Ser、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；Xaa₁₄表示Leu、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；

Xaa₁₆表示Gly、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；

Xaa₂₄表示Ala、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；

Xaa₂₈表示Arg、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；

Xaa₃₀表示Arg、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；

Xaa₁₂、Xaa₁₄、Xaa₁₆、Xaa₂₄、Xaa₂₈及Xaa₃₀之中至少1个为糖链加成Cys或糖链加成Asn](序列编号：5)

其中Xaa₂₄和/或Xaa₃₀优选为糖链加成Cys或糖链加成Asn，特别优选Xaa₃₀为糖链加成Cys。

本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物，可列举例如在具有以下氨基酸序列的BIM-51077中加成糖链而获得的物质：

His-R2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-R2-Arg-NH₂

[式中的R2表示α-甲基丙氨酸(亦可称为氨基异丁酸，也称为Aib)](序列编号：18)

糖链加成BIM-51077的实例如下述通式(3)所示的物质：

通式(3)

His-R2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa₁₈-Tyr-Xaa₂₀-Glu-Xaa₂₂-Gln-Ala-Ala-Xaa₂₆-Glu-Phe-Ile-Xaa₃₀-Trp-Leu-Val-Xaa₃₄-R2-Xaa₃₆-NH₂

[式中的R2表示α-甲基丙氨酸，Xaa₁₈表示Ser、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；Xaa₂₀表示Leu、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；Xaa₂₂表示Gly、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；Xaa₂₆表示Lys、糖链加成Cys、糖链加成Asn、或糖链加成Lys；Xaa₃₀表示Ala、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；Xaa₃₄表示Lys、糖链加成Cys、糖链加成Asn、或糖链加成Lys；Xaa₃₆表示Arg、糖链加成Cys、或糖链加成Asn；Xaa₁₈、Xaa₂₀、Xaa₂₂、Xaa₂₆、Xaa₃₀、Xaa₃₄及Xaa₃₆之中至少1个为糖链加成Cys或糖链加成Asn](序列编号：19)

本说明书中的“糖链”指由一个或多个的单位糖(单糖(monosaccharide)和/或其衍生物)连接而形成的化合物。在两个或多于两个的单位糖连接时，各单位糖彼此之间是经由糖苷键脱水缩合而键合。此类糖链的实例可列举如体内中所含的单糖类及多糖类(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、褐藻糖、木糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸及其复合物及衍生物)；以及例如经分解的多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖、糖脂质等由复合体内分子经分解或衍生的糖链等广泛范围内的物质，但并不限定于此。糖链可为直链型也可为支链型。

本说明书中的“糖链”亦包含糖链的衍生物，糖链衍生物的实例有例如构成糖链之糖为：包含羧基的糖(例如C-1位置被氧化为羧酸的醛糖酸(例如D-葡萄糖被氧化成D-葡萄糖酸)、末端C原子转化为羧酸的糖醛酸(D-葡萄糖被氧化成D-葡萄糖醛酸))、包含氨基或氨基的衍生物(例如乙酰化氨基)的糖(例如N-乙酰基-D-葡萄糖胺、N-乙酰基-D-半乳糖胺等)、同时包含氨基及羧基两者的糖(例如N-乙酰神经氨糖酸(唾液酸)、N-乙酰胞壁酸等)、去氧化的糖(例如2-脱氧-D-核糖)、包含硫酸基的硫酸化糖、包含磷酸基的磷酸化糖等构成的糖链，但并不限定于此。

本发明中优选的糖链是，在被加成至抗原性GLP-1类似物时(以糖链加成氨基酸形式取代抗原性GLP-1类似物中的氨基酸时)，可降低抗原性GLP-1类似物的抗原性的糖链，优选可增加血中稳定性，且更优选是不使血糖值抑制活性消失的糖链。但也可以是其血中稳定性和/或血糖值抑制活性与抗原性GLP-1类似物同等的情况，只要降低抗原性即可。

本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物中的糖链并无特别限定，可为体内存在的作为糖复合物(糖肽(或糖蛋白)、蛋白聚糖、糖脂质等)的糖链，亦可为不在体内存在的作为糖复合物的糖链。

体内存在的作为糖复合物的糖链，从本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物为体内施用的角度考虑是优选的。此类糖链的实例，可列举如N-键合型糖链、O-键合型糖链等与体内糖肽(或糖蛋白)的肽(或蛋白质)键合的糖链等。其中以使用N-键合型糖链较佳。N-键合型糖链的实例，可列举如高甘露糖(high mannose)型、复合(complex)型、混成(hybrid)型，其中特别以复合型较佳。

本发明中可使用的优选复合型糖链，可列举例如由下述通式所示的糖链等：

[其中，R¹及R²互为相同或不同，表示：

并且Ac表示乙酰基]。

同时，本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物中，若其糖链为体内糖复合物存在的糖链，也可以通过除O-键合型及N-键合型以外的方式与抗原性GLP-1类似物键合。例如，上述的糖链经连接子与Cys等键合而构成的物质也包括于本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物中。

在本发明的一个实施方案中，以本发明糖链加成抗原性GLP-1类似物中的糖链优选为由4个或多于4个、例如5个或多于5个、7个或多于7个、特别是9个或多于9个、11个或多于11个的糖所形成的糖链。

本发明的一个优选实施方案中，本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物中的糖链是由5至11个、9至11个、9个、11个糖所形成的糖链。

本发明的一个优选实施方案中，本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物中的糖链为双股链的复合型糖链。复合型糖链的特征在于，包含2种或多于2种的单糖、含有如下所示的基本结构及如Galβ1-4GlcNAc所示的乳糖胺结构的特征。

双股链的复合型糖链，是指在其基本结构之末端的2个甘露糖各自键合由0至3个糖所组成的单股的糖链。双股链的复合型糖链的实例，可列举例如如下所示的二唾液酸糖链：

单唾液酸糖链：

去唾液酸糖链：

diGlcNac糖链：

二甘露糖糖链：

等，其中更优选是二唾液酸糖链、单唾液酸糖链或去唾液酸糖链。

进一步地，本说明书中的“二唾液酸糖链”、“单唾液酸糖链”、“去唾液酸糖链”、“diGlcNAc糖链”、“二甘露糖链”，除如上式所示者以外，亦包括键合形式与上式所示的实例不同的糖链，该糖链亦为本发明可用的优选糖链。该糖链的实例有例如二唾液酸糖链或去唾液酸糖链中的唾液酸与半乳糖以(α2→3)键合的糖链等。

进一步地，本发明中使用的高甘露糖型糖链，是在上述复合型糖链的基本结构中，又键合两个或多于两个甘露糖的糖链。由于高甘露糖型糖链尺寸较大，因此肽中键合高甘露糖型糖链时，可进一步提高血中稳定性。其中优选是例如哺乳类的高甘露糖型糖链等包含5至9个甘露糖的糖链，也可以是例如酵母菌的高甘露糖型糖链等包含更多甘露糖的糖链。本发明中可使用的优选高甘露糖型糖链可列举例如高甘露糖-5(M-5)：

高甘露糖-9(M-9)：

等。

本发明中的优选糖链，可列举例如人体内与蛋白质键合而以糖蛋白存在的糖链(例如“FEBS LETTERS Vol.50，No.3，Feb.1975”中所记载的糖链)、及包含相同结构的糖链(构成的糖之种类及其键合形式相同的糖链)或其由非还原末端去除一个或多个糖的糖链、如下述表2至5中所记载的糖链。

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

本发明的一个优选实施方案中，本发明糖肽中的糖链的结构是均一的。本说明书中所指的糖肽中的糖链的结构均一，是指在糖肽间比较时，肽中糖链加成之部位、构成糖链的各糖之种类、键合顺序、及糖间键合之方式相同者，至少90％以上，更优选是95％以上，再优选是99％以上的糖链结构是均一的。糖链均一的糖肽，品质恒定，特别是在药品制造及分析等方面是优选的。均一糖链的比例，可使用例如HPLC、毛细管电泳、NMR、质谱分析等方法测定。

本发明中优选糖链加成抗原性GLP-1类似物的实例可列举如后述实施例1至4中所制造的糖链加成抗原性GLP-1类似物。

具体言之，为：

(a1)由序列编号：2中所记载的氨基酸序列构成的促胰岛素分泌肽-4中，其第30位的Gly经二唾液酸糖链加成Cys取代的糖链加成抗原性GLP-1类似物(实施例1)(序列编号：6)；

(a2)由序列编号：2中所记载的氨基酸序列构成的促胰岛素分泌肽-4中，其第30位的Gly经高甘露糖-5型糖链加成Cys所取代的糖链加成抗原性GLP-1类似物(实施例2)(序列编号：7)；

(a3)由序列编号：3中所记载的氨基酸序列的利拉鲁肽中，其第30位的Arg经去唾液酸糖链加成Cys所取代的糖链加成抗原性GLP-1类似物(实施例3)(序列编号：8)；

(a4)由序列编号：3中所记载的氨基酸序列的利拉鲁肽中，其第30位的Arg为二唾液酸糖链加成Cys所取代的糖链加成抗原性GLP-1类似物(实施例4)(序列编号：9)；

(a5)由序列编号：18中所记载的氨基酸序列的BIM-51077中，其第20位的Lys为二唾液酸糖链加成Cys所取代的糖链加成抗原性GLP-1类似物(实施例5)(序列编号：21)；

(制造方法)

本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物可以按本领域技术人员已知的肽合成方法，再配合糖链加成步骤制成。糖链加成时，可以利用以转谷氨酰胺酶为代表的酶的逆反应方法来进行，但由于在该场合中，将需要加成大量的糖链，导致最终步骤后的精制变得复杂，且存在糖链加成之位置及可加成之糖链亦受限制等问题，所以仅可用在分析用等少量合成上，但在制造药品等大规模制造时，不能说是有实用性的方法。

本发明中糖链加成抗原性GLP-1类似物的简便制造方法，为加成糖链结构为均一的糖链抗原性GLP-1类似物的稳定制造方法的具体实例，可如以下所示的实例：使用糖链加成Asn作为糖链加成氨基酸，以固相合成、液相合成等已知肽合成方法制成糖链加成抗原性GLP-1类似物的方法(A法)；以已知肽合成方法制成抗原性GLP-1类似物中任意的氨基酸由Cys取代之肽后，再以化学合成方法在Cys上加成糖链，制成糖链加成抗原性GLP-1类似物的制造方法(B法)；以及将糖链加成Asn键合于连接子之一端后，在连接子之另一端再键合N-羟基琥珀酰亚氨基(N-hydroxysuccinimidyl)，再使N-羟基琥珀酰亚氨基与抗原性GLP-1类似物的Lys残基的侧链氨基进行反应，制成糖链加成抗原性GLP-1类似物的方法(C法)。参考此类制造方法，本领域技术人员可制成各种糖链加成抗原性GLP-1类似物，其制成的糖链加成抗原性GLP-1类似物及其制造方法，特别在药品制造方面极为有用。

进一步地，此类A法至C法，亦可以组合其中2种进行使用。在使用于分析等合成量少的情况时，亦可再于上述方法中组合以转移酶进行糖链伸长的反应。其中A法载于国际公开第WO2004/005330号小册子(US2005222382(A1))中，B法载于国际公开第WO2005/010053号小册子(US2007060543(A1))中，其中所揭示之全部内容并入本说明书中以供参考。其中关于A法至C法中所使用的糖链结构均一的糖链的制造方法，载于第WO03/008431号小册子(US2004181054(A1))、第WO2004/058984号小册子(US2006228784(A1))、第WO2004/058824号小册子(US2006009421(A1))、第WO2004/070046号小册子(US2006205039(A1))、第WO2007/011055号小册子等之中，其中所揭示的全部内容并入本说明书中以供参考。

糖链加成抗原性GLP-1类似物的制造方法(A法)

糖链加成抗原性GLP-1类似物可以如以下概略所示，以糖链加成天冬酰胺经固相合成而制造。

(1)以含羟基的树脂(resin)的该羟基与由脂溶性保护基保护其氨基氮的氨基酸的羧基进行酯化反应。此时，由于氨基酸的氨基氮由脂溶性保护基保护，因此可防止氨基酸彼此的自我缩合，使树脂的羟基与氨基酸的羧基发生酯化反应。

(2)从制成的酯中脱去所述脂溶性保护基，以形成游离氨基。

(3)使该游离氨基与由脂溶性保护基保护其氨基氮的任意氨基酸的羧基进行酰胺化反应。

(4)脱去上述脂溶性保护基，以形成游离氨基。

(5)将上述(3)及(4)步骤重复1次或多次，以使任意数量的任意氨基酸连接，从而制成一端键合于所述树脂上、另一端含游离氨基的肽。

(6)最后，以酸切断该树脂，即可制成具有期望的氨基酸序列的肽。

其中(1)中由脂溶性保护基保护其氨基氮的氨基酸，亦可使用由脂溶性保护基保护其氨基氮的糖链加成天冬酰胺，使该天冬酰胺的部分羧基与树脂的羟基反应，即可制成C末端具有所述糖链加成天冬酰胺的肽。

同时，在(2)之后，再重复1次以上的任意次数的(3)及(4)之后，在(3)中替代由脂溶性保护基保护其氨基氮的氨基酸而使用由脂溶性保护基保护其氨基氮的糖链加成天冬酰胺，即可在任意位置上加成该糖链。

此外，在任何(1)及(3)之步骤中，替代由脂溶性保护基保护其氨基氮的氨基酸，2次或多于2次地使用由脂溶性保护基保护其氨基氮的糖链加成天冬酰胺时，可制成在任意2个或多于2个的位置上加成糖链的肽。

该糖链加成氨基酸键合后，再脱去脂溶性保护基以形成游离氨基，之后进行步骤(6)，即可制成N末端上具有糖链加成天冬酰胺的肽。

含有羟基的树脂，只要为一般在固相合成中使用而含羟基的树脂即可，其实例可列举如Amino-PEGA树脂(Merck公司制造)、Wang树脂(Merck公司制造)、HMPA-PEGA树脂(Merck公司制造)等。

进一步地，在如Ex-4中其C末端酰胺化时，优选使用Rink-Amido-PEGA树脂(Merck公司制造)。以酸切开该树脂与肽时，肽C末端的氨基酸即可酰胺化。

作为氨基酸，可使用所有氨基酸，例如作为天然氨基酸的丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)。

脂溶性保护基的实例，可列举如9-氟甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苯甲基、烯丙基、烯丙氧羰基、乙酰基等碳酸酯系或酰胺系保护基等。在氨基酸中导入脂溶性保护基的实例，可例如在其中导入Fmoc基时，可加入9-氟甲基-N-琥珀酰亚氨基碳酸酯及碳酸氢钠使其进行反应而导入。该反应可在0至50℃，优选在室温，进行反应约1至5小时左右。

由脂溶性保护基保护的氨基酸，可使用一般市售物。其实例可列举如Fmoc-Ser、Fmoc-Asn、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Ile、Fmoc-Ala、Fmoc-Tyr、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys、Fmoc-Arg、Fmoc-His、Fmoc-Asp、Fmoc-Glu、Fmoc-Gln、Fmoc-Thr、Fmoc-Cys、Fmoc-Met、Fmoc-Phe、Fmoc-Trp、Fmoc-Pro。

酯化催化剂可列举如1-均三甲苯磺酰基-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)等已知脱水缩合剂。氨基酸与脱水缩合剂使用之比例，相对于1重量份的前者，后者一般优选为1至10重量份，更优选为2至5重量份。

酯化反应可例如在固相管柱中加入树脂，再以溶剂清洗该树脂，之后再加入氨基酸溶液进行反应。清洗用溶剂的实例可列举如二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等。溶解氨基酸的溶剂的实例可列举如二甲基亚砜(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反应可在0至50℃，优选是室温，进行反应约10分钟至30小时左右，优选是15分钟至24小时左右。

此时，优选使用乙酸酐等对固相上未反应的羟基进行乙酰化加帽(capping)。

脂溶性保护基之脱保护，可以用例如碱进行处理。碱的实例可列举如哌啶、吗啉等。此时，优选在溶剂存在下进行。其中的溶剂可列举如DMSO、DMF、甲醇等。

游离氨基与由脂溶性保护基保护其氨基氮的任意氨基酸的羧基之间的酰胺化反应，优选在活化剂及溶剂存在下进行。

活化剂可列举如二环己碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(WSC/HCl)、叠氮磷酸二苯酯(DPPA)、羰二咪唑(CDI)、氰基磷酸二乙酯(DEPC)、苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷子基鏻盐(DIPCI)、苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、二甲氨基吡啶(DMAP)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、羟基苯二甲酰亚胺(HOPht)、五氟苯酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟膦酸盐(HATU)、O-苯并三唑-1-基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三吖嗪(Dhbt)等。

活化剂的使用量，相对于由脂溶性保护基保护其氨基氮的任意氨基酸，优选是1至20当量，更优选是1至10当量，再优选是1至5当量。

溶剂的实例可列举如DMSO、DMF、二氯甲烷等。其反应在0至50℃、优选是室温，进行约10至30小时左右，优选是15分钟至24小时左右。可按上述方法进行脂溶性保护基之脱除。

从树脂切断肽链，优选是采用酸处理。其中的酸可列举如三氟乙酸(TFA)、氟化氢(HF)等。

如此操作，即可制成在期望位置上以糖链加成天冬酰胺取代的糖链加成抗原性GLP-1类似物。

糖链加成抗原性GLP-1类似物的制造方法(B法)

糖链加成抗原性GLP-1类似物可以采用先合成肽链，再加成糖链的方法制造。具体言之，可以经固相合成法、液相合成法、细胞合成法、由自然界存在之物中分离萃取的方法等制造在欲加成糖链的位置具有Cys的肽。

其次，将卤化乙酰胺化复合型糖链衍生物与上述制成的含Cys的肽反应，使糖链键合在该肽上。上述反应一般在0至80℃，优选是在10至60℃，更优选是在15至35℃进行。其反应时间一般优选是30分钟至5小时左右。该反应结束后，亦可再经适当的已知方法(例如高效液相色谱(HPLC))精制。

卤化乙酰胺化复合型糖链衍生物可列举如在与复合型天冬酰胺键合型糖链的第1位的碳键合的羟基被-NH-(CO)-(CH₂)_a-CH₂X(其中的X为卤素原子，a为整数，但在不妨碍目标连接子功能的限度内，并无限定，其中优选为0至4的整数)取代的化合物。

具体言之，使卤化乙酰胺化复合型糖链衍生物与含Cys的肽在磷酸缓冲溶液中、于室温反应。反应结束后，再以HPLC精制，即可制成由糖链加成Cys取代的糖链加成抗原性GLP-1类似物。

在制造糖链加成利拉鲁肽作为本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物时，亦进行在Lys残基上加成脂肪酸的步骤。该步骤可以通过使例如Pal-Glu(OBu)-OSu与含Lys的肽反应而进行。脂肪酸加成步骤可在糖链加成步骤之前进行，亦可在之后进行。

糖链加成GLP-1肽的制造方法(C法)

本方法可用于所要加成糖链的抗原性GLP-1类似物中含Lys残基的情况。

首先，将含Lys的肽，以固相合成法、液相合成法、细胞合成法、由自然界中存在之物中分离萃取的方法等制成。

其次，将戊二酸键合于糖链加成氨基酸。例如，可将糖链加成氨基酸溶于DMSO溶液中，再于该溶液中加入戊二酸-EDC混合之DMSO溶液，并于室温搅拌1日。该反应混合物经适当稀释后，经分子量大小排阻凝胶色谱等分级，即可制成具有与α-氨基键合的戊二酸的糖链加成氨基酸。

再次，在戊二酸键合糖链加成氨基酸的DMSO溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺的DMSO溶液及EDC的DMSO溶液，于室温搅拌6小时后，使其中的EDC钝化，即可合成戊二酸键合糖链加成氨基酸的N-羟基琥珀酰亚氨基酯。

随后，于抗原性GLP-1类似物的DMSO溶液中加入DIPEA及戊二酸键合糖链加成氨基酸的N-羟基琥珀酰亚氨基酯，并于室温搅拌2小时后，再加入甘氨酸水溶液使反应停止，再经适当精制，即可使抗原性GLP-1类似物的Lys残基经由戊二酸连接子与糖链加成氨基酸键合。

通过使该抗原性GLP-1类似物中期望部位的氨基酸被Lys取代，或使抗原性GLP-1的野生型中所含的Lys残基被其他氨基酸取代，即可制成在期望部位键合糖链加成氨基酸的糖链加成抗原性GLP-1类似物。根据C法，在野生型抗原性GLP-1类似物中所含的Lys上加成糖链时，即可制成肽骨架与野生型相同的糖链加成抗原性GLP-1类似物。

(活性)

本发明中的糖链加成抗原性GLP-1类似物具有GLP-1活性。本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物优选具有与天然型GLP-1同等或更好的GLP-1活性，更优选是与未加成糖链的抗原性GLP-1类似物(以下有时也称之为“非糖链加成抗原性GLP-1类似物”)比较具有同等或更好的GLP-1活性。

本说明书中的“GLP-1活性”是指GLP-1的已知生理活性的一部份或全部。GLP-1活性，已知除了血糖值抑制作用之外，亦具有例如cAMP合成诱导所伴随的胰岛素分泌、保护胰岛(抑制细胞凋亡)、胰岛增殖等胰岛作用；胰腺外作用(extrapancreatic activities)，例如食欲抑制、消化道运动抑制、降血钙素分泌促进、局部缺血时心脏保护作用等。因此，GLP-1活性是指与此类作用相关的全部或一部份生理活性，而且可分别以本领域技术人员已知方法测定。

例如GLP-1活性中的血糖值抑制活性，可以使用在糖尿病小鼠(db/db小鼠)中血糖值降低作用的测定、或经口葡萄糖耐受性试验(OGTT：OralGlucose Tolerance Test)中的血糖值上升抑制作用之测定等进行测定。本说明书中的“血糖值抑制”包括抑制血糖值上升及降低血糖值中的任一概念。特别在本说明书中，在db/db小鼠中血糖值抑制作用是指“血糖值降低作用”，在OGTT中血糖值抑制作用是指“血糖值上升抑制作用”。

在OGTT中的血糖值抑制活性，可以由强制小鼠摄入糖时测定其血糖值上升抑制来判断。例如先以试验化合物施用禁食一晚的小鼠，经30分钟后经口施用葡萄糖溶液。施用葡萄糖造成小鼠血糖值上升，在施用约30分钟后达最高值再缓缓降低。因此测定葡萄糖施用后30分钟的血糖值，再与施用非糖链加成抗原性GLP-1类似物时的血糖值比较，即可评定糖链加成抗原性GLP-1类似物的血糖值抑制作用。

另一方面，比较在OGTT中可确定有相同程度的血糖值上升抑制作用的施用量时，即可评定本发明糖链加成抗原性GLP-1类似物的血糖值抑制活性的强度。例如施用10(份)的非糖链加成抗原性GLP-1类似物，而具有与施用1(份)的糖链加成抗原性GLP-1类似物时同等的血糖值抑制作用时，该糖链加成抗原性GLP-1类似物的血糖值抑制活性即为非糖链加成抗原性GLP-1类似物的10倍。

使用db/db小鼠时的血糖值抑制活性可以根据糖尿病小鼠在施用试验化合物后的血糖值的测定加以判断。经时测定试验化合物施用后的血糖值，例如在施用后120分钟的血糖值比施用时降低时，可以确定具有血糖值降低作用。此外，例如测定施用后300分钟时的血糖值，也可判断血糖值降低作用的持续性。

进一步地，即使在血糖值抑制活性比非糖链加成抗原性GLP-1类似物低时，若血中稳定性增大，亦可补偿该血糖值抑制活性的降低。

例如GLP-1活性中的胰岛素分泌活性，可以用体外(in vitro)的cAMP合成能力试验等测定。GLP-1可经由与GLP-1受体结合，使细胞内cAMP浓度上升，因此可促进胰岛素分泌。因此，例如以糖链加成抗原性GLP-1类似物刺激表达小鼠GLP-1受体的CHO-K1细胞，测定细胞内合成的cAMP量，再与非糖链加成抗原性GLP-1类似物比较EC₅₀值，即可评定糖链加成抗原性GLP-1类似物的胰岛素分泌活性。

本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物的血中稳定性，优选是与天然型GLP-1同等或更高，更优选是与非糖链加成抗原性GLP-1类似物同等或更高。血中稳定性可以按本领域技术人员已知方法测定，例如测定血浆中的稳定性、及对DPP-IV(双肽蛋白酶IV)的耐受性，可由半衰期、AUC(血药浓度-时间曲线下的面积)等指征判断。此外，肾脏清除率的增加有助于血中稳定性的提高。

本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物在血浆中的稳定性，优选与天然型GLP-1同等或更高，更优选与非糖链加成抗原性GLP-1类似物同等或更高。

对DPP-IV的耐受性，可以例如根据在DPP-IV溶液中的半衰期测定而判断。本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物与非糖链加成抗原性GLP-1类似物比较，其对DPP-IV的耐受性为同等或更高。

本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物优选具有至少1小时的血中半衰期，更优选是至少3、5、7、10、15、20小时，再优选是至少24小时的血中半衰期。

本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物与非糖链加成抗原性GLP-1类似物比较为其抗原性降低。抗原性的降低，可以例如以糖链加成抗原性GLP-1类似物或非糖链加成抗原性GLP-1类似物刺激小鼠而致敏，再测定各小鼠血液中的抗GLP-1类似物抗体效价后进行比较，以之评定。

本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物的抗原性，与非糖链加成抗原性GLP-1类似物比较，优选降低至其抗原性的约1/2或更低，更优选降低至其抗原性的约1/3或更低，再优选降低至其抗原性的约1/4左右。

(药物组合物)

现对包含本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物作为有效成分的药物组合物进行说明。

含有本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物作为有效成分的药物组合物，可有效地治疗或预防GLP-1相关疾病。如上所述，GLP-1已知具有各种作用，因此与其作用相关的疾病亦有多种。例如已发现GLP-1经由刺激胰岛素释出，可引起细胞摄入葡萄糖并降低血糖值。此外，通过抑制胃和/或肠的运动性，可因此抑制胃和/或肠的内容物排出及抑制食物摄入。因此，GLP-1相关疾病包括例如非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)、胰岛素依赖性糖尿病、脑中风(参照Efendic的国际公开公报第WO00/16797号小册子)、心肌梗塞(参照Efendic的国际公开公报第WO98/08531号小册子)、肥胖症(参照Efendic的国际公开公报第WO98/19698号小册子)、功能性消化不良、过敏性肠综合症(参照Efendic的国际公开公报第WO99/64060号小册子)、胰岛移植。含本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物作为有效成分的药物组合物可特别有效地用于糖尿病的治疗或预防，更特别有效地用于1型糖尿病的预防、2型糖尿病的治疗。

上述药物组合物可使用常用的填充剂、增量剂、黏结剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等稀释剂或赋形剂，制成一般药物组合物的形式。

此类药物组合物可列举如片剂、丸剂、散剂、液剂、悬浮剂、乳剂、粒剂、胶囊剂、栓剂、注射剂等。

药物组合物中所含的本发明糖链加成抗原性GLP-1类似物的用量，并无特别限定，可在广泛范围内适当选择，该药物组合物中所含的本发明之糖链加成抗原性GLP-1类似物通常优选为1至70重量％。

含本发明的糖链加成抗原性GLP-1类似物作为有效成分的药物组合物，亦可含有其他有效成分，亦可与含其他有效成分的药物组合物组合使用。含本发明糖链加成抗原性GLP-1类似物作为有效成分的药物组合物，亦可含有一种或多种不同的本发明糖链加成抗原性GLP-1类似物作为有效成分，亦可与含有一种或多种不同的本发明糖链加成抗原性GLP-1类似物作为有效成分的药物组合物组合使用。

本发明的药物组合物的施用方法并无特别限定，可依照各种制剂形态、患者年龄、性别、疾病之状态、其他条件而决定其方法施用。作为片剂、丸剂、液剂、悬浮剂、乳剂、粒剂及胶囊剂时的施用方法，例如可列举经口施用。作为注射剂时，可单独、或与葡萄糖、氨基酸等一般补充液混合，以静脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹腔内施用。作为栓剂时，可以直肠内施用。

上述药物组合物的施用量，可依照用法、患者年龄、性别、疾病程度、其他条件而适当选择，一般相对于体重1kg，本发明糖链加成抗原性GLP-1类似物的施用量优选为0.1至900nmol，更优选为1至90nmol。本发明糖链加成抗原性GLP-1类似物比非糖链加成抗原性GLP-1类似物抗原性低，因此提高施用量后仍可具有相对较高的安全性。

上述药物组合物的施用次数，可依照用法、患者年龄、性别、疾病程度、其他条件而适当选择，例如3次/1日、2次/1日、1次/1日，亦可再依其在血中稳定性，选择频率较少的施用次数(例如1次/周、1次/月等)。上述药物组合物的施用次数优选为少于等于1次/1日。

本发明糖链加成抗原性GLP-1类似物中加成的糖链，可容易地由体内代谢系统分解。本发明的一个实施方案中，该糖链具有可与体内的糖肽(或糖蛋白)键合存在的结构。因此，含有本发明糖链加成抗原性GLP-1类似物及该肽作为有效成分的药物组合物，在体内施用时具有不显示副作用及抗原性及较少的因过敏反应或抗体产生而无法发挥药效之顾虑的优点。

同时，本发明糖链加成抗原性GLP-1类似物亦可稳定且简便地大量供给，在可提供质量稳定、高质量的药品方面极为有用。

本发明的另一方面提供了GLP-1相关疾病的治疗或预防方法，其特征在于施用有效量的本发明糖链加成抗原性GLP-1类似物。

本说明书中所使用的术语是为说明特定实施方案而用，但本发明并未受其限定。

进一步地，本说明书中所使用的术语“包含(包括、含有)”，除在文理上明显须作不同理解的场合外，均为表示其中所述事项(材料、步骤、要点、数字等)的存在，但并不排除其他事项(材料、步骤、重点、数字等)的存在。

除非另有定义，本文中所使用的所有术语(包含技术用语及科学用语)，其意义均与本发明所属技术领域人员所广泛理解的相同。其中所使用的术语只要未明显表示为不同定义，均应在本说明书可与相关技术范围中的意义匹配的意义上解释，而不应按理想化或过度形式的意义解释。

本发明的实施方案中亦有可同时参照示意图说明的情形，在示意图的情况下，有时也可能为使说明更为明确而夸张地表现。

其中使用的第一、第二等用语是用以表现各种要点，但应可理解此类要点并未受此类用语所限定。此类用语只用在表现一个要点与其他要点区别之时，例如以第一要点表示第二要点、同样地以第二要点表示第一要点，在不脱离本发明范围之下均可。

以下再参照实施例详细说明本发明。但本发明可以由各种方案具体化表现，因此并不解释为限定于其中所述实施例。

实施例

以下以实施例具体说明本发明，但本发明并未受其任何限定。

实施例1第30位Cys-二唾液酸糖链加成促胰岛素分泌肽-4(序列编号：6)的合成法

将12.0mg的由后述合成例1中合成的Ex-4(序列编号：10；序列编号：2中所示的Ex-4的氨基酸序列中第30位的Gly被Cys取代的39残基肽)、及36mg的如下述式(a)所示的经溴乙酰基化的二唾液酸糖链(大塚化学公司制造)在100mM，pH7.4的磷酸钠缓冲溶液、1mL的5mM三羧基乙基膦中，在37℃反应1小时。

再将其直接以HPLC[色谱柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)，

梯度：A溶液：0.1％TFA-水，B溶液：0.09％TFA/10％水/90％AN，8mL/min；B溶液35→50％20分钟线性梯度]精制，制成10.6mg的促胰岛素分泌肽-4的第30位Gly被二唾液酸糖链加成Cys取代的糖链加成促胰岛素分泌肽-4。(M：C271H422N58O123S MALDI TOF质谱计算值[M+H]⁺6493.63，实测6494.33)

实施例2第30位Cys-高甘露糖-5型糖链加成促胰岛素分泌肽-4(序列编号：7)的合成法

将1.2mg的由后述合成例1中合成的Ex-4(序列编号：10；序列编号：2中所示的Ex-4的氨基酸序列中第30位的Gly被Cys取代的39残基肽)、及3.9mg的由后述合成例2中合成的如下述式(b)所示的经溴乙酰基化的M5糖链、在35mM，pH7.4的磷酸钠缓冲溶液、0.17mL的1mM三羧基乙基膦中，在37℃反应3小时。

再将其直接以HPLC[色谱柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN0.7mL/min；B液35→50％20分钟线性梯度]精制，制成0.5mg的促胰岛素分泌肽-4的第30位Gly被高甘露糖型M5糖链加成Cys取代的糖链加成促胰岛素分泌肽-4。(M：C233H362N54O97S MALDI TOF质谱计算值[M(平均)+H]⁺5504.74，实测5506.85)

实施例3第30位Cys-去唾液酸糖链加成利拉鲁肽(序列编号：8)的合成

(1)第28位Arg、第30位Cys的GLP-1(序列编号：11)的合成

以Fmoc法的肽固相合成法合成，再以HPLC[色谱柱：SHISEIDOUG-120(C18，5μm)，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8mL/min；B液20→95％，20min线性梯度]精制。

(2)第28位Arg、第30位Cys-去唾液酸糖链加成GLP-1(序列编号：12)的合成

将21.9mg的第28位Arg、第30位Cys的GLP-1(7-37)与40.3mg的如下式所示的去唾液酸溴乙酰基化糖链、1.3mL的水，在60μL的100mMTCEP、70μL的200mM HEPES缓冲液pH7.5中，在37℃反应7小时。

再将其直接以HPLC[色谱柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN8mL/min；B液20→95％，20min线性梯度]精制，即制成20.8mg的第28位Arg、第30位Cys-去唾液酸糖链加成GLP-1(7-37)。

(3)第30位Cys-去唾液酸糖链加成利拉鲁肽(序列编号：8)的合成

将7.0mg的在(2)中合成的第28位Arg、第30位Cys-去唾液酸糖链加成GLP-1(7-37)与5.0mg的Pal-Glu(OBu)-Osu(参照日本特表2002-512175号公报，实施例33)，在4.6μL的DIPEA、300μL的NMP、200μL的水中反应5分钟。于其中加入Gly水溶液(6mg的Gly、100μL的水、100μL的EtOH)，再经HPLC[色谱柱：Zorbax 300SB-CN，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 1.0mL/min；B液40→55％15min 65℃线性梯度]精制，再经冷冻干燥(4.3mg)。

所得冷冻干燥品中的1.1mg经TFA处理后，再度以相同的HPLC条件精制(图1)，制成0.8mg的利拉鲁肽的第30位Arg被去唾液酸糖链加成Cys所取代的30Cys去唾液酸糖链加成利拉鲁肽。(MALDI TOF质谱计算值[M(平均)+H]⁺5379.68，实测5378.42)

实施例4第30位Cys-二唾液酸糖链加成利拉鲁肽(序列编号：9)的合成

(1)第28位Arg、第30位Cys(acm)的GLP-1(序列编号：13)的合成

以Fmoc法的肽固相合成法合成，再以HPLC[色谱柱：SHISEIDOUG-120(C18，5μm)，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8mL/min；B液20→95％20min线性梯度]精制。

(2)第30位Cys-利拉鲁肽的合成

将10.4mg的在(1)中合成的肽与9.0mg的Pal-Glu(OBu)-OSu(参照日本特表2002-512175号公报，实施例33)，在10.9μL的DIPEA、600μL的NMP、300μL的水中反应10分钟。于其中加入Gly水溶液(29mg的Gly、400μL的水、200μL的EtOH)，再经HPLC[色谱柱：Zorbax 300SB-CN，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN1.0mL/min；B液48→55(7min)-65(8min)-100(9min)，15min 65℃线性梯度]精制，并经冷冻干燥。

将所制成的肽8.2mg中的5.2mg经TFA处理后，再经HPLC[色谱柱：Zorbax 300SB-CN，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 1.0mL/min；B液45→47(1min)-50(7min)-95(8min)，14min 65℃线性梯度]精制，再经冷冻干燥(3.2mg)。

将3.2mg的该冷冻干燥品在2.5mM的90％乙酸银水溶液(160μL)中溶解，再于室温搅拌2小时。于其中加入二硫苏糖醇(3.8mg)，再经HPLC[色谱柱：Zorbax 300SB-CN，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 1.0mL/min；B液45→48(1min)-50(7min)-95(8min)，14min 65℃线性梯度]精制(图2)，再经冷冻干燥，制成2.9mg的利拉鲁肽的第30位Arg被Cys取代的肽(序列编号：14)。

(3)第30位Cys-二唾液酸糖链加成利拉鲁肽(序列编号：9)的合成

将1.6mg的在(2)中制成的第30位Cys的利拉鲁肽，再于20.0mg的如下式所示的二唾液酸溴乙酰基糖链、250μL的水、40μL的100mM TCEP、480μL的200mM，pH7.5的HEPES缓冲液中，于37℃反应6小时。

经9小时后，再直接经HPLC[色谱柱：Zorbax 300SB-CN，梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 1.0mL/min；B液42→43(3min)-52(4min)-61(7min)-95(8min)，14min 65℃线性梯度]精制(图3)，制成2.3mg的如下式所示的利拉鲁肽的第30位Arg被二唾液酸糖链加成Cys取代的第30位Cys-二唾液酸糖链加成利拉鲁肽。

(MALDI TOF质谱计算值[M(平均)+H]⁺5962.19，实测5963.04)

在亲油性取代基的Lys(K²⁰)的键合部位如下。

实施例5第20位Cys-二唾液酸糖链加成BIM51077(序列编号：21)的合成

将合成例3中所合成的BIM51077的第20位的Lys被Cys取代的30残基肽(序列编号：20)(2.4mg，0.72μmol)及鸟嘌呤(216mg)溶于蒸馏水(240μL)中，再依序加入TCEP水溶液(100mM，100μL)、如下式(a)所示的溴乙酰基化二唾液酸糖链(10mg/mL，100μL，4.26μmol)、及500mM磷酸钠缓冲液(pH7.4，100μL)。

于37℃反应2小时后，直接经HPLC[色谱柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7mL/min；B液35→60％20min线性梯度]精制，制成1.9mg的BIM51077的第20位的Lys被二唾液酸糖链加成Cys取代的糖链加成BIM51077肽(序列编号：21)。(MALDI TOF质谱计算值[M(平均)+H]⁺5578.72，实测5578.74)

比较例1促胰岛素分泌肽-4(序列编号：2)的合成

先以DMF清洗固相合成用管柱中的Rink-Amido-PEGA树脂(Merck公司制造)后，再以如下所示的方法进行肽伸长反应，依序缩合氨基酸。

将以Fmoc基保护氨基的氨基酸(0.5mmol)溶解于0.45MHCTU·HOBT/NMP(2.5mmol)中，再将其加入固相合成用管柱中，之后添加0.9M DIPEA/NMP(2.5mmol)。于室温搅拌20分钟后，以DCM及DMF清洗树脂，之后Fmoc基以20％的哌啶/DMF溶液(2mL)进行15分钟脱保护。重复操作以依序缩合氨基酸。

使用以Fmoc基保护氨基酸的Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Pro、Fmoc-Pro、Fmoc-Pro、Fmoc-Ala、Fmoc-Gly、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Pro、Fmoc-Gly、Fmoc-Gly、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Leu、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Val、Fmoc-Ala、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Met、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂中制成含Ser(tBu)-Pro-Pro-Pro-Ala-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Pro--Gly-Gly-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Ile-Phe-Leu-Arg(Pbf)-Val-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-His(Trt)的39残基肽(序列编号：15)。

再将一部份已形成该肽的树脂置入固相合成用管柱中，加入使树脂完全浸没的三氟乙酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，于室温搅拌3小时。之后过滤去除该树脂，再减压浓缩该反应溶液。该制成的残渣再经HPLC[色谱柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0mL/min；B液35→60％20min线性梯度]精制，制成含39个氨基酸残基的Ex-4肽(序列编号：2)。

比较例2 GLP-1(序列编号：1)的合成

先在固相合成用管柱中加入Amino-PEGA树脂(100μmol)后，再以DCM、DMF充分清洗，并经DMF充分膨润。再将其加入其中已溶解4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)、N-乙基吗啉(0.25mmol)的DMF(2mL)的管柱中，于室温搅拌4小时。该树脂再经DMF及DCM充分清洗，制成HMPB-PEGA树脂，以之作为固相合成时的固相。

再取Fmoc-Gly(0.50mmol)及MSNT(0.50mmol)、N-甲基咪唑(0.375mmol)，将其溶解于DCM(2mL)中，将其加入固相合成用管柱中，于25℃搅拌3小时。

在搅拌后，再以DCM、DMF清洗该树脂。Fmoc基再经20％的哌啶/DMF溶液(2mL)作用进行15分钟脱保护。以DMF清洗后，再按以下所示的方法通过依序缩合氨基酸进行肽链的后续伸长。

将以Fmoc基保护氨基的氨基酸溶解于NMP(1mL)中，再加入0.45M的HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)后，将其加入固相合成用管柱中，将0.9M的DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。于室温搅拌20分钟后，再以DCM、DMF清洗树脂，之后Fmoc再以20％的哌啶/DMF溶液(2mL)进行15分钟脱保护。重复该操作，使用由Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)依序缩合氨基酸。

使用由Fmoc基保护氨基酸的Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂中制成含Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)--Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列编号：16)。

以DCM及DMF清洗之后，再将相当于5μmol该31残基肽的树脂移于微试管中。

再将一部份所制成的其中已形成肽的树脂移入固相合成用管柱中，再加入使树脂完全浸没的三氟乙酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，于室温搅拌3小时。之后过滤去除该树脂，再减压浓缩该反应溶液。该制成的残渣再经HPLC(Cadenza column C18 100×10mm展开溶剂A：0.1％TFA 水溶液B：0.1％TFA 乙腈∶水＝90∶10梯度A∶B＝95∶5→5∶95 15分钟流速3.0mL/min)精制，制成GLP-1(序列编号：1)。

比较例3利拉鲁肽(序列编号：3)的合成

利拉鲁肽的制备是依照日本特表JP2002-512175中实施例34的方法，依以下的顺序进行的。

以Fmoc法的肽固相合成法合成，再以HPLC[色谱柱：SHISEIDOUG-120(C18，5μm)，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8mL/min；B液20→95％20min线性梯度]精制。

以10.4mg的该制成的肽与Pal-Glu(OBu)-OSu(9.0mg)在10.9μL的DIPEA、600μL的NMP、300μL的水中反应10分钟。于其中加入Gly水溶液(29mg的Gly、400μL的水、200μL的EtOH)，经HPLC[色谱柱：Zorbax300SB-CN，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 1.0mL/min；B液48-55(7min)-65(8min)-100(9min)，15min 65℃]精制后，再经冷冻干燥。

该制成的保护脂质化肽经TFA处理后，以HPLC[色谱柱：Zorbax300SB-CN，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 1.0mL/min；B液45-47(1min)-50(7min)-95(8min)，14min 65℃]精制，再经冷冻干燥，制成利拉鲁肽(序列编号：3)。(MALDI TOF质谱计算值[M(平均)+H]⁺3749.95，实测3750.97)

合成例1促胰岛素分泌肽-4的第30位氨基酸被Cys取代的肽的合成法

先以DMF清洗固相合成用管柱中的Rink-Amido-PEGA树脂(Merck公司制造)(100μmol)后，再以如下所示的方法进行肽伸长反应，依序缩合氨基酸。

将以Fmoc基保护氨基的氨基酸(0.5mmol)溶解于0.45MHCTU·HOBT/NMP(2.5mmol)中，再将其加入固相合成用管柱中，另再加入0.9M DIPEA/NMP(2.5mmol)。于室温搅拌20分钟后，再以DCM及DMF清洗树脂，之后Fmoc再以20％的哌啶/DMF溶液(2mL)进行15分钟脱保护。重复该操作，依序缩合氨基酸。

所用的由Fmoc基保护的氨基酸是Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Pro、Fmoc-Pro、Fmoc-Pro、Fmoc-Ala、Fmoc-Gly、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Pro、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Leu、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Val、Fmoc-Ala、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Met、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂中制成含Ser(tBu)-Pro-Pro-Pro-Ala-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Pro-Cys(Trt)-Gly-Asn(Trt)--Lys(Boc)-Leu-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Ile-Phe-Leu-Arg(Pbf)-Val-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-His(Trt)的39残基肽(序列编号：17)。

再将一部份所制成的其中已形成肽的树脂移入固相合成用管柱中，再加入使树脂完全浸没的三氟乙酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，于室温搅拌3小时。之后过滤去除该树脂，再减压浓缩该反应溶液。该制成的残渣再经HPLC(色谱柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0mL/min；B液35→60％20min线性梯度)精制，即制成Ex-4的第30位的Gly被Cys取代的39残基肽。(MALDI TOF质谱计算值[M+H]⁺4230.60，实测4231.27)(序列编号：10)。

合成例2溴乙酰基化M5糖链的合成法

取100g的大豆粉，以500mL的丙酮洗涤2次、500mL的甲醇洗涤2次，以制成61.4g的脱脂大豆粉。

再于43.0g的该已制成的脱脂大豆粉中加入430mL的水、4.3g的液化酶T(HBI公司制造)，边搅拌边在70℃反应19小时。该反应液经离心分离(10000G，10分钟)以分离上清液与沉淀物，制成800mL的上清液。之后于该沉淀物中加入430mL的水、4.3g的液化酶T，再次在70℃反应19小时，该反应液经离心分离(10000G，10分钟)以分离上清液与沉淀物，制成600mL的上清液。

合并该制成的上清液(合计1400mL)、100mL的500mM、pH7.0磷酸缓冲液、3.0g的Orientase ONS(HBI公司制造)，在搅拌的同时于50℃反应19小时。之后过滤反应后的溶液以去除其中的不溶物，以旋转蒸馏器浓缩至溶液量为400mL。该制成的溶液用分级分子量为1K的超滤膜(MinimateTFF Capsule 1K membrane，Pall公司制造)超滤。

经处理6小时后，可回收未通过滤膜的溶液230mL。在该回收的溶液中加入20mL的1M，pH8.0的Tris-盐酸缓冲液、250mg的氮化钠、423.5mg的Actinase E(科研制药公司制造)，于37℃反应82小时。之后过滤反应液以去除其中的不溶物，以旋转蒸馏器浓缩至液量为100mL。该制成的浓缩液再各以一半分2次以Sephadex-G25

管柱进行分级，仅收集含糖链的级分，浓缩成2.22g。

之后于该制成的含糖链级分中加入21.0mL的蒸馏水、14.9mL的乙醇，并使其溶解，再加入1.13g的碳酸氢钠、2.02g的Fmoc-OSu，于室温反应16小时。反应后加入250mL的丙酮，并以滤膜(

保持粒径0.5μm，Advantec Toyo公司制造)过滤。以蒸馏水溶解回收该滤膜上余留的不溶物，以旋转蒸馏器浓缩至液量为10mL以下。该浓缩液以Sephadex-G25

管柱分级，收集含糖链的级分而浓缩成1.37g。

该产物以4mL的蒸馏水溶解后，以ODS管柱(Wakogel 100C18，

)分级，仅收集含糖链的级分加以浓缩，制成48.6mg的粗制糖链。该粗制糖链再以HPLC[色谱柱：YMC-PackODS-AM，

溶离液：乙腈/25mM乙酸铵缓冲液＝82/18，流速：8.0mL/min]精制，制成13.0mg的高甘露糖型Man5GlcNAc₂糖链(M5糖链)。

于11.0mg的该制成的M5糖链中加入165μL的水溶解。于该溶液中加入200mg的碳酸氢铵，并于室温处理41小时后，进行冷冻干燥。该冷冻干燥品中加入12.5mg的碳酸氢钠、110μL的水，并加入预先溶解于10μL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的19.9mg的溴乙酸酐(Aldrich公司制造)，一面于冰浴反应1小时。经过1小时后，使该反应液恢复至室温，再反应1小时，经膜过滤精制，制成7.9mg的如下所示的溴乙酰基化M5糖链(b)。

合成例3 BIM51077的第26位被Cys取代的肽的合成法

先以DMF清洗固相合成用管柱中的Rink-Amido-PEGA树脂(Merck公司制造)(100μmol)后，再以如下所示的方法进行肽伸长反应，依序缩合氨基酸。

将以Fmoc基保护氨基的氨基酸(0.5mmol)溶解于0.45MHCTU·HOBT/NMP(2.5mmol)中，再将其加入固相合成用管柱中，另加入0.9M DIPEA/NMP(2.5mmol)。于室温搅拌20分钟后，再以DCM及DMF清洗树脂，之后Fmoc再以20％的哌啶/DMF溶液(2mL)进行15分钟脱保护。重复该操作，依序缩合氨基酸。

使用由Fmoc基保护氨基酸的Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-AminoisobutyricAcid(Aib)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Aib、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂中制成含Arg(Pbf)-Aib-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Trt)--Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Aib-His(Trt)的30残基肽(序列编号：22)。

再将一部份所制成的其中已形成肽的树脂移入固相合成用管柱中，再加入使树脂完全浸没的三氟乙酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，于室温搅拌3小时。之后过滤去除该树脂，再减压浓缩该反应溶液。该制成的残渣再经HPLC[色谱柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)，

梯度：A液：0.1％TFA水，B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0mL/min；B液35→60％20min线性梯度]精制，制成12mg的BIM51077的第20位的Lys被Cys取代的30残基肽。(MALDI TOF质谱计算值[M(平均)+H]⁺3315.69，实测3314.72)(序列编号：20)。

试验例1糖链加成促胰岛素分泌肽-4的抗原性降低作用的确认

以非糖链加成促胰岛素分泌肽-4或第30位Cys-二唾液酸糖链加成促胰岛素分泌肽-4刺激致敏小鼠，并通过比较其血中抗促胰岛素分泌肽-4抗体浓度，以验证糖链加成对促胰岛素分泌肽的抗原性的影响。

初次免疫是以实施例1中合成的第30位Cys-二唾液酸糖链加成的促胰岛素分泌肽-4及非糖链加成的促胰岛素分泌肽-4(American PeptideCompany)与完全弗氏佐剂(Complete Freund′s adjuvant)(Difco Laboratories)充分混合成乳化液，以腹腔内施用于balb/c小鼠(雌性，7周龄)。

在第14日时，再以与不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund′s adjuvant)(Difco Laboratories)充分混合成乳化液的糖链加成促胰岛素分泌肽-4或非糖链加成促胰岛素分泌肽-4，皮下施用于balb/c小鼠(雌性，7周龄)以追加免疫。

追加免疫7日后，再自小鼠中采集血浆。以市售的抗促胰岛素分泌肽-4抗体(Antibodyshop)为标准品，以酶-连结免疫吸附分析(Enzyme-LinkedImmunosorbent assay；ELISA)测定血浆中的抗促胰岛素分泌肽-4抗体浓度。

取50μg的非糖链加成促胰岛素分泌肽-4置入96孔ELISA分析盘中，于37℃培育2小时。该分析盘以含0.05％的Tween20的pH7.4磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(清洗缓冲液)清洗3次，以含0.5％的牛血清白蛋白的清洗缓冲液在4℃阻断1夜。经阻断后再3次清洗该分析盘，于其中加入血浆试样经PBS稀释制成的稀释系列，于37℃培育2小时。在以清洗缓冲液清洗3次的分析盘中加入50μL的过氧化酶结合的山羊抗小鼠(peroxidase-conjugated goat anti-mouse)IgG，于37℃培育2小时。将分析盘以清洗缓冲液清洗3次后，加入100μL的ABTS过氧化酶基质(Pierce)进行显色。该显色反应以添加20％的SDS终止，测定其在405nm的吸收度。抗促胰岛素分泌肽-4抗体的浓度是以抗促胰岛素分泌肽-4单株抗体标准品标定的。其结果如图4所示。

在以非糖链加成的促胰岛素分泌肽-4免疫的小鼠中强力诱导抗体产生，其血浆中的浓度为707±68.2mg/mL。相对地，以第30位Cys-二唾液酸糖链加成促胰岛素分泌肽-4免疫的小鼠血浆中的抗促胰岛素分泌肽-4抗体浓度与以非糖链加成促胰岛素分泌肽-4免疫时相比，降低至约1/4(178.8±22.3mg/mL)，显示出显著的抗原性降低作用(p＜0.001，Student′st-test)。

S试验例2糖链加成促胰岛素分泌肽-4的经口葡萄糖耐受性试验(OGTT：Oral Glucose Tolerance Test)

取实施例1中合成的第30位Cys-二唾液酸糖链加成促胰岛素分泌肽-4或比较例1中合成的非糖链加成促胰岛素分泌肽-4的PBS溶液(0.9nmol/10mL)、或比较例2中制成的GLP-1的PBS溶液(9nmol/10mL)，以10mL/kg施用量腹腔内施用于经一夜禁食的C57BL/6JJcl小鼠(10周龄，雄性)。

经过30分钟后，以1mg/g的施用量经口施用葡萄糖溶液。于施用葡萄糖前、施用葡萄糖30分钟后、60分钟后、120分钟后由眼窝采血，以Accu-Chek Aviva(Roche Diagnostics公司)测定血糖值。同样地以非糖链加成利拉鲁肽施用于db/db小鼠，测定其经时血糖值，与第30位Cys-二唾液酸糖链加成利拉鲁肽的作用进行比较。其结果如图5所示。

其显示第30位Cys-二唾液酸糖链加成促胰岛素分泌肽-4及非糖链加成促胰岛素分泌肽-4具有同等的效果，均显示有较赋形剂(PBS单独)及GLP-1更高的血糖上升抑制作用。

试验例3使用db/db小鼠的糖链加成促胰岛素分泌肽-4的血糖值降低作用的确认

取实施例1中合成的第30位Cys-二唾液酸糖链加成促胰岛素分泌肽-4的PBS溶液(9nmol/10mL)，以10mL/kg的施用量腹腔内施用于BKS·Cg-+Leprdb/+Leprdb/Jcl小鼠(10周龄，雄性)。于施用化合物前、30分钟后、60分钟后、120分钟后、240分钟后由眼窝采血，以Accu-ChekAviva(Roche Diagnostics公司)测定血糖值。

将其血糖值降低作用与比较例1中合成的非糖链加成促胰岛素分泌肽-4比较。其结果如图6所示。

其显示非糖链加成促胰岛素分泌肽-4的血中稳定性高，施用后30分钟显示有强的血糖值降低作用，该效果可持续至240分钟后。第30位Cys-二唾液酸糖链加成促胰岛素分泌肽-4显示了与非糖链加成促胰岛素分泌肽-4同等的血糖值降低作用及持续性，在促胰岛素分泌肽-4的第30位的氨基酸加成糖链的影响无法检出。

由试验例1、2及3的结果可知，在非糖链加成促胰岛素分泌肽-4的第30位上加成糖链对促胰岛素分泌肽-4的药理作用并无影响，因此应该为降低非糖链加成促胰岛素分泌肽-4的抗原性的有效方法。

试验例4糖链加成利拉鲁肽的经口葡萄糖耐受性试验(OGTT：Oral GlucoseTolerance Test)

取实施例4中制成的第30位Cys-二唾液酸糖链加成利拉鲁肽、比较例2中制成的GLP-1或比较例3中制成的利拉鲁肽的PBS溶液(9nmol/10mL)，以10mL/kg的施用量的PBS腹腔内施用于禁食一夜的C57BL/6JJcl小鼠(10周龄，雄性)。

经过30分钟后，以1mg/g的施用量经口施用葡萄糖溶液。于施用葡萄糖前、施用葡萄糖30分钟后、60分钟后、120分钟后由眼窝采血，以Accu-Chek Aviva(Roche Diagnostics公司)测定血糖值。其结果如图7所示。

其结果显示第30位Cys-二唾液酸糖链加成利拉鲁肽及非糖链加成利拉鲁肽均有较赋形剂(PBS单独)及GLP-1更高的血糖上升抑制作用，第30位Cys-二唾液酸糖链加成利拉鲁肽与非糖链加成利拉鲁肽比较，显示出具有更高的血糖值上升抑制作用。

试验例5使用db/db小鼠的糖链加成利拉鲁肽血糖值上升抑制作用试验

取实施例4中制成的第30位Cys-二唾液酸糖链加成利拉鲁肽的PBS溶液(9nmol/10mL)，以10mL/kg的施用量腹腔内施用于BKS·Cg-+Leprdb/+Leprdb/Jcl小鼠(db/db小鼠，10周龄，雄性)。于施用化合物前、30分钟后、60分钟后、120分钟、240分钟、480分钟、720分钟后由眼窝采血，以Accu-Chek Aviva(Roche Diagnostics公司)测定血糖值。同样以非糖链加成利拉鲁肽施用于db/db小鼠，测定经时血糖值，与第30位Cys-二唾液酸糖链加成利拉鲁肽比较其作用。其结果如图8所示。

其结果显示第30位Cys-二唾液酸糖链加成利拉鲁肽的血中稳定性提高，施用后30分钟显示有强的血糖值降低作用，该效果可持续至12小时后。第30位Cys-二唾液酸糖链加成利拉鲁肽显示出与非糖链加成利拉鲁肽同等的血糖值降低作用及持续性，因此在利拉鲁肽的第30位的氨基酸加成糖链的影响无法检出。

序列表检索文字

序列编号：1是GLP-1。

序列编号：2是促胰岛素分泌肽-4。

序列编号：3是利拉鲁肽。

序列编号：4是糖链加成促胰岛素分泌肽-4的通式。

序列编号：5是糖链加成利拉鲁肽的通式。

序列编号：6是第30位的Gly被二唾液酸糖链加成Cys取代的促胰岛素分泌肽-4。

序列编号：7是第30位的Gly被高甘露糖-5型糖链加成Cys取代的促胰岛素分泌肽-4。

序列编号：8是第30位的Arg被去唾液酸糖链加成Cys取代的利拉鲁肽。

序列编号：9是第30位的Arg被二唾液酸糖链加成Cys取代的利拉鲁肽。

序列编号：10是第30位的Gly被Cys取代的促胰岛素分泌肽-4。

序列编号：11是第28位的Lys被Arg、第30位的Arg被Cys取代的GLP-1肽。

序列编号：12是第28位的Lys被Arg、第30位的Arg被去唾液酸糖链加成Cys取代的GLP-1肽。

序列编号：13是第28位的Lys被Arg、第30位的Arg被Cys(acm)取代的GLP-1。

序列编号：14是第30位的Arg被Cys取代的利拉鲁肽。

序列编号：15是比较例1中合成的具有保护基之肽。

序列编号：16是比较例2中合成的具有保护基之肽。

序列编号：17是合成例1中合成的具有保护基之肽。

序列编号：18是BIM-51077。

序列编号：19是糖链加成BIM-51077的通式。

序列编号：20是第20位的Lys被Cys取代的BIM-51077。

序列编号：21是第20位的Lys被二唾液酸糖链加成Cys取代的BIM-51077。

序列编号：22是合成例3中合成的具有保护基之肽。

Claims (21)

1.具有GLP-1活性的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，所述抗原性GLP-1类似物中的至少1个氨基酸被糖链加成氨基酸所取代。

2.如权利要求1所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，所述糖链加成氨基酸为糖链加成Asn或糖链加成Cys。

3.如权利要求1或2中所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，所述糖链加成氨基酸中，所述糖链与所述氨基酸是经由连接子键合的。

4.如权利要求1至3中任一项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，所述糖链是由4个或多于4个的糖所构成的糖链。

5.如权利要求1至4中任一项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，所述糖链是双股链复合型糖链。

6.如权利要求5所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，所述糖链是从由二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、diGlcNAc糖链及二甘露糖链所组成的组中选择的糖链。

7.如权利要求5所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，所述糖链为下式所示糖链：

式中的R¹及R²为相同或不同，表示下述基团：

其中的Ac表示乙酰基。

8.如权利要求1至7中任一项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，所述抗原性GLP-1类似物为促胰岛素分泌肽-4。

9.如权利要求8所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，由糖链加成氨基酸取代的部位为序列编号：2中所记载的氨基酸序列中的第30位。

10.如权利要求8所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，由序列编号：2中所记载的氨基酸序列所构成的肽中，第30位的Gly被糖链加成Cys所取代，所述糖链为如下式所示的二唾液酸糖链：

且在所述糖链加成Cys中，所述糖链与所述Cys是经由连接子键合的。

11.如权利要求1至7中任一项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，所述抗原性GLP-1类似物为利拉鲁肽。

12.如权利要求11所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，所述糖链加成氨基酸所取代的部位为在序列编号：3中所记载的氨基酸序列中的第30位。

13.如权利要求11所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，由序列编号：3中所记载的氨基酸序列所构成的肽中，第30位的Arg被糖链加成Cys所取代，所述糖链为如下式所示的二唾液酸糖链：

或为如下式所示的去唾液酸糖链：

而且，所述糖链加成Cys中，所述糖链与所述Cys是经由连接子键合的。

14.如权利要求1至13中任一项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，所述糖链在实质上是均一的。

15.如权利要求1至13中任一项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其中，所述糖链是99％以上均一的。

16.如权利要求1至15中任一项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其抗原性与未加成任何糖链的该抗原性GLP-1类似物比较，小于或等于1/2。

17.如权利要求1至16中任一项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物，其抗原性比未加成任何糖链的该抗原性GLP-1类似物降低，且GLP-1活性比天然型GLP-1提高。

18.药物组合物，含有权利要求1至17中任一项所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物作为有效成分。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其用于GLP-1相关疾病的治疗或预防。

20.如权利要求19所述的药物组合物，其中，所述GLP-1相关疾病是糖尿病。

21.GLP-1相关疾病的治疗或预防方法，其特征为施用有效量的权利要求1至17中任一项中所述的抗原性GLP-1类似物的糖链加成物。

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