CN104774246B

CN104774246B - Nrp-1特异性肿瘤靶向多肽及其应用

Info

Publication number: CN104774246B
Application number: CN201510119364.6A
Authority: CN
Inventors: 曾木圣; 张星; 王均; 冯国开; 张梦清; 刘荣彬; 叶晓璇; 钟茜
Original assignee: SUN YAT-SEN UNIVERSITY CANCER HOSPITAL
Current assignee: Sun Yat-sen University Cancer Hospital; Sun Yat Sen University
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2015-03-18
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2035-03-18
Also published as: CN104774246A

Abstract

发明公开了肿瘤靶向多肽及其应用。肿瘤靶向多肽的基序的通式为（R/K）XX（R/K）XXX，基序的C端和/或N端可选连接有1～3个氨基酸，X为20种天然氨基酸中的任一种或其D型氨基酸。体内外实验证明，该肿瘤靶向多肽特异性结合于肿瘤细胞中过表达的NRP‑1，在肿瘤分子诊断和靶向治疗中具有重要应用价值。

Description

NRP-1特异性肿瘤靶向多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种靶向多肽，特别涉及一种肿瘤靶向多肽及其应用。

背景技术

目前神经纤毛蛋白1(Neuropilin-1, NRP-1)是肿瘤靶向成像和治疗的理想靶点。在正常生理条件下，NRP-1作为3型信号素（semaphorin 3, SEMA 3）的共受体，参与神经突触的发育过程。在肿瘤中，NRP-1作为多种肿瘤相关膜蛋白的共受体，参与肿瘤的起源、生长、侵袭和转移。NRP-1在多种肿瘤细胞中高表达，例如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胶质瘤、肺癌、食管癌、膀胱癌和胰腺癌等。NRP-1的表达水平与肿瘤预后密切相关，其表达水平越高，肿瘤预后越差。以NRP-1为靶点，研究人员目前已经研发了多种肿瘤靶向药物，主要包括小分子药物、单克隆抗体、siRNA、SEMA 3以及NRP-1靶向多肽。与其它针对NRP-1的肿瘤靶向药物相比较，NRP-1靶向多肽具有高效、安全、毒副作用少和低免疫原性等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与NRP-1特异性结合的肿瘤靶向多肽及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

肿瘤靶向多肽，其基序的通式为（R/K）XX（R/K）XXX（SEQ ID NO：4），基序的C端和/或N端可选连接有1～3个氨基酸，X为20种天然氨基酸中的任一种或其D型氨基酸。

作为本发明的进一步改进，多肽的基序的通式为KXXKXXX（SEQ ID NO：5）。

作为本发明的进一步改进，多肽通过其末端氨基酸成环。

作为本发明的进一步改进，多肽的基序两端分别连接有一个Cys。

作为本发明的进一步改进，多肽的基序为LKADKAK。

一种肿瘤靶向制剂，偶联有上述的任一种肿瘤靶向多肽。

本发明的有益效果是：

体内外实验证明，该肿瘤靶向多肽具有NRP-1的结合特异性，在肿瘤分子诊断和靶向治疗中具有重要应用价值。

将本发明的多肽与分子标记偶联，可以很好地结合在肿瘤细胞上，可以很好地应用于肿瘤的筛查、诊断。

将本发明的多肽与药物分子偶联，可以起到靶向治疗的效果。

附图说明

图1是多肽与乳腺癌细胞结合实验结果；

图2是多肽与乳腺癌细胞结合依赖于NRP-1实验结果；

图3是乳腺癌SPECT成像实验结果；

图4是乳腺癌NIRF成像实验结果；

图5是编码CK3多肽T7噬菌体的电泳图；

图6是CK3噬菌体结合能力与NRP-1表达水平之间的关系图；

图7 是^99mTc标志的CK3多肽在正常兔子的体内生物分布图；

图8是Cy5标志的 CG7C，iRGD，RPARPAR 和 CK3多肽在MDA-MB-231荷瘤裸鼠中的NIRF成像结果。

具体实施方式

肿瘤靶向多肽，其基序的通式为（R/K）XX（R/K）XXX，基序的C端和/或N端可选连接有1～3个氨基酸，X为20种天然氨基酸中的任一种或其D型氨基酸。

作为本发明的进一步改进，多肽的基序的通式为KXXKXXX。

作为本发明的进一步改进，多肽的基序为LKADKAK。

作为本发明的进一步改进，多肽通过其末端氨基酸成环。环肽在体内可以更为稳定的存在，起效时间可以进一步延长。

作为本发明的进一步改进，多肽的基序两端分别连接有一个Cys。更进一步的，多肽通过其两端连接的Cys形成二巯键成环。

一种肿瘤靶向制剂，偶联有上述的任一种肿瘤靶向多肽。在该制剂中，多肽起到靶向作用，与其偶联的起效分子可以是诊断试剂，也可以是用于治疗的药物，如肿瘤杀伤肽、化疗用小分子药物等。为了使起效分子可以很好地偶联在多肽上，可以使用本领域常用的偶联基团。为了保证靶向效果，偶联的位点不应选择在基序上。

上述肿瘤靶向多肽可以由左旋或右旋氨基酸组成，由右旋氨基酸在体内更稳定地存在，是更佳的选择。

下述实验中所使用的肽如下

T7噬菌体构建和结合分析

T7噬菌体构建方法

1)根据Merck公司T7噬菌体包装试剂盒说明书，构建编码CK3多肽T7 415-1b噬菌体。按照下列反应体系，用Ligation High将编码CK3多肽的DNA片段与T7噬菌体DNA片段进行连接。

2)然后加入25µl Merck公司T7噬菌体包装试剂，室温连接2小时，加入LB终止反应，铺板，挑噬菌体单克隆，纯化噬菌体，提噬菌体DNA进行测序。

T7噬菌体结合分析方法

1)胰酶消化细胞，细胞计数，取1×10⁶ 个细胞，200µl 2% BSA DMEM重悬；

2)加入1×10⁹ TU 噬菌体，37℃结合1小时；

3)2% BSA DMEM冲洗6次，1ml/次，400g，离心3分钟，冲洗6次；

4)1% NP-40 LB裂解细胞，稀释计数。

SPECT成像方法

1)按照下列反应体系混合多肽；

2)100℃ 加热20分钟；

3)取100µl上述反应液，加入900µl 0.9%氯化钠注射液稀释；

4)取上述稀释液100µl，对兔子进行尾静脉注射，分别在2.5, 15, 30, 60, 90and 120分钟，对兔子进行SPECT成像，检测正常器官的分布和排泄情况；

5)取上述稀释液100µl，对MDA-MB-231荷瘤裸鼠进行尾静脉注射，4小时后进行SPECT成像，检测肿瘤和正常器官的富集情况；

6)处死裸鼠，取器官和肿瘤进行称重，同时对器官和肿瘤进行放射性定量；

7)统计分析方法：器官或肿瘤平均放射性强度=器官或肿瘤放射性强度/器官或肿瘤重量。肿瘤比器官的放射性强度比率=肿瘤平均放射性强度/器官平均放射性强度。

多肽合成和标志

Cy5-CK3，Cy5-C 、Cy5-iRGD 和 Cy5-RPARPAR多肽由杭州中肽公司合成。

数据分析：

计数结果应用统计软件SPSS16.0进行分析，采用Levene法对各组计数结果进行方差齐性检验。如果各组方差齐性(P>0.05时，方差齐性)，然后采用独立样本t检验，分析组间是否有显著差异(P<0.05时，有显著差异)。

成功构建T7噬菌体后，对构建得到的噬菌体进行电泳，结果如图5所示。图中A）EcoR I 和 Hind III 对T7 select 415-1b 噬菌体DNA进行双酶切，琼脂糖电泳结果显示T7噬菌体的左臂和右臂；B)编码CK3多肽的DNA退火前和退火后的电泳图。证明构建成功。

CK3与多种乳腺癌细胞结合实验

首先应用Western-blotting 实验，检测乳腺癌细胞MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-435和MCF-7中NRP-1的表达情况，然后检测CK3噬菌体与上述细胞的结合情况，最后应用CK3多肽阻断CK3噬菌体与MDA-MB-231细胞的结合。具体操作如下：

Western-blotting 实验，检测乳腺癌细胞MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-435和MCF-7中NRP-1的表达情况：

1)8% SDS-PAGE凝胶电泳细胞总蛋白，条件为恒压120V，电泳2小时；

2)电泳产物转膜于PVDF膜中，条件为恒流200mA，转膜2小时；

3)5%脱脂奶粉封闭30分钟；

4)TBST冲洗1次，5分钟每次；

5)一抗Anti-NRP-1 rabbit (1:1000)，5% BSA结合2小时；

6)TBST冲洗3次，10分钟每次；

7)二抗HRP-Anti-Rabbit (1:5000)，5% BSA结合1小时；

8)TBST冲洗3次，10分钟每次；

9)加入HRP底物发光，X光片检测发光。

CK3噬菌体与乳腺癌MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-435和MCF-7细胞的结合以及CK3多肽阻断实验，具体操作如下：

1)胰酶消化细胞，200微升DMEM重悬细胞，阻断实验时加入相应浓度的CK3多肽，冰上孵育30分钟（结合实验直接进入第3步）；

2)加入1.0×10⁸个噬菌体，冰上孵育结合1小时；

3)PBS冲洗3次，1ml/次，400g，离心5分钟；

4)1ml TBS重悬沉淀，稀释10³～10⁴倍，取100μl计数；

5)T7噬菌体感受菌BL21，接种，按照V/V=1/100接种，37℃，200转/分，摇菌为4小时至OD值为0.5-1.0，感染菌处于对数生长中期，24小时内4℃保存待用；

6)准备好噬菌体培养底层胶，37℃预温待用；准备好上层胶，45℃水浴预温待用；

7)待测噬菌体用LB培养基，10倍浓度梯度系列稀释，每次稀释换新枪头，每个待检测浓度准备1个EP管；

8)4ml EP管中加入100μl对数生长期BL21，加入100μl待检测噬菌体；

9)加入4ml 45℃预温上层胶，迅速倒入37℃预温噬菌体培养底层胶培养皿中，室温5分钟待凝固；

10)37℃培养4小时，对噬菌体白斑进行计数。根据稀释倍数，计算对应管待测噬菌体滴度。

实验结果如图1所示：A图显示NRP-1在乳腺癌MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-435和MCF-7细胞中的表达情况；B图显示CK3噬菌体与细胞的结合力与NRP-1的表达水平相关；C图显示，CK3多肽浓度依赖性抑制CK3噬菌体与MDA-MB-231细胞的结合。

以NRP-1蛋白Western-Blot条带灰度值为横坐标，MDA-MB-231转染NC，siRNA1和siRNA转染的MDA-MB-231后，CK3噬菌体相对于CG7C噬菌体的结合力为纵坐标，进行相关性分析。Pearson相关系数和p值标志于图中。结果如图6所示，显然CK3噬菌体结合能力与NRP-1表达水平具有很强的正相关性。

该结果证明CK3多肽可以与多种表达NRP-1的肿瘤细胞结合。

CK3肽与乳腺癌细胞的结合依赖于NRP-1表达

首先在NRP-1表达水平高的乳腺癌细胞MDA-MB-231中，应用siRNA干扰NRP-1的表达，检测CK3噬菌体的结合能力；同时在NRP-1表达水平低的鼻咽癌细胞HNE1中，通过外源性转染质粒过表达NRP-1，检测CK3噬菌体的结合能力；最后，在HNE1细胞中，检测CK3多肽与NRP-1的共定位情况。

应用siRNA干扰NRP-1的表达，然后检测CK3噬菌体结合，具体操作如下：

1)传MDA-MB-231细胞于6孔板中，0.2 X 10⁶个每孔；

2)5微升siRNA与250微升无血清培养基OPTI-MEM混合，终浓度为50微摩尔每毫升；

3)5微升转染试剂lipofectamine RMAmaxi与250微升无血清培养基OPTI-MEM混合，室温5分钟；上述液体混合室温20分钟，加入细胞中；

4)48小时后，按照上述Western-blotting 实验检测NRP-1干扰效果；按照上述CK3与细胞结合实验检测干扰后结合情况。

应用质粒外源性转染过表达NRP-1，然后检测CK3噬菌体结合，具体操作如下：

1)传HNE1细胞于6孔板，0.2 X 10⁶个每孔；

2)2微克质粒pMSCV和pMSCV-NRP-1与100微升无血清培养基OPTI-MEM混合，加入4微升转染试剂X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，室温孵育20分钟，加入细胞中；

3)48小时后，按照上述Western-blotting 实验检测NRP-1过表达情况；按照上述CK3与细胞结合实验检测过表达结合情况。

应用质粒外源性转染过表达NRP-1，然后检测CK3多肽与NRP-1共定位，具体操作如下：

1)传HNE1细胞于24孔板中，0.05X 10⁶个每孔；

2)0.5微克质粒pEGFP和pEGFP-NRP-1与100微升无血清培养基OPTI-MEM混合，加入4微升转染试剂X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，室温孵育20分钟，加入细胞中；

3)48小时后，细胞加入Bitoin-CK3肽或Bitoin-C肽，37℃孵育结合2小时；

4)PBS冲洗3次，1ml/次，每次5分钟；

5)4%多聚甲醛固定10分钟；

6)0.1%Triton-X100 破膜5分钟；

7)5% BSA 封闭30分钟；

8)PBS冲洗2次，1ml/次，每次5分钟；

9)加入Cy3-streptavidin 避光结合1小时；

10)PBS冲洗3次，1ml/次，每次5分钟；

11)加入1:2000 DAPI 室温避光5分钟；

12)PBS冲洗1次，1ml/次，每次5分钟；

13)Anti-fade 封片，共聚焦显微镜观察。

实验结果如图2所示：A图显示，siRNA干扰后NRP-1表达明显减弱；B图显示，siRNA干扰后，CK3噬菌体结合减少；C图显示，外源性转染后NRP-1高表达；D图显示，NRP-1高表达后，CK3噬菌体结合增加；E图显示，CK3与NRP-1在细胞膜表面共定位。该结果证明CK3多肽与肿瘤细胞的结合依赖于NRP-1的表达。

CK3 多肽SPECT肿瘤分子成像实验

首先将Tc⁹⁹标志CK3多肽，然后在MDA-MB-231小鼠动物模型中进行SPECT分子成像实验，具体操作如下：

1)取9只4周龄雌性BALB∕c裸鼠；

2)胰酶消化MDA-MB-231细胞，计数，调整浓度为1.0×106个/ml，20% Matrigel1640重悬，200μl/只裸鼠，乳房垫注射；

3)葡萄糖酸钠1.0g，碳酸氢钠3.0g，氯化亚锡2.25mg，溶解于1.5 ml的sodiumpertechnetate solution (Na⁹⁹mTcO₄)中，室温反应10分钟；

4)取上述反应液体100微升，加入900微升生理盐水；

5)200微升每只裸鼠，尾静脉注射，2小时，4小时，6小时，12小时和24小时动态SPECT成像检测。

实验结果如图3所示：A图红色箭头显示MDA-MB-231肿瘤位置；B图红色箭头显示，注射后6小时，CK3多肽在肿瘤中聚集；C图显示，CT扫描肿瘤位置。该结果证明CK3多肽可以应用肿瘤SPECT成像。

^99mTc标志的CK3多肽在正常兔子的体内生物分布如图7所示。A)标志后的CK3多肽尾静脉注射进入正常兔子60分钟后，进行灌注实验。B) 尾静脉注射20分钟后，进行排泄实验。C)尾静脉注射2.5 , 15, 30, 60, 90 和 120分钟后，进行SPECT成像。^99mTc标志的CK3多肽主要在肾脏和膀胱中富集。

CK3 多肽红外荧光肿瘤分子成像实验

应用小动物活体成像实验方法，检测Cy5-CK3荧光肽在裸鼠各个脏器和肿瘤中分布情况，具体操作如下：

1)取9只4周龄雌性BALB∕c裸鼠；

2)胰酶消化MDA-MB-231细胞，计数，调整浓度为1.0×10⁶个/ml，20% Matrigel1640重悬，200μl/只裸鼠，乳房垫注射；

3)1-2周观察肿瘤形成情况，测量肿瘤大小，根据肿瘤大小将其随机化分3组，分别为PBS组，对照肽Cy5-C组以及Cy5-CK3组，每组3只小鼠；

4)200µl PBS溶解300µg荧光肽，尾静脉注射荧光肽，小动物活体动物成像仪动态检测荧光肽在裸鼠各个脏器和肿瘤中的分布情况；

5)取各个脏器和肿瘤，匀浆，检测各个脏器和肿瘤的荧光强度，统计分析。

肿瘤分子成像实验结果如图4显示：A图显示，尾静脉注射24小时后，Cy5-CK3荧光肽在肿瘤中明显聚集；B图显示，尾静脉注射24小时后，Cy5-CK3荧光肽在肿瘤中明显富集，此外肾脏中有少量聚集；C图显示，尾静脉注射24小时后，Cy5-35荧光肽在肿瘤中平均荧光强度明显强于对照。该结果证明CK3多肽可以应用于肿瘤红外荧光分子成像。

Cy5标志的 CG7C，iRGD，RPARPAR 和 CK3多肽在MDA-MB-231荷瘤裸鼠中的NIRF成像结果如图8所示。CK3多肽与两条代表性NRP-1多肽进行比较，即与iRGD和RPARPAR多肽进行比较。成像结果表明，尾静脉注射12小时后，CK3和iRGD在肿瘤中富集，RPARPAR和对照CG7C多肽没有在肿瘤中富集。

<110> 中山大学附属肿瘤医院

<120> NRP-1特异性肿瘤靶向多肽及其应用

<130>

<150> CN201410109399.7

<151> 2014-03-21

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工多肽

<220>

<221> 环肽

<222> (1)..(9)

<223> 通过两端的Cys环化

<400> 1

Cys Leu Lys Ala Asp Lys Ala Lys Cys

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工多肽

<220>

<221> 环肽

<222> (1)..(9)

<223> 通过两端的Cys环化

<400> 2

Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工多肽

<220>

<221> 环肽

<222> (1)..(9)

<223> 通过两端的Cys环化

<400> 3

Cys Leu Lys Ala Asp Lys Ala Lys Ala Cys

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工多肽

<220>

<221> 可变位点

<222> (1)..(1)

<223> Lys可被Arg替换

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> 可变位点

<222> (4)..(4)

<223> Lys可被Arg替换

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(7)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 4

Lys Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工多肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(7)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 5

Lys Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工多肽

<400> 6

Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工多肽

<400> 7

Arg Pro Ala Arg Pro Ala Arg

1 5

Claims

1.肿瘤靶向多肽，其序列为CLKADKAKC，通过其末端氨基酸成环。

2.权利要求1所述的肿瘤靶向多肽在制备肿瘤诊断试剂中的应用。

3.权利要求1所述的肿瘤靶向多肽在制备肿瘤靶向药物中的应用。

4.一种肿瘤靶向制剂，所述制剂上偶联有权利要求1所述的肿瘤靶向多肽。