CN107952080A - 一种肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种肿瘤靶向多肽‑药物偶联衍生物、其制备方法及应用，所述肿瘤靶向多肽‑药物偶联衍生物包括靶向多肽、长效多肽和药物分子；其中，所述靶向多肽通过柔性连接肽连接在长效多肽的C端形成融合肽，所述融合肽作为所述药物分子的载体，所述药物载体与融合肽中的长效肽以化学键相连；所述长效多肽为与人血清白蛋白具有亲和相互作用的多肽或蛋白结构域。本发明肿瘤靶向多肽‑药物偶联衍生物可与人血清白蛋白结合，显著延长在血液循环系统中的保留半衰期，实现体内长效性，并可靶向并渗透进入肿瘤组织或细胞，然后在肿瘤组织微酸环境下或细胞内通过酸水解机制释放出游离效应分子，发挥更强的抗肿瘤效能。

Description

一种肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物、其制备方法及应用。

背景技术

恶性肿瘤是一种常见的、严重危及人类生命的疾病，其治疗一直是世界性难题。目前临床应用中的抗肿瘤药众多，但传统的化疗药物，如阿霉素(doxorubicin)、美登素(maytansine)澳瑞他汀(auristatin)和紫杉醇(paclitaxel)等，一般具有强烈的细胞毒性，在强效杀伤肿瘤细胞的同时，也会对人体的正常组织和细胞带来损害。此外，该类药物在细胞中的渗透能力弱、体内代谢过快等缺陷，大大降低了其疗效，使其在临床上的应用受到了很大限制。因此，科研人员一直致力于寻找增加药效及安全性的策略。随着分子生物学技术的发展及对肿瘤发病机制认识的深入，小分子药物靶向治疗已凭借其低毒、定向的优势逐步成为国内外抗肿瘤药物研发的热点，如抗体-药物偶联(antibody-drugconjugate)或蛋白-药物偶联(protein-drugconjugate)。

提高抗肿瘤药物的靶向性，除了通过与单抗偶联的方式之外，还可通过将药物与多种细胞渗透肽偶联的方式来实现。肿瘤细胞渗透肽(tumorcellpenetratingpeptide，TCPP)可与肿瘤表面高表达的特异性受体结合，通过受体介导的内吞作用，靶向并渗透进入肿瘤组织内部，降低在正常组织中的相对浓度,提高药物的有效性和降低不良反应。

董萍等在“神经纤毛蛋白-1与肿瘤的关系”(重庆医学2015年1月，第44卷第3期)公开了神经纤毛蛋白-1(NRP-1)受体在某些肿瘤中高表达，具有C 末端R/K-X-X-R/K(X为任意氨基酸)序列的细胞渗透肽能与NRP-1高效、特异性结合，并携带目标药物进入肿瘤细胞内部。其渗透机理为，此类细胞渗透肽因具备精氨酸或赖氨酸序列从而带正电荷，可与细胞磷脂膜上的负电荷相互作用，促进多肽及偶联药物穿膜进入细胞内部。

白蛋白是血浆中含量最为丰富的蛋白质，其由于分子量大，远超出肾小球滤过阈值，以及参与机体中的FcRn循环过程，因此具有长达15-19天的体内循环半衰期。基于白蛋白的长效递药策略是近年来研究的热点，其中，通过与白蛋白高亲和力结合的多肽作为长效机制的策略在大分子药物设计中被深入研究，如长效干扰素，粒细胞集落刺激因子等。这些与白蛋白具有高亲和力的多肽包括源自自然微生物天然蛋白序列筛选发现获得的结构域，如链球菌G蛋白中与白蛋白结合的结构域(albuminbindingdomain，ABD)以及人为设计改造获得的抗白蛋白抗体中抗原结合结构域(domainantibody，dAb)。通过噬菌体展示技术筛选出的多种ABD肽均具备白蛋白结合位点，且具有极高的白蛋白亲和性能，在毫微摩尔范围内即可与血浆白蛋白特异性结合，借助白蛋白在体内的长时循环，可间接延长偶联药物在体内的代谢时间，发挥长效作用。

因此，在本领域中期望能够得到一种既长效递药又具有靶向性的药物体系。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物、其制备方法及应用。该新型分子可有效将药物靶向并渗透入肿瘤内部，实现药物在肿瘤部位的高浓度富集，实现高效杀伤肿瘤细胞，同时其在体内的循环半衰期也得到了大大的延长。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物，其特征在于，所 述肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物包括靶向多肽、长效多肽和药物分子；

其中，所述靶向多肽通过柔性连接肽连接在长效多肽的C端形成融合肽，所述融合肽作为所述药物分子的载体，所述药物分子与融合肽中的长效多肽以化学键相连；

所述长效多肽为与人血清白蛋白具有亲和相互作用的多肽或蛋白结构域。

本发明通过将与白蛋白具有高亲和力的多肽和具有肿瘤细胞靶向渗透功能的短肽融合设计一种兼具长效和肿瘤细胞靶向渗透能力的融合多肽作为药物分子载体，将小分子药物或其衍生物与功能肽进行化学偶联，制备获得长效及肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物。

优选地，所述长效多肽的分子量为1-20kDa。

优选地，所述长效多肽的N末端的10个氨基酸中有半胱氨酸、赖氨酸或非天然氨基酸中的任意一种或至少两种的组合，优选半胱氨酸。

优选地，所述半胱氨酸的数量为1-3个，例如可以是1个、2个或3个。

优选地，所述赖氨酸的数量为0-3个，例如可以是0个、1个、2个或3个。

优选地，所述非天然氨基酸的数量为0-3个，例如可以是0个、1个、2个或3个。

优选地，所述长效多肽为链球菌G蛋白中与白蛋白结合结构域、抗白蛋白抗体抗原结合结构域、白蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述长效多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-4所示，

所述氨基酸序列如下：

SEQ ID NO.1：CGSLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP；

SEQ ID NO.2：LAEAKVLANRELDKYGVSDLYKNMINHASRVAAVKWSIDWILAALP；

SEQ ID NO.3：LALAKCRALRGLDHYGVSDYYKDLIDKAKTVEGVHALWPEILQALP；

SEQ ID NO.4：LARAKPIALEGLDNRGVSDYYKDLIDKAKTVEGVAALRREILAALP。

优选地，所述靶向多肽的结构通式为(R/K-X-Y-R/K)_n

其中，R为精氨酸，K为赖氨酸，X和Y为任意氨基酸，n为1-5范围内的自然整数。

优选地，所述靶向多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5-12所示，

所述氨基酸序列选自但不限于：RGDK(SEQ ID NO.5)、RNGR(SEQ ID NO.6)、RPARPAR(SEQ ID NO.7)、CRPPR(SEQ ID NO.8)、CGNKRTR(SEQ ID NO.9)、CGNKRTRGC(SEQ IDNO.10)、CRGDR(SEQ ID NO.11)或YGRKKRRQRRRC(SEQ ID NO.12)。

优选地，所述靶向多肽通过柔性连接肽连接在长效多肽的C端组成长效多肽-靶向多肽，所述长效多肽-靶向多肽通过多肽合成的方法和/或重组表达的方法获得，优选为重组表达的方法获得。

所述柔性连接肽的通式为(G_m-S)_i

其中，G为甘氨酸，S为丝氨酸，m和i独立地选自1-10范围内的自然整数，例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

优选地，所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.13-14所示，

所述氨基酸序列如下：

ABD-RGDK(SEQ ID NO.13)：CGSLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPGGGSGGGSGGGSSRGDK；

ABD-RPARPAR(SEQ ID NO.14)：CGSLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPGGGSGGGSGGGSSRPARPAR。

优选地，所述融合肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示，

所述核苷酸序列如下：

ABD-RGDK(SEQ ID NO.15)：GGTTGCGGTTCTCTGGCTGAAGCTAAAGTCCTGGCAAATCGTGAGCTGGACAAATATGGTGTGTCCGATTTCTACAAACGCCTGATCAACAAAGCGAAGACCGTTGAAGGTGTAGAAGCACTGAAACTGCACATTCTGGCCGCGCTGCCGGGTGGCGGTTCCGGTGGCGGCAGCGGCGGCGGTAGCTCTCGTGGCGACAAA；

ABD-RPARPAR(SEQ ID NO.16)：GGTTGCGGTTCTCTGGCTGAAGCTAAAGTCCTGGCAAATCGCGAGCTGGACAAGTATGGCGTGTCCGATTTCTACAAACGTCTGATCAACAAAGCGAAAACCGTAGAAGGTGTTGAAGCGCTGAAACTGCACATTCTGGCCGCGCTGCCTGGCGGTGGCTCCGGCGGCGGTAGCGGTGGCGGTTCTAGCCGTCCGGCACGCCCAGCTCGT。

优选地，所述药物分子为具有抑制作用和/或杀伤作用的小分子化合物。

优选地，所述药物分子的分子量不超过2000Da。

优选地，所述药物分子选自但不限于多柔比星衍生物(DOXO-EMCH衍生 物)、单甲基澳瑞他汀D衍生物(Mc-MMAD或Vc-MMAD)、单甲基澳瑞他汀E衍生物(Mc-MMAE或Vc-MMAE)、单甲基澳瑞他汀F衍生物(Mc-MMAF)或美登素(DM1)中的任意一种或至少两种的组合。

所述药物分子与融合肽中的长效多肽以化学键相连，所述相连是通过长效多肽N端序列氨基酸残基上的氨基和/或巯基形成稳定化学键进行连接。

本发明中，所述氨基酸可以是天然氨基酸即半胱氨酸或赖氨酸，也可以是非天然氨基酸。

优选地，所述N端序列氨基酸为N端的1-10个氨基酸。

优选地，所述的化学键选自但不限于碳硫单键(药物-C-S-多肽)、硫硫单键(药物-S-S-多肽)或碳氮单键(药物-C-NH-多肽)中的任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本发明提供了如第一方面所述的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)通过基因工程手段，将长效肽与靶向肽通过大肠杆菌工程菌进行融合表达，经过离子交换层析纯化，获得长效-靶向双功能的融合肽；

(2)将融合肽溶于偏碱性缓冲溶液中，将药物分子溶解于有机溶剂中，再将药物分子逐滴加入融合肽溶液中，温和搅拌，室温避光反应，离心去除沉淀，得到偶联粗产物；

(3)将步骤(2)得到的偶联粗产物通过凝胶过滤层析法分离纯化，去除未偶联的小分子，得到本申请肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物，冻干保存。

本发明中，以通过巯基或氨基偶联或/和引入控释化学键结构为目的的药物分子衍生物与融合肽的N-末端的半胱氨酸或赖氨酸残基进行偶联，形成偶联终产物。

优选地，步骤(2)所述偏碱性缓冲溶液的pH为8.5-9.5，例如可以是8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4或9.5。

优选地，步骤(2)所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和/或二甲基亚砜。

优选地，所述有机溶剂的体积分数为20-60％，例如可以是20％、21％、23％、25％、26％、28％、30％、31％、33％、35％、36％、38％、40％、42％、43％、45％、48％、50％、53％、55％、58％或60％，优选为25-50％。

优选地，步骤(2)所述药物分子逐滴加入融合肽溶液中，相对于1mL反应体系药物分子的滴加速度为30-50μL/min，例如可以是30μL/min、31μL/min、33μL/min、35μL/min、38μL/min、40μL/min、42μL/min、45μL/min、48μL/min或50μL/min。

优选地，所述融合肽与药物分子的摩尔比为1:(1-10)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。

优选地，步骤(2)所述避光反应的时间为1-8h，例如可以是1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h或8h。

优选地，步骤(3)所述凝胶过滤层析法中的层析柱为SephadexG25介质。

优选地，所述凝胶过滤层析法中的层析缓冲液为pH8.0的100mM NH₄HCO₃溶液和/或pH7.5的50mM PB溶液。

第三方面，本发明提供如第一方面所述的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明中的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物在靶向肽的辅助作用下，可以与肿瘤表面高表达的神经纤毛蛋白-1(NRP-1)受体特异性结合，从而靶向并渗透进入肿瘤组织内部，并且在酸性的肿瘤微环境下，衍生物结构中的pH值敏 感化学键(比如腙键)可特异性水解释放出游离阿霉素，杀伤肿瘤细胞，提高抗肿瘤疗效，此外，长效肽可高效亲和血浆中的白蛋白，借助白蛋白在体内的长效循环作用，间接延长药物半衰期，增长药物作用时间；

(2)本发明中的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物可有效靶向至肿瘤部位，高效抑制肿瘤生长，并大大延长药物代谢时间，选取神经纤维蛋白-1受体高表达的A549人非小细胞肺癌细胞作为细胞模型，Balb/C荷瘤裸鼠作为动物模型，偶联衍生物均可有效杀伤肿瘤细胞，并可特异性靶向至肿瘤部位，实现药物在肿瘤组织中的高浓度富集，显著抑制裸鼠瘤块的增长速率，同时药物毒性大为降低；

(3)本发明中的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物制备的优点在于工艺简单、易于操作、耗时较短，长效多肽-靶向肽自身具有良好水溶性好且结构稳定，对水溶性差的小分子药物能够起到增溶的效果，此外，以小分子量的多肽作为靶向肽和长效肽，有较好的亲和力及特异性，能更有效穿透到组织中，且不会引起机体的免疫反应，安全性强，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明长效多肽-靶向肽的融合肽(ABD-RAGK和ABD-RPARPAR)的构建目的基因序列鉴定和对应E.coli体系表达鉴定图谱，其中，图1(a)-(b)为基因电泳图谱，图1(c)-(d)为蛋白电泳图谱；

图2为本发明的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物的MALDI-TOF图谱，其中，图2(A)为ABD-RGDK-DOXO的MALDI-TOF；图2(B)为ABD-RPARPAR-DOXO的MALDI-TOF图；

图3为本发明的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物及游离DOX、DOXO-EMCH对A549细胞的生长抑制曲线；

图4为本发明的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物及游离DOX在A549细胞中的摄取量示意图；

图5为本发明的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物及游离DOX、DOXO-EMCH、空白对照PBS对移植瘤裸鼠体内活性测定示意图，其中，图5(A)为体重变化趋势图；图5(B)为肿瘤体积变化趋势图；图5(C)为肿瘤体重示意图；图5(D)为肿瘤大小示意图；

图6为本发明的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物及游离DOX、DOXO-EMCH在SD大鼠体内的药代动力学测定示意图；

图7为本发明的融合肽与人血清白蛋白在体内的结合示意图，其中，图7(A)为ABD-RGDK与HSA的结合图；图7(B)为ABD-RPARPAR与HSA的结合图；

图8为本发明的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：肿瘤靶向、长效双功能多肽ABD-RGDK和ABD-RPARPAR的制备方法

(1)构建氨基酸序列：

ABD-RGDK：CGSLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPGGGSGGGSGGGSSRGDK

ABD-RPARPAR：CGSLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPGGGSGGGSGGGSSRPARPAR

(2)核苷酸序列：

ABD-RGDK：GGTTGCGGTTCTCTGGCTGAAGCTAAAGTCCTGGCAAATCGTGAGCTGGACAAATATGGTGTGTCCGATTTCTACAAACGCCTGATCAACAAAGCGAAGACCGTTGAAGGTGTAGAAGCACTGAAACTGCACATTCTGGCCGCGCTGCCGGGTGGCGGTTCCGGTGGCGGCAGCGGCGGCGGTAGCTCTCGTGGCGACAAA

ABD-RPARPAR：GGTTGCGGTTCTCTGGCTGAAGCTAAAGTCCTGGCAAATCGCGAGCTGGACAAGTATGGCGTGTCCGATTTCTACAAACGTCTGATCAACAAAGCGAAAACCGTAGAAGGTGTTGAAGCGCTGAAACTGCACATTCTGGCCGCGCTGCCTGGCGGTGGCTCCGGCGGCGGTAGCGGTGGCGGTTCTAGCCGTCCGGCACGCCCAGCTCGT；

融合肽的电泳图如图1(a)-(b)所示；

(3)选用质粒类型为pET-30a，宿主菌为E.coliBL21株；

(4)微生物培养：使用LB培养基培养至OD600nm至3.0左右时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导目的基因表达蛋白，诱导3小时后，离心获得菌体，使用超声细胞破碎仪破碎获得上清液；

(5)目标蛋白纯化：使用CM-sepharose柱纯化ABD-RGDK和ABD-RPARPAR蛋白，层析条件50mM PB pH6.0稀释上清液后进行上样，上样结束后继续使用缓冲液淋洗至基线平稳后，使用0.5MNaCl，50mM PB pH6.0缓冲液洗脱，收集目标蛋白，检测波长280nm，目标蛋白如图1(c)-(d)所示。

实施例2：肿瘤靶向、长效双功能多肽-阿霉素衍生物的制备方法

(1)：ABD-RGDK-DOXO与ABD-RPARPAR-DOXO的合成：

ABD-RGDK-DOXO的合成：称取60mgABD-RGDK肽的冻干粉，溶于6mL pH8.5-9.5的100mM Na₂CO₃-NaHCO₃溶液中，再加入320μL 50mM的TCEP母液，室温还原20min，然后称取18.57mg DOXO-EMCH固体，于4mL DMF中充分溶解，再以30μL/min的速度滴加至多肽溶液中，温和搅拌，室温避光反应2-4h。最后于10000rpm，4℃离心5min，去除未反应的沉淀，既得ABD-RGDK-DOXO的粗产物。

ABD-RPARPAR-DOXO的合成：称取60mg ABD-RGDK肽的冻干粉，溶于6mL pH8.5-9.5的100Mm Na₂CO₃-NaHCO₃溶液中，再加入280μL 50mM的TCEP母液，室温还原20min，然后称取16.38mg DOXO-EMCH固体，于4mL DMF中充分溶解，再以30μL/min的速度滴加至多肽溶液中，温和搅拌，室温避光反应2-4h。最后于10000rpm，4℃离心5min，去除未反应的沉淀，既得ABD-RGDK-DOXO的粗产物。

(2)：ABD-RGDK-DOXO与ABD-RPARPAR-DOXO的分离纯化：

采用凝胶过滤层析法分离纯化，选用SephadexG25柱，层析buffer为100mMNH₄HCO₃pH8.0或50mM PB pH7.5，流速2mL/min,上样量500μL，收集脱盐峰1，去除未偶联小分子，既得终产物ABD-RGDK-DOXO或ABD-RPARPAR-DOXO，最后真空冻干，可得到红色粉末状终产物，-20℃保存。

ABD-RGDK-DOXO的结构式为：

ABD-RPARPAR-DOXO的结构式为：

(3)：ABD-RGDK-DOXO与ABD-RPARPAR-DOXO偶联终产物的鉴定：

将脱盐至100mM NH₄HCO₃中的ABD-RGDK-DOXO与ABD-RPARPAR-DOXO样品，与基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(简称CHCA)等体积混合，然后点板，待样品干燥后进行MALDI-TOF法鉴定偶联产物的分子量，以验证偶联产物的生成。结果如图2所示，可得出，峰3即为偶联终产物峰。由于偶联修饰率无法达到100％，峰1为未发生偶联的原蛋白峰。峰2则是由于MALDI-TOF酸性基质导致的酸水解产物峰。

实施例2：CCK8法测定偶联物对A549细胞毒性实验

选取生长状态良好的A549细胞，胰酶消化后，1200rpm离心去除胰酶，再 加入培养基稀释，调整细胞浓度为1×10⁵cells/mL，吹打均匀后将细胞悬液铺于96孔板，100μL/孔，即1×10⁴cells/孔。先置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h，使细胞贴壁，然后移除培养基，换为100μL含药培养基，药物分别为DOX、DOXO-EMCH、ABD-RGDK-DOXO、ABD-RPARPAR-DOXO，给药浓度范围为0.01-70uMDOXeqv，每组药物设置三个复孔，并设置空白对照组。药物作用60h后，吸除药物，PBS洗涤各孔三次，再加入100μL完全培养基及10μL CCK8溶液，作用2h后，酶标仪测定各孔吸收值，背景波长为630nm，测定波长为450nm。按照以下公式计算细胞活力：细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100％。

通过CCK8法测定各药物对A549细胞的细胞毒性作用，绘制细胞存活率曲线，如图2所示，可得出，DOX、DOXO-EMCH、ABD-RGDK-DOXO、ABD-RPARPAR-DOXO的IC50值分别为0.25±0.28μM、0.37±0.53μM、9.27±3.56μM、13.21±6.54μM。说明ABD-RGDK-DOXO与ABD-RPARPAR-DOXO的细胞毒性略低于DOX及DOXO-EMCH，安全性较好。

实施例3：肿瘤细胞对药物的摄取量

选取生长状态良好的A549细胞，胰酶消化后，铺于96孔板，铺板密度为4×10⁴cells/孔。将细胞于37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h，使细胞贴壁，然后移除培养基，换为100μL含药培养基，药物分别为DOX、ABD-RGDK-DOXO、ABD-RPARPAR-DOXO、ABD-RGDK-DOXO+RGDK肽、ABD-RPARPAR-DOXO+RPARPAR肽，给药浓度为20uMDOXeqv及500μM肽，每组药物设置三个复孔。药物分别作用1、2、8h后，吸除药物，PBS洗涤各孔三次，再加入100μLPBS，于荧光酶标仪测定各孔吸收值，激发波长为480nm， 发射波长为580nm。绘制细胞摄取荧光强度曲线，如图4所示，可得出，DOX的摄取量其略高于ABD-RGDK-DOXO及ABD-RPARPAR-DOXO，这是由于小分子量的DOX可通过快速简单扩散方式入胞，其速率远高于后者的受体介导的内吞作用入胞速率。此外，RGDK肽及RPARPAR肽可有效抑制相应偶联产物的摄取，这是由于多肽可与偶联产物竞争性结合肿瘤表面的NRP-1受体，间接说明了偶联产物与NRP-1受体的特异性作用。

实施例4：体内抗肿瘤活性

将对数期生长的A549细胞用PBS重悬至2×10⁷cells/mL，用一次性无菌注射器吸取100μL细胞悬液，注射至4周龄的Balb/C雄性裸鼠右前肢腋下，建立肿瘤裸鼠模型。待肿瘤体积长至150-200mm³,将肿瘤裸鼠随机分为五组，每组5只，分别皮下给药PBS、DOX、DOXO-EMCH、ABD-RGDK-DOXO及ABD-RPARPAR-DOXO，给药量为3mg/kg DOXeqv 4天/次，共4次，每两天测量各组肿瘤尺寸、称裸鼠体重，第20天处死裸鼠，剥取肿瘤组织，PBS洗涤后进行肿瘤称重并拍照。绘制各组裸鼠的体重、肿瘤体积变化曲线等，如图5所示。结果表明，ABD-RGDK-DOXO及ABD-RPARPAR-DOXO均可有效减缓肿瘤的增长，并且可有效避免体重速降，减少死亡率。

实施例5：药代动力学性质检测

选取体重约200g的雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为五组，每组3只。分别通过尾静脉注射PBS、DOX、DOXO-EMCH、ABD-RGDK-DOXO、ABD-RPARPAR-DOXO，给药量为5mg/kgDOXeqv。给药后，前三者分别于10min、20min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h，后两者分别于20min、45min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h眼眶取血0.5-0.6mL，分离血清。然后分 别将各组相应时间点的含药血清样品加入96孔板中，100μL/孔，于荧光酶标仪测定其吸收值(Ex＝480nm,Em＝580nm)，PBS组的血清样品为空白对照。此外，向空白血清中，精密加入梯度浓度的游离DOX，使含0.5、1、1.5、2、2.5、5、10、20、40μg/mL，以同样方法测定荧光吸收值，以浓度为横坐标，吸收值为纵坐标绘制标准曲线，即为上述各大鼠血样的定量方程。绘制不同药物组的药-时曲线，如图6所示，并计算各药物的t1/2及AUC如下表1所示。结果表明，ABD-RGDK-DOXO及ABD-RPARPAR-DOXO的半衰期可长达12-17h，较游离DOX与DOXO-EMCH大大延长。

表1

实施例6：功能肽与人血清白蛋白的体外结合性质验证

用20mMPB,pH7的缓冲液分别配制人血清白蛋白(HSA)母液50mg/mL，ABD-RGDK肽母液0.5mg/mL及ABD-RPARPAR肽母液0.5mg/mL。然后各取适量HSA母液与恒定体积的肽母液进行混合，使其摩尔比分别为：ABD-RGDK：HSA＝1:0,1:1,1:2,1:5,1:10；ABD-RPARPAR：HSA＝1:0,1:1,1:2,1:3,1:10，并以缓冲液补至同等体积，以保证各组的多肽终浓度均为0.2mg/mL。将HSA与多肽的混合样品置于室温放置40min，使之相互结合。然后，采用Peptide凝胶层析进行分析，层析buffer为20Mm PB，0.1M Na₂SO₄，pH7观察多肽峰的峰高是否降低。结果如图7所示，在ABD-RGDK：HSA＝1:5，ABD-RPARPAR：HSA＝1:2 的条件下，HSA即可与多肽结合完全。表明ABD融合渗透肽之后，仍然具备体外结合HSA的能力。据此可推测，该融合功能肽在体内仍可以与HSA结合，从而保持长效性能。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的载药聚合物纳米胶束及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物，其特征在于，所述肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物包括靶向多肽、长效多肽和药物分子；

其中，所述靶向多肽通过柔性连接肽连接在长效多肽的C端形成融合肽，所述融合肽作为所述药物分子的载体，所述药物分子与融合肽中的长效多肽以化学键相连；

所述长效多肽为与人血清白蛋白具有亲和相互作用的多肽或蛋白结构域。

2.根据权利要求1所述的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物，其特征在于，所述长效多肽的分子量为1-20kDa；

优选地，所述长效多肽的N末端的10个氨基酸中有半胱氨酸、赖氨酸或、非天然氨基酸中的任意一种或至少两种的组合，优选半胱氨酸；

优选地，所述半胱氨酸的数量为1-3个；

优选地，所述赖氨酸的数量为0-3个；

优选地，所述非天然氨基酸的数量为0-3个；

优选地，所述长效多肽为链球菌G蛋白中与白蛋白结合结构域、抗白蛋白抗体抗原结合结构域或白蛋白中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述长效多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。

3.根据权利要求1或2所述的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物，其特征在于，所述靶向多肽为与肿瘤组织的过表达受体具有亲合力的氨基酸序列配体；优选地，所述靶向多肽的氨基酸序列的结构通式为(R/K-X-Y-R/K)_n

其中，R为精氨酸，K为赖氨酸，X和Y为任意氨基酸，n为1-5范围内的自然整数；

优选地，所述靶向多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5-12所示。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物，其特征在于，所述靶向多肽通过柔性连接肽连接在长效多肽的C端组成长效多肽-靶向多肽的融合肽，所述长效多肽-靶向多肽通过多肽合成的方法和/或重组表达的方法获得，优选为重组表达的方法获得；

优选地，所述柔性连接肽的通式为(G_m-S)_i

其中，G为甘氨酸，S为丝氨酸，m和i独立地选自1-10范围内的自然整数；

优选地，所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.13-14所示；

优选地，所述融合肽的基因序列如SEQ ID NO.15-16所示。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物，其特征在于，所述药物分子为具有抑制作用和/或杀伤作用的小分子化合物；

优选地，所述药物分子的分子量不超过2000Da；

优选地，所述药物分子为多柔比星衍生物、单甲基澳瑞他汀D衍生物、单甲基澳瑞他汀E衍生物、单甲基澳瑞他汀F衍生物或美登素中的任意一种或至少两种的组合。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物，其特征在于，所述药物分子与融合肽中的长效多肽以化学键相连，所述相连是通过长效多肽N端序列氨基酸残基上的氨基和/或巯基形成稳定化学键进行连接；

优选地，所述N端序列氨基酸为N端的1-10个氨基酸；

优选地，所述的化学键为碳硫单键、硫硫单键或碳氮单键中的任意一种或至少两种的组合。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)通过基因工程手段，将长效肽与靶向肽通过大肠杆菌工程菌进行融合表达，经过离子交换层析纯化，获得长效-靶向双功能的融合肽；

(2)将融合肽溶于偏碱性缓冲溶液中，将药物分子溶解于有机溶剂中，再将药物分子逐滴加入融合肽溶液中，温和搅拌，室温避光反应，离心去除沉淀，得到偶联粗产物；

(3)将步骤(2)得到的偶联粗产物通过凝胶过滤层析法分离纯化，去除未偶联的小分子，得到本申请肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物，冻干保存。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述偏碱性缓冲溶液的pH为8.5-9.5；

优选地，步骤(2)所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和/或二甲基亚砜；

优选地，所述有机溶剂的体积分数为20-60％，优选为25-50％。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述药物分子逐滴加入融合肽溶液中，相对于1mL反应体系药物分子的滴加速度为30-50μL/min；

优选地，所述融合肽与药物分子的摩尔比为1:(1-10)；

优选地，步骤(2)所述避光反应的时间为1-8h；

优选地，步骤(3)所述凝胶过滤层析法中的层析柱为SephadexG25介质；

优选地，所述凝胶过滤层析法中的层析缓冲液为pH8.0的100mM NH₄HCO₃溶液和/或pH7.5的50mM PB溶液。

10.根据权利要求1-4中任一项所述的肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。