CN105985447B - 一种白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，它是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与白蛋白结合域的融合蛋白，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与白蛋白结合域通过连接子连接。本发明还公开了一种如核苷酸序列以及包括它的重组载体、重组菌，还公开了前述白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体的制备方法和用途。本发明通过基因工程的方式制备得到了白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其半衰期长，体内抗肿瘤活性强，临床应用前景良好。

Description

一种白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及 其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途。

背景技术

近年来，全球新发恶性肿瘤病人数量不断上升。由于治疗手段有限，恶性肿瘤已成为威胁人类生命的头号杀手。外科手术结合传统放、化疗方法，仍是目前肿瘤治疗的主要手段。传统放化疗手段最大的弊端在于缺乏选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也伤害大量正常细胞，长期使用毒副作用大。因此，迫切需要研发选择性高效抗肿瘤药物(Corti A et al.,Medicinal Research Reviews,2012,32:1078-1091)。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是一种具有高效选择性杀伤肿瘤细胞特性的蛋白。它通过肿瘤细胞表面的死亡受体DR4和DR5传递死亡信号，诱导肿瘤细胞凋亡。死亡受体DR4和DR5在肿瘤细胞表面高表达，在正常细胞表面低表达。不仅如此，正常细胞表面还高表达TRAIL诱骗受体DcR1和DcR2。TRAIL能与诱骗受体结合，但不传递死亡信号。因此，TRAIL在高效杀伤肿瘤细胞的同时，对多数正常细胞表现无毒或低毒，具有较强的肿瘤细胞杀伤选择性，是极具潜力的新型抗肿瘤药物(Stuckey D W,et al.,Trends in Molecular Medicine,2013,19(11):685-694；Ashkenazi A.,Nature Reviews Drug Discovery,2008,7(12):1001-1012.)。

作为新型候选抗肿瘤药物，基因工程重组表达的人可溶型TRAIL(human TRAIL，hTRAIL)目前已进入临床I-II期试验(Soria J C et al.,J Clin Oncol2011,29:4442-4451)。结果表明，hTRAIL具有良好的安全性，多种肿瘤病人对hTRAIL的治疗都有反应。但是，hTRAIL分子量较小(单体20KD左右)，在体内极易通过肾脏被清除，其在血浆中的半衰期小于30分钟(Xiang H,et al.Drug metabolism and disposition,2004,32(11):1230-1238.)。“半衰期短”这一特性极大地削弱了hTRAIL的体内抗肿瘤作用。因此，延长hTRAIL半衰期，提高其抗肿瘤效果已成为新的研究热点。

已有研究通过聚乙二醇(PEG)修饰和纳米颗粒包裹来延长hTRAIL半衰期(Chae SY,et al.Molecular cancer therapeutics,2010,9(6):1719-1729；Lim S M,etal.Biomaterials,2011,32(13):3538-3546)。越来越多的研究发现，利用血清白蛋白作为抗肿瘤药物载体除了可能延长半衰期外，还可能增加肿瘤的药物吸收。血清白蛋白是哺乳动物血清中含量最丰富的蛋白质，其可与FcRn受体结合。此外，白蛋白还可在肿瘤和炎症部位富集。因此，药物与白蛋白形成复合物后，不仅可能延长药物半衰期，还可能在肿瘤部位富集，进而增强抗肿瘤效果(Kratz F.Journal of Controlled Release,2014)。

制备hTRAIL-白蛋白复合物的方法包括：1)直接将hTRAIL与血清白蛋白偶联；2)将hTRAIL与白蛋白编码基因融合后重组表达(Müller N,et al.Biochemical andBiophysical Research Communications,2010,396(4):793-799)。直接偶联法要消耗大量白蛋白，将TRAIL与白蛋白基因融合后重组表达产量有限。而且，引入外源血清白蛋白，增加严重感染风险。

最新研究发现，将白蛋白结合域(Albumin-Binding Domain)与蛋白/肽类分子融合，可能让蛋白/肽类分子与内源性白蛋白结合，从而延长半衰期(Sleep D et al.,Biochimica et Biophysica Acta 1830(2013)5526–5534)。迄今为止，尚无利用这一方法延长TRAIL半衰期进而增强其抗肿瘤作用的报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途。

本发明白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，它是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与白蛋白结合域的融合蛋白，白蛋白结合域通过连接子连接在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的N末端。

其中，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或4所示。

其中，所述白蛋白结合域的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

其中，所述白蛋白结合域由SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列编码。

其中，所述连接子由2～20个氨基酸组成。优选地，所述连接子是(G4S)₃连接子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

其中，所述白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体由SEQ ID NO：9或11所示的核苷酸序列编码。其氨基酸序列如SEQ ID NO：10或12所示。

本发明还提供了一种核苷酸序列，它包括肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的编码序列与白蛋白结合域的编码序列，二者之间通过连接子的编码序列连接。

其中，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的编码序列如SEQ ID NO：1或3所示。

其中，所述白蛋白结合域编码序列如SEQ ID NO：5所示。

其中，所述连接子是(G4S)₃连接子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

其中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：9或11所示。

本发明还提供了前述核苷酸序列的重组载体或重组菌。

本发明还提供了一种制备前述白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体的方法，它是以前述核苷酸序列为目标片段，采用基因工程的方法制备得到的。

本发明还提供了前述白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体在制备治疗细胞增生性疾病的药物中的用途。

其中，所述治疗细胞增生性疾病的药物是治疗肿瘤或自身免疫性疾病的药物。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，它是以前述白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

目前，有研究通过将hTRAIL与人白蛋白HSA共价连接形成复合物来延长TRAIL半衰期增强抗肿瘤效果。但该方法要耗费大量HSA，且引入他人血液来源的HSA可能增加感染风险。本方法利用添加白蛋白结合域的方法，使TRAIL进入体内后利用内源性白蛋白延长半衰期而增强抗肿瘤效果，成本低，无感染风险。

虽然通过与白蛋白结合域连接制备融合蛋白是本领域提高目标蛋白药物半衰期的方法之一，但是构建得到半衰期延长同时药效活性增强的融合蛋白却并非易事，其关键的难点在于：与目标蛋白连接后白蛋白结合域本身可能会影响目标蛋白活性，同时改造后的目标蛋白与白蛋白结合后也可能对其活性有影响，而蛋白的结构复杂，蛋白和蛋白之间的相互作用规律也不清楚，因此，选择何种白蛋白结合域，连接在目标蛋白什么部位可以得到的半衰期延长同时药效活性优良的融合蛋白是不确定的，极有可能得到没有活性的融合蛋白。比如，本发明人前期筛选了一种白蛋白结合域SA21，将其与hTRAIL连接后并未明显延长hTRAIL半衰期；另外，将本发明筛选的白蛋白结合域ABD连接在hTRAIL C-末端，不仅未显著延长半衰期，还降低了hTRAIL的体内抗肿瘤活性。这些事实说明，通过添加白蛋白结合域的方式构建得到的半衰期延长同时抗肿瘤活性增强的融合蛋白并非易事。

然而，本发明通过选择特定的白蛋白结合域，并对其核苷酸序列进行了优化，同时在特定连接方式下，与TRAIL融合制备的融合蛋白，半衰期长，抗肿瘤活性优良，取得了意料不到的技术效果。

本发明通过基因工程的方式，制备得到了纯品白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体：ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL，与hTRAIL和mmTRAIL相比，它们的半衰期明显延长，同时体内抗肿瘤活性也明显增强，药效和药代动力学性能优良，临床应用前景良好。

附图说明

图1 ABD-hTRAIL纯化后SDS-PAGE凝胶电泳。M：蛋白质分子量标准；1：hTRAIL；2：ABD-hTRAIL

图2 ABD-mmTRAIL纯化后SDS-PAGE凝胶电泳。M：蛋白质分子量标准；1：ABD-mmTRAIL；2：mmTRAIL

图3 ABD-hTRAIL和hTRAIL与白蛋白结合能力比较。A:凝胶过滤法；B:酶标板法

图4 ABD-mmTRAIL和mmTRAIL与白蛋白结合能力比较。A:凝胶过滤法B:酶标板法

图5 白蛋白结合对ABD-hTRAIL细胞杀伤活性的影响

图6 白蛋白结合对ABD-mmTRAIL细胞杀伤活性的影响

图7 ABD-hTRAIL和hTRAIL的体内代谢速率比较

图8 ABD-mmTRAIL和mmTRAIL体内代谢速率比较

图9 ABD-hTRAIL和hTRAIL肿瘤摄入和组织分布比较。1:心，2:肝，3:脾，4:肺，5:肾，6:小肠，7:结肠，8:肌肉，9:脑，10:肿瘤

图10 ABD-mmTRAIL和mmTRAIL肿瘤摄入和组织分布比较。1:心，2:肝，3:脾，4:肺，5:肾，6:小肠，7:结肠，8:脑，9:肌肉，10:肿瘤

图11 ABD-hTRAIL与hTRAIL体内抗肿瘤效果比较(箭头指示给药时间)。A：治疗后瘤体生长曲线；B：治疗结束瘤体大小

图12 ABD-mmTRAIL和mmTRAIL体内抗肿瘤效果比较(箭头指示给药时间)。A：治疗后肿瘤生长曲线；B：治疗结束瘤体大小

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1本发明白蛋白结合型TRAIL变异体的制备

1、白蛋白结合型TRAIL变异体的设计和基因克隆

将白蛋白结合域(ABD)与hTRAIL或mmTRAIL连接，制备白蛋白结合型TRAIL变异体，ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL。

hTRAIL和mmTRAIL为人和猴全长TRAIL 114-281位氨基酸组成的片段。将ABD通过(G4S)3连接在hTRAIL或mmTRAIL N-末端，形成的融合蛋白分别命名为ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL。为方便克隆，融合蛋白编码基因两端分别添加BamHI和NotI酶切位点。基因委托南京金斯瑞公司合成。合成的基因经BamH/NotI双酶切后，琼脂糖凝胶回收DNA片段，再与同样经双酶切、胶回收的pQE30载体进行连接，连接产物转化克隆菌株TOP10。通过氨苄西林筛选(100μg/ml)和双酶切鉴定初步确定阳性单克隆菌株，DNA序列分析进一步验证阳性克隆。包含ABD-hTRAIL或ABD-mmTRAIL编码基因的质粒分别命名为pQE30-ABD-hTRAIL或pQE30-ABD-mmTRAIL。

表1本发明涉及氨基酸及核酸序列

2、白蛋白结合型TRAIL变异体的诱导表达和分离纯化

提取表达质粒，转化表达菌株M15，用含氨苄西林(100μg/ml)和卡那霉素(30μg/ml)LB平板培养基筛选得到阳性克隆菌株。将阳性克隆菌株接种于含相同抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡培养至菌液A₆₀₀达到0.5～1之间，加入0.05-1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。4小时后，离心收集菌体。获得的菌体用磷酸盐缓冲液(50mM，pH8.0)重悬。超声破菌后，离心(20000g，15min)收集上清。向上清液中加入Ni-NTA Super Flow凝胶，4℃缓慢振荡结合3h。将凝胶装柱，用40mM咪唑洗涤杂蛋白，再用300mM咪唑洗脱获得目的蛋白。纯化的蛋白用去内毒素试剂盒(南京金斯瑞公司)去除内毒素。

结果如图1和图2所示，hTRAIL和mmTRAIL分子量大约为20KD左右，融合ABD形成的白蛋白结合型TRAIL变异体，即ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL分子量均为25KD左右。

实验结果说明，本发明制备得到了白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1白蛋白结合型TRAIL变异体与人血清白蛋白的结合

1、试验方法

1)凝胶过滤法

将ABD-hTRAIL或ABD-mmTRAIL与人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)用含500mM NaCl的磷酸盐缓冲液(10mM Na₂HPO₄，2.68mM KCl，2mM KH₂PO₄)稀释至相同的摩尔浓度，然后等体积混合。室温结合10～30min后，将混合物样品上凝胶过滤柱Superdex 75(GEHealthcare)分析。用hTRAIL和mmTRAIL分别作为融合蛋白ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL的对照。

结果如图3A所示，hTRAIL与HSA混合(hTRAIL+HSA)后，凝胶过滤分析发现没有形成分子量明显大于HSA的复合物，提示hTRAIL没有与HSA结合。而ABD-hTRAIL与HSA混合(ABD-hTRAIL+HSA)后，形成的复合物分子量远远大于HSA，提示ABD-hTRAIL与HSA有结合。

相同条件下，如图4A所示，mmTRAIL与HSA的混合物在凝胶过滤柱上显示为双峰，分子量大小对应于HSA和mmTRAIL，提示mmTRAIL未与HSA结合。而ABD-mmTRAIL与HSA混合物主要成分分子量远远大于HSA，提示ABD-mmTRAIL与HSA结合。

2)酶标板法

用磷酸盐缓冲液PBS(137mM NaCl，10mM Na₂HPO₄，2.68mM KCl，2mM KH₂PO₄)溶解HSA至20mg/ml。向酶标板中加入HSA(100μl/孔)，4℃包被过夜。酶标板用PBS(200μl/孔)洗涤两次，再加入100μl不同浓度的融合蛋白。37℃孵育2h后，用PBST(PBS+0.075％吐温20)洗板4次，再加入小鼠抗TRAIL抗体孵育1h。PBST洗板后，再加入辣根过氧物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗进行孵育。最后用TMP底物显色，2M磷酸终止显色反应，酶标仪测定A_450nm。用hTRAIL和mmTRAIL作为对照。

2、试验结果

结果如图3B和4B所示，hTRAIL和mmTRAIL与HSA孵育后，用抗TRAIL抗体进行检测，颜色反应并不随蛋白浓度增高而变化。但是，随着ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL浓度的提高，A_450nm吸收值也相应升高。这一结果说明hTRAIL和mmTRAIL几乎不与HSA结合。而ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL与HSA能够结合。

实验结果说明，本发明制备得到的白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体：ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL，均具有白蛋白结合能力。

实验例2白蛋白结合型TRAIL变异体体外细胞杀伤活性

1、试验方法

将结肠癌Colo205细胞接种于RPMI 1640中，于37℃，5％CO₂条件下培养。ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL与has分别按摩尔比1:1混合，室温结合30-60min后加入细胞中(20000个/孔)。作用过夜后，再向孔中加入10ul CCK8测定细胞存活率。

2、试验结果

如图5和图6所示，ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL与蛋白结合后，对肿瘤细胞有杀伤作用。

实验结果说明，本发明制备得到的白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体：ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL，与白蛋白结合后均有肿瘤细胞杀伤活性，可用于体内抗肿瘤。

实验例3白蛋白结合型TRAIL变异体体内代谢

1、试验方法

将BALB/c小鼠分为两组。一组按10mg/kg尾静脉注射hTRAIL或mmTRAIL蛋白。另一组注射相同量的ABD-hTRAIL或ABD-mmTRAIL。注射后不同时间点取血，肝素抗凝，离心得小鼠血浆。再将小鼠血浆用RMPI1640培养基稀释25，50，100和250倍后，用Colo205细胞测定杀伤活性。通过血浆中残余蛋白活性的变化来监测蛋白体内代谢速度。

2、试验结果

结果如图7A和8A所示，hTRAIL和mmTRAIL代谢速率相似。静脉注射后，血浆中蛋白含量迅速下降。静脉注射4h后，即便血清只稀释25倍，也基本检测不到肿瘤细胞杀伤活性，提示此时hTRAIL和mmTRAIL蛋白在血浆里的残余量已经很少。图7B和8B显示，ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL在血浆内的代谢要慢得多。即便到48h，稀释250倍，仍能检测到血浆内残存蛋白对肿瘤细胞的杀伤。

以上结果表明，与hTRAIL和mmTRAIL相比，本发明制备得到的白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体：ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL，其在体内的代谢慢，半衰期长，在体内的存留时间长。

实验例4白蛋白结合型TRAIL变异体的肿瘤吸收和组织分布

1、试验方法

将ABD-hTRAIL和hTRAIL分别用CF750荧光染料进行标记。将5×10⁵个Colo205细胞(100μl)接种于裸鼠右后肢皮下，待瘤体生长到100-200mm³大小时，尾静脉注射给予50ug的CF750标记的蛋白，然后在第2，4，8，24h活体成像扫描，观察蛋白被肿瘤摄取的情况。最后一次扫描结束后(24h)，处死小鼠，取出脏器和组织进行扫描，检查蛋白的组织分布情况。

2、试验结果

如图9所示，静脉注射2h后，瘤体内即可检测到hTRAIL和ABD-hTRAIL。4-8h时，瘤体摄取hTRAIL量比2h有所增加。但24h时，瘤体内hTRAIL的量明显减少。与hTRAIL不同的是，4-8h期间，瘤体摄入的ABD-hTRAIL达到高峰，但24h后蛋白量并未明显减少。而且，相同时间点，瘤体摄取的ABD-hTRAIL含量比hTRAIL多。24h后取出小鼠组织扫描发现，肿瘤中ABD-hTRAIL含量明显比hTRAIL多。此外，两种蛋白主要分布在代谢器官肝和肾。与活体成像观察一致，组织器官扫描也证明ABD-hTRAIL比hTRAIL更易富集于肿瘤组织。

ABD-mmTRAIL和mmTRAIL被肿瘤的吸收和组织分布显示同样的规律。结果如图10所示，活体成像和组织分布都显示ABD-mmTRAIL比mmTRAIL更易富集于肿瘤组织。

试验结果说明，与hTRAIL和mmTRAIL相比，本发明制备得到的白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体：ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL的靶向性更强。

实验例5白蛋白结合型TRAIL变异体体内抗肿瘤效果

1、试验方法

将5×10⁵个Colo205细胞(100μl)接种于裸鼠右后肢皮下，随机分组。在接种后一定时间，尾静脉注射给予5mg/kg蛋白，对照组给予相同体积的PBS。每天测量记录肿瘤大小，并在24天时处死小鼠，取瘤体拍照。

2、试验结果

如图11所示，接种后第6天和第11天各给药一次，ABD-hTRAIL组肿瘤生长趋势比hTRAIL组明显延缓。到第24天时，PBS对照组，hTRAIL组和ABD-hTRAIL组瘤体的大小分别为：674.3±194.1mm³，546.1±265.1mm³和65.6+41.7mm³(图11A)。瘤体大小观察与生长曲线结果一致(图11B)。PBS对照组，hTRAIL组和ABD-hTRAIL组瘤体重量分别为0.367±0.06g，0.32±0.09g和0.016±0.02g。

图12结果显示，ABD-mmTRAIL与ABD-hTRAIL治疗结果相似。接种后第5天和第9天各给药1次，ABD-mmTRAIL组肿瘤生长明显比mmTRAIL治疗组缓慢。24天观察结束时，PBS对照，mmTRAIL组和ABD-mmTRAIL组瘤体大小分别为925.7±222.7mm³，642.4±194.5mm³和152.3±44.7mm³(图12A)。瘤体大小与肿瘤生长曲线结果一致(图12B)。PBS对照组，mmTRAIL组和ABD-mmTRAIL组瘤体平均重量分别为0.539±0.069g，0.341±0.089g，0.088+0.028g。

以上结果表明，与hTRAIL和mmTRAIL相比，本发明制备得到的白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体：ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL具有更强的体内抗肿瘤活性。

本发明通过基因工程的方式，制备得到了纯品白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体：ABD-hTRAIL和ABD-mmTRAIL，与hTRAIL和mmTRAIL相比，它们的半衰期明显延长，同时体内抗肿瘤活性也明显增强，药效和药代动力学性能优良，临床应用前景良好。

Claims (7)

1.一种白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：它是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与白蛋白结合域的融合蛋白，白蛋白结合域通过连接子连接在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的N末端；

所述白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体的氨基酸序列如SEQ IDNO：10或12所示。

2.根据权利要求1所述的白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：其由SEQ ID NO：9或11所示的核苷酸序列编码。

3.一种多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO：9或11所示。

4.包含权利要求3所述多核苷酸的重组载体或重组菌。

5.一种制备权利要求1或2所述白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体的方法，其特征在于：它是以权利要求3所述多核苷酸为目标片段，采用基因工程的方法制备得到的。

6.权利要求1或2所述白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

7.一种抗肿瘤药物，其特征在于：它是以权利要求1或2所述白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。