CN109453187A - 具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物制剂与临床药学领域，涉及一种具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物及其制备方法和应用。该抗体核酸药物偶联物具有A‑m‑X‑Y‑B所示结构，其中，A为抗体，X为通过短肽m与所述A共价连接的穿膜肽，Y为与所述X共价连接的柔性链段，B为与所述Y共价连接的核酸药物。本发明的抗体核酸药物偶联物具有普适性，可用作多种核酸药物传递系统，也为近一步的临床转化提供了理论支持和技术参考。此外，本发明的抗体核酸药物偶联物也可用作体外筛选药物。根据不同药物研究中体外筛选目的的不同，上述核酸偶联物可以作为阳性对照或阴性对照。

Description

具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于药物制剂与临床药学领域，更具体地，涉及一种具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
结肠癌作为常见恶性肿瘤，发病率居于全球第三位，每年新增136万病例，其中有超过五十万人死于结肠癌，占每年诊断的癌症病例的40％。结肠癌在中国的发病率低于欧美国家，但随着城市化进程的加快，其发病率有明显的增长趋势。目前结肠癌的治疗方式包括手术、冷冻疗法、化疗、放疗和靶向治疗。较高的术后复发率成为手术治疗结肠癌的主要障碍。在以化疗为主要策略的治疗过程中，利用不同的药物或联合用药来减少癌细胞分裂。但由于常规的化疗会将药物递送至非靶向部位，从而产生一系列毒副作用并最终导致耐药，迄今为止尚未取得满意的治疗结果。因此寻找到高效低毒的药物并构建合理的靶向递送体系是当前结肠癌治疗的发展方向。
自1998年RNA干扰(RNAi)技术被首次发现以来，以其高度特异性，分子靶向性，高效性在近二十年间迅猛发展。由于RNAi技术在癌基因沉默、协同增效放疗/化疗、促进凋亡、调控细胞周期、抗血管生成等方面均可发挥作用，siRNA药物在临床的实验及应用不断增加，涵盖的疾病包括原发性及转移癌症、眼部相关疾病、TTR相关淀粉样病变、血友病、高胆固醇血症等许多方面，其中，将裸siRNA应用于老年性黄斑变性眼局部治疗已被证明是成功的。截至2015年，共有2210个基因治疗临床试验已获批准，其中78.1％处于I或I/II阶段。但是由于siRNA本身的物理化学性质，如由于磷酸骨架所致的聚阴离子特性(约-40电荷)、分子量大(MW:1.3×104至1.5×104Da)等使其在全身给药后不易通过被动扩散方式进入细胞，此外核酸酶易感性、高免疫原性等特性使siRNA易被肾小球滤过后有效去除，导致血浆半衰期短于10分钟而难以发挥药效。这些问题部分地通过选用合理的载体来解决。
以穿膜肽(CPP)介导的siRNA递送是近年来研究较为火热的课题。穿膜肽是一类富含碱性氨基酸的短肽，通常具有5-30个氨基酸，能有效穿透细胞膜的脂质双分子层进入细胞，同时还可携带多种分子易位进入细胞内，细胞毒性小，效率高。最主要的一类CPP是从病毒中分离出来的，如源于人类免疫缺陷病毒HIV-1蛋白的Tat衍生肽，PenetratinTM，Transportan等在与siRNA结合后，被证实可以在缺乏转染试剂的情况下，成功转染细胞。考虑到穿膜肽的来源及获取时在应用上的限制，我们选取了源于天然鱼精蛋白酶解产生的低分子量鱼精蛋白(LMWP)，其序列中含有大量的精氨酸，已证实具有穿膜效应。同时LMWP毒性低，制备工艺简单，易于获取并可进行规模化生产，为siRNA递送提供了一个很好的选择。
当前CPP介导的siRNA递送主要通过两种策略，即通过电荷相互作用形成复合物或者通过共价偶联。大多数涉及CPPs的研究都采用了非共价结合的方法。非共价静电复合物的形成是技术上简单的方法，并且可以诱导有效的细胞内摄取。其中CPP和siRNA的电荷比对转运效果产生影响，在形成复合物时，通常需要较高电荷比，这就需要引入过量的CPP，然而体系中过高浓度的肽可能引起一系列的不良反应。相比而言，共价结合物的配制过程可以在均匀性和重复性方面得到很好的控制。但如何避免两者之间通过静电作用形成非共价的复合物是合成的关键。可以利用PEG独特的动态空间运动产生对带电分子的屏蔽效应来解决两者之间因静电作用产生的聚集。由于CPP的趋核性以及RNA在细胞质中诱导沉默复合体机制的特性，使得连接CPP与siRNA分子的共价键在细胞环境内必须是可逆的，故引入可被胞浆中的谷胱甘肽降解的二硫键，以保证siRNA在胞浆中释放发挥沉默效果。经实验验证，以CPP介导的共价化合物的转运效率高于物理混合物及单纯药物，具有显著的基因沉默活性。但是，以CPP介导的siRNA递送的一个主要问题是CPP在透膜过程中无靶向性，由于CPP的高渗透性，静脉注射后的穿膜肽可迅速渗透进入富血供的各主要器官和组织(如心脏、肝脏等)。研究显示，穿膜肽修饰后由于组织穿透性增强，导致药物在各组织中的非特异性分布进一步增加。故而CPP不能将siRNA特异性地递送到靶细胞。
基于此，需采取主动靶向策略优先增强siRNA在肿瘤部位或特定细胞类型的积聚，可使其有在较低剂量下有效，并能降低非靶组织的毒性。针对肿瘤(肿瘤微环境或肿瘤细胞)中仅表达或至少过度表达的酶及其特有的受体，在递送系统中引入靶向的配体，如单克隆抗体。单克隆抗体可能是合适的siRNA载体，siRNA与单克隆抗体及抗体片段的偶联或形成复合增加了siRNA递送的特异性并使脱靶效应最小化，同时在体循环期间保持优越的稳定性。基于单克隆抗体的疗法在过去10至15年内对多种癌症类型的疗法有显着改善。针对EGFR家族的抗体的突出实例包括用于乳腺癌治疗的曲妥珠单抗和培妥珠单抗以及用于结直肠癌的西妥昔单抗或帕尼单抗。西妥昔单抗是结肠癌中已确立且有效的治疗方法，其在KRAS野生型结肠癌中的用途提高了响应率和作为单一疗法的存活率，特别是与化疗联合。不幸的是，含有某些RAS突变的结肠癌细胞对西妥昔单抗高度耐药，即使在用其治疗后存活率仍旧偏低。
在采取主动引入靶向配体的同时，肿瘤微环境如肿瘤酶、酸碱度、氧化-还原梯度等也可以为靶向递送提供条件。它富含蛋白水解活性，酸性且低氧；提供了蛋白酶活性转化为有效的细胞毒性药物的有利环境。前体药物在肿瘤细胞外微环境中的靶向激活，减少选择缺乏靶酶表达的肿瘤细胞的压力，从而增强肿瘤破坏的安全性和功效。作为潜在的分子靶点，legumain被证实在多种肿瘤如结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、一些中枢神经系统肿瘤等肿瘤血管生成内皮细胞表面高度表达，但在癌旁和其他的正常组织细胞表面则未见表达。作为半胱氨酸蛋白酶C13家族的一个独特的新的成员，legumain具有严格的底物切割特异性——严格要求底物的P1位点为天冬酰胺。它只在酸性条件下，如肿瘤微环境、酸性细胞器中发挥其内肽酶活性，因此，legumain在肿瘤细胞外的肿瘤微环境中可以保持活性。严格的底物特异性与各种肿瘤类型的过度表达相结合，促使开发legumain成为癌症治疗中的前药激活剂，即药物在未定靶前将保持非激活状态而不会引起全身毒性，并且只在靶部位特异性的激活因子的作用下才会被激活。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物及其制备方法，以解决目前癌症化学治疗因靶向性缺乏导致的药物在靶区的浓度过低、药物自身的效力低、大分子药物难以透过细胞膜导致细胞摄取不足、以及药物对正常组织具有毒性的问题。
为了实现上述目的，本发明提供一种具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物，该抗体核酸药物偶联物具有A-m-X-Y-B所示结构，其中，A为抗体，X为通过短肽m与所述A共价连接的穿膜肽，Y为与所述X共价连接的柔性链段，B为与所述Y共价连接的核酸药物。
本发明的抗体核酸药物偶联物的结构如图1所示。所构建的递药体系中抗体可高效靶向癌细胞(如，当抗体为西妥昔单抗时可靶向结肠癌细胞)，同时因其空间位阻作用产生“前药”保护效果，暂时封闭了穿膜肽(如LMWP)穿透肿瘤组织的功能，而肿瘤细胞表面特异性酶(如Legumain)可作为激活因子，切断与其对应的Linker，释放出siRNA-LMWP，重新激活穿膜肽的细胞渗透性能。
根据本发明，所述短肽m优选含有肿瘤细胞表面特异性酶的底物序列。所述肿瘤细胞表面特异性酶是指在肿瘤细胞表面的存在量远高于正常细胞的酶，其可为本领域任何已知的具有上述特征的酶，具体地，所述肿瘤细胞表面特异性酶为legumain酶或MMP家族酶，所述短肽m为AANL、AAA、GLTGALPAAPTIL、HSAAVPTAATTA、IHTAAHV、GGLAGIP或含有MMP家族酶的底物序列的短肽；所述MMP家族酶优选包括MMP-1酶、MMP-2酶、MMP-3酶、MMP-7酶、MMP-8酶、MMP-9酶、MMP-11酶、MMP-12酶、MMP-13酶、MMP-14酶、MMP-15酶、MMP-16酶、MMP-17酶、MMP-19酶、MMP-20酶、MMP-24酶、MMP-25酶、MMP-26酶、MMP-28酶；所述含有MMP家族酶的底物序列的短肽优选为RWTNNFREY；GGPLGVR、SLAYYTAA、HMHAALTA、HMHKALTA、ESLAYYTA、RSLSRLTA、NRYSSLTA；PEELKFQ、HHLGGAKQ；KVYLSEXKTG、VVLLPNVETP、PVVLLPNVE；TEGEARGS；GPKGVYSL、GLAGQR、GLOGER、GPFGFKSL；GGYAELRMGG；AVVASELRCQC；SGRIGFLRTA；MLPLGLDAA；KANLRRRRKR；KFHIRRKR；RRRRQAP；TLKYLLLG；YEPMGGWLHHQI；RRRRNKR；AGLVRRRRR；PVAVSQS；RRKKR。
根据本发明，所述抗体为靶向肿瘤细胞的抗体，优选为西妥昔单抗、纳武单抗、派姆单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、曲妥珠单抗、阿达卡莫单抗。
本发明中，柔性链段是指在水溶液中具有良好的溶解性和延展性的线性结构的高分子聚合物链段。中性聚合物是指当聚合物溶解于水环境中时，该聚合物水溶液的pH值为中性的聚合物。
本发明的抗体核酸药物偶联物中，柔性链段能够在物理空间上间隔核酸药物和穿膜肽，进而阻止强电负性的核酸药物与呈正电性的穿膜肽之间相互吸引形成发夹结构，从而避免核酸药物进入细胞质内后形成包涵体或者聚集沉淀而抑制核酸药物在胞内的生物活性。因而，任何能够起到间隔作用的柔性链段均适用于本发明，只要能够递送核酸药物到细胞内，并且使核酸药物在胞质内的目的位置发挥相应的生物学活性即可。
在本发明一种优选的实施例中，该柔性链段为具有较弱电解能力的中性聚合物形成的线性结构的高分子链段。呈电中性能够避免所增加的柔性链段与强电负性的核酸药物相互作用而形成发夹结构影响核酸药物的活性。选择直链的柔性链段更有利于在一定程度上屏蔽穿膜肽表面的正电荷以及保持良好的分子动力学性能，同时维持核酸偶联物结构和构象上的专一性和稳定性。比较适合的柔性链段可以是常用的聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯以及聚丙烯酰胺中的任一种去除端部基团后所形成的链段。选择这些中性聚合物所形成的柔性链段具有较好分子动力学特征和对穿膜肽表面正电荷的屏蔽效果好的优点。
在上述优选实施例中，柔性链段的分子量的大小可以根据所递送的核酸药物的具体种类、穿膜肽的具体种类以及两者所带电荷的强弱差异而进行合理调整，以达到隔离电荷之间的相互作用为准。在本发明另一种优选的实施例中，柔性链段的分子量为1000～10000，更优选为2000～5000。分子量过小的物理隔离作用相对较弱，分子量过大容易对穿膜效率造成不利影响。而分子量在上述范围内的柔性链既能满足隔离穿膜肽与核酸药物之间的电荷作用，又不影响穿膜效率，因而，既能满足核酸药物被递送入细胞内，又利于核酸药物在细胞质内发挥相应的药物活性。
在本发明的上述药物中，连接核酸药物与柔性链的共价键可以根据所欲递送的核酸药物在胞内发挥药效作用的目的场所的不同而进行合理选择，只要是能够将核酸药物递送至细胞内的目的位置的共价键均适用于本发明。在本发明一种优选的实施例中，连接核酸药物与柔性链的共价键Z包括二硫键、腙键、酰胺键、酯键或醚键。其中，上述二硫键在细胞质内更容易被还原形成巯基，腙键更容易在酸性条件下水解断裂而释放核酸药物，因而使用上述两种共价键更容易在细胞质内断裂，使所携带的核酸药物在细胞质内发挥药效作用。酰胺键、酯键或醚键形成的共价键相对比较稳定，能够使核酸药物在穿膜肽的引导下穿过细胞膜后，经过细胞质进入细胞核内发挥作用。所述短肽m与所述A共价连接的共价键以及所述Y与所述X共价连接的共价键也可根据需要选择，优选地，所述短肽m与所述A共价连接的共价键包括二硫键、腙键、酰胺键、酯键或醚键；所述Y与所述X共价连接的共价键包括二硫键、腙键、酰胺键、酯键或醚键。
在本发明的上述药物中，核酸药物可以是现有的各种核酸药物，包括核苷酸单体或寡聚核苷酸，优选寡聚核苷酸为非取代的寡核苷酸或取代的寡核苷酸，取代的寡核苷酸为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，非取代的寡核苷酸选自锁核酸、siRNA、microRNA、核酸适体、肽核酸、诱骗ODN、催化性RNA以及CpG二核苷酸中的任意一种；优选寡聚核苷酸为长度为19～23bp的siRNA。更优选地，这些19～23bp的siRNA可为中国专利申请CN201610083905.9中表1和表2中的序列中的任意一种(序列表中所示序列为各siRNA的反义链)在临床上具有重要意义的siRNA。
上述各种核酸药物的主体结构中都含有磷酸骨架，与蛋白质药物相比，都是电负性比较强的药物。与能够通过直接与穿膜肽共价结合而实现胞内递送且不影响药物活性的蛋白质药物相比，核酸药物无法通过同样的与穿膜肽的共价结合而实现胞内递送且不影响药物活性。上述核酸药物中的核苷酸单体包括四种脱氧核糖核苷酸单体和四种核糖核苷酸单体。
在本发明的上述药物中，穿膜肽根据不同的核酸药物，可以从如下穿膜肽中合理选择其中的任意一种：LMWP(Low Molecular Weight Protein，低分子量蛋白)、Tat48-60、Tat48–60-P10、CAI、HIV-TAT、MAP、MPGα、M918、R6Pen、penetratin、Pep-1-K、ARF1-22、Tp10、POD、3-100个赖氨酸残基组成的聚赖氨酸以及4～9个精氨酸残基组成的聚精氨酸；优选聚精氨酸为8个精氨酸残基组成的聚精氨酸R8。上述穿膜肽与CN 105727304 A中相应名称的氨基酸序列一致，CN 105727304 A公开的内容全部引入本发明作为参考。
上述各种穿膜肽分别具有良好的入胞能力，因而都适用于核酸药物的细胞内递送。其中，LMWP具有易于制备、成本低廉以及卓越的穿膜能力等更优异的性能，因而，更优选穿膜肽为LMWP。
对于本发明的上述药物，由于具有较高的细胞膜穿透性，且在细胞内核酸药物也具有很高的生物利用度。而该药物作为药物的一种形式，可适应药物的各种给药途径，包括但不仅限于静脉注射、皮下注射、黏膜给药或者经皮给药；黏膜给药包括鼻腔黏膜、口腔黏膜、直肠黏膜和阴道黏膜中的任意一种。
根据上述实际给药途径的不同，上述药物还可以制备成各种合适的给药剂型，包括但不仅限于针剂、喷雾剂、涂抹剂、生物可降解的包埋剂、凝胶剂、膜剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、脂质体、透皮贴剂、栓剂、冻干粉针剂、或贴片等。
本发明的第二方面提供上述核酸偶联物的制备方法，所述制备方法包括：
融合肽的活化步骤，将穿膜肽与m的融合肽的N端或C端特异性地与柔性链段进行共价结合，得到活化的融合肽；
核酸药物的活化步骤，在所述核酸药物反义链的3’端或者正义链的任意一端引入不同于磷酸基团或羟基基团的反应活性基团，得到活化的核酸药物；
第一共价连接步骤，将所述活化的融合肽与所述活化的核酸药物通过亲核反应或亲电加成反应得到所述核酸药物与融合肽的偶联物；
核酸药物与融合肽的偶联物的活化步骤，在所述核酸药物与融合肽的偶联物的融合肽一端引入抗体反应基团，得到活化的核酸药物与融合肽的偶联物；
第二共价连接步骤，将所述活化的核酸药物与融合肽的偶联物与抗体反应，得到所述核酸偶联物。
通过引入双官能团PEG衍生物将穿膜肽与siRNA共价偶联，形成还原酶敏感siRNA-LMWP的前体药物。具体而言在LMWP与legumain特异性酶切的底物短肽(AANL)的连接方式上，本发明首先将两者制成融合肽，而后在制备含穿膜肽的融合肽-核酸偶联物时，选用OPSS-PEG-NHS作为原料，OPSS-PEG-NHS与LMWP-AANL的氨基反应后生成的OPSS-PEG-LMWP-AANL可直接与巯基化的siRNA反应得到siRNA-LMWP-AANL。在此基础上，利用癌细胞表面过表达的Legumain酶的底物肽(Linker)连接该前体药物与抗体，即通过EDC/NHS活化前体药物Linker部位C端羧基与抗体上的氨基形成具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物。
在合成偶联物的过程中同时进行siRNA-LMWP-AANL-Antibody的纯化。首先LMWP-AANL与NHS-PEG-OPSS反应后，通过肝素亲和层析柱的纯化得到PEG-LMWP-AANL。PEG-LMWP-AANL与siRNA反应后，通过阴离子交换柱纯化得到单一的产物siRNA-PEG-LMWP-AANL。抗体在使用之前首先经过脱盐柱的纯化，以除去溶液中甘氨酸、聚山梨酯80等辅料成分，减少反应副产物的产生。纯化后的抗体用于偶联物的合成，利用反应产物与反应物siRNA-PEG-LMWP-AANL及Antibody之间分子量的差异采用脱盐柱进行纯化，从而得到最终的偶联产物siRNA-LMWP-AANL-Antibody。
应用本发明的技术方案，可实现核酸药物靶向递送及定点释放，同时以穿膜肽改善大分子药物透膜性能，提高其生物利用度，保障核酸药物治疗肿瘤的高效性及减少递送过程中对非靶组织的毒性。
本发明的抗体核酸药物偶联物具有普适性，可用作多种核酸药物传递系统，也为近一步的临床转化提供了理论支持和技术参考。此外，本发明的抗体核酸药物偶联物也可用作体外筛选药物。根据不同药物研究中体外筛选目的的不同，上述核酸偶联物可以作为阳性对照或阴性对照。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为本发明的双重酶敏感的前药型抗体靶向递药体系siRNA-LMWP-AANL-Antibody的结构示意图。
图2为本发明的双重酶敏感的前药型抗体靶向递药体系合成路线图。
图3为Legumain酶敏感的前药型抗体靶向递药体系纯化谱图；其中图3A代表肝素柱纯化PEG-LMWP-AANL所得到的FPLC图谱；图3B代表离子交换DEAE柱纯化siRNA-PEG-LMWP-AANL所得到的FPLC图谱；图3C代表脱盐柱纯化抗体所得到的FPLC图谱；图3D代表脱盐柱纯化siRNA-LMWP-AANL-Antibody偶联物所得到的FPLC图谱。
图4为siRNA-LMWP-AANL-Antibody偶联物以及siRNA-LMWP-AANL与Antibody物理混合物经脱盐柱后所得的FPLC色谱图。
图5为Legumain酶敏感的前药型抗体靶向递药体系的偶联物的琼脂糖电泳表征图。其中1代表核酸标准物(Marker)；2代表siRNA；3代表siRNA-PEG-LMWP-AANL；4代表抗体(Antibody)；5代表siRNA-LMWP-AANL与Antibody物理混合物；6代表siRNA-LMWP-AANL-Antibody体系脱盐柱纯化后出峰；7代表siRNA-LMWP-AANL-Antibody体系脱盐柱纯化前出峰。
图6为琼脂糖凝胶法评价在血清中递药体系对siRNA的保护作用。
图7为西妥昔单抗靶向性验证及“前药”siRNA-LMWP-AANL细胞摄取性能考察。
图8为评价抗体内化功能细胞流式分析图。
图9示出了各细胞legumain表达量。其中图9A是各细胞裂解物中的酶原legumain(约56kDa)和活性legumain(约36kDa)的蛋白质印迹分析；图9B是legumain表达量半定量分析结果。
图10是CoCl2·6H2O模拟缺氧条件刺激肿瘤酶legumain的表达情况。其中图10A经不同浓度CoCl2·6H2O诱导刺激后，HCT116细胞裂解物中的酶原legumain(约56kDa)和活性legumain(约36kDa)的蛋白质印迹分析；图10B是HCT116细胞裂解物中legumain表达量半定量分析结果；图10C是经不同浓度CoCl2·6H2O诱导刺激后SW620细胞裂解物中的酶原legumain(约56kDa)和活性legumain(约36kDa)的蛋白质印迹分析；图10D是SW620细胞裂解物中legumain表达量半定量分析结果，其中，control为对照组，CoCl2·6H2O浓度为0mM。
图11是Legumain型药物递送体系在不同细胞的激活情况。
图12是不同制剂组对稳定转染EGFP的HCT116细胞的体外基因沉默效果。图12A是EGFP-HCT116细胞激光扫描共聚焦图像。图12B是共聚焦图像的荧光强度，所显示的值表示平均值±标准差(n＝3，**P<0.01，***P<0.001)。其中各制剂组分别为：(1)PBS；(2)游离的siRNA；(3)LMWP-AANL和siRNA的物理混合物(摩尔比为1:1)；(4)Lipofecter和siRNA复合物；(5)siRNA-S-S-PEG-LMWP偶联物；(6)siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL-cetuximab偶联物。
图13是不同制剂组对稳定转染EGFP的HCT116细胞的体外基因沉默效果的蛋白印记分析。不同制剂组分别为：(1)PBS；(2)游离抗EGFP siRNA；(3)LMWP-AANL和siRNA物理混合物；(4)siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL偶联物；(5)-(7)siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL-cetuximab偶联物；(8)Lipo6000和siRNA物理混合物。
图14是MMP-2酶敏感的前药型抗体靶向递药体系合成纯化流程图。
图15是MMP-2酶敏感的前药型抗体靶向递药体系纯化谱图。其中图15A是肝素柱纯化PEG-LMWP-GGPLGVR所得到的FPLC图谱；图15B是离子交换DEAE柱纯化siRNA-PEG-LMWP-GGPLGVR所得到的FPLC图谱；图15C是脱盐柱纯化siRNA-LMWP-GGPLGVR-Antibody偶联物所得到的FPLC图谱。图15D是MMP-2酶敏感的前药型抗体靶向递药体系的琼脂糖电泳表征。其中1代表20bp marker；2代表游离siRNA；3代表siRNA-PEG-LMWP-GGPLGVR；4代表Antibody；5代表siRNA-LMWP-GGPLGVR与Antibody物理混合物；6代表siRNA-LMWP-GGPLGVR-Antibody体系。
图16是MMP-2酶敏感的前药型抗体靶向递药体系在不同细胞的激活情况。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。由于核苷酸单体与寡居核苷酸都具有电负性，区别就在于核苷酸数目的不同，而核苷酸数目的多少对于合成具有柔性链段共价连接核酸药物与穿膜肽的药物来说并无影响，步骤都是相同的。因此，下面以siRNA(5’-GGCUACGUCCAGGAGCGCAdTdT-3’(SEQ ID NO:1)和3’-UGCGCUCCUGGACGUAGCCdTdT-5’(SEQ ID NO:2))为例来进一步说明与载体连接的药物的制备方法及其在药物活性方面的效果。以下实施例中，所用到的试剂或药品，除特殊说明外，均来自于北京索莱宝生物科技有限公司。下列实施例中的LMWP发明人自制的序列如SEQ IDNO:1所示的低分子量蛋白。以下实施例中，Antibody代表西妥昔单抗。
实施例1
Legumain前药型抗体靶向递药体系siRNA-LMWP-AANL-Antibody(siRNA-LMWP-AANL-cetuximab)的合成。合成路线如图2所示。
首先制备含穿膜肽的融合肽-核酸偶联物：取10mg LMWP-AANL溶于适量缓冲液(20mM NaH2PO4，pH＝6.9)置于20mL西林瓶中，称取74mg OPSS-PEG-NHS(其中n为5)溶于无水DMSO中，待其完全溶解后逐滴加入西林瓶中。将西林瓶置于摇床中，25℃220rpm反应6h，肝素柱纯化反应溶液，得到OPSS-PEG-LMWP-AANL溶液。
取5nmol巯基化的siRNA溶于适量缓冲液(20mM NaH2PO4，1mM EDTA，pH＝6.9)中，再将上述得到的OPSS-PEG-LMWP-AANL溶液快速滴加到含有siRNA的缓冲液中，40℃220rpm反应1h，DEAE柱纯化得到siRNA-PEG-LMWP-AANL。
取适量EDC和sulfo-NHS溶于适量MES缓冲溶液，逐滴滴加入到纯化后的siRNA-PEG-LMWP-AANL溶液中，25℃反应30min。用截留MW 3000的超滤离心管纯化反应溶液。
将脱盐柱纯化后的西妥昔单抗置于西林瓶中，逐滴滴加上一步中所得的超滤后的siRNA-PEG-LMWP-AANL溶液，4℃80rpm反应2h。脱盐柱纯化所得反应液得到siRNA-LMWP-AANL-Antibody偶联物。纯化后的溶液超滤脱盐后冻干备用。
实施例2
Legumain前药型抗体靶向递药体系siRNA-LMWP-AANL-Antibody的纯化。
LMWP-AANL与NHS-PEG-OPSS反应后，产物PEG-LMWP-AANL通过肝素柱进行纯化，用以除去未反应的LMWP-AANL。纯化过程中使用的低盐流动相为20mM NaH2PO4(pH＝6.9)，高盐流动相为20mM NaH2PO4，2M NaCl(pH＝6.9)。在215nm检测波长，1ml/min流速的条件下，0-100％高盐流动相的线性梯度洗脱纯化获得PEG-LMWP-AANL化合物。
PEG-LMWP-AANL与siRNA反应后，通过阴离子交换柱DEAE柱纯化得到单一的产物siRNA-PEG-LMWP-AANL。分离条件如下：低盐流动相为20mM NaH2PO4，1mM EDTA，高盐流动相为20mM NaH2PO4，1mM EDTA，1M NaCl。检测波长为260nm，流速为1ml/min。0-70％高盐流动相的线性梯度洗脱。
在采用EDC和sulfo-NHS对siRNA-PEG-LMWP-AANL的羧基活化后，使用截留MW 3000的超滤离心管纯化反应溶液以除去过量的EDC和sulfo-NHS。同时通过脱盐柱对市售抗体进行纯化。纯化过程中使用PBS作为平衡溶液和洗脱溶液，检测波长为280nm，流速为2ml/min。纯化后的siRNA-PEG-LMWP-AANL和抗体反应后，仍旧采用脱盐柱进行纯化，其分离条件与纯化抗体相似，仅把检测波长调整为260nm。
递药体系的纯化结果如图3所示，其中图3A是肝素柱纯化PEG-LMWP-AANL所得到的FPLC图谱；图3B是离子交换DEAE柱纯化siRNA-PEG-LMWP-AANL所得到的FPLC图谱；图3C是脱盐柱纯化抗体所得到的FPLC图谱；图3D是脱盐柱纯化siRNA-LMWP-AANL-Antibody偶联物所得到的FPLC图谱。
使用肝素亲和层析柱对PEG(OPSS)-LMWP-AANL纯化，PEG(OPSS)-LMWP-AANL在0.9MNaCl处被洗脱下来，融合肽LMWP-AANL则在1.2M NaCl处被洗脱下来。通过峰面积定量计算PEG(OPSS)-LMWP-AANL的产率约为50％。DEAE柱纯化以融合肽制成的前体药物siRNA-PEG(OPSS)-LMWP-AANL时，前体药物在0.3M NaCl处被洗脱下来，副产物siRNA-S-S-siRNA则在0.5M NaCl处被洗脱下来。通过对纯化后siRNA-PEG(OPSS)-LMWP-AANL样品与初始投入的siRNA的浓度进行比较，计算siRNA-PEG(OPSS)-LMWP-AANL产率约为46％。西妥昔单抗分子量约为150KDa，医用制剂中所添加的小分子辅料经过脱盐柱除去，纯化的抗体在2min左右被洗脱出来。反应后最终偶联物经脱盐柱纯化后在3min左右被洗脱出来。
实施例3
Legumain前药型抗体靶向递药体系siRNA-LMWP-AANL-Antibody的表征。
3.1色谱检测
如图4所示，通过脱盐柱纯化后，siRNA-PEG-LMWP-AANL和Antibody反应后的溶液分别在3ml左右和8ml右洗脱出峰，而siRNA-LMWP-AANL与Antibody物理混合物仅在3ml左右洗脱且与前样品中的前出峰位置相同。依据上述色谱行为，可初步判断合成产物为siRNA-LMWP-AANL-Antibody体系。
3.2琼脂糖凝胶电泳检测
在上述色谱结果的支持下，利用琼脂糖凝胶电泳法进一步对合成产物进行表征。结果如图5所示，与siRNA相比，siRNA-PEG-LMWP-AANL由于连接了带有正电荷的LMWP-AANL，使其暴露的负电荷较少，同时连有长链分子PEG的作用使得偶联物的泳动性质较siRNA相差较大，故其条带出现在分子量较大的位置，呈弥散状。而siRNA-LMWP-AANL-Antibody体系组相比于抗体，由于连接了带有负电荷的siRNA-PEG-LMWP-AANL，使其条带出现在介于抗体和siRNA-PEG-LMWP-AANL之间的位置。以上结果说明已成功合成了siRNA-LMWP-AANL-Antibody。
实施例4
酶敏感前药型抗体靶向递药体系血清稳定性试验。
在血液循环期间，siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL-Antibody体系将与血清蛋白相互作用。在血流中，过早崩解是有害的，将导致siRNA的降解。实际上，核酸酶的快速降解是当前siRNA递送的主要瓶颈之一。为评估递药体系中siRNA的稳定性，将siRNA-LMWP-AANL-Antibody与等体积FBS混合，在37℃条件下分别孵育1h，6h，24h；以未修饰的siRNA作为对照，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳和SYGR GreenⅡ染色，并用凝胶成像仪进行观察。
从图6中可以看出裸siRNA在6h已经出现了较为明显的降解现象，递药体系于血清暴露后24h仅有轻微的强度变化。
实施例5
西妥昔单抗及siRNA-LMWP-AANL“前药”的细胞摄取。
考察西妥昔单抗及“前药”siRNA-LMWP-AANL在人结肠癌细胞HCT116，SW620和人纤维肉瘤细胞HT1080上的细胞摄取情况。盖玻片置于24孔板预处理，期间加入聚赖氨酸风干过夜。将处于对数生长期的HCT116，SW620和HT1080细胞以5×104个细胞/盖玻片的密度铺在盖玻片上并孵育直至完全粘附。将FITC标记的西妥昔单抗和TAMRA标记的前体药物siRNA-LMWP-AANL在37℃分别与HCT116，SW620和HT1080细胞一起孵育4小时后，细胞用PBS洗涤，并用4％多聚甲醛固定30分钟，再与DAPI(5μg/mL)一起孵育10min。在488nm处激发波长下观察FITC荧光强度，565nm处激发波长下观察TAMRA荧光强度，以观测前体药物的细胞摄取情况。使用激光扫描显微镜采集图像。
结果如图7所示，HCT116和HT1080细胞表面均可见明显的绿色荧光，SW620细胞则无明显的荧光信号。表明西妥昔单抗可与人结肠癌细胞系HCT116和人纤维肉瘤细胞HT1080表面的受体进行有效结合并内化，而与人结肠癌细胞系SW620表面的受体几乎不结合。
依据体系设计，该系统为一前药体系，故而考察了“前药”siRNA-LMWP-AANL偶联物在所选取的三种细胞系HCT116，SW620以及HT1080中的摄取能力。如图7所示，siRNA-LMWP-AANL在三种细胞中都可见明显的红色荧光，表明该前药体系具有很好的细胞摄取能力。
实施例6
抗体内化功能评价。
保证抗体内化功能是实现体系靶向运载siRNA的前提，因此首先将未偶联的西妥昔单抗和含有西妥昔单抗的递药体系偶联物与与表面表达EGFR的HCT116细胞一起孵育。具体步骤如下：
将处于对数生长期的HCT116细胞以105个细胞/孔的密度铺于12孔板中，孵育直至完全粘附。吸弃旧培养基并用PBS清洗，加入未偶联的西妥昔单抗及递药体系偶联物siRNA-LMWP-AANL-Antibody在37℃孵育1h后，胰酶消化并收集于管中，1000rpm离心5min，弃去上清，提前预冷的PBS清洗两次后，加入FITC标记的抗EGFR抗体冰上孵育1h，离心弃上清，预冷PBS清洗两次，加入200μL PBS，使用BD FACS流式细胞仪进行检测，并用FlowJo软件分析结果。
结果如图8所示，使用与西妥昔单抗不同的EGFR细胞外表位结合的FITC标记的抗EGFR抗体染色后，FACS分析显示，当细胞与未偶联的西妥昔单抗和含有西妥昔单抗的递药体系偶联物预孵育时，检测到HCT116细胞表面上的EGFR表达下降，分析表明递药体系siRNA-LMWP-AANL-Antibody中的抗体仍可与细胞表面的EGF受体结合并有效内化，从而印证了合成过程不影响抗体功能。
实施例7
不同肿瘤细胞中Legumain酶表达量的测定。
采用Western Blot方法在HCT116，SW620及HT1080细胞的细胞裂解液中检测肿瘤酶legumain的表达情况。各细胞裂解液中legumain表达结果如图9所示，人结肠癌细胞系HCT116和SW620均存在legumain的酶原(约56kDa)，同时HCT116细胞中以活性成熟形式存在的legumain(约36kDa)的表达量要多于SW620细胞，而人纤维肉瘤细胞HT1080中几乎不表达legumain。legumain表达的半定量分析采用Quantity One软件进行处理，结果表明HCT116细胞中的legumain的酶原表达量是SW620细胞的1.65倍，而HCT116细胞中以活性成熟形式存在的legumain的表达量是SW620细胞的1.47倍。
实施例8
采用CoCl2·6H2O模拟缺氧条件刺激肿瘤酶Legumain的表达。
采用CoCl2·6H2O模拟体内肿瘤部位的缺氧条件，以刺激肿瘤酶legumain的表达。实验中分别选取浓度为100mM，0.2mM，0mMCoCl2·6H2O来刺激HCT116细胞和SW620细胞中legumain的表达。Westernblot检测legumain表达水平。结果表明CoCl2·6H2O的引入有效地促进了活性成熟形式的legumain的表达(图10)。通过Quantity One软件对legumain表达量进行半定量分析，在HCT116细胞中，不同浓度CoCl2·6H2O的引入可以使活性成熟形式的legumain的表达量提高3-4倍，同时在SW620细胞中也可以使其提高1.5-2倍，其中control为0mM CoCl2·6H2O组。考虑到药物最大利用率以及药物浓度对细胞状态的影响，选取0.2mMCoCl2·6H2O作为干预细胞的最终药物浓度。
实施例9
Legumain酶切体系底物肽段激活前药体系的验证。
为了考察体系的肿瘤酶响应性，选取CoCl2·6H2O刺激的HCT116细胞，SW620细胞和HT1080细胞作为活性legumain的来源。为了检测活性legumain是否可以切断偶联物中对应的底物肽AANL并释放前药siRNA-LMWP-AAN，分别用FITC和TAMRA标记西妥昔单抗(绿)和siRNA(红)，以可视化西妥昔单抗和siRNA在细胞内的位置。具体步骤如下：
消化收集处于对数生长期的HCT116，SW620和HT1080细胞，以密度5×104个/孔接种于含有预处理盖玻片的24孔板中，孵育至完全粘附。CoCl2·6H2O预先处理18h后，吸弃培养基，PBS清洗，加入递药体系TAMRA-siRNA-LMWP-AANL-Antibody-FITC，观察偶联物在不同细胞上的荧光共定位情况，激光扫描共聚焦显微镜采集图像。
结果显示(图11)，HCT116细胞中可见明显的红色和绿色荧光信号，且两种荧光信号并未完全重合；HT1080细胞中虽可见较为明显的荧光信号，但呈现较为明显的荧光共定位现象；而SW620细胞中几乎无明显的荧光信号；结果说明所构建的递送体系在legumain高表达的结肠癌细胞系HCT116细胞中可以被成功激活。
实施例10
酶敏感前药型抗体靶向递药体系基因沉默实验。
采用稳转EGFP的人结肠癌细胞株HCT116评估不同siRNA制剂组对EGFP的基因沉默效果。用EGFP基因转染的HCT116细胞表现出绿色的荧光，绿色强度的减少象征着EGFP表达的下调，以此来测试抗EGFP siRNA制剂的基因沉默功效。
HCT116-EGFP的培养条件与HCT116相同，即采用添加10％FBS和1％青霉素-链霉素双抗的McCoy's 5a培养基，37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。准备转染时，使用处于对数生长期的人结肠癌HCT116-EGFP，按照5×104个/孔的密度分别接种于含有聚赖氨酸预处理的24孔板和常规的24孔板中，孵育直至完全粘附。
分别加入PBS，siRNA，LMWP-AANL与siRNA共混物，siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL前药，Lipo6000与siRNA共混物和siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL-Antibody体系，每孔siRNA的浓度为100nM，孵育24h。孵育结束后吸弃含药培养基结束转染，更换为新鲜培养基后继续培养72h。使用Confocal定性观察EGFP表达量。同时加入裂解液，离心后收集上清，Western blot法定性检测EGFP表达量。具体结果如图12A-12B和图13所示。
图12A和图12B中，1代表PBS组，2代表游离的siRNA组，3代表LMWPAANL和siRNA的物理混合物组(摩尔比为1:1)，4代表Lipofecter和siRNA复合物组，5代表siRNA-S-S-PEG-LMWP偶联物组，6代表siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL-Antibody偶联物组。图12中，1代表PBS组，2代表游离的siRNA组，3代表LMWPAANL和siRNA的物理混合物组，4代表siRNA-S-S-PEG-LMWP偶联物组，5-7代表siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL-Antibody偶联物组，8代表Lipo6000和siRNA物理混合物。
如图12A所示，不同制剂组对EGFP的表达均产生一定的抑制作用，所构建的前药体系siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL以及siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL-Antibody递药体系组的基因沉默情况整体上强于物理混合物组。通过分析EGFP的荧光强度值得出了一致的发现(图12B)，相比于PBS处理组(FI＝309407)、siRNA组、LMWPAANL和siRNA的物理混合物(摩尔比为1:1)组、Lipofecter和siRNA复合物组处理的细胞均显示出统计学显著的FI值降低(FI值分别为280749，86716，60942)，本发明所构建的前药体系组siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL以及siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL-Antibody递药体系组则显示更低的FI值(FI值分别为12527，7302)。
Western blot的结果(图13)显示，各组均显示一定的基因沉默能力，但是前体药物组及递药体系组的基因沉默能力最强。通过Quantity One软件对沉默效果进行初步分析可知，游离siRNA组，LMWP-AANL和siRNA物理混合物组，siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL前药组，siRNA-S-S-PEG-LMWP-AANL-Antibody组在siRNA浓度均为100nM时，可以有效地将EGFP的表达量分别下调35.6％，42.2％，81.4％以及89.2％。
实施例11
1.MMP-2前药型抗体靶向递药体系siRNA-LMWP-GGPLGVR-Antibody的合成及纯化。
本发明针对基质金属蛋白酶MMP-2特异性酶切的底物肽序列PLGVR，平行构建了针对MMP-2酶敏感的前药型抗体靶向递药体系siRNA-LMWP-GGPLGVR-Antibody，其合成纯化路线可如图14所示。
对siRNA-LMWP-GGPLGVR-Antibody的分离纯化与siRNA-LMWP-AANL-Antibody相似，其结果如图15所示。针对含LMWP的融合肽的聚阳离子特性，选择肝素柱纯化，PEG(OPSS)-LMWP-GG-PLGVR在盐浓度0.8M-1M出峰，而LMWP-GGPLGVR与肝素柱结合能力较强，梯度洗脱时后被洗脱，在盐浓度1.2M-1.4M出峰。通过峰面积定量方法计算PEG(OPSS)-LMWP-GGPLGVR的产率约为60％。DEAE柱纯化siRNA-PEG(OPSS)-LMWP-GG-PLGVR时，目标产物在盐浓度0.3M-0.35M出峰，副产物siRNA-S-S-siRNA约在0.45M出峰。经计算siRNA-PEG(OPSS)-LMWP-GGPLGVR的产率约为40％。最终偶联物经脱盐柱纯化后在3min左右被洗脱出来。
2.MMP-2前药型抗体靶向递药体系siRNA-LMWP-GGPLGVR-Antibody的表征
使用琼脂糖凝胶电泳来评价所得的的siRNA-LMWP-GGPLGVR-Antibody偶联物，结果如图15D所示。在图15D中，泳道1为核酸标准物(Marker)，泳道2为siRNA，泳道3为siRNA-PEG-LMWP-GGPLGVR，泳道4为Antibody，泳道5为siRNA-LMWP-GGPLGVR与Antibody物理混合物，泳道6为siRNA-LMWP-GGPLGVR-Antibody体系。结果表明siRNA-LMWP-GGPLGVR-Antibody被成功合成。
3.MMP-2酶切体系底物肽段激活前药体系的验证
将递药体系TAMRA-siRNA-LMWP-GGPLGVR-cetuximab-FITC加入到HCT116，SW620和HT1080这三种细胞中，观察其在不同细胞上的荧光共定位情况。
如图16所示，MMP-2型药物递送体系在人结肠癌细胞系HCT116细胞和人纤维肉瘤细胞系HT1080细胞中均可被成功激活。这为所构建药物递送体系的广泛应用奠定了基础。
上述实验证实了本发明所构建递药体系的抗体特异性及肿瘤酶响应性，即在抗体与细胞表面抗原特异性结合后，含有底物肽的前药体系被对应酶切，激活前体药物，细胞穿膜肽介导siRNA入胞，随后二硫键在胞浆被还原并释放siRNA，继而产生良好的基因沉默效果。
序列表
<110> 天津医科大学
<120> 具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物及其制备方法和应用
<130> BJI1800584TJMU
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcuacgucc aggagcgcat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ugcgcuccug gacguagcct t 21

Claims (10)

1.一种具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物，其特征在于，该抗体核酸药物偶联物具有A-m-X-Y-B所示结构，其中，A为抗体，X为通过短肽m与所述A共价连接的穿膜肽，Y为与所述X共价连接的柔性链段，B为与所述Y共价连接的核酸药物。
2.根据权利要求1所述的具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物，其特征在于，所述短肽m为含有肿瘤细胞表面特异性酶的底物序列的短肽。
3.根据权利要求1所述的具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物，其特征在于，所述肿瘤细胞表面特异性酶为legumain酶或MMP家族酶，所述短肽m为AANL、AAA、GLTGALPAAPTIL、HSAAVPTAATTA、IHTAAHV、GGLAGIP或含有MMP家族酶的底物序列的短肽；所述MMP家族酶优选包括MMP-1酶、MMP-2酶、MMP-3酶、MMP-7酶、MMP-8酶、MMP-9酶、MMP-11酶、MMP-12酶、MMP-13酶、MMP-14酶、MMP-15酶、MMP-16酶、MMP-17酶、MMP-19酶、MMP-20酶、MMP-24酶、MMP-25酶、MMP-26酶、MMP-28酶；所述含有MMP家族酶的底物序列的短肽优选为RWTNNFREY；GGPLGVR、SLAYYTAA、HMHAALTA、HMHKALTA、ESLAYYTA、RSLSRLTA、NRYSSLTA；PEELKFQ、HHLGGAKQ；KVYLSEXKTG、VVLLPNVETP、PVVLLPNVE；TEGEARGS；GPKGVYSL、GLAGQR、GLOGER、GPFGFKSL；GGYAELRMGG；AVVASELRCQC；SGRIGFLRTA；MLPLGLDAA；KANLRRRRKR；KFHIRRKR；RRRRQAP；TLKYLLLG；YEPMGGWLHHQI；RRRRNKR；AGLVRRRRR；PVAVSQS；RRKKR。
4.根据权利要求1所述的具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物，其特征在于，所述短肽m与所述A共价连接的共价键包括二硫键、腙键、酰胺键、酯键或醚键；所述Y与所述X共价连接的共价键包括二硫键、腙键、酰胺键、酯键或醚键；所述B与所述Y共价连接的共价键包括二硫键、腙键、酰胺键、酯键或醚键。
5.根据权利要求1所述的具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物，其特征在于，所述抗体为靶向肿瘤细胞的抗体，优选为西妥昔单抗、纳武单抗、派姆单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、曲妥珠单抗、阿达卡莫单抗。
6.根据权利要求1所述的具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物，其特征在于，所述柔性链段为由中性聚合物形成的线性结构的链段；优选地，所述柔性链段由聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯以及聚丙烯酰胺中的任意一种中性聚合物形成；所述中性聚合物的分子量优选为1000～10000，更优选为2000～5000。
7.根据权利要求1所述的具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物，其特征在于，所述穿膜肽选自如下任意一种：LMWP、Tat48-60、Tat48-60-P10、CAI、HIV-TAT、MAP、MPGα、M918、R6Pen、penetratin、Pep-1-K、ARF1-22、Tp10、POD、3～100个赖氨酸残基组成的聚赖氨酸以及4～9个精氨酸残基组成的聚精氨酸；优选所述聚精氨酸为8个精氨酸组成的聚精氨酸R8。
8.根据权利要求1所述的具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物，其特征在于，所述核酸药物包括核苷酸单体或寡聚核苷酸，优选所述寡聚核苷酸为非取代的寡核苷酸或取代的寡核苷酸，所述取代的寡核苷酸为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，所述非取代的寡核苷酸选自锁核酸、siRNA、microRNA、核酸适体、肽核酸、诱骗ODN、催化性RNA以及CpG二核苷酸中的任意一种；更优选所述寡聚核苷酸为长度为19～23bp的siRNA。
9.权利要求1-8中任意一项所述的具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
融合肽的活化步骤，将穿膜肽与m的融合肽的N端或C端特异性地与柔性链段进行共价结合，得到活化的融合肽；
核酸药物的活化步骤，在所述核酸药物反义链的3’端或者正义链的任意一端引入不同于磷酸基团或羟基基团的反应活性基团，得到活化的核酸药物；
第一共价连接步骤，将所述活化的融合肽与所述活化的核酸药物通过亲核反应或亲电加成反应得到所述核酸药物与融合肽的偶联物；
核酸药物与融合肽的偶联物的活化步骤，在所述核酸药物与融合肽的偶联物的融合肽一端引入抗体反应基团，得到活化的核酸药物与融合肽的偶联物；
第二共价连接步骤，将所述活化的核酸药物与融合肽的偶联物与抗体反应，得到所述抗体核酸药物偶联物。
10.权利要求1至8中任意一项所述的具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物的应用，所述应用包括：体外筛选药物、作为siRNA药物递送系统。
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