CN116381125A - 评估与蛋白偶联的核酸稳定性的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物制药技术领域,提供了一种对与蛋白偶联的核酸稳定性进行分析的方法,所述方法包括:a)将目标核酸偶联物与血浆混匀,孵育后储存;b)使用结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白对纯化载体进行包被;c)将包被后的纯化载体与待测样品进行共孵育,获得结合有待测样品的纯化载体;d)对目标待测样品进行分离,并通过每个峰的保留时间以及260 nm和280 nm的相对吸收比值,对目标待测样品稳定性进行分析。本发明还提供了一种用于对与蛋白偶联的核酸稳定性进行分析的试剂盒。本发明相对于传统的核酸定量的PCR法,不需要引入外源探针来进行PCR扩增,可直接检测蛋白‑核酸偶联物信号,步骤相对简单,数据更有参考价值。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域,涉及一种用于评估与蛋白偶联的核酸稳定性的方法及试剂盒。
背景技术
核酸偶联药物技术是近年基于抗体偶联药物(Antibody-Drug Conjugates,ADC)、多肽偶联药物(Peptide-Drug Conjugates,PDC)的上市和寡核苷酸疗法(OligonucleotideTherapeutics)的成功发展起来的,具体是通过蛋白-核酸共价偶联的方式,将抗体/多肽的组织靶向性与寡核苷酸疗法对基因的精准调控相结合,实现特定组织、器官或细胞中致病相关基因表达水平的上调、下调或者剪切调控、序列编辑等效果。与非偶联的核酸药物相比,核酸偶联药物能够有效改善药物的药代动力学特征,降低脱靶毒性,降低药物给药剂量等优势,具有很强的创新性和广阔的临床应用前景。
评价核酸药物的稳定性,是在核酸药物、核酸偶联药物的早期开发中都非常关注的核心问题之一。在核酸偶联药物中,决定靶向性的部分如抗体在循环系统中的降解相对缓慢,而决定药效的核酸部分则较容易发生降解。这和两类分子的生物学特性有关——蛋白作为生命活动执行者遍布全身,蛋白酶多分布在胞内的特殊细胞器比如溶酶体中发挥作用;核酸作为遗传信息的传递和储存者,正常的活动范围局限于细胞内,而核酸内切酶和外切酶大量存在于生物体内,作为对外源病原体的防御机制。
传统的抗体或多肽偶联药物的稳定性评估主要是通过质谱的方法,先利用免疫共沉淀的原理,在完成血浆共孵育后,通过识别相应抗原表位的免疫球蛋白(如单克隆抗体),将目标ADC/PDC从样品中捕获,然后进样进行质谱分析,得到偶联药物的完整性和药物抗体比(drug-to-antibody ratio,DAR)等信息。
但用以上方法对核酸偶联药物进行稳定性评估,却不太可行,因为在完成偶联物的捕获后,后续较难对完整的核酸蛋白偶联物分子进行质谱分析。其原因在于:首先,现有生物大分子质谱分析采取正离子模式,这会对核酸类带有高度负电荷的分子及其偶联物的离子化效率产生影响,使得难以基于质谱信号进行DAR值分析;其次,经过血浆孵育的样品,本身存在诸多降解产物,质谱能够较好地定义小分子的生物转化产物和对应的质谱信号,但较难对分子量较大(几kDa~十几kDa)且具有四碱基(A/U/C/G)重复结构的核酸分子进行谱图解析,因为核酸链在电离时的断裂方式排列组合的可能性非常之多,且可重复性较差,较难判断不同样品间相应的差异是稳定性实验过程中发生的还是质谱分析过程中引入的,故难以对核酸偶联物的稳定性进行准确表征。
传统的未偶联蛋白或多肽的寡核苷酸分子,其血浆稳定性测试的经典方法是先进行样品中的核酸组分提取,再采用Northen blot的方式,或者Stemloop-qPCR的方式进行定量,前者操作步骤复杂且涉及同位素操作,后者需要引入外源的探针,并进行PCR扩增,检测的灵敏度也存在较大问题。若用此类方法来对核酸蛋白偶联物进行血浆稳定性测试,还需要克服核酸的提取问题:使用常规的核酸提取手段比如酚氯仿抽提,蛋白质部分会沉淀,这会影响到目标核酸分子的回收;若采取蛋白酶切的方式进行处理,又会增加可变因素和样品制备的繁琐程度;即使采取了适当的样品前处理得到了重复性较好的结果,由于蛋白已经被去除,原始样品中偶联物DAR值和各组分占比的信息也因此丢失。
综上所述,核酸偶联药物作为刚刚兴起的一类治疗手段,目前尚无成熟的技术手段对其血浆稳定性进行表征和检测。当前亟需一种操作相对简便、结果更为准确的用于对核酸偶联药物的血浆稳定性进行定性、乃至定量分析的方法及试剂盒,以区别不同分子设计(核酸序列、修饰、连接子设计等)对核酸偶联药物稳定性的影响,满足核酸偶联药物早期研发的需求。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种操作简便、结果准确的对核酸偶联药物的血浆稳定性进行分析的方法,该方法包括:
a) 将目标核酸偶联物与血浆混匀;
b) 使用结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白或抗体对纯化载体进行包被;
c) 将包被后的纯化载体与待测样品进行共孵育,获得结合有待测样品的纯化载体;
d) 通过离子交换色谱对目标待测样品进行分离,并通过每个峰的保留时间以及260 nm和280 nm的相对吸收比值,对目标待测样品稳定性进行分析。
优选地,所述核酸为天然或在特定位置经过化学修饰的、长度10-200 nt的单链或者双链寡聚核苷酸。
进一步优选地,所述核酸为天然或经修饰的RNA序列。
优选地,所述目标核酸偶联物中的蛋白为单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、具有特定组织靶向性的长度不少于10个氨基酸的蛋白质、环状或线性的多肽。
本发明实施例的另一目的在于提供一种对与蛋白偶联的核酸稳定性进行分析的试剂盒,该试剂盒包括:1)纯化载体、2)结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白、3)封闭缓冲液、4)清洗缓冲液、5)洗脱缓冲液、6)中和缓冲液、7)制剂缓冲液。
优选地,所述纯化载体是包被有链霉亲和素的磁珠、包被有Protein A/G的琼脂糖微球、或者含有NHS酯配基的聚合物微球。
优选地,所述结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白是单克隆抗体、多克隆抗体或抗体片段。
优选地,所述封闭缓冲液是含有离子和蛋白的中性缓冲液。
优选地,所述清洗缓冲液是含有离子和表面活性剂的中性缓冲液。
优选地,所述洗脱缓冲液是有生物相容性的酸性缓冲液;所述中和缓冲液是碱性缓冲液;所述制剂缓冲液是含有离子的弱酸性缓冲液。
由于核酸和蛋白具有不同的紫外吸收谱,因此能够通过经验摩尔消光系数,来推测样品中的蛋白质和核酸的相对比例;而由于核酸分子带有大量负电荷,一旦发生降解,则整个偶联物分子的等电点等理化特性也会有相应的变化。本发明利用以上两点,通过理化手段结合离子交换色谱与核酸偶联物各组分在260nm和280nm的特征吸收特点对核酸偶联药物进行定性、乃至相对定量的分析,表征其稳定性的变化情况。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
1)相对于传统的核酸定量的PCR法,本发明的方法不需要引入外源探针来进行PCR扩增,可以直接检测蛋白-核酸偶联物信号,可以确定偶联物中不同DAR值偶联物的实际比例,步骤相对简单,数据更有参考价值;
2)相比传统的液相-质谱分析方法,本发明的方法受核酸序列和化学修饰的影响较小,结果重复性更好,能够更简便、更准确地表征核酸偶联物中核酸的降解情况。
附图说明
图1是本发明实施例提供的示出偶联物A血浆稳定性趋势的柱状图。
图2是本发明实施例提供的示出偶联物血浆孵育14天后各组分比例的柱状图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种对与蛋白偶联的核酸血浆稳定性进行定量分析的方法,该方法包括:
a)将待测样品(目标核酸蛋白偶联物)与血浆以适当的配比(如1:9)混匀,在稳定条件下孵育特定时间段(如孵育前,孵育后1天,4天,7天,14天等)后转入-80℃储存,所有孵育时间点达到后,统一进行纯化操作;
b)对纯化载体进行包被,将结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白与纯化载体进行共价或者非共价的结合,使处理后的纯化载体对目标核酸蛋白偶联物具有选择性;
c)将经包被的纯化载体与待测样品-血浆混合物进行共孵育,并通过磁力或离心等物理方式获得结合有目标待测样品的纯化载体,接着通过清洗去掉非特异性结合,再通过低pH条件解开该免疫球蛋白与目标蛋白的结合,并快速调整pH至中性,最后超滤换液至弱酸性缓冲液中,得到经纯化的目标待测样品,冻存备用;
d)通过离子交换色谱IEX-HPLC对经纯化的目标待测样品的各组分进行分离,将离子交换色谱上每个峰的保留时间,以及260 nm和280 nm的相对吸收比值,与参考样品的数据进行比对,对每个峰进行定性,进而对样品分子的降解产物情况进行定量,最终得到对应偶联物的血浆稳定性的数据。
本申请的定性、乃至相对定量的分析方法,利用通过核酸和蛋白不同的紫外吸收谱以及核酸分子带大量负电荷的特点,通过理化手段结合离子交换色谱和260nm和280nm的特征吸收特点来进行分析,操作简便,检测周期短,准确度高。本申请通过检测与蛋白偶联的核酸的稳定性,可以区别不同核酸偶联物的分子设计(核酸序列、修饰、连接子设计等)对核酸偶联药物稳定性的影响,对核酸偶联药物早期研发的具有指导意义。
具体地,所述核酸蛋白偶联物具有特定的分子结构A-(L)m-(B)n,A分子为上述目标蛋白,可以是单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、或抗体片段,可以是具有特定组织靶向性的长度不少于10个氨基酸的蛋白质,可以是环状或线性的多肽,具有1个或多个与L分子偶联的位点;L分子是单价或多价结构的连接子,将A和B组分以共价方式连接;B分子是天然或在特定位置经过化学修饰的,长度10-200 nt的单链或者双链寡聚核苷酸;L分子的数量m大于等于1,B分子的数量n大于等于1。
具体地,所述血浆可以是人、小鼠、大鼠、恒河猴等哺乳动物的血浆,也可以是特定病人、特定动物疾病模型来源的血浆,也可以是其他体液组分(淋巴液、消化液、血清等),也可以是血浆组分模拟物组合(具有特定pH,含核酸酶、蛋白酶等组分的缓冲液)。
具体地,所述稳定性条件可以是生理温度(37℃±1℃)、室温(18℃~25℃)、或更加温和或剧烈的温度条件(2℃~50℃),优选为生理温度(37℃±1℃)。
本发明实施例还提供一种对与蛋白偶联的核酸稳定性进行定性分析的试剂盒,该试剂盒包括1)纯化载体、2)结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白、3)封闭缓冲液、4)清洗缓冲液、5)洗脱缓冲液、6)中和缓冲液、7)制剂缓冲液。
具体地,所述纯化载体可以是包被有链霉亲和素(strep avidin,SA)的磁珠、包被有Protein A/G的琼脂糖微球、含有NHS酯等配基的聚合物微球,其通过磁力或者离心力与液相物质实现分离。
具体地,所述结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白可以是识别目标蛋白某些区段的单克隆/多克隆抗体或抗体片段,其可以借助共价的配基偶联或非共价的受体配体结合至磁珠表面,同时其蛋白结合域还可以从样品中结合到目标蛋白。具体地,如果目标蛋白为第一抗体,则该免疫球蛋白为结合第一抗体的第二抗体。
具体地,所述封闭缓冲液可以是含有一定离子强度的近中性缓冲液,并溶解有一定百分比的蛋白(0.1%~0.5% BSA),该封闭缓冲液的孵育一方面可以去除未完成包被的上述免疫球蛋白,同时能够更充分地封闭上述纯化载体上的非特异性结合的位点。
具体地,所述清洗缓冲液可以是含有一定离子强度的近中性缓冲液,并含有一定百分比的表面活性剂(0.1%~1% TritonX-100),该清洗缓冲液可以通过一定的离子强度和表面活性剂,清洗掉非特异性结合的待测样品中的物质;
具体地,所述洗脱缓冲液是具有较低pH和较好生物相容性的溶液(25mM Glycine,pH 2.0~2.5),其能够解开目标蛋白与纯化载体上所包被的免疫球蛋白的结合;
具体地,所述中和缓冲液是具有较高pH的缓冲液(1M Tris base,pH 8.5~9.5),其能够将洗脱后缓冲液pH调节至近中性,且不对待测样品造成明显的稀释;
具体地,所述制剂缓冲液是具有弱酸性pH和一定的离子强度(0.1M Glycine,0.05M Tris base, pH5.0)的缓冲液,其在待测样品通过超滤换液后使用,用于保证待测样品在正常储存、检测条件下能够相对稳定。
其他组分说明:考虑到不同实验对特定样品所需要评估的血浆的种属来源或者对应动物模型有特定要求,本发明试剂盒组分中不包括待测样品、血浆及对照样品,另外不包括低吸附离心管,超滤离心管,以及孵育后的样品。
以下通过具体实施例对本申请进行进一步描述。
实施例所用材料:
大鼠血浆,可购自上海南方模式生物科技股份有限公司,采用SD大鼠新鲜制备血浆样品,速冻置于-80℃备用;
磷酸盐缓冲盐水(PBS, 10x),可购自Thermo Scientific的Invitrogen™,规格为10倍储液,pH 7.4,无 RNA酶活性;
生物素标记抗体(anti-human Fc),可购自Thermo Scientific 的CaptureSelect™,规格为蛋白浓度1 mg/ml缓冲液 PBS, pH 7.4;
牛血清白蛋白(BSA,heat shock fraction),可购自Sigma Aldrich的 Vetec™,其无 RNA酶/蛋白酶活性, PH 7.0, 纯度≥98%;
Tris base,可购自Sigma Aldrich,其纯度为99.9%;
甘氨酸(Glycine),可购自Merck的Millipore™,其无 RNA酶/蛋白酶活性,呈粉末状, 纯度≥99%;
Triton X-100,可购自Thermo Scientific的Invitrogen™,其为1%(v/v)水溶液;
低吸附离心管(EP管),可购自Corning的Axygen®,其为MaxyClear带盖低吸附1.5ml离心管;
离心管,可购自Corning,规格为15ml;
超滤离心管,可购自Merck的Millipore Amicon® Ultra,规格为10kDa,离心式过滤器,0.5ml。
实施例1 核酸偶联物的设计和准备
待进行血浆稳定性测试的核酸偶联样品,由抗体(anti-TfR1单克隆抗体,OKT9,购自赛默飞)、anti-HPRT siRNA(正义链5’-3’序列为:UCC UAU GAC UGU AGA UUU UAU(SEQID NO. 1),反义链5’-3’序列为:AUA AAA UCU ACA GUC AUA GGA AU (SEQ ID NO. 2),购自欧利生物)和不同连接子(连接子a:SMCC,连接子b:N3,购自新基茵)通过不同的共价偶联工艺制备得到粗品,并经层析纯化得到纯品。不同分子设计样品对应的分子设计如表1所示。
表1核酸偶联物的分子设计
实施例2 核酸偶联物的特性表征
偶联物A、B、C制备过程中的IEX-HPLC历史数据总结见表2,该表格列出了核酸偶联物各组分的色谱保留时间和260:280面积比特征(对应的IEX-HPLC色谱条件见表3)。随着核酸偶联物DAR值的降低,核酸在偶联物中占比下降,其色谱出峰时间逐渐提前(由核酸峰逐渐向抗体峰偏移),且260:280面积比值逐渐降低,因此能够根据保留时间判断待测样品中各个峰核酸的大致比例,从而判断对应的分子形式。
表2 核酸偶联物各分子类型及特征
实施例3 核酸偶联物稳定性分析
血清孵育:
取实施例1中准备的三种核酸偶联物的待测样品,用PBS缓冲液将其浓度调节至2mg/ml,每份样品均以待测样品:血浆=1:9的体积比进行充分混合(核酸偶联物终浓度达0.2mg/ml),并按照1ml/管均匀分装至5个EP管中。分装完毕后,取其中1管置于-80℃作为初始时间点样品,其余置于37℃恒温培养箱中,孵育1天,4天,7天和14天,并在取样节点及时取出置于-80℃,等待统一的纯化和分析。
样品纯化:
(1)磁珠准备:按需取9.3 mL链霉亲和素偶联磁珠(组分1)于15 mL离心管中,将离心管置于磁力架(参考型号Invitrogen™ DynaMag™-2)上使磁珠载体紧贴管壁一侧,沿另一侧吸去溶液。加入预先配置好的10 mL含有0.1%BSA(w/v)的1xPBS溶液(组分3),温和混匀10 min,去上清。重复上述0.1%BSA(w/v)PBS溶液清洗操作两次,最后将磁珠重悬在10 mL的PBS+0.1% BSA buffer中备用。
(2)磁珠免疫球蛋白包被:向上述准备好的链霉亲和素磁珠加入1.4 mg生物素标记抗体(组分2),于4℃温和混匀孵育过夜。
(3)磁珠清洗:将离心管置于磁力架上使磁珠载体紧贴管壁一侧,沿另一侧吸去溶液,并加入预先配置好的10mL含有0.1%BSA(w/v)的1xPBS溶液,轻微振摇混匀10min,再置于磁力架上。重复上述0.1%BSA(w/v)PBS溶液清洗操作两次,最后一次清洗完毕后,最后将磁珠重悬在10 mL的PBS+0.1% BSA buffer中。
(4)样品孵育:将上述磁珠均等分成15份,分别转入解冻好的血浆稳定性待测样品,25℃条件下孵育2个小时,期间保持温和混匀。
(5)样品清洗:将离心管置于磁力架上使磁珠载体紧贴管壁一侧,沿另一侧吸去样品,注意不要吸太干,随后迅速加入预先配制好的10ml含有0.1% TritonX-100(v/v)的1xPBS溶液(组分4),轻微振摇混匀10min,再置于磁力架上。再重复上述0.1% TritonX-100(v/v)PBS溶液清洗操作两次。
(6)样品洗脱:将离心管置于磁力架上使磁珠载体紧贴管壁一侧,沿另一侧吸去缓冲液,注意尽量吸走残液,随后迅速加入100μL预先配制好的摩尔浓度0.1M的甘氨酸洗脱缓冲液(pH 2.5)(组分5),轻微震荡混匀并孵育10min,再置于磁力架上,小心将液体转入新的离心管中备用。再重复执行上述洗脱操作两次,分别取洗脱后的待测样品溶液通过Nanpdrop测定UV280吸收进行初检后,将所得待测样品溶液合并混匀,并立即加入10μL 摩尔浓度1M的Tris base缓冲液pH=9.0(组分6),轻微震荡混匀。
(7)超滤浓缩换液:将以上得到的溶液转入超滤离心管中,加入制剂缓冲液(组分7),12000rpm 4℃离心至20μL(浓度大于1mg/ml),再次加入制剂缓冲液,重复上述浓缩2次,浓缩至20μL并转入新的离心管,取样品通过Nanpdrop测定UV280吸收进行初检后,置于-80℃冻存备用。
样品检测:
每个样品取10ug,添加缓冲液(流动相A)1:1稀释后进行阴离子交换层析-高效液相色谱分析(参考设备:Agilent 1260;参考层析柱:ProPac SAX-10,4X250mm),色谱条件见表3。
表3 IEX-HPLC样品分析条件
数据处理:
得到样品的IEX-HPLC谱图后,对每个峰的保留时间进行记录,对各色谱峰在OD260和OD280对应的面积进行积分,并计算面积比。对于总面积≤5%的峰,由于基线波动等会造成较大误差,不再进行260:280比值的计算。
实验结果:
(1)单一核酸偶联物血浆稳定性:以偶联物A在孵育前(Ctrl),孵育首日(D0),孵育满1天(D1)、4天(D4)、7天(D7)和14天(D14)后的IEX-HPLC分析数据为例,按照色谱保留时间分类,得到5.4-5.5,5.8,7.5-7.9和8.1-8.3四个亚类,根据表2的特征信息,推测为单克隆抗体,抗体-连接子,抗体核酸偶联物(DAR≤1),抗体核酸偶联物(DAR≤2),样品各组分随时间的百分比如图1所示。
通过图1中结果得知,样品A很短时间内就发生了高比例(约90%)的剪切和降解,主要产物是不含核苷酸的抗体-连接子,后续1至14天,残余的10%的抗体核酸偶联物继续发生降解,由DAR2偶联物降解为DAR1偶联物或者抗体-连接子,而抗体连接子进一步降解转化为单克隆抗体。表现出了比较好的逐级降解的趋势。
(2)不同核酸偶联物的核酸稳定性:为了比较样品A、样品B、样品C不同分子设计(见表1)在稳定性上的优劣,选取血浆稳定反应终点(第14天)的各组分数据进行横向比较(图2)。可以发现在使用相同连接子的条件下,采用了定点偶联样品B中残余的核酸偶联物比例高于随机偶联的样品A,且完全切割成抗体的比例低于样品A,说明该组合物的稳定性较好;同样采用定点偶联工艺的条件,由连接子a偶联的样品B整体稳定性优于采用连接子b的样品C。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种对与蛋白偶联的核酸稳定性进行分析的方法,所述方法包括:
a) 将目标核酸偶联物与血浆混匀;
b) 使用结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白或抗体对纯化载体进行包被;
c) 将包被后的纯化载体与待测样品进行共孵育,获得结合有待测样品的纯化载体;
d) 通过离子交换色谱对目标待测样品进行分离,并通过每个峰的保留时间以及260nm和280 nm的相对吸收比值,对目标待测样品稳定性进行分析。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述核酸为天然或在特定位置经过化学修饰的、长度10-200 nt的单链或者双链寡聚核苷酸。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述核酸为天然或经修饰的RNA序列。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述目标核酸偶联物中的蛋白为单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、具有特定组织靶向性的长度不少于10个氨基酸的蛋白质、环状或线性的多肽。
5.一种用于实施根据权利要求1至4中任一项所述的方法的试剂盒,所述试剂盒包括:1)纯化载体、2)结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白、3)封闭缓冲液、4)清洗缓冲液、5)洗脱缓冲液、6)中和缓冲液、以及7)制剂缓冲液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述纯化载体是包被有链霉亲和素的磁珠、包被有Protein A/G的琼脂糖微球、或者含有NHS酯配基的聚合物微球。
7.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白是单克隆抗体、多克隆抗体或抗体片段。
8.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述封闭缓冲液是含有离子和蛋白的中性缓冲液。
9.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述清洗缓冲液是含有离子和表面活性剂的中性缓冲液。
10.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述洗脱缓冲液是有生物相容性的酸性缓冲液;所述中和缓冲液是碱性缓冲液;所述制剂缓冲液是含有离子的弱酸性缓冲液。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20230704 |
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