CN116875605A - 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）棘突蛋白S1亚基的核酸适配体及其应用 - Google Patents

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）棘突蛋白S1亚基的核酸适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具提供了新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)棘突蛋白S1亚基(也称S1蛋白)的核酸适配体及其应用。本发明公开的SARS‑CoV‑2S1蛋白的核酸适配体不仅具有分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记特点，还能高亲和力地结合SARS‑CoV‑2S1蛋白或其RBD区域，且能结合SARS‑CoV‑2假病毒，可用于SARS‑CoV‑2的实验室研究，以及可应用于SARS‑CoV‑2引起的相关疾病的检测、诊断、成像以及治疗等方面。

Description

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)棘突蛋白S1亚基的核酸适配体及 其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及核酸适配体的筛选及应用，尤其涉及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)棘突蛋白S1亚基(也称S1蛋白)的核酸适配体及其应用。
背景技术
2020年1月12日，世界卫生组织正式将新型冠状病毒命名为“2019新型冠状病毒(2019-nCoV)”，其后在2月11-12日国际病毒分类委员会(International Committee onTaxonomy of Viruses,ICTV)宣布，新型冠状病毒的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，世界卫生组织(WHO)同日在日内瓦举办全球研究和创新论坛上宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为“COVID-19”。这几种命名均表示同一种新型冠状病毒命，以下均简称为SARS-CoV-2。
SARS-CoV-2属于β冠状病毒属，包膜单股正链RNA病毒，颗粒呈大致球形或多形性,直径80～120nm，其核酸和核衣壳蛋白紧密包装在病毒体中，多数病毒体外面有脂质双层膜，膜表面存在棘突蛋白(spike protein，简称S蛋白)。S蛋白由S1和S2亚基两部分组成，S1负责识别细胞的受体，S1主要包含有受体结合区(receptor binding domain，RBD)。SARS-CoV-2进入细胞的受体为ACE2【Zhou et al.DisCoVery of a novel coronavirusassociated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential batorigin.bioRxiv.2020】，SARS-CoV-2正是通过RBD区与细胞表面受体ACE2结合来感染细胞。
核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。基于核酸适配体的特性，能与SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基特异性结合的核酸适配体在新冠肺炎的研究、检测、治疗等方面将具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了能与SARS-CoV-2S1蛋白(即SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基)特异性结合的核酸适配体及其应用并提供了一种SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基特异性结合的核酸适配体的筛选方法。
发明人使用体外指数富集的配基系统进化(SELEX)技术，筛选得到了以高亲和力特异性性结合SARS-CoV-2S1蛋白的核酸适配体。具体地，本发明人设计并合成了一个随机单链DNA文库和相应的引物，通过磁珠法筛选具有分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力结合SARS-CoV-2S1蛋白的核苷酸链，并对这些核苷酸链进行进一步筛选和验证获得两个能与SARS-CoV-2S1蛋白特异性结合的核酸适配体。进一步，发明人将获得的核酸适配体用于SARS-CoV-2S1蛋白和SARS-CoV-2假病毒的检测。
本发明的第一方面，提供了结合SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基的核酸适配体及核酸适配体的衍生物。
所述核苷酸适配体包含以下以下核苷酸序列中的至少一种：
(1)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列；
(2)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有高同源性并且结合SARS-CoV-2S1蛋白的DNA序列；
(3)由(1)或(2)的核苷酸序列转录获得并能够结合SARS-CoV-2S1蛋白的RNA序列；
(4)在(1)至(3)中任意一个核苷酸序列的某一位置处或多个位置处删除、增加或替换一个或多个碱基，所得的能够结合SARS-CoV-2S1蛋白的核苷酸序列。
在一些方式中，与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有高同源性指具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％的序列与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列相同。
作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，或者，连接信号分子或活性分子或功能性基团，可得到所述核酸适配体的衍生物。
所述修饰包括：磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化等，可以选择其中的一种或多种修饰方式，也可以对上述核酸适配体的核苷酸序列上一个位置进行修饰，也可以对多个位置的同时进行修饰。当然，修饰的条件是这样修饰后得到的核酸适配体的衍生物具有合乎需要的性质，即可以具有与修饰前的核酸适配体序列SARS-CoV-2S1蛋白相等或更高的结合的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
所述连接信号分子或活性分子或功能性基团指在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、蛋白、siRNA、纳米材料、生物素、地高辛、叶酸和胆固醇中等标记性或活性物质，以获得具有特定功能或作用的核酸适配体衍生物。例如，在上述核酸适配体上连接上荧光物质，使所述衍生物与SARS-CoV-2S1蛋白结合后，能进行荧光检测，因而可用于SARS-CoV-2S1蛋白的荧光定量检测。例如，在上述核酸适配体上连接能干扰SARS-CoV-2基因表达的siRNA，所述衍生物能特异性与SARS-CoV-2S1蛋白结合，使siRNA到达SARS-CoV-2所在位置，进而该siRNA干扰SARS-CoV-2病毒表达，因而可用于制备抗SARS-CoV-2药物的制备。同理，在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接信号分子或活性分子或功能性基团时，需要考虑与SARS-CoV-2S1蛋白的亲和力，连接后获得的衍生物应仍能与SARS-CoV-2S1蛋白具很好的亲和力。
在一些方式中，所述衍生物是由前述任一项技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架改造成结合SARS-CoV-2S1蛋白的硫代磷酸酯骨架而得，或者是前述任一项技术方案中所述核酸适配体改造成的结合SARS-CoV-2S1蛋白的肽核酸。
本发明所使用的术语“硫代磷酸酯骨架”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指RNA和DNA核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键氧原子可以被一个或两个硫原子取代，分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。已知这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其靶标的结合亲和力，以及对核酸酶降解的增强的抗性。
本发明所使用的术语“肽核酸”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指一种人工合成DNA分子类似物，于1991年由Nielsen等首次报道。用N-2-(氨乙基)-甘氨酸(N-(2-aminoethyl)-glycine)单位代替糖-磷酸酯骨架作为重复结构单元，合成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸。由于肽核酸(PNA)没有如DNA或RNA上的磷酸基团，因此PNA与DNA之间缺乏电性相斥的现象，使两者之间的结合强度大于DNA与DNA之间的结合强度。
本发明的第二方面，提供了一种筛选SARS-CoV-2S1蛋白核酸适配体的方法。所述方法包括以下步骤：
S1、提供随机单链DNA文库和引物，所述随机单链DNA文库包含序列为SEQ ID NO.3的随机单链DNA，所述引物包括SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的一种或多种。
S2、用磁珠法筛选并进行至少6轮反筛和正筛。
具体地，S2步骤包括：
S2.1、以所述随机单链DNA文库为模板，使用所述引物进行PCR扩增，获得用于筛选的初始DNA文库；
S2.2、将SARS-CoV-2S1蛋白和his小肽分别与磁珠偶联，得到S1蛋白偶联磁珠和his小肽偶联磁珠；
S2.3、反筛：将S2.1的初始DNA文库与S2.2的his小肽偶联磁珠进行孵育，孵育后进行磁性分离，收集上清；正筛：将反筛收集的上清与S1蛋白偶联磁珠进行孵育，孵育后进行磁性分离，收集磁珠，收集结合在磁珠上的DNA并进行扩增和纯化以获得下一轮筛选的DNA文库；
S2.4、以S2.3中得到的DNA文库代替S2.1的初始DNA文库重复进行S2.3，至少进行6轮反筛和正筛。
在一些方式中，发明人在6轮反筛和正筛的过程中选用不同的反筛用蛋白或小肽，例如在第一、二轮和第五、六轮时，选用his小肽，在第三、四轮时，选用fc小肽。另外，在进行第3轮至第6轮正筛的孵育时，分别在孵育前加入2％、5％、10％、10％的血清。
核酸适配体筛选的常规条件是在离子缓冲液中进行，而在筛选条件下逐步添加一定浓度的血清，一方面因为血清中含有丰富的蛋白，可以与磁珠表面的蛋白竞争性的与DNA文库中的核苷酸链结合，从而去除那些与靶标SARS-CoV-2S1蛋白结合能力很弱或者只是物理吸附的核苷酸序列。另一方面，核苷酸序列在血清环境中结合靶标蛋白，该环境与核酸适配体使用环境类似，因而该环境下筛选获得核酸适配体能更好的满足后期核酸适配体的实际应用。
本发明的第三方面，提供了SARS-CoV-2S1蛋白的核酸适配体及其衍生物的用途。
本发明发现的SARS-CoV-2S1蛋白的核酸适配体及其衍生物能与SARS-CoV-2的S1或RBD蛋白结合，可应用于制备结合SARS-CoV-2S1蛋白或RBD蛋白(SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基的受体结合区域)的试剂，该试剂具有下述的一或多种用途：
1)定量或定性检测SARS-CoV-2S1蛋白或Spike蛋白；
2)纯化SARS-CoV-2的RBD蛋白、S1蛋白或Spike蛋白；
3)SARS-CoV-2的S1蛋白或Spike蛋白的成像；
4)结合SARS-CoV-2并将其富集；
5)作为SARS-CoV-2的S1蛋白或Spike蛋白的抑制剂；
6)制备阻断SARS-CoV-2的S1蛋白或Spike蛋白与ACE2蛋白结合的制剂；
7)制备靶向到SARS-CoV-2Spike-S1蛋白或Spike蛋白的药物；
8)制备用于诊断和治疗SARS-CoV-2感染的肺炎的试剂或药物；
9)开发用于检测SARS-CoV-2的S1蛋白的方法，如夹心法(优选夹心ELISA法)中的用途。本文所使用的，“夹心法”是指通过两个适配体结合同一蛋白的不同位置来进行检测，例如但不限于夹心ELISA法。
10)SARS-CoV-2S1蛋白的核酸适配体及其衍生物能应用于SARS-CoV-2假病毒的检测及应用与制备结合SARS-CoV-2假病毒的试剂方面。如在一个实施方案中，本发明发现的2个核酸适配体能进行SARS-CoV-2假病毒的检测。
本发明的有益效果在于：本发明所提供的核酸适配体、其缀合物及其衍生物能够以较高的亲和力结合SARS-CoV-2S1蛋白、SARS冠状病毒的RBD蛋白，且分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记。
附图说明
图1显示利用表面等离子共振(SPR)检测本发明实施例1筛选的DNA文库与SARS-CoV-2S1蛋白结合情况；
图2核酸适配体ZZS1-22和ZZS1-33与SARS-CoV-2S1蛋白结合情况；
图3核酸适配体ZZS1-22(a)和ZZS1-33(b)与SARS RBD蛋白结合情况；
图4核酸适配体ZZS1-22的斑点杂交实验结果；
图5核酸适配体ZZS1-33的斑点杂交实验结果；
图中，Spike指SARS-CoV-2棘突蛋白，Spike S1指SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基，假病毒指SARS-CoV-2假病毒。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中未特别指出的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1：结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S1蛋白的ssDNA核酸适配体的筛选
1、随机单链DNA文库和引物
随机单链DNA文库：
SEQ ID NO.3：5’-CTACGGTGCCTTGAAGTGAC-36N-CATAGCAGGTCACTTCCAGG-3’
其中，“36N”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
引物信息如表1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1引物及其序列
引物名称 序列(5'-3')
lib25S1 SEQ ID NO.4：CTACGGTGCCTTGAAGTGAC
lib25-FAM-S1 SEQ ID NO.5：FAM-CTACGGTGCCTTGAAGTGAC
lib25-ployA-A2 SEQ ID NO.6：AAAAAAAAAAAAAAAAAAA/Spacer18/CCTGGAAGTGACCTGCTATG
lib25A2 SEQ ID NO.7：CCTGGAAGTGACCTGCTATG
其中，引物名称中的lib25S1和lib25-FAM-S1为正向引物，lib25-ployA-A2和lib25A2为反向引物。lib25-ployA-A2序列中的19个A表示由19个腺苷酸(A)组成的polyA尾，“Spacer 18”表示18原子的六乙二醇间臂，“Spacer 18”结构式如下式所示。
引物分别用DPBS缓冲液(氯化钙0.1g/L，氯化钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，六水氯化镁0.1g/L，氯化钠8g/L，十二水磷酸氢二钠2.8915g/L；PH7.4，25℃)配制成100μM的贮存液，于-20℃保存备用。
2、磁珠法筛选
采用磁珠法筛选，共计筛选6轮，每一轮的筛选流程见表2。
表2新型冠状病毒棘突蛋白适配体筛选流程
轮数 正筛 反筛 缓冲溶液
第一轮 偶联新冠S1-histag蛋白 偶联his的磁珠 DPBS缓冲液
第二轮 偶联新冠S1-histag蛋白 偶联his的磁珠 DPBS缓冲液
第三轮 偶联新冠S1-fctag蛋白 偶联fc的磁珠 DPBS缓冲液；2％血清
第四轮 偶联新冠S1-fctag蛋白 偶联fc的磁珠 DPBS缓冲液；5％血清
第五轮 偶联新冠S1-histag蛋白 偶联his的磁珠 DPBS缓冲液；10％血清
第六轮 偶联新冠S1蛋白包被的假病毒 偶联his的磁珠 DPBS缓冲液；10％血清
具体筛选方法如下：
1)获取初始DNA文库
以上述随机单链DNA文库为模板，并用上述引物进行PCR扩增，具体过程为：取1OD随机单链核苷酸文库，用DPBS缓冲液溶解至10μM，混匀后分装到PCR管进行变复性处理。处理过程如下：PCR仪设定程序95℃保持10分钟，此步骤目的是使折叠的链解开，然后4℃保持5分钟，然后平衡至室温，得初始DNA文库，记为pool0。
2)偶联磁珠与SARS-CoV-2S1蛋白
活化磁珠：取50μl磁珠(羧基磁珠，江苏泽成生物技术有限公司，货号：FM2221)，用200μl超纯水清洗4遍，磁铁垂钓磁珠，去上清。取配置好的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶液)各100μl，等体积混合，加入到磁珠中，25℃孵育20分钟以活化磁珠表面的羧基，磁珠用DPBS缓冲液清洗2遍后备用。
偶联过程：取20μl的SARS-CoV-2S1蛋白(购自义翘神州，40591-VO8H，浓度为0.87mg/ml)，加入pH 3.6的10mM醋酸钠80μl混匀，加入活化后的磁珠。25℃置于垂直混合仪上孵育60分钟，SARS-CoV-2S1蛋白则通过蛋白表面的氨基偶联到磁珠表面。将偶联管置于磁力架上，吸弃上清，取100μl 1M乙醇胺pH 8.5加入到磁珠中，25℃垂直混合仪上孵育10分钟，封闭磁珠表面未反应的活化位点。置于磁力架上，吸弃封闭液。磁珠用200μl DPBS清洗4遍，标记为MB-S1。
由于为了筛选出特异性好的序列，筛选的六轮当中使用不同标签的SARS-CoV-2S1进行交替筛选，其余几种带有不同标签的SARS-CoV-2S1蛋白和S1-histag偶联方法一样，分别为SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike S1(D614G)40591-V02H3，SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike PseudovirusPSV001。
3)偶联磁珠与his小肽或fc小肽
his小肽由金斯瑞生物科技有限公司合成，为9个连续的组氨酸。His小肽的浓度为10mM，用pH 4.0的10mM NaAC溶液稀释。具体地，取20μl his小肽，加入80μl pH 4.0的10mMNaAC溶液混匀。其余偶联his蛋白的步骤与偶联SARS-CoV-2S1蛋白的相同。偶联后的磁珠标记为MB-his。
4)反筛与正筛
①反筛
将初始DNA文库加入到50μl的MB-his磁珠中，混匀，在垂直混合仪上室温孵育一段时间。置于磁力架上，收集上清，标记为pool-。
②正筛
将反筛得到的上清加入到50μl MB-S1磁珠中，在垂直混合仪上25℃孵育40分钟。置于磁力架上，吸弃上清，保留磁珠，用200μl DPBS(缓冲液)清洗磁珠4次。最后在清洗后的磁珠中加入200μl DPBS，沸水浴10分钟，收集上清，标记为elution-S1。
③扩增和纯化
扩增：以elution-S1中的核酸分子为模板，用乳浊液PCR(ePCR)进行扩增。方法如下：将全部模板elution-S1加入2ml PCR mix中混匀，加入4倍体积的ePCR微液滴生成油，涡旋5分钟制备乳浊液。将乳浊液分成100μl/管加入到PCR管中，扩增条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环，4℃保存。ePCR微液滴生成油以及PCR mix购自安徽省昂普拓迈(Aptamy)生物科技有限公司，货号分别为EPO100和ESE2018。
正丁醇纯化：收集所有的ePCR产物于15ml尖底离心管中，加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；台式离心机，9000rpm(转/分钟)于25℃离心10分钟；移弃上相(正丁醇)，得到浓缩的PCR扩增产物。
收集DNA文库：按体积比1：1加入TBE/尿素变性缓冲液至浓缩的PCR扩增产物中，煮沸10分钟使DNA变性，随后冰浴1分钟，将所有的样品进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使带荧光的FAM标记的正义链与反向的加长的链分开，7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如下表3。
表3变性聚丙烯酰胺凝胶配方
成分 用量
尿素 3.78g
40％聚丙烯酰胺 1.8ml
5*TBE 1.8ml
ddH2O 2.25ml
10％APS 60μl
TEMED 15μl
切胶回收FAM标记的链：将凝胶取出放在塑料膜上，在Ex＝495nm，Em＝517nm下检测我们需要的带有FAM标记的ssDNA；用干净的刀片将目的条带直接切下，将胶条转移至1.5ml EP管中并捣碎，加入1ml ddH2O后沸水浴10分钟将胶中的ssDNA转移至溶液中，离心去除胶的碎片，留上清。上清用正丁醇纯化，得到DNA单链用3KD的透析袋透析过夜，即可作为下一轮筛选的DNA文库。
以该轮筛选获得的DNA文库代替初始DNA文库或上一轮筛选获得的DNA文库，进行下一轮的反筛、正筛、扩增和纯化过程，共进行6轮的正筛和反筛。每一轮筛选时，先用his小肽偶联磁珠或fc小肽偶联磁珠进行反筛，再用几种带有不同标签的SARS-CoV-2S1蛋白偶联磁珠进行正筛。6轮用的正筛或反筛的偶联磁珠情况如表2。另外，在进行第3轮至第6轮的筛选中，向使用的DPBS溶液中添加血清(正常人血清，购买自北京索莱宝科技有限公司，货号：SL010)，其添加的比例如表2。特别地，在第6轮使用磁珠偶联SARS-CoV-2S1蛋白包被的假病毒(SARS-CoV-2购买自义翘神州，货号：PSV001)进行正筛，这样筛选获得的核酸适配体除了可能与SARS-CoV-2S1蛋白具有高亲和力外，也可能与SARS-CoV-2假病毒具有高亲和力。6轮筛选得到的DNA文库依次记为pool1、pool2、pool3、pool4、pool5、pool6。
3、筛选结果
用表面等离子共振(SPR)检测DNA文库对SARS-CoV-2S1蛋白识别能力的变化，随着筛选轮数的增加，筛选获得的DNA文库与SARS-CoV-2S1蛋白的亲和力呈递增的趋势，如图1，与SARS-CoV-2S1蛋白的亲和力大小为：pool6>pool3>pool0。
对筛选获得的pool6进行高通量测序得到大量核苷酸序列，由金唯智生物(江苏)科技有限公司合成这些核苷酸序列并检测其与SARS-CoV-2S1蛋白的亲和力，发现亲和力较好的2条序列。将这2条序列进行挑选之后分别得到了SEQ ID NO:1或2所示的核酸适配体分别命名为ZZS1-22和ZZS1-33。
实施例2：表面等离子共振(SPR)检测ZZS1-22和ZZS1-33与SARS-CoV-2S1蛋白的亲和力
委托通用生物合成核酸适配体ZZS1-22和ZZS1-33，将其分别用DPBS缓冲液稀释成500nM。
将SARS-CoV-2S1蛋白偶联到CM5芯片蛋白芯片表面的第2通道，具体方法如下：先用50mM NaOH清洗芯片，进样20μL，流速10μL/分钟，然后将等体积的EDC【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶液】和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)两个试剂混合后进样50μL活化芯片，流速5μl/分钟。将SARS-CoV-2S1蛋白用pH4.5的10mM醋酸钠稀释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积50μL，流速5μL/分钟，SARS-CoV-2S1蛋白偶联量为4500Ru。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5μL/分钟，进样50μL。第1通道按照上述处理，除用his小肽代替SARS-CoV-2S1蛋白外，偶联his小肽的步骤，活化和封闭的步骤完全一样，作为对照通道。
检测：使用表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore 8K)设定检测参数，将上述稀释好的500nmM的2种适配体样品依次流过1、2、通道，具体的程序如下：进样30μL/分钟，时间2.5分钟，解离30μL/分钟，时间2.5分钟，再生1M NaCl 30μL/分钟，时间1分钟。
适配体与SARS-CoV-2S1蛋白的亲和力检测数据见图2，每一条曲线是通道2差减通道1之后的曲线，KD值分别如下表4所示。
表4ZZS1-22和ZZS1-33与SARS-CoV-2S1蛋白亲和力
核酸适配体 亲和力KD(nM)
SEQ ID NO.1(ZZS1-22): 29
SEQ ID NO.2(ZZS1-33): 25
由图2和表4结果可知，ZZS1-22和ZZS1-33均与SARS-CoV-2S1蛋白具有很高的亲和力，说明ZZS1-22和ZZS1-33结合SARS-CoV-2S1蛋白的能力强。
实施例3：表面等离子共振(SPR)检测ZZS1-22和ZZS1-33与SARS RBD蛋白的亲和力
SARS RBD蛋白即仅含有SARS-CoV-2S1 RBD区的蛋白，购自义翘神州(货号：40150-V08B2)。
与实施例2中将SARS-CoV-2S1蛋白固定到CM5芯片进行测试的方法相同，将SARSRBD蛋白偶联到芯片表面的2通道；将his小肽(南京金斯瑞生物科技有限公司)偶联到第1通道。使用表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore 8K)，设定检测参数，将实施例2步骤1中稀释好的2种适配体样品依次进样，每种依次流过1、2通道，每一个适配体的程序如下：进样30μL/分钟，时间2分钟，解离30μL/分钟，时间8分钟，再生1M NaCl 30μL/分钟，时间1分钟。另取BSA(牛血清白蛋白)代替上述SARS RBD蛋白进行相同实验。
实验结果如图3所示，由图中结果可知，ZZS1-22(图3a)和ZZS1-33(图3b)能与SARSRBD蛋白的亲和力高。该结果说明ZZS1-22和ZZS1-33均能特异性地结合SARS RBD蛋白，ZZS1-22和ZZS1-33通过特异性结合SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基的RBD与SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基结合。
实施例4：基于ZZS1-22和ZZS1-33的斑点杂交实验检测SARS-CoV-2S1蛋白和SARS-CoV-2假病毒
1.核酸适配体ZZS1-22的斑点杂交实验
1)取2块8cm×2cm的硝酸纤维素膜(购自Millipore)，取SARS-CoV-2棘突蛋白、SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基(SARS-CoV-2S1蛋白)、SARS-CoV-2假病毒分别用DPBS稀释成0.5mg/ml，将对照蛋白BSA、His小肽、VEGFR2(血管内皮细胞生长因子受体2)、CD14(白细胞分化抗原)也稀释成0.5mg/ml。点样1.5μl到硝酸纤维素膜上，自然风干40分钟。
2)待干燥后，用10％小牛血清在室温封闭3小时，封闭结束后用DPBST(DPBS含0.5‰tween20)清洗3次，吸净。
3)用生物素修饰实施例2中通用生物合成的核酸适配体ZZS1-22稀释到1uM然后将稀释后的核酸适配体与硝酸纤维素膜上的蛋白在摇床室温孵育2小时。
4)孵育结束后用DPBST洗三次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。
5)加入用DPBST按照1:10000稀释的HRP-标记的链霉抗生物素蛋白(购自碧云天，货号A0303)，室温摇床孵育30分钟。
6)DPBST洗3次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。
7)以A液：B液＝1:1(v/v)的比例加入显色液(BeyoECL Star特超敏ECL化学发光试剂盒，购自碧云天，货号P0018A，A液和B液为试剂盒自带溶液)，在室温显色1分钟。
8)成像系统观察拍照：使用仪器为GE医疗生命科学部的ImageQuantTMLAS 4000数字成像系统。
2.核酸适配体ZZS1-33的斑点杂交实验
核酸适配体ZZS1-33的斑点杂交实验方法同上核酸适配体ZZS1-22的。
3.结果和分析
核酸适配体ZZS1-22、ZZS1-33的斑点杂交实验结果分别如图4和图5所示，与对照蛋白相比，实验组显色明显，说明生物素修饰的ZZS1-22和ZZS1-33均可以用于膜杂交SARS-CoV-2棘突蛋白、SARS-CoV-2S1蛋白和SARS-CoV-2假病毒的检测，并且对照蛋白BSA、His小肽、VEGFR2和CD14组几乎不显色，则进一步证明ZZS1-22和ZZS1-33均能特异性的与SARS-CoV-2棘突蛋白、SARS-CoV-2S1蛋白或SARS-CoV-2假病毒结合。
上述结果也证明实施例1的筛选方法可筛选能同时结合SARS-CoV-2S1蛋白和SARS-CoV-2假病毒的核酸适配体。
假病毒是指一种反转录病毒整合了另外一种病毒的囊膜糖蛋白，从而形成的具有外源性病毒囊膜，而基因组仍保持着反转录病毒本身基因组特性的病毒，又称为假型病毒。由于假病毒没有自我复制能力，使其可以在生物安全二级实验室中操作。同时假病毒具有原真病毒相类似的细胞感染能力，可替代原真病毒进行细胞趋向性、受体识别、病毒抑制剂和抗体的评估等研究。因此，SARS-CoV-2假病毒安全性高，尤其适用于代替SARS-CoV-2进行实验室研究，而ZZS1-22和ZZS1-33能特异性结合SARS-CoV-2假病毒，则可应用于SARS-CoV-2假病毒的探测，有利于加快研究进程。同时，ZZS1-22和ZZS1-33也可以用于SARS-CoV-2的探测，则ZZS1-22或ZZS1-33尤其适用于需要同时探测或表征SARS-CoV-2假病毒和SARS-CoV-2情况，或者，在研究适用于SARS-CoV-2假病毒的药物或方法等是否也适用于SARS-CoV-2的情况，例如在使用ZZS1-22或ZZS1-33表征SARS-CoV-2假病毒的实验中发现某一药物能抑制SARS-CoV-2假病毒的细胞感染能力，进一步需要研究该药物是否能抑制SARS-CoV-2的感染能力时，则可仅将SARS-CoV-2假病毒更换为SARS-CoV-2，其他实验条件不需要进行调整(如不需要更换核酸适配体)，这样有利于控制单一变量加快研究进程和提高研究结果的准确性。
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.结合SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基的核酸适配体，所述核苷酸适配体包含以下核苷酸序列中的至少一种：
(1)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列；
(2)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有高同源性并且结合SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基的DNA序列；
(3)由(1)或(2)的核苷酸序列转录获得并能够结合SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基的RNA序列；
(4)在(1)至(3)中任意一个核苷酸序列的某一位置处或多个位置处删除、增加或替换一个或多个碱基，所得的能够结合SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有高同源性指具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％的同源性。
3.一种如权利要求1～2之一所述核酸适配体的衍生物，其特征在于，所述衍生物为将所述核酸适配体的核苷酸序列进行修饰，或者，连接信号分子或活性分子或功能性基团，获得的能够结合SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基的衍生物。
4.如权利要求3所述的衍生物，其特征在于，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的一种或多种。
5.如权利要求3所述的衍生物，其特征在于，所述信号分子或活性分子或功能性基团包括荧光物质、放射性物质、治疗性物质、蛋白、siRNA、纳米材料、生物素、地高辛、叶酸和胆固醇中的一种或多种。
6.一种SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基的核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：
S1、提供随机单链DNA文库和引物，所述随机单链DNA文库包含序列为SEQ ID NO.3的随机单链DNA，所述引物包括SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7中的一种或多种。
S2、用磁珠法筛选并进行至少6轮反筛和正筛。
7.如权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，S2的具体过程包括：
S2.1、以所述随机单链DNA文库为模板，使用所述引物进行PCR扩增，获得用于筛选的初始DNA文库；
S2.2、将SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基和his小肽分别与磁珠偶联，得到S1蛋白偶联磁珠和his小肽偶联磁珠；
S2.3、反筛：将S2.1的初始DNA文库与S2.2的his小肽偶联磁珠进行孵育，孵育后进行磁性分离，收集上清；正筛：将反筛收集的上清与S1蛋白偶联磁珠进行孵育，孵育后进行磁性分离，收集磁珠，收集结合在磁珠上的DNA并进行扩增和纯化以获得下一轮筛选的DNA文库；
S2.4、以S2.3中得到的DNA文库代替S2.1的初始DNA文库重复进行S2.3，至少进行6轮反筛和正筛。
8.如权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，在进行第3轮至第6轮正筛的孵育时，分别在孵育前加入2％、5％、10％、10％的血清。
9.如权利要求1～2之一所述的核酸适配体或如权利要求3～5之一所述的衍生物在制备用于结合SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基的试剂中的应用。
10.如权利要求1～2之一所述的核酸适配体或如权利要求3～5之一所述的衍生物在制备于结合SARS-CoV-2假病毒的试剂中的应用。
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