CN110373415A - 特异性结合pd-l1蛋白的核酸适配体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供由SEQ ID NO：1‑2所示的特异性结合PD‑L1蛋白的核酸适配体及其用途。具体地，本发明的核酸适配体及其衍生物相对PD‑L1蛋白抗体而言，具有能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点。

Description

特异性结合PD-L1蛋白的核酸适配体及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种由SEQ ID NO：1-2所示的可 用于特异性结合细胞程序性死亡-配体1(Programmed cell death 1ligand 1， PD-L1)蛋白的核酸适配体及其用途。
背景技术
程序性死亡受体1(programmed death-1，PD-1)是重要的免疫检查点， 通过与其配体(programmed death ligand，PD-L)PD-L1和PD-L2的作用而 抑制T细胞的活化及细胞因子的产生，在维持机体的外周耐受上发挥着至 关重要的作用。PD-1诱导性表达于活化的T细胞表面，而PD-L1组成性 的低表达于抗原递呈细胞(APCs)、多种间质细胞、血管内皮细胞、心脏、 肝脏、胎盘组织等，是PD-1的主要配体。除此之外，在肿瘤微环境中， 炎症因子的刺激会上调肿瘤细胞PD-L1的表达。正常情形下免疫系统会对 聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，抗原特异性的细胞毒杀性T细 胞(CD8+T细胞)会增殖，而PD-1与PD-L1结合，可以传导抑制性的信 号，对CD8+T细胞的进一步增殖和活化有显著的抑制作用。肿瘤细胞能 借助此途径逃逸细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤作用，从而减弱机体 对肿瘤细胞的免疫应答。
核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术 (SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其他靶标如 蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的 结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔 的前景。核酸适配体与抗体相比具有分子量小、稳定性更好、易改造修饰、 无免疫原性、制作周期短、可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、 饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程，因此核酸适配体是一种非常理想的 分子探针。
以PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂为代表的免疫治疗现已成为肿瘤治 疗领域最具前景的治疗手段。截至目前为止，FDA已经批准了5种 PD-1/PD-L1抗体药物用于晚期黑色素瘤、晚期非小细胞肺癌、头颈鳞状 细胞癌、经典型霍奇金淋巴瘤、转移性尿路上皮癌、膀胱癌、转移性胃癌、 晚期肾癌等多种癌症的一线或二线治疗方案。PD-1抗体药物通过与T淋巴细胞上PD-1结合，PD-L1抗体药物通过与肿瘤细胞上PD-L1结合来阻 断PD-1和PD-L1信号通路传导，解除肿瘤细胞对T淋巴细胞的免疫抑制 作用，从而促进T淋巴细胞的活化，释放IL-2、INF-γ等细胞因子或者直 接分泌颗粒酶和穿孔素杀伤肿瘤细胞。因此，PD-1/PD-L1抑制剂发挥作 用的前提是能够识别相应PD-1/PD-L1靶标，阻止PD-1和PD-L1相互之 间的结合。基于SELEX的筛选原理，PD-1/PD-L1核酸适配体用于肿瘤免 疫治疗的可行性也被广泛研究。目前已经有一些研究者公布了他们所发现 的一些PD-L1的核酸适配体序列，并在荷瘤小鼠模型上验证了其抗肿瘤增 殖的能力，发现PD-1/PD-L1核酸适配体和PD-1/PD-L1抗体具有相似的抗 肿瘤免疫功效。然而，这些PD-1/PD-L1的核酸适配体存在一些缺点，例如，有些核酸适配体的靶标是鼠源PD-1/PD-L1蛋白，实际应用受限；有 些核酸适配体分子量大，针对PD-L1蛋白的结合亲和力不太高、特异性不 好、稳定性不高等。因此，本领域对具有针对人源PD-1/PD-L1蛋白的结 合亲和力更高的核酸适配体存在需求。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种具有高度 特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合PD-L1蛋 白的核酸适配体及其衍生物，还相应提供所述核酸适配体的用途。
具体地，本发明人设计并合成了一个随机单链DNA文库和相应的引 物，用来筛选具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标 记的能够结合PD-L1蛋白的核酸适配体，由此筛选得到一些特异性结合 PD-L1蛋白的核酸适配体，并检测了它们与PD-L1蛋白的结合能力。在此 基础上，本发明人完成了本发明。
在一个方面，本发明提供特异性结合PD-L1蛋白的核酸适配体，所述 核酸适配体包含或由以下组成：
(1)如下所示的SEQ ID NO：1-2中任一个所示的核苷酸序列：
SEO ID NO：1(PD-L1-33s)：
5’-GCCCCAGTTATGCTTTCCCCCTCTGTCTCTTTG-3’；
SEQ ID NO：2(PD-L1-30s)：
5’-ATCGCCCGCAGCACCCATTTGTTTTTTTTG-3’；
或
(2)与SEQ ID NO：1-2中任一个所示的核苷酸序列具有至少60％、至 少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少 96％、至少98％或至少99％的同源性且特异性结合PD-L1蛋白的核苷酸序 列，例如可将SEQ ID NO：1-2中任一个所示的核苷酸序列删除或增加部分 互补的核苷酸；或
(3)由(1)或(2)的核苷酸序列转录且特异性结合PD-L1蛋白的RNA序 列。
在一个实施方案中，本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案 的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰。因此 本发明提供的核酸适配体的核苷酸序列可被修饰，例如，磷酸化、甲基化、 氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化等，条件是这样修 饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，具有与修饰前的 母体核酸适配体序列相同或更高的结合PD-L1蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
在另一方面，本发明还提供核酸适配体的缀合物。本领域技术人员应 该理解，作为对上述技术方案的改进，可在上述核酸适配体的核苷酸序列 上连接本领域惯常用于标记、检测、诊断或治疗的荧光标记物例如FAM、 放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽(由2-10 个氨基酸通过肽键形成的直键肽被称为寡肽或小肽)、siRNA或酶标记等， 条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，具 有与修饰前的母体核酸适配体序列相同或更高的结合PD-L1蛋白的亲和 力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
换言之，以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体序列，都 具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，且都与 PD-L1蛋白结合。
在另一方面，本发明还提供核酸适配体的衍生物，所述衍生物是将前 述核酸适配体或核酸适配体的缀合物的核苷酸序列的骨架改造成硫代磷 酸酯骨架而得，或者是前述核酸适配体或核酸适配体的缀合物改造成的相 应肽核酸，条件是所述衍生物都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分 子结构、理化性质和功能，且都与PD-L1蛋白结合。
本发明所使用的术语“硫代磷酸酯骨架”具有本领域普通技术人员一 般理解的含义，其是指RNA和DNA核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键 氧原子可以被一个或两个硫原子取代，分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代 磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。已知这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其 靶标的结合亲和力，以及对核酸酶降解的增强的抗性。
本发明所使用的术语“肽核酸”具有本领域普通技术人员一般理解的 含义，其是指一种人工合成DNA分子类似物，于1991年由Nielsen等首 次报道。用N-2-(氨乙基)-甘氨酸(N-(2-aminoethyl)-glycine)单位代替糖- 磷酸酯骨架作为重复结构单元，合成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物，称 为肽核酸。由于肽核酸(PNA)没有如DNA或RNA上的磷酸基团，因此 PNA与DNA之间缺乏电性相斥的现象，使两者之间的结合强度大于DNA 与DNA之间的结合强度。
在另一方面，本发明提供前述核酸适配体、其缀合物或其衍生物在由 以下各项组成的组中的任意一项中的用途：
(1)纯化PD-L1蛋白或检测PD-L1蛋白；
(2)表达PD-L1的细胞、组织或活体定位成像；
(3)捕获表达PD-L1的细胞或外泌体；或
(4)激活淋巴细胞、促进细胞因子释放。
在一个实施方案中，本发明的核酸适配体、其缀合物或其衍生物，优 选本发明的核酸适配体可以用于PD-L1蛋白纯化或检测，检测受试者肿瘤 组织中PD-L1的表达量，进而判断所述受试者是否适用于PD-1/PD-L1免 疫抑制剂治疗，并对预后做出判断。
在另一个实施方案中，NCI-H292细胞内源性高表达PD-L1，将该细 胞与荧光基团修饰的SEQ ID NO：1-2所示的任意一个或两个核酸适配体 孵育，该经修饰的核酸适配体会特异性结合细胞上的PD-L1蛋白，利用流 式细胞仪或者共聚焦显微镜，可以检测核酸适配体上标记的荧光分子，从 而对细胞表达的PD-L1进行检测，进一步进行精确定量。本领域技术人员 能够依据实际需要选择适当的检测方式及检测对象。
在另一方面，本发明提供前述核酸适配体、其缀合物或其衍生物在制 备用于抑制肿瘤增殖、转移的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包含前述核酸适配体、 其缀合物或其衍生物；优选地，所述试剂盒包含SEQ ID NO：1-2所示的任 意一个或两个核酸适配体、其缀合物或其衍生物；更优选地，所述试剂盒 包含SEQ ID NO：1-2所示的任意一个或两个核酸适配体。
在另一方面，上述任一项的核酸适配体或上述核酸适配体的缀合物或 上述核酸适配体的衍生物在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于例 如纯化PD-L1蛋白或检测PD-L1蛋白，表达PD-L1的细胞、组织或活体 定位成像，捕获表达PD-L1蛋白的细胞或外泌体，抑制肿瘤增殖、转移， 或激活淋巴细胞，或促进细胞因子释放。
本发明的有益效果在于：所提供的核酸适配体、其缀合物及其衍生物 高度特异性结合PD-L1蛋白，且分子量小、化学性质稳定、易于保存和标 记。
附图说明
图1显示本发明实施例1筛选得到的PD-L1-33s与PD-L1蛋白的亲和 力检测数据(SPR数据)。PD-L1-33s能与PD-L1蛋白结合，KD值为1.04nM。
图2显示本发明实施例1筛选得到的PD-L1-30s与PD-L1蛋白的亲和 力检测数据(SPR数据)。PD-L1-30s能与PD-L1蛋白结合，KD值为9.14nM。
图3显示如实施例3所述，本发明实施例1筛选得到的PD-L1-33s和 PD-L1-30s的各同源序列与PD-L1蛋白的亲和力检测数据(SPR数据)。 各同源序列与PD-L1蛋白均有结合。
图4显示如实施例4所述，本发明实施例1筛选得到的PD-L1-33s(图 4a)和PD-L1-30s(图4b)与目的蛋白PD-L1、肿瘤坏死因子α蛋白(简称 TNF-α蛋白)，以及程序化死亡分子1蛋白(简称PD1蛋白)的亲和力检 测数据(SPR数据)。
图5显示核酸适配体PD-L1-33s和表达PDL1蛋白的细胞的结合特异 性检测结果。
图6显示核酸适配体PD-L1-30s和表达PDL1蛋白的细胞的结合特异 性检测结果。
图7显示本发明实施例1筛选得到的PD-L1-33s和PD-L1-30s与表达 PD-L1蛋白的非小细胞肺癌细胞NCI-H292细胞亲和力检测数据(流式细 胞术数据)。
图8显示本发明实施例1筛选得到的PD-L1-33s与表达PD-L1蛋白的 NCI-H292细胞亲和力检测数据(共聚焦显微镜拍摄图片)。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该 理解，以下的实施例便于更好的理解本发明，本发明并不限于这些具体的 实施例。
以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例 中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购 买得到。
实施例1：特异性结合PD-L1蛋白的ssDNA核酸适配体的筛选
1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：
随机单链DNA文库：
SEQ ID NO：3：5’-TCCAGCACTCCACGCATAAC-36N-GTTATGCG TGCGACGGTGAA-3’
其中，“36N”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
引物信息如表1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1引物及其序列
其中，引物名称中的S代表正向引物，引物名称中A代表反向引物， 序列中的19个A表示由19个腺苷酸(A)组成的polyA尾，“Spacer 18” 表示18原子的六乙二醇间臂。三种“Spacer 18”的结构式如下式I-III所 示。在上述3’端引物中所用的“Spacer18”结构式如式I所示。
引物分别用MES缓冲液(MES：100mM，NaCl：150mM，KCl：1mM， MgCl2：1mM，CaCl2：1mM；PH6.0，25℃)配制成100μM的贮存液，于-20℃保存备用。
2、磁珠法和毛细管电泳法结合筛选
采用磁珠法筛选与毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)筛选相 结合的筛选方法进行筛选，共计筛选九轮，每一轮的筛选流程见表2。
表2 PD-L1蛋白适配体筛选流程
轮数 磁珠筛选 CE筛选 反筛
第一轮 √
第二轮 √
第三轮 √ √
第四轮 √ √
第五轮 √ √
第六轮 √
第七轮 √ √
第八轮 √
第九轮 √ √
具体筛选方法如下：
1)羧基磁珠固定PD-L1(pI：6.72)蛋白
取100μl羧基磁珠(Invitrogen，DynabeadsTM MyOneTM Carboxylic Acid， #65012)，用200μl DPBS(CaCl2：0.1g/L，KCl：0.2g/L，KH2PO4：0.2g/L， MgCl2·6H2O：0.1g/L，NaCl：8g/L，Na2HPO4：1.15g/L)清洗。取配置好的 NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶液)，等体积混合，加入到磁珠中，25℃孵 育20分钟活化磁珠表面的羧基，磁珠用MES缓冲液清洗2遍后备用。
取10μl的PD-L1蛋白(该PD-L1蛋白以(NCBI Reference Sequence： NP 054862.1的第18-132位氨基酸的基因序列为模板，进行分子克隆，并 使用大肠杆菌表达)(浓度为0.73mg/ml)，加入pH 4.0的10mM NaAC溶 液100μl混匀，加入到上述的活化磁珠中。25℃置于垂直混合仪上孵育30min，PD-L1蛋白通过蛋白表面的氨基偶联到磁珠表面。
偶联结束，将偶联管置于磁力架上，吸弃上清，取200μl 1M乙醇胺 pH8.5加入到磁珠中，25℃垂直混合仪上孵育10min，封闭磁珠表面未反 应的活化位点。置于磁力架上，吸弃封闭液。磁珠用200μl MES清洗4遍， 标记为MB-PD-L1。
2)磁珠筛选
取1OD随机单链核苷酸文库，14000rpm离心10分钟，将文库离心到 管底，用MES缓冲液溶解至10μM，分装到PCR管进行变复性处理。处 理过程如下：PCR仪设定程序95℃保持10分钟，此步骤目的是使折叠的 链解开，然后4℃保持5分钟，然后在25℃保持5分钟。将得到的处理后 的文库加入100μl MB-PD-L1磁珠，在垂直混合仪上25℃孵育50分钟。 置于磁力架上，吸弃上清，保留磁珠，用200μl MES清洗磁珠4次。清洗 后的磁珠加入200μl MES沸水浴10min，收集上清，标记为elution-PD-L1。
以elution-PD-L1中的核酸分子为模板，用乳浊液PCR(ePCR)进行扩 增。方法如下：将全部模板elution-PD-L1加入2ml PCR mix中混匀，加入 4倍体积的ePCR微液滴生成油，涡旋制备乳浊液。将乳浊液分成100μl/ 管加入到PCR管中，扩增条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性 60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共35个循环，4℃保存。 ePCR微液滴生成油购自安徽省昂普拓迈(Aptamy)生物科技有限公司(货 号：EPO100)，PCR mix的配方见表3。
表3 ePCR mix配方
扩增产物用正丁醇纯化：收集所有的ePCR产物于15ml尖底离心管 中，加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；台式离心 机，9000rpm(转/分钟)于25℃离心10分钟；移弃上相(正丁醇)，得到 浓缩的PCR扩增产物，按体积比1∶1加入TBE/尿素变性缓冲液，煮沸变 性15分钟使DNA变性，随后冰浴1分钟，将所有的样品进行尿素变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳，400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使加长的 FAM标记的链与反向的链分开，7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如表4。
表4变性聚丙烯酰胺凝胶配方
成分 用量
尿素 3.78g
40％聚丙烯酰胺 1.8ml
5*TBE 1.8ml
ddH2O 2.25ml
10％APS 60μl
TEMED 15μl
切胶回收FAM标记的链：将凝胶取出放在塑料膜上，Ex(nm)：495， Em(nm)：517检测我们需要的带有FAM标记的ssDNA；用干净的刀片将 目的条带直接切下，将胶条转移至1.5mlEP管中并捣碎，加入1ml ddH2O 后沸水浴10分钟将胶中的ssDNA转移至溶液中，离心去除胶的碎片，留 上清。上清用正丁醇纯化，方法同2.4。得到DNA单链用3KD的透析袋 透析过夜，即可作为下一轮筛选的文库；
3)反筛
用连有PD-1蛋白的磁珠(标记为MB-PD-1)进行反筛，偶联PD-1 蛋白的方法同偶联PD-L1蛋白相同。第三轮之后每一轮磁珠筛选在进行以PD-L1蛋白为靶标的正筛之前都先用PD-1磁珠进行反筛，反筛步骤如下： 制备的单链核苷酸文库经变复性后，与50μl MB-PD-1磁珠孵育，垂直旋 转仪上25℃孵育30min。置于磁力架上，收集上清，上清作为单链核苷酸文库与MB-PD-L1磁珠进行正筛。
4)毛细管电泳筛选
将上一轮制备的单链核苷酸文库用MES稀释成1μM*20μl，转入PCR 管，按上述变复性方法进行处理。取10μl变复性文库加入10μl PD-L1蛋 白(DPBS透析)，混匀，垂直旋转仪上25℃孵育，记为sample。取10μl 文库加入10μl MES，混匀，记为control。用CE进行筛选收集sample中 的复合物峰。扩增步骤和单链制备同磁珠筛选法。
磁珠法结合CE法，重复筛选九轮，每次操作均以前一次操作中得到 的次级文库为起始核酸文库，筛选过程中用SPR检测DNA单链文库对 PD-L1蛋白识别能力的变化，当DNA单链文库对PD-L1蛋白的识别能力 满足要求，即筛选后的DNA单链文库与靶标的结合能力高于筛选起始投 入的文库，将所得产物经克隆测序分析，最终得到核酸适配体。
所述筛选方法中，可逐轮增加筛选压力，以增进筛选核酸适配体的富 集程度，缩短筛选进程。所述增加筛选压力包括减少投入的单链DNA文 库的量、靶标蛋白的用量和两者的孵育时间，增加清洗时间，清洗次数以 及加大反筛磁珠的用量。
3、分析和鉴定多次筛选后得到的核酸适配体，将得到的富集文库产 物经克隆测序分析后，挑选若干条序列由上海生工合成，检测亲和力。
在后续检测中，确定了2条序列具有很强的结合能力，将2条序列进 行截短之后分别得到了SEQ ID NO：1-2所示的核酸适配体，且验证后具有 理想的结合PD-L1蛋白的亲和力，将它们分别命名为PD-L1-33s和 PD-L1-30s。
实施例2：表面等离子共振(SPR)检测PD-L1核酸适配体与PD-L1 蛋白的亲和力
1.将上海生工合成核酸适配体PD-L1-33s(SEQ ID NO：1)和 PD-L1-30s(SEQ IDNO：2)，分别用MES缓冲液稀释成：7.8125、15.625、 31.25、62.5、125nM；以及15.625、62.5、125、500、1000nM。
2.将实施例1中制备的PD-L1蛋白偶联到CM5芯片(GE Healthcare 货号：BR100399)表面：先用50mM NaOH清洗芯片，进样20μl，流 速10μl/min，然后用将等体积的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚 胺盐酸盐；0.4M水溶液)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)两 个试剂混合后进样50μl活化芯片，流速5μl/min。将PD-L1蛋白用pH 4.0的10mM醋酸钠稀释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积50μL，流 速5μL/min，PD-L1蛋白偶联量为5000Ru。进样完成后，进乙醇胺封闭 芯片，流速5μL/min，进样50μL。
3.检测：使用表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore T200) 设定动力学检测参数，进样30μL/min*3min，解离30μL/min*5min，再生1M NaCl 30μL/min*0.5min，将稀释好各个浓度的核酸适配体PD-L1-33s和 PD-L1-30s依次进样。
亲和力检测数据见图1(PD-L1-33s)和图2(PD-L1-30s)，这些数据 说明PD-L1-33s和PD-L1-30s用SPR仪均检测到与PD-L1蛋白有很强的 结合，KD值分别为1.04nM和9.14nM。
实施例3.表面等离子共振(SPR)检测PD-L1核酸适配体的各种同 源序列与PD-L1蛋白的亲和力
1.从上海生工合成如下表5所示的核酸适配体PD-L1-33s(SEQ ID NO：1)和PD-L1-30s(SEQ ID NO：2)的同源序列，分别用MES缓冲液 稀释至100nM。
表5 PD-L1-33s的同源序列及其与PD-L1蛋白的亲和力
表6 PD-L1-30s的同源序列及其与PD-L1蛋白的亲和力
2.将实施例1中制备的PD-L1蛋白偶联到CM5芯片(公司：GE Healthcare LifeSciences货号：BR100399)表面：先用50mM NaOH清 洗芯片，进样20μl，流速10μl/min，然后用将等体积的EDC(1-(3-二甲氨 基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶液)和NHS(N-羟基琥珀酰亚 胺；0.1M水溶液)两个试剂混合后进样50μl活化芯片，流速5μl/min。将 PD-L1蛋白用pH 4.0的10mM醋酸钠稀释至终浓度为50μg/mL后进样， 进样体积50μL，流速5μL/min，PD-L1蛋白偶联量为2000Ru。进样完成 后，进乙醇胺封闭芯片，流速5μL/min，进样50μL。
3.检测：使用BiacoreT200设定进样30μL/min*3min，解离 30μL/min*5min，再生使用1M NaCl溶液，30μL/min*0.5min，将稀释好 的每个核酸适配体依次按照该程序进样。亲和力检测数据见图3和表5-6。 可以看出合成的这些同源性序列均对PD-L1蛋白均有结合，说明这些同源 性序列均对PD-L1蛋白有很强和亲和力。
实施例4.表面等离子共振(SPR)检测PD-L1核酸适配体与对照蛋 白(TNF-α蛋白、PD1蛋白)的结合情况
1.将上海生工合成的核酸适配体PD-L1-33s(SEQ ID NO：1)和 PD-L1-30s(SEQ IDNO：2)，分别用MES缓冲液稀释成100nM；
2.分别将PD-L1蛋白、TNF-α蛋白、PD1蛋白偶联到CM5芯片表面 的第2、3、4通道上：先用50mM NaOH清洗芯片，进样20μl，流速10μl/min， 然后用将等体积的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M 水溶液)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)两个试剂混合后进样 50μl活化芯片，流速5μl/min。将PD-L1蛋白用pH 4.0的10mM醋酸钠稀释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积50μL，流速5μL/min，PD-L1 蛋白偶联量为2000Ru，TNFα蛋白偶联量为2500Ru、PD1蛋白偶联量为 2300Ru。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5μL/min，进样50μL。
3.检测：使用Biacore T200设定检测参数，将稀释好浓度到100nM 的核酸适配体PD-L1-33s(SEQ ID NO：1)和PD-L1-30s(SEQ ID NO：2) 依次进样。亲和力检测数据见图4，这些数据说明PD-L1-33s(SEQ ID NO： 1)和PD-L1-30s(SEQ ID NO：2)与目的蛋白PD-L1有结合，与对照蛋白 TNFα、PD1均没有结合或者结合非常非常弱，值见表7。可见本发明实施例1筛选得到的PD-L1-30s和PD-L1-33s与目的蛋白PD-L1的亲和力很高， 与TNF-α蛋白和PD1蛋白没有亲和力或者亲和力很弱。
表7 PD-L1核酸适配体与对照蛋白(TNF-α蛋白、PD1蛋白)的亲和力的 RU数值
PD-L1 TNFα PD1
PD-L1-30s 138.6 2.42 -2.6
PD-L1-33s 99.72 -1.07 2.12
实施例5：流式细胞仪检测PD-L1-33s和PD-L1-30s与表达PD-L1蛋 白的细胞的结合特异性。
众所周知，A549细胞和CHO细胞是不表达PDL1蛋白的，于是我们 将这两种细胞作为阴性对照，并使用了过表达PDL1蛋白的CHO细胞系 以及表达PDL1蛋白的NCI-H292细胞作为阳性细胞。实验步骤如下。
1.分别将贴壁培养的处于对数生长期的A549细胞(ATCC CCL-185-)、 CHO细胞(ATCC CCL-61)和过表达PD-L1蛋白的CHO细胞(过表达 PD-L1蛋白的CHO细胞的制备方法为：构建PDL1蛋白表达载体：PDL1 蛋白对应的DNA的NCBI参考序列号为NM 014143.2，将该序列的cDNA 克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)中，然后通过阳离子质脂体lipofectine2000(Invitrogen公司)将该质粒转染到CHO细胞内，传代培养 后用含G418(0.5mg/ml)的培养基筛选表达PDL1蛋白的细胞，得到单克 隆细胞，并进行扩大培养，对培养得到的单克隆细胞系进行表达量的鉴定， 从而得到稳定表达PDL1蛋白的细胞系进行传代培养并保存)以及NCI-H292细胞(ATCC CRL-1848-)各一皿(直径6cm的皿)用DPBS(无 钙镁，购自corning，#21-031)清洗2遍，然后用无酶消化液(普利莱，#C1000) 消化，加入1ml细胞培养基终止消化。用移液器将细胞从皿上吹打悬浮， 2000rpm离心3min后去上清，用2mlDPBS离心洗涤2次后分别与100nM 的标记了FAM的核酸适配体PD-L1-33s和PD-L1-30s以及随机单链DNA 文库(人工合成的33nt长度的随机的单链文库 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’)在4℃孵育1 小时；
2.将步骤1孵育后的细胞分别用MES缓冲液清洗2次，每次用量400μl， 最后加入200μl的MES缓冲液重悬细胞，用于流式细胞仪检测。检测结 果如图5和图6所示，结果证明，核酸适配体PD-L1-33s和PD-L1-30s能 特异性识别表达PDL1蛋白的CHO细胞以及NCI-H292细胞，且随机单链 DNA文库与细胞均无结合或者结合能力很弱。
上述所有细胞系均是在37℃，5％CO2的培养箱里培养；CHO细胞和 A549细胞的培养基为含10％胎牛血清(Hyclone)的DMEM(Gibco； #12430054)，NCI-H292的培养基为含10％胎牛血清(Hyclone)的RPMI-1640。 过表达PDL1蛋白的CHO细胞的培养基为添加了0.5mg/ml的G418(sigma； #A1720-1G)以及1×HT培养基添加剂(HT Supplement)的DMEM。(HT 是次磺嘌呤(Hypoxanthine，10mmol/L)和胸腺嘧啶核苷(Thymidine， 1.6mmol/L)的混合剂，溶解后用培养液稀释，作为DNA补救合成途径的 补充剂和营养添加剂以克服细胞内残留氨基喋呤(Aminopterin)对DNA 经典合成途径的抑制作用。)
实施例6：流式细胞仪检测PD-L1核酸适配体与表达PD-L1蛋白的细 胞的亲和力
1、将贴壁培养的处于对数生长期的NCI-H292细胞(ATCC CRL-1848)， 弃去培养基，用DPBS(无钙镁，购自corning，#21-031)清洗2遍，加 入1ml无胰酶消化液(普利莱，#C1000)25℃消化10min，显微镜下观察， 细胞变圆，加入1ml细胞培养基终止消化。用移液器将细胞从皿上吹打悬 浮，收集到1.5ml离心管中，3000rpm离心3min，弃上清，加入DPBS清洗一遍。1ml DPBS重悬细胞，按照实验需求等分成若干份，3000rpm离 心3min，弃上清，收获NCI-H292细胞，将其平均分成四组。
2、取上述步骤1收获的第一组NCI-H292细胞与兔抗人PD-L1一抗 (invitrogen，#PA5-28115，含1％BSA的DPBS作为抗体稀释液1：200 稀释使用)在垂直旋转仪上25℃孵育60min，3000rpm离心3min，弃上清。 1ml DPBS重悬，3000rpm离心3min，弃上清。加入Alexa488标 记的羊抗兔荧光二抗(Abcam，#ab150077，含1％BSA的DPBS作为抗体 稀释液1：1000稀释使用)，25℃垂直旋转仪上避光孵育60min。3000rpm 离心3min，弃上清。DPBS清洗两遍，200μl DPBS重悬细胞，作为阳性 对照，用于流式细胞仪检测。
3、在上述步骤1收获第二组至第四组的NCI-H292细胞中，分别加入 100nM的FAM修饰的SEQ ID NO：1-2以及阴性对照随机核苷酸单链文库 (Negtive Control，NC)(人工合成的33nt长度的随机的单链文库5’ --3’)，25℃垂直旋 转仪上避光孵育60min，3000rpm离心3min，弃上清。MES清洗两遍，200μl MES重悬细胞，流式细胞仪检测。结果见表8和图7。
表8和图7的数据表明，相对于阴性对照随机核苷酸文库，添加 PD-L1-33s和PD-L1-30s的组的荧光强度明显增加，说明两者均可与 NCI-H292细胞结合，其中，PD-L1-33s的结合能力更强，可与兔抗人PD-L1 一抗抗体媲美。这说明PD-L1-33s和PD-L1-30s可以替代抗体用于流式细 胞仪检测PD-L1蛋白。
表8 PD-L1核酸适配体与NCI-H292细胞的亲和力
组 荧光值(平均值)
PD-L1-33s 694
PD-L1-30s 545
兔抗人PD-L1抗体 689
阴性对照 54.5
实施例7：细胞免疫荧光检测PD-L1核酸适配体与表达PD-L1蛋白的 细胞的亲和力
1、细胞爬片：将直径14mm的玻璃爬片(雷布斯，#360021)铺到24 孔细胞培养板中，紫外照射15min。取对数生长期NCI-H292，以5X104个/孔种植到爬片上，用含10％FBS(ExCell Bio，#FSP500)和1％青霉素、 链霉素(Gibco，#15140-122)的1640培养基(HyClone，#SH30809.01)培养，在 含5％CO2的细胞培养箱中于37℃培养。观察细胞生长情况，大约24小 时，待到细胞密度适合共聚焦观测时，开始细胞免疫荧光实验。
2、细胞免疫荧光：将旧培养基吸弃，加入1ml DPBS，清洗。每孔加 入1ml预冷的4％多聚甲醛，4℃固定30min。吸弃4％多聚甲醛，加入1ml DPBS，放置于摇床上清洗3min，吸弃DPBS，如此重复清洗3次。加入 1ml0.2％的Triton-X10025℃透化10min，弃去透化液，用DPBS重复清 洗3次。向核酸适配体及阴性对照随机单核苷酸链(NC)测试孔加入300μl 封闭液(5％BSA+1ug/ml鲑鱼精DNA)封闭过夜；向阳性对照孔(抗体 孵育孔)加入300μl封闭液25℃封闭1h，弃去封闭液，加入200μl兔抗人 PD-L1(invitrogen，#PA5-28115，抗体稀释液1：200稀释使用)，4℃，湿 盒孵育过夜。吸弃一抗，加入1ml漂洗液(1％BSA和0.5％Tween 20，现 配现用)，置于摇床，25℃漂洗5min，吸弃漂洗液，重复漂洗3次。加入 300μl Alexa488标记的羊抗兔荧光二抗(Abcam，#ab150077，抗 体稀释液1∶1000稀释使用)，25℃避光孵育60min。同步地，核酸适配体 及NC测试孔加入100nM的FAM修饰的PD-L1-33s及NC，25℃避光孵 育60min。吸弃二抗及核酸，加入200μl 3nM的DAPI染核5min。抗体孵 育孔用漂洗液按上述漂洗操作清洗3次，核酸适配体及NC孵育孔用MES 按同样的漂洗操作清洗3次。甘油封片，共聚焦观测。结果见图8。
图8的数据表明，阴性对照随机核苷酸与细胞不结合，PD-L1-33s与 细胞结合，且和抗体有相同的细胞定位，两者均在胞质和核膜检测到PD-L1 的表达，且核膜表达更强。这说明PD-L1-33s可以替代PD-L1抗体用于细 胞免疫荧光的检测。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并 不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围 内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖 在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.特异性结合PD-L1蛋白的核酸适配体，其特征在于所述核酸适配体包含或由以下组成：
(1)SEQ ID NO：1-2中任一个所示的核苷酸序列，其中SEQ ID NO：1是5’-GCCCCAGTTATGCTTTCCCCCTCTGTCTCTTTG-3’，SEQ ID NO：2是5’-ATCGCCCGCAGCACCCATTTGTTTTTTTTG-3’；或
(2)与SEQ ID NO：1-2中任一个所示的核苷酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％的同源性且特异性结合PD-L1蛋白的核苷酸序列；或
(3)由(1)的核苷酸序列转录且特异性结合PD-L1蛋白的RNA序列。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰且修饰后的核酸适配体特异性结合PD-L1蛋白，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种。
3.核酸适配体的缀合物，其特征在于其为在根据权利要求1或2所述核酸适配体的核苷酸序列上连接其他用于标记、检测、诊断或治疗的物质，且连接所述物质后的所述核酸适配体的缀合物特异性结合PD-L1蛋白，所述物质是荧光标记物例如FAM、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA和酶标记中的至少一种。
4.核酸适配体的衍生物，其特征在于所述衍生物是将权利要求1-2中任一项所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物的核苷酸序列的骨架改造成特异性结合PD-L1蛋白的硫代磷酸酯骨架而得，或者是由权利要求1-2中任一项所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物改造成的特异性结合PD-L1蛋白的肽核酸。
5.权利要求1-2中任一项所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物或权利要求4所述的核酸适配体的衍生物在由以下各项组成的组中的任意一项中的用途：
(1)纯化PD-L1蛋白或检测PD-L1蛋白；
(2)表达PD-L1的细胞、组织或活体定位成像；
(3)捕获表达PD-L1的细胞或外泌体；或
(4)激活淋巴细胞、促进细胞因子释放。
6.权利要求1-2中任一项所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物或权利要求4所述的核酸适配体的衍生物在制备用于抑制肿瘤增殖、转移的药物中的用途。
7.一种试剂盒，其特征在于包含权利要求1-2中任一项所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物或权利要求4所述的核酸适配体的衍生物。
8.权利要求1-2中任一项所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物或权利要求4所述的核酸适配体的衍生物在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于选自由以下各项组成的组中的任意一项：
(1)纯化PD-L1蛋白或检测PD-L1蛋白；
(2)表达PD-L1的细胞、组织或活体定位成像；
(3)捕获表达PD-L1的细胞或外泌体；
(4)抑制肿瘤增殖、转移；或
(5)激活淋巴细胞、促进细胞因子释放。
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