CN105111283B - 一种小肽及由该小肽连接形成的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种小肽，及其筛选方法与应用，在应用方面涉及由该小肽连接载体部分和靶向肽组成的递送组合物和由该小肽连接载体部分和具有促进免疫功能的短肽组成的具有促进免疫功能的组合物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种小肽，及其筛选方法与应用，在应用方面涉及由该小肽连接载体部分和靶向肽组成的递送组合物和由该小肽连接载体部分和具有促进免疫功能的短肽组成的具有促进免疫功能的组合物。
背景技术
exosome是一种由细胞及体液分泌的生物纳米囊泡结构，直径约为30-100nm，能够携带内源的mRNA、miRNA和蛋白等，是生物体内天然的细胞信使，可以介导细胞间信号传导、细胞物质的交换以及细胞中抗原的递呈等生物学过程。最近的研究表明，exosome具备携带供体细胞生物学信息的特性，可作为临床疾病诊断的指标、其携带miRNA的exosome可以用于肿瘤的治疗、通过将药物转载到exosome中，可作为生物纳米药物运输载体等方面。但目前对于exosome的表面修饰的研究报道较少，已有的研究均为利用重组质粒将靶向短肽和exosome表面膜蛋白在细胞水平进行重组表达，通过收集释放的exosome，达到对exosome的表面修饰。但由于该方法存在质粒转染效率较低、靶向短肽融合表达表达构象不清以及exosome回收效率较低等缺点，严重影响到exosome做为运输载体的开发应用前景。因此，研发一种新型高效的exosome表面修饰方法，对于exosome作为运输载体的研究具有非常重要的意义。
本发明利用exosome膜表面稳定表达的膜蛋白CD63进行噬菌体展示文库筛选，获得和CD63蛋白特异性结合的小肽，并确认小肽和exosome表面的CD63蛋白具有特异结合的能力，并能够将特定的靶向短肽或具有促进免疫功能的短肽连接到exosome表面，达到对exosome的表面进行修饰的目的。通过对修饰后exosome在体内、体外功能的检测，确定小肽作为linker短肽的修饰方法可行，为后续的研究提供一种高效、简便的修饰手段。
发明内容
本发明创造提供一种小肽及由该小肽连接形成的组合物，其中所述小肽的多核苷酸包含选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:21或SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39或与上述任一序列具有至少80％同源性的序列，再优选为至少具有90％相同性，更优选为至少具有95％、96％、97％、98％、99％的相同性。
其中所述小肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38或SEQ IDNO:40具有至少80％同源性的序列，再优选为至少具有90％相同性，更优选为至少具有95％、96％、97％、98％、99％的相同性。
进一步，其中所述小肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38或SEQID NO:40，并优先为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。
进一步，所述小肽为人工合成或利用噬菌体肽库筛选所得。
进一步，所述小肽的筛选方法为体外重组跨膜蛋白loop区，并以此为底物进行噬菌体肽库筛选，所得小肽通过与载体共孵育的方式连接到载体表面跨膜蛋白的loop区上。
进一步，所述跨膜蛋白选自CD63、CD81、CD82、CD9、Lamp-1、Lamp-2、CD13、CD86、阀蛋白、突触融合蛋白-3、CD2、CD36、CD40、CD40L、CD41a、CD44、CD45、ICAM-1、整联蛋白α4、LiCAM、LFA-1、Mac-1α和β、Vti-1A和B、CD3ε和ζ、CD18、CD37、CD53、CXCR4、FcR、GluR2/3、HLA-DM(MHC II)、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II成分、TCRβ和四旋蛋白，并优选为CD63。
进一步，所述小肽的筛选方法为体外重组跨膜蛋白CD63的loop区，重组的该loop区的氨基酸序列为SEQ ID NO:41，以该重组的loop区为底物进行噬菌体肽库筛选。在此需要说明的是，跨膜蛋白CD63在exosome膜外有大小两个loop区，本发明涉及的重组CD63的loop区，均为重组CD63的大loop区。
进一步，所述CD63源于exosome表面的跨膜蛋白。
本发明还提供了由上述小肽连接形成的组合物，包括载体部分、小肽和短肽部分，所述小肽用于连接载体部分和短肽部分，所述载体部分包括位于其表面的跨膜蛋白，所述小肽与所述载体表面的跨膜蛋白连接。
进一步，所述短肽部分为靶向肽或具有促进免疫功能的短肽。
当上述小肽用以连接载体部分和靶向肽时，即由该小肽连接形成了一种递送组合物。
进一步，所述小肽的筛选方法为包括但不限于以下三种，第一种方法为直接以载体为底物，进行噬菌体肽库的筛选，所得小肽通过与载体共孵育的方式连接到载体表面蛋白上；第二种方法为体外重组跨膜蛋白，并以此为底物进行噬菌体肽库筛选，所得小肽通过与载体共孵育的方式连接到载体表面跨膜蛋白上；第三种方法为体外重组跨膜蛋白loop区，并以此为底物进行噬菌体肽库筛选，所得小肽通过与载体共孵育的方式连接到载体表面跨膜蛋白的loop区上；并优选第三种方法。
进一步，所述载体为生物纳米材料或非生物纳米材料。
进一步，所述生物纳米材料选自细胞或纳米粒。
进一步，所述纳米粒选自脂质体、囊泡或exosome，并优选为exosome。
进一步，所述跨膜蛋白选自CD63、CD81、CD82、CD9、Lamp-1、Lamp-2、CD13、CD86、阀蛋白、突触融合蛋白-3、CD2、CD36、CD40、CD40L、CD41a、CD44、CD45、ICAM-1、整联蛋白α4、LiCAM、LFA-1、Mac-1α和β、Vti-1A和B、CD3ε和ζ、CD18、CD37、CD53、CXCR4、FcR、GluR2/3、HLA-DM(MHC II)、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II成分、TCRβ或四旋蛋白，并优选为CD63。
进一步，所述小肽的筛选方法为，体外重组exosome表面CD63的loop区，重组的该loop区的氨基酸序列为SEQ ID NO:41，以该重组的loop区为底物进行噬菌体肽库筛选，所得小肽通过与exosome共孵育的方式连接到exosome表面CD63的loop区上。
进一步，筛选所得小肽的氨基酸序列包括与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40具有至少80％同源性的序列。
进一步，筛选所得小肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38或SEQID NO:40，并优选为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。
进一步，所述靶向肽为与待靶向的细胞上存在部分结合的多肽，此外，与待靶向的细胞上存在部分结合并具有靶向作用的脂类也在本发明的保护范围内。
进一步，所述多肽选自RVG、M12、SP94，上述多肽通过共价结合的方式与小肽连接。
在一些技术方案中，所述载体部分负载有抗癌药物，所述载体优选为exosome，即该递送组合物为抗癌药物的递送组合物，该抗癌药物可通过电击转化法或与exosome溶液共孵育的方式装载到exosome内部。
进一步，所述抗癌药物选自阿霉素、阿司匹林、替莫唑胺、紫杉醇、柔红霉素、秋水仙碱、长春新碱；负载有上述药物的递送组合物用于治疗与靶向肽相配合的组织疾病。
进一步，装载有抗癌药物的所述载体部分还被装载有分子探针。
进一步，所述分子探针为带荧光标记的分子信标、核酸分子或量子点，并优选为PKH67标记。
在一些技术方案中，所述载体部分被装载有外源遗传物质，所述载体优选为exosome，即该递送组合物为外源遗传物质的递送组合物，该外源遗传物质可通过电击转化法或利用阳离子脂质体转染剂装载到exosome内部。
进一步，所述外源遗传物质选自外源质粒DNA、siRNA或反义寡核苷酸药物，并优选为反义寡核苷酸药物。
进一步，装载有外源遗传物质的所述载体部分还被装载有分子探针。
进一步，所述分子探针为带荧光标记的分子信标、核酸分子或量子点，并优选为PKH67标记。
在一些技术方案中，所述载体部分仅被装载有分子探针。
进一步，所述分子探针为带荧光标记的分子信标、核酸分子或量子点，并优选为PKH67标记。
当上述小肽用以连接载体部分和具有促进免疫功能的短肽时，即由该小肽连接形成了一种具有俱进免疫功能的组合物。
进一步，所述小肽的筛选方法为包括但不限于以下三种，第一种方法为直接以载体为底物，进行噬菌体肽库的筛选，所得小肽通过与载体共孵育的方式连接到载体表面蛋白上；第二种方法为体外重组跨膜蛋白，并以此为底物进行噬菌体肽库筛选，所得小肽通过与载体共孵育的方式连接到载体表面跨膜蛋白上；第三种方法为体外重组跨膜蛋白loop区，并以此为底物进行噬菌体肽库筛选，所得小肽通过与载体共孵育的方式连接到载体表面跨膜蛋白的loop区上；并优选第三种方法。
进一步，所述载体为生物纳米材料或非生物纳米材料。
进一步，所述生物纳米材料选自细胞或纳米粒。
进一步，所述纳米粒选自脂质体、囊泡或exosome，并优选为exosome。
进一步，所述exosome具有促进免疫或促进免疫系统的活性。
进一步，所述exosome具有以下一种或多种活性：(i)招募DC细胞(树突状细胞)；(ii)激活DC细胞；(iii)激活免疫系统。
进一步，所述跨膜蛋白选自CD63、CD81、CD82、CD9、Lamp-1、Lamp-2、CD13、CD86、阀蛋白、突触融合蛋白-3、CD2、CD36、CD40、CD40L、CD41a、CD44、CD45、ICAM-1、整联蛋白α4、LiCAM、LFA-1、Mac-1α和β、Vti-1A和B、CD3ε和ζ、CD18、CD37、CD53、CXCR4、FcR、GluR2/3、HLA-DM(MHC II)、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II成分、TCRβ或四旋蛋白。
进一步，所述小肽的筛选方法为，体外重组exosome表面CD63的loop区，重组的该loop区的氨基酸序列为SEQ ID NO:41，以该重组的loop区为底物进行噬菌体肽库筛选，所得小肽通过与exosome共孵育的方式连接到exosome表面CD63的loop区上。
进一步，筛选所得小肽的氨基酸序列包括与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40具有至少80％同源性的序列。
进一步，筛选所得小肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38或SEQID NO:40，并优选为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。
进一步，所述具有促进免疫功能的短肽为HMGN1蛋白的N端片段(简称N1ND)。
本发明还提供上述所述的具有促进免疫功能的组合物的应用，主要用于制备预防和/或治疗免疫系统疾病的药物组合物。
进一步，所述的药物组合物为疫苗组合物。
进一步，所述免疫系统性疾病包括但不限于肿瘤、类风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤真菌病、膜肾球肾炎、炎性肠病和自身免疫性溶血贫血。
综上，本发明提供了一种exosome表面修饰的新方法，即利用exosome膜表面稳定表达的跨膜蛋白CD63位于exosome膜外的loop区蛋白进行噬菌体展示文库筛选，获得与CD63的loop区蛋白特异性结合的小肽，该小肽与exosome表面的CD63的的loop区蛋白具有特异结合的能力，并能够与靶向肽或具有促进免疫功能的短肽共价结合，即使得靶向肽或具有促进免疫功能的短肽连接到exosome表面，达到exosome表面修饰的目的；本发明进行噬菌体肽库筛选的底物为体外重组的CD63的loop蛋白，较重组整个CD63蛋白简单方便，与小肽的连接稳定性强，且使得小肽与CD63结合位点明确，为后续exosome表面修饰提供便利；上述修饰方法克服了现有的质粒转染等表面修饰方法存在的转染效率低的问题，为后续研究提供一种高效、简便的修饰手段；另外，利用上述修饰手段合成的递送组合物及具有促进免疫功能的组合物稳定性好，具有较好的临床应用前景。
附图说明
图1本发明实施例一及实施例二中小肽与细胞表面CD63蛋白的结合特异性及结合效率检测。(a)免疫荧光染色显示组氨酸标记的小肽CP05(SEQ ID NO:2)、CP07(SEQ ID NO:4)分别与细胞膜表面CD63蛋白的结合情况，并以组氨酸标记的短肽scramble(SEQ ID NO:46)作对照。分别以CD63抗体和组氨酸抗体标记，并以不同荧光二抗显示二者相互结合情况；(b，c)免疫沉淀法检测CP05、CP07分别与CD63蛋白的结合情况。利用免疫沉淀法富集CD63蛋白，将组氨酸标记的CP05和CP07分别与CD63蛋白共孵育，利用组氨酸抗体分别检测两种小肽与CD63蛋白的结合能力；(d)小肽CP05、CP07与细胞裂解物中CD63蛋白特异性结合情况检测。利用组氨酸标记的两种短肽与细胞裂解物进行共孵育，利用组氨酸抗体分别检测两种小肽与CD63蛋白的结合特异性。
图2本发明实施例一及实施例二中小肽与exosome表面CD63蛋白的结合特异性及结合效率检测。(a)流式细胞术检测小肽CP05、CP07与exosome结合效率。将荧光标记的两条小肽CP05、CP07分别与exosome共孵育，然后与能够结合蛋白的磁珠(beads)孵育，利用流式细胞仪检测小肽与exosome的结合效率；(b)荧光共振转移法(FRET)检测CP05、CP07与exosome结合情况。将罗丹明B标记的两条小肽CP05、CP07分别与cellmask deep red标记的exosome共孵育，并以罗丹明B标记的随机短肽Scramble(Scr)为对照，将孵育产物加入细胞中，利用FRET法检测二者的结合效率；(c)免疫沉淀法检测CP05、CP07分别与CD63蛋白的结合效率检测。利用免疫沉淀法富集exosome中的CD63蛋白，将组氨酸标记的CP05和CP07分别与CD63蛋白共孵育，利用组氨酸抗体分别检测两种小肽与exosome中CD63蛋白的结合能力；(d)小肽CP05、CP07与exosome裂解物中CD63蛋白特异性结合情况检测。利用组氨酸标记的两种短肽与exosome裂解物进行共孵育，利用组氨酸抗体分别检测两种小肽与exosome中CD63蛋白的结合特异性。
图3本发明实施例一中小肽CP05与exosome结合血清稳定性检测。(a)流式细胞术检测不同时间点20％FBS血清消化后CP05与exosome结合稳定性。将荧光标记的两条小肽CP05、CP07分别与exosome共孵育，20％FBS中37℃消化，收集不同时间点的孵育产物，并将其与磁珠偶联，然后利用流式细胞仪检测小肽与exosome的结合稳定性；(b)FRET法检测不同时间点20％FBS血清消化后荧光共振转移强度。
图4本发明实施例一中小肽CP05介导M12(SEQ ID NO:43)、RVG(SEQ ID NO:42)和SP94(SEQ ID NO:44)三种靶向短肽分别对exosome的靶向修饰效率检测。(a)M12-CP05修饰后exosome(M12-CP05+EXO)在小鼠体内的组织分布检测。TA:tibialis anterior(胫骨前肌),Q:quadriceps(股四头肌),G:gastrocnemius(腓肠肌),T:triceps(三头肌),H:heart(心肌),L:liver(肝),K:kidney(肾),S:spleen(脾)；(b)RVG-CP05修饰后的exosome(RVG-CP05+EXO)在小鼠体内的组织分布检测。Q:quadriceps,H:heart(心肌),L:liver(肝),K:kidney(肾),S:spleen(脾),B:brain(脑)；(c)SP94-CP05修饰后的exosome(SP94-CP05+EXO)在小鼠体内的组织分布检测。Q:quadriceps(股四头肌),H:heart(心肌),L:liver(肝),K:kidney(肾),S:spleen(脾),T:tumor(肿瘤)。
图5本发明实施例一中小肽CP05介导M12对囊泡结构(microvesicles，MV)的靶向修饰效率检测。将体外合成的M12-CP05与荧光标记的MV共孵育过夜，将孵育产物通过尾静脉注射到小鼠体内，30min后取材，并利用小动物活体成像系统检测M12-CP05+MV在小鼠体内的分布情况。Q:quadriceps(股四头肌),G:gastrocnemius(腓肠肌),TA:tibialisanterior(胫骨前肌):T:triceps(三头肌),H:heart(心肌),L:liver(肝),K:kidney(肾),S:spleen(脾)。
图6本发明实施例一中exosome作为药物运输载体的功能测试。(a)将反义寡核苷酸药物MOE-RNA装载到exosome中，以此介导mdx小鼠TA肌中dystrophin蛋白恢复表达。利用免疫组化检测肌纤维组织中dystrophin蛋白阳性纤维分布情况。mdx组代表未治疗组肌纤维中dystrophin阳性纤维的分布，C57组代表野生型正常小鼠肌纤维中dystrophin阳性纤维的分布，MOE-RNA组代表对mdx小鼠肌肉组织局部注射MOE-RNA后dystrophin阳性纤维的分布，EXO+MOE-RNA组代表通过点激法装载MOE-RNA至exosome中，局部注射治疗后dystrophin阳性纤维的分布；(b)反义寡核苷酸药物MOE-RNA装载到exosome后介导mdx小鼠外显子23跳读效率检测。
图7本发明实施例二中小肽CP05介导警报素HMGN1的功能短肽N1ND(SEQ ID NO:45)对exosome的抗原负载能力测试。(a)警报素HMGN1的功能短肽N1ND活化DC表面共刺激因子CD80、CD86、ICAM的表达情况；(b)N1ND-CP05+EXO刺激T细胞活化相关免疫因子IFN-γ的分泌水平；(c)N1ND-CP05+EXO刺激T细胞活化相关的免疫因子IL2的分泌水平；(d)N1ND-CP05+EXO活化的T细胞特异性免疫杀伤肝癌细胞的效率。
图8本发明实施例一中肌肉组织中提取的RNA的RT-PCR反应条件示意图。
图9本发明实施例一中肌肉组织中提取的RNA的PCR反应条件示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明创造进行进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或本领域技术人员在知识范围内能够推知的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中涉及的试剂和仪器用具，通常为商用可市购产品，或能够通过其他公开途径获得的产品。
下述实施例中涉及的主要仪器设备说明：
| 仪器设备名称 | 选购公司/国别 |
| 小动物活体成像仪 | IVIS Spectrum PE公司/美国 |
| 超净工作台 | AIRTECH/中国 |
| 台式高速冷冻离心机 | Eppendorf公司/德国 |
| PCR仪 | BIO-RAD/美国 |
| 梯度PCR仪 | Eppendorf公司/德国 |
| 电泳仪 | 北京市六一仪器厂/中国 |
| 凝胶成像系统 | 上海Tanon公司/中国 |
| 电热恒温培养箱 | 天津中环实验电炉有限公司/中国 |
| 高压蒸汽灭菌器 | SANYO公司/日本 |
| 流式细胞仪 | BD FACS ArialⅡ/美国 |
| 正置荧光显微镜 | Olympus BX51/日本 |
| 倒置荧光显微镜 | Olympus IX71/日本 |
| 共聚焦荧光显微镜 | Olympus公司/日本 |
| 全自动酶标仪 | Bio-Tek Synergy HT/美国 |
| -80℃低温冰箱 | SANYO公司/日本 |
| -20℃低温冰箱 | 海尔公司/中国 |
| 制冰机 | GRANT公司/美国 |
| 微量核酸测定仪 | NanoDrop 2000c/美国 |
下述实施例中涉及的噬菌体随机展示文库购自Ph.D-12,New England Bio-lab公司。
实施例一小肽连接exosome和靶向肽形成的递送组合物
本实施例的实施过程如下：
1)体外重组exosome表面CD63的loop区，以该重组的loop区为底物进行噬菌体肽库筛选，获得与CD63的loop区特异性结合的小肽；
2)将所得小肽与靶向肽以偶联的方式结合，结合所得嵌合短肽通过与exosome共孵育的方式连接到exosome表面CD63的loop区上；
3)利用电击转化法将反义寡核苷酸药物MOE-RNA装载到exosome中，研究经上述靶向修饰后的exosome作为药物载体的应用。
实验部分：
1、CD63特异结合小肽的筛选
实验步骤如下：
(1)体外重组CD63的loop区蛋白按10μg包被到酶链条中，4℃包被过夜。
(2)洗去多余抗原，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗3遍，每次5min。
(3)加入100μL 5％BSA封闭液封闭1h。
(4)吸去封闭液，加入噬菌体随机展示文库(1012pfu)孵育2h.。
(5)用PBS洗7遍，洗去未结合的噬菌体。
(6)加入90μL Gly-HCl(pH 2.2)，室温洗脱10min后加入5μL Tris-HCl(pH 8.8)中和。
(7)收集洗脱液，进行回收产物滴度测定。
(8)按上述方法利用上轮回收噬菌体产物重复对CD63的loop区蛋白进行2轮筛选，每次包被CD63蛋白的量依次减半。
(9)将最终回收产物进行二代测序，选取包含重复序列克隆数排名前20的序列作为候选，并以排名前2的CP05和CP07进行后期验证，并对该20个序列组成进行数据库比对分析。
2、小肽的体外验证
2.1小肽与细胞表面CD63蛋白的共定位测试
(1)体外分别合成带有组氨酸标签的小肽CP05、CP07和对照肽Scramble(Scr)，将合成的小肽与细胞在37℃培养箱中共孵育2小时。
(2)用4％多聚甲醛固定细胞，4℃固定30min。
(3)用5％BSA封闭1h。
(4)加入组氨酸标签抗体(鼠源)和CD63抗体(兔源)，室温2-3h或4℃孵育过夜。
(5)用PBS洗3遍，每次5min。
(6)加入两种不同荧光标记的抗鼠、抗兔二抗，室温孵育1h。
(7)用PBS洗3遍，每次5min。
(8)Hoechst 33342染核，封片，共聚焦显微镜观察，结果见图1a。
2.2小肽与CD63蛋白结合效率测试
(1)用IP裂解液(用前加入蛋白酶抑制剂)裂解C2C12细胞，提取细胞蛋白。
(2)将Protein A-beads加入细胞裂解液中孵育，4℃15min，4℃，14000g离心15min。
(3)取上清进行蛋白浓度测定，按1mg蛋白中加入1μg的CD63抗体和50μg ProteinA-beads，4℃缓慢摇动过夜(同时以IgG抗体为对照)。
(4)14000g离心收集沉淀，弃上清，用预冷的裂解buffer洗3遍。
(5)沉淀分别与小肽CP05-H6、CP07-H6共孵育4℃过夜，3000g离心。
(6)PBS清洗3次，每次5min。
(7)加入适量Loading buffer，变性，进行SDS-PAGE电泳，并以His-tag抗体进行western blot检测，结果见图1b，图1c。
2.3小肽与CD63蛋白的特异性结合测试
(1)用IP裂解液(用前加入蛋白酶抑制剂)裂解C2C12细胞，提取细胞蛋白。
(2)将带有组氨酸标签的小肽CP05-H6、CP07-H6分别与20μg细胞蛋白进行共孵育。
(3)共孵育产物进行SDS-PAGE电泳，转膜，用5％脱脂奶粉进行封闭。
(4)以组氨酸标签抗体孵育过夜。
(5)脱脂奶粉洗3次，每次5min。
(6)羊抗鼠二抗孵育1h。
(7)PBST洗3次，每次15min。
(8)显影，定影，结果见图1d。
2.4小肽与exosome的结合效率测试
流式细胞术检测：
(1)将FAM荧光标记的小肽分别与exosome进行共孵育过夜。
(2)回收exosome，PBS洗3遍。
(3)将回收的exosome与beads室温共孵育2h。
(4)离心回收beads，PBS洗3遍。
(5)流式细胞仪检测exosome上结合的荧光标记短肽。结果见图2a。
荧光共振转移(FRET)检测：
(1)将罗丹明标记的小肽CP05、CP07和Scramble分别与cell mask deep red标记的exosome于4℃共孵育过夜。
(2)收集exosome，将exosome加入到无血清培养的hepa1-6细胞中，12小时后利用共聚焦显微镜观察FRET减弱程度，结果见图2b。
2.5小肽与exosome表面CD63蛋白的结合效率测试
(1)超离法离心收集exosome，以IP裂解液重悬exosome，并置冰上裂解30min。
(2)将Protein A-beads加入细胞裂解液中孵育，4℃15min，4℃，14000g离心15min。
(3)取上清进行浓度测定，加入1μg的CD63抗体和50μg Protein A-beads，4℃缓慢摇动过夜(同时以IgG抗体为对照)。
(4)14000g离心收集沉淀，弃上清，用预冷的裂解buffer洗3遍。
(5)沉淀与小肽CP05-H6共孵育4℃过夜，3000g离心。
(6)PBS清洗3次，每次5min。
(7)加入适量Loading buffer，变性，进行SDS-PAGE电泳，并以His-tag抗体进行检测。结果见图2c。
2.6小肽与exosome表面CD63蛋白的特异性结合测试
(1)超离法离心收集exosome，用蛋白IP裂解液裂解exosome。
(2)将带有组氨酸标签的小肽CP05-H6、CP07-H6分别与20μg的exosome进行4℃摇床孵育过夜。
(3)加入适量Loading buffer，变性，进行SDS-PAGE电泳，以His-tag抗体进行western blot检测，结果见图2d所示。
2.7小肽与exosome表面CD63蛋白的结合稳定性测试
小肽与exosome通过表面蛋白CD63结合，形成的复合结构CP05+EXO在血清存在的环境中的稳定性对于基于小肽的exosome修饰方法研究具有非常重要的意义。因此，本专利利用流式细胞术、荧光共振能量转移(FRET)等方法深入检测了CP05+EXO结构经血清消化后的稳定性，为该小肽的后期修饰提供理论支持。
流式细胞术检测具体方法如下：
(1)将罗丹明标记的小肽与exosome共孵育过夜。
(2)利用100KD的滤膜将多余的小肽去除，PBS洗3次，回收exosome。
(3)exosome中加入20％FBS，置37℃中消化不同时间点，分别收集0h、30min、1h、2h、6h、12h共6个时间点。
(4)收集不同时间点处理的exosome，将exosome与磁珠共孵育2小时，利用流式细胞仪检测不同时间点exosome上所携带的荧光强度，结果见图3a。
荧光共振能量转移(FRET)方法如下：
(1)将罗丹明标记的小肽与cell mask deep red标记的exosome于4℃共孵育过夜。
(2)收集exosome，加入20％FBS置37℃中消化不同时间点。分别收集0h、30min、1h、2h、6h、12h共6个时间点。
(3)收集不同时间点处理的exosome，将exosome加入到无血清培养的hepa1-6细胞中，12小时后利用共聚焦显微镜观察FRET减弱程度，结果见图3b。
3、小肽的体内验证
3.1小肽与靶向肽及exosome结合后在小鼠体内分布情况测试
选取已报道靶向短肽RVG(脑靶向肽)、M12(肌肉靶向肽)和SP94(肝癌靶向肽)为验证模型，将以上三种短肽分别与CP05在体外以偶联的形式合成嵌合短肽，并分别命名为RVG-CP05、M12-CP05和SP94-CP05，将上述三种嵌合短肽分别与PKH67标记的exosome共孵育过夜，将孵育产物RVG-CP05+EXO、M12-CP05+EXO和SP94-CP05+EXO分别通过尾静脉注射到小鼠体内，30min后取材，并利用小动物活体成像系统检测上述孵育产物在小鼠体内的分布情况，同时以未修饰的exosome为对照。
具体方法如下：
(1)超速离心收集exosome，并利用PKH67对exosome进行荧光标记。
(2)将PKH67标记的exosome按30μg中加入100μg嵌合短肽，4℃孵育过夜。
(3)将孵育后形成的SP94-CP05+EXO以尾静脉注射的方法注入小鼠体内，同时以未修饰的exosome作为对照。
(4)注射2h后，用PBS进行肝门静脉灌流，取材。
(5)小动物成像系统观察各组织中荧光信号，结果见图4。
3.2小肽靶向修饰其他生物膜的功能测试
为验证候选短肽CP05与其他类型生物膜结构的结合能力，本研究进一步提取了细胞分泌的另一种囊泡结构(microvesicles,MV)将M12-CP05与MV共孵育，利用小动物成像系统检测经过靶向修饰的MV的体内分布情况，用以判断CP05在其他类型生物膜结构上应用的广泛性。
具体方法如下：
(1)高速离心法收集肌肉细胞C2C12分泌的MV，并利用PKH67对MV进行荧光标记。
(2)将PKH67标记的MV按30μg中加入100μg嵌合短肽，4℃孵育过夜。
(3)将孵育后形成的SP94-CP05+MV以尾静脉注射的方法注入小鼠体内，同时以未修饰的MV作为对照。
(4)注射2h后，用PBS进行肝门静脉灌流，取材。
(5)小动物成像系统观察各组织中荧光信号，结果见图5。
3.3靶向修饰后的exosome作为药物运输载体的功能测试
Exosome的药物装载效率直接决定了exosome应用于临床治疗的意义。2’-O-甲氧乙基修饰的RNA(2’-O-Methoxyethyl RNA，简称MOE-RNA)是一种反义寡核苷酸类药物，本发明中用于介导dystrophin基因发生特异性外显子跳读，诱导dystrophin蛋白恢复表达，从而达到治疗杜兴肌肉萎缩症的效果。本发明通过对exosome中药物装载方法的优化，利用电击转化法，在400V，125uF的条件下将反义寡核苷酸药物MOE-RNA装载到exosome中，并检测装载有MOE-RNA的M12-CP05+EXO介导mdx小鼠外显子跳读效率及诱导dystrophin蛋白表达水平，结果见图6。
具体操作方法如下：
肌肉组织免疫组化染色：
(1)利用冰冻切片机将小鼠前胫骨肌(TA)组织切成8μm厚的切片；
(2)PBS浸泡15min，加入含20％胎牛血清(FBS)，20％山羊血清(NGS)的封闭液封闭1小时；
(3)弃封闭液，加入dystrophin抗体(1:3000)孵育2小时；
(4)PBS洗3遍，加入荧光二抗，孵育1小时；
(5)PBS洗3遍，封片，晾干，荧光显微镜观察。
肌肉组织RNA提取方法如下：
(1)用冷冻切片机收集组织于1.5mlEP管内，按250μL/孔加入TRIzol试剂，吹打混匀；
(2)按50μL/管加入氯仿，振荡器振荡混匀15s，室温静置5mins；
(3)12 000r/min、4℃离心15mins；
(4)将上清转移到已加有125μL/管的异丙醇中，用手轻轻混匀，室温静置20mins；
(5)12 000r/min、4℃离心10mins；
(6)弃上清，按250μL/管加入75％乙醇(DEPC水配制)，用手晃动几次使沉淀悬起来；
(7)7 600r/min、4℃离心5mins；
(8)弃上清，微甩一下，用枪将上清尽量去除，开盖风干10-15mins；
(9)20μL/管DEPC水回溶，55℃加热10mins；
(10)Nano drop测定RNA浓度。
RT-PCR和PCR反应条件
RT-PCR反应体系：
RT-PCR反应条件见图8。
PCR反应体系：
PCR反应条件见图9。
结果与分析部分：
1、小肽体外验证结果
本次筛选通过将体外重组的CD63蛋白包被在酶联板孔中，通过3轮噬菌体展示文库筛选，利用二代高通量测序，获得能够和CD63蛋白结合的小肽CP05和CP07。为验证小肽和CD63蛋白的特异性结合效率，本研究体外合成CP05和CP07，分别将2条His-tag标记的小肽与细胞共孵育，利用免疫荧光染色法检测在细胞水平，CP05、CP07和细胞膜表面CD63蛋白的共定位情况(结果见图1a)，结果显示小肽能够与细胞膜表面的CD63蛋白结合。进一步为验证小肽与CD63蛋白的结合的特异性及结合效率，本研究提取细胞蛋白并用免疫共沉淀法浓缩CD63蛋白，分别将CP05-H6、CP07-H6与免疫共沉淀获得的CD63蛋白共孵育，结果显示两条小肽都能够与CD63蛋白结合(结果见图1b，c)。将CP05-H6和CP07-H6与细胞裂解物共孵育后验证特异性结合反应，结果显示二者均与CD63蛋白有特异性结合(结果见图1d)。
进一步验证小肽与exosome膜表面CD63的结合效率及结合特异性，结果显示，与荧光FAM标记的对照肽Scramble(简写为Scr)相比，CP05、CP07均能与exosome结合(结果见图2a)；荧光共振能量转移法(FRET)检测罗丹明标记的CP05、CP07能够和cellmask deep red标记的exosome发生荧光共振转移现象(结果见图2b)，提示小肽CP05和CP07均能够和exosome结合；免疫共沉淀exosome中CD63蛋白后分别与CP05-H6、CP07-H6共孵育，检测发现两条小肽均与exosome表面CD63有明显的结合(结果见图2c)；进一步对其结合的蛋白特异性检测显示CP05-H6、CP07-H6均能与exosome膜表面的CD63蛋白特异性结合(结果见图2d)。
短肽介导的exosome靶向性修饰功效依赖于该复合体的血清稳定性，因此，进一步对该结构的血清稳定性进行了检测。结果显示20％FBS消化12小时后短肽仍维持与exosome稳定结合(结果见图3a)；FRET法检测不同时间点消化后荧光共振转移强度(结果见图3b)，提示该结构在血清中能够至少保持12小时稳定性。
2、小肽体内验证结果
为验证小肽作为连接短肽将已知靶向短肽结合到exosome上的能力，本发明选择3条已知靶向短肽RVG(脑靶向肽)、M12(肌肉靶向肽)和SP94(肝癌靶向肽)，分别将CP05和3条靶向短肽合成在一起，验证嵌合短肽对exosome的靶向修饰作用，利用小动物成像系统检测经靶向修饰的exosome在体内组织分布情况(结果见图4)。结果显示M12-CP05修饰后的exosome在小鼠肌肉组织(骨骼肌)的分布明显提高(结果见图4a)。RVG-CP05修饰后的exosome在小鼠脑内的分布与对照组相比有显著性提高(结果见图4b)。SP94-CP05修饰后的exosome在小鼠皮下瘤的分布明显提高，显著高于对照组(结果见图4c)。以上结果均表明，利用小肽CP05，exosome能够被靶向肽修饰，并能够明显改变exosome在小鼠体内的分布。
另外，本发明利用CP05对其他种类的生物膜结构(Microvesicles,MV)进行了肌肉靶向肽的修饰，结果显示CP05同样能够显著提高MV在肌肉组织中的分布(结果见图5)，表明该小肽能够和不同的生物纳米膜结构结合，从而达到靶向修饰的目的。
另外，本研究发现，利用电击转化法能够有效地将MOE-RNA装载到exosome中(结果见图6a)，装载有MOE-RNA的M12-CP05+EXO能够介导外显子23跳读，且能够诱导dystrophin表达(结果见图6b)。以上结果显示exosome可以作为药物运输载体对反义寡核苷酸类药物进行运输，也为exosome靶向修饰应用的广泛性提供了实验依据。
实施例二小肽连接exosome和NIND形成的具有促进免疫作用的组合物
本实施例的实施过程如下：
1)体外重组exosome表面CD63的loop区，以该重组的loop区为底物进行噬菌体肽库筛选，获得与CD63的loop区特异性结合的小肽CP05；
2)将所得CP05与警报素分子(HMGN1)的功能短肽N1ND进行偶联，结合所得嵌合短肽通过与exosome共孵育的方式连接到exosome表面CD63的loop区上。
实验部分：
1、CD63特异结合小肽的筛选
该部分与实施例1的相应部分相同，不再赘述。
2、小肽的体外验证
该部分与实施例1的相应部分相同，不再赘述。
3、小肽的体内验证
3.1小肽与N1ND及exosome结合后在对肿瘤组织免疫应答测试
警报素(简称HMGN1)是一种由细胞分泌的信号分子，可以招募机体内未成熟的树突状细胞(DC细胞)。本研究利用CP05将HMGN1蛋白的N端片段(简称N1ND)连接到exosome表面，利用N1ND招募未成熟的DC细胞的同时，利用exosome本身携带的抗原活化招募的DC细胞，达到杀伤肿瘤细胞的能力。本发明利用CD63结合小肽CP05与N1ND进行偶联形成嵌合短肽，将该嵌合短肽与exosome共孵育，检测N1ND-CP05+EXO复合体对肿瘤细胞的免疫应答反应及杀伤情况，结果见图7。
具体方法如下：
(1)体外合成N1ND-CP05短肽，将短肽与exosome共孵育过夜。
(2)将复合物加入到未成熟的DC细胞中，48小时后利用流式细胞法检测DC2.4表面因子CD80、CD86、ICAM的表达水平。同时以未刺激DC细胞为对照(Sham组)。结果见图7a。
(3)将经N1ND-CP05+EXO刺激成熟的DC2.4细胞加入到T细胞中，12小时后检测T细胞分泌的IL-2、INF-γ因子表达水平，结果见图7b和图7c。
(4)将经成熟的DC2.4刺激的T细胞加入到hepa1-6细胞中，利用LDH方法检测T细胞对hepa1-6细胞的杀伤效果，结果见图7d。
结果与分析部分：
1、小肽体外验证结果
该部分与实施例1的相应部分相同，不再赘述。
2、小肽体内验证结果
N1ND-CP05-EXO能明显活化DC表面关键共刺激因子(结果见图7a)。与未经刺激的DC细胞组(Sham)相比，N1ND具有明显的特异性免疫应答效应，能够明显提高T细胞活化相关的免疫因子IFN-γ和IL2的分泌(结果见图7b和图7c)，并且，N1ND活化的T细胞能明显产生特异性免疫杀伤肝癌细胞(结果见图7d)。
Claims (10)
1.一种小肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO:2。
2.由权利要求1所述的小肽连接形成的一种递送组合物，其特征在于，由载体部分、小肽和短肽部分组成，所述小肽用于连接载体部分和短肽部分，所述载体部分包括位于其表面的跨膜蛋白，所述小肽与所述载体表面的跨膜蛋白连接。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述载体为生物纳米材料，所述生物纳米材料选自细胞或纳米粒，所述纳米粒为脂质体或exosome中的一种。
4.如权利要求3所述的组合物，所述纳米粒为exosome。
5.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述跨膜蛋白为CD63。
6.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述短肽部分为靶向肽或具有促进免疫功能的短肽。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述靶向肽为RVG、M12、SP94中的一种。
8.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述具有促进免疫功能的短肽为N1ND。
9.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述载体部分负载有抗癌药物，所述抗癌药物为阿霉素、阿司匹林、替莫唑胺、紫杉醇、柔红霉素、秋水仙碱或长春新碱。
10.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述载体部分负载有外源遗传物质,所述外源遗传物质为核酸或反义寡核苷酸，所述反义核寡苷酸为MOE-RNA。
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