CN109837281A - 特异性结合s100p蛋白的核酸适配体及其筛选、鉴定和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特异性结合S100P蛋白的核酸适配体及其筛选、鉴定和应用，包括以下步骤：设计并构建随机寡核苷酸文库，经SELEX筛选富集、测序、流式分析、免疫荧光及斑点杂交等验证，最终获得能与S100P蛋白特异性结合的寡核苷酸，即核酸适配体，命名为AptS100P‑1，其序列如下所示5’‑ATCCAGAGTGACGCAGCACAGGACTGC TTAGGATTGCGAAGTGCATAGAGCGGCTATATGGACACGGTGGCTTAGT‑3’。

Description

特异性结合S100P蛋白的核酸适配体及其筛选、鉴定和应用

技术领域

本发明属于分析化学与医学生物领域，涉及特异性结合S100P的核酸适配体及其筛选、鉴定和应用，具体还涉及该核酸适配体在设计、制备验证、应用于基础研究与临床治疗各个方面。

背景技术

结直肠癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一。尽管在过去的几十年里它的治疗和预后有了改善，但结直肠癌的手术治愈率、5年生存率始终徘徊在50％左右。近年来，结直肠癌的靶向治疗越来越受关注，实现肿瘤靶向治疗则需要有在肿瘤细胞内高表达的靶标，S100P蛋白作为一种钙结合蛋白，介导钙依赖的信号转导通路，参与调节细胞周期进程等多种细胞生长分化过程，它在多种癌症组织中表达上调，与临床预后不良有关。已有研究表明S100P的过表达与结直肠癌的生长、转移和侵袭有关。因此，S100P有望成为一个有效的结直肠癌治疗靶点。核酸适配体(Aptamer)是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中得到的小分子RNA或DNA，可充当性能优良的能特异性识别肿瘤靶标的配体。核酸适配体具有较大表面积和大量受体结合位点且空间三维构型易形成螺旋、发卡、茎环、凸环、三叶草等结构，能够与靶标物质紧密结合，具有高亲和力与强特异性；同时，核酸适配体靶标广泛，包括组织、细胞、病毒、蛋白等；再次，其易于标记荧光且活性不受影响。因此易于应用于成像检测技术，如荧光显微镜成像和流式细胞术；其次筛选获得的核酸适配体易于体外大量合成，重复性好、稳定性高且易于贮存；最后，其操作简便易行，成本低。

目前国内外尚未有S100P核酸适配体的报道。本申请拟筛选首个S100P核酸适配体，以期为结直肠癌治疗提供新思路。(1.Kaur H,Bruno J G,Kumar A,et al.Aptamers inthe therapeutics and diagnostics pipelines[J].Theranostics,2018,8(15):4016；2.Jiang L,Lai Y K,Zhang J,et al.Targeting S100P inhibits colon cancer growthand metastasis by Lentivirus-mediated RNA interference and proteomic analysis[J].Molecular medicine,2011,17(7-8):709-716；3.Ahmadyousefi Y,Malih S,MirzaeeY,et al.Nucleic acid aptamers in diagnosis of colorectal cancer[J].Biochimie,2019,156:1-11；4.Morita Y,Leslie M,Kameyama H,et al.Aptamer therapeutics incancer:Current and future[J].Cancers,2018,10(3):80；5.General InformationAbout Colon Cancer.National Cancer Institute.2014-05-12[29June 2014]；6.王周平,张维潇.适配体及其研究进展[J].食品与生物技术学报,2013,32(9):897-906)。

发明内容

本发明的目的是针对传统技术中的不足，提供一种特异性结合S100P蛋白核酸适配体及其筛选、鉴定方法和应用于基础研究与临床治疗的探索实验，发明具有可在体外大量、快速合成，制备方法简单，易于修饰，易于偶联不同的基团、蛋白、药物，稳定性优于抗体，利于储存，容易穿透肿瘤组织细胞，免疫原性低等优点。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：该可与S100P结合的核酸适配体命名为AptS100P-1，其序列如下所示：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCACAGGACTGCTTAGGATTGCGAAGTGCATAGAGCGGCTATATGGACACGGTGGCTTAGT-3’。

进一步地，特异性结合S100P蛋白的核酸适配体AptS100P-1的核苷酸序列上的某一位置被化学修饰或偶联不同的基团、蛋白、药物和纳米载体，得到与所述核酸适配体AptS100P-1具有同源核心序列，相同功能用途的核酸序列即核酸适配体AptS100P-1的衍生物。

进一步地，特异性结合S100P蛋白的核酸适配体的筛选包含a)、b)、c)和d)四个步骤：

a)正向筛选

将重组人S100P蛋白与适量琼脂糖镍珠室温孵育一定时间，使其偶联至琼脂糖镍珠上，结合缓冲液(Binding BufferⅠ)重悬备用，洗涤除去未结合物，以此为正向筛选的靶标，将合成的随机文库95℃变性，并缓慢冷却至室温后，加入上述制备好的S100P蛋白偶联的琼脂糖镍珠中室温孵育一定时间，将琼脂糖镍珠洗涤后用焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)处理过并经高温高压灭菌的去离子水重悬，95℃变性一定时间，离心后收集上清作为模板进行PCR扩增，PCR产物通过3％琼脂糖电泳鉴定，选择没有非特异条带的最高扩增循环数作为大量制备PCR产物的条件，以此对每轮筛选中的PCR循环数进行具体优化。

b)ssDNA文库制备

5’端Cy3修饰的ssDNA文库的制备方法如下：用5’端Cy3修饰的上游引物和5’端生物素(biotin)修饰的下游引物进行PCR扩增，将biotin化的PCR产物偶联到链霉亲和素琼脂糖珠上，200mM NaOH解离上游单链，经NAP-5柱脱盐纯化，即为5’端Cy3修饰的ssDNA文库；5’端biotin修饰的ssDNA文库的制备方法如下：用5’端biotin修饰的上游引物和无标签的下游引物扩增，将biotin化的PCR产物偶联至链霉亲和素琼脂糖珠，200mM NaOH解离后弃下游单链，加入50μL 0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，100℃煮沸5min，取离心后上清过NAP-5柱脱盐纯化，即为5’端biotin修饰的ssDNA文库。

c)流式实验检测各轮筛选文库富集程度

为了检测筛选进程，取洗涤重悬后的琼脂糖镍珠与S100P蛋白室温孵育一定时间，洗涤除去未结合物，将Cy3标记的ssDNA文库或核酸适配体95℃变性冷却至室温后，加入上述制备好的S100P蛋白偶联的琼脂糖镍珠中，室温孵育一段时间，洗涤后使用流式细胞仪检测ssDNA文库或核酸适配体的富集程度，观察荧光信号。

d)溶解曲线分析各轮文库富集情况

引物为不带标签的上下游引物，模板为各轮富集文库。

进一步地，筛选得到可与S100P结合的核酸适配体第5轮文库进行高通量测序。

进一步地，该核酸适配体AptS100P-1标记荧光后可作为成像探针，用于荧光显微镜或流式细胞仪的分子成像技术。

进一步地，所述核酸适配体可与S100P蛋白高特异性、高亲和地结合，可作为结直肠癌靶标治疗的配体，为人结直肠癌的治疗提供应用前景。

本发明的有益效果为：本发明的核酸适配体AptS100P-1是一种新型的靶向小分子，与抗体相比具有优势。由于其化学基础为核酸分子，易修饰而并不影响其空间结构与功能,因此易于结合荧光基团应用成像检测技术，如荧光显微镜成像和流式细胞术。本发明通过SELEX技术筛选到首个可与S100P蛋白结合的核酸适配体，该核酸适配体可与S100P蛋白高特异性、高亲和地结合，可作为结直肠癌靶标治疗的配体，为人结直肠癌的治疗提供应用前景。

附图说明

图1为核酸适配体AptS100P-1的序列(图A)及其预测二级结构图(图B)。

图2为本发明实施例1中SELEX筛选中核酸适配体富集情况的流式实验结果。图A为第2、4、5轮筛选得到的ssDNA产物、随机文库与S100P蛋白偶联琼脂糖镍珠的结合情况；图B(阴性对照组)为第2、4、5轮筛选得到的ssDNA产物、随机文库与组氨酸(His)标签重组蛋白偶联琼脂糖镍珠的结合情况。曲线a为空琼脂糖镍珠，曲线b为随机文库，曲线c、d、e分别为第2、4、5轮ssDNA文库。

图3为溶解曲线分析各轮文库富集情况。

图4为top10序列核酸适配体在各轮文库中丰度的富集程度。

图5为非线性回归分析法计算AptS100P-1与S100P蛋白的Kds值。

图6为流式分析AptS100P-1与S100P结合情况。在图6中，曲线a、b分别为S100P蛋白、随机文库与AptS100P-1结合，曲线c、d分别为AptS100P-1、随机文库与His标签重组蛋白结合，曲线e为空琼脂糖镍珠。

图7为Dot Blot实验分析AptS100P-1与S100P结合情况，分别检测了AptS100P-1、随机文库与S100P蛋白的结合情况。

图8为细胞免疫荧光S100P抗体与4种结直肠癌细胞内S100P蛋白靶向结合对照图。

图9为细胞免疫荧光AptS100P-1与4种结直肠癌细胞内S100P蛋白靶向特异结合验证。

图10为流式测定AptS100P-1可与细胞内S100P靶向特异结合验证。图A细胞免疫荧光AptS100P-1与4种结直肠癌细胞内S100P蛋白靶向特异结合验证；图B为细胞免疫荧光S100P抗体与4种结直肠癌细胞内S100P蛋白靶向结合对照图。

图11为斑点杂交(Dot Blot)实验分析AptS100P-1与HT-29细胞上清中分泌型S100P蛋白结合情况，分别检测了S100P抗体、AptS100P-1、HRP、随机文库与S100P蛋白的结合情况。

图12为Transwell迁移实验测定AptS100P-1对SW480细胞迁移影响。

图13为Transwell迁移实验测定AptS100P-1对DLD-1细胞迁移影响。

图14为CCK-8细胞增殖实验检测AptS100P-1对SW480细胞、DLD-1细胞生长的影响。

具体实施方式：

提供以下实施例以更好地理解本发明，而非限制于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料如无特殊说明均为实验室常规材料和试剂，均可从市场上购买。

以下实施例中的SELEX初始文库序列：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-N(40)-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’、上游引物序列：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA、下游引物序列：5’-ACTAAGCCACCGTGTCCA、特异的核酸适配体序列、引物序列及其5’端Cy3或biotin修饰均由上海生工生物合成并经HPLC纯化。单链DNA随机文库，引物序列和后续的核酸适配体序列均由上海生工生物有限公司合成。

细胞来源：以下实施例中所用的结直肠癌细胞株SW480、SW620、DLD-1、HT-29均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

细胞培养基：以下实施例中所用的RPMI-1640培养基、胎牛血清、Trypsin-EDTA和PBS缓冲液均购自Thermo Fisher Scientific公司。

其他试剂：重组人S100P蛋白(6X His-tag)购自Novus Biologicals公司；0.45μm硝酸纤维素膜(NC膜)、Ni-Sepharose Beads、NAP-5脱盐柱、超滤管购自GE Healthcare公司；6×组氨酸多肽(纯度>95％)购自中肽生化有限公司；DPBS(含有Ca2+和Mg2+)、Streptavidin Agarose Beads、tRNA、TurboFect转染试剂、非酶消化液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、超敏发光液、普通发光液、辣根过氧化酶标记山羊抗兔抗体IgG购自Thermo FisherScientific公司；BSA(无蛋白酶)、TEMED、过硫酸铵购自Sigma Aldrich公司；Tween-20、DEPC水、ECL发光试剂盒购自碧云天生物技术公司；氢氧化钠、琼脂糖购自上海生工生物工程有限公司；Lyophilized HS Taq PCR Master Mix试剂盒、50bp DNA Marker购自TAKARA公司；，SsoFast^TM SuperMixs试剂盒购自Bio-Rad公司，Streptavidin-HRP购自R&D systems公司；S100P单克隆抗体购于Abcam公司。

实施例1：S100P特异性核酸适配体的筛选

SELEX筛选流程具体步骤如下：

a)正向筛选

将10μg重组人S100P蛋白(6×组氨酸标签)与适量琼脂糖镍珠(Ni-SepharoseBeads)室温孵育30min，使其偶联至琼脂糖镍珠上，Binding BufferⅠ(1％BSA，0.1％Tween-20，0.2mg/mL tRNA，DPBS，pH7.4)重悬备用，洗涤除去未结合物，以此为正向筛选的靶标。将5OD(约14nmol)合成的随机文库95℃变性，并缓慢冷却至室温后，加入上述制备好的S100P蛋白偶联的琼脂糖镍珠中室温孵育1h。将琼脂糖镍珠洗涤后用DEPC水重悬，95℃变性10min，离心后收集上清作为模板进行PCR扩增(95℃30s；56.3℃30s；72℃30s)。PCR扩增的引物序列如下：上游引物序列：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’；下游引物序列：5’-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’。PCR产物通过3％琼脂糖电泳鉴定，选择没有非特异条带的最高扩增循环数作为大量制备PCR产物的条件，以此对每轮筛选中的PCR循环数进行具体优化。

b)ssDNA文库制备

5’端Cy3修饰的ssDNA文库的制备方法如下：用5’端Cy3修饰的上游引物和5’端biotin修饰的下游引物进行PCR扩增，将biotin化的PCR产物偶联到链霉亲和素琼脂糖珠(Streptavidin Agarose Beads)上，200mM NaOH解离上游单链，经NAP-5柱脱盐纯化，即为5’端Cy3修饰的ssDNA文库；5’端biotin修饰的ssDNA文库的制备方法如下：用5’端biotin修饰的上游引物和无标签的下游引物扩增，将biotin化的PCR产物偶联至链霉亲和素琼脂糖珠，200mM NaOH解离后弃下游单链，加入50μL 0.1％SDS，100℃煮沸5min，取离心后上清过NAP-5柱脱盐纯化，即为5’端biotin修饰的ssDNA文库。以上述制备的ssDNA文库为模板进行下一轮筛选，并逐渐降低S100P蛋白、S100P蛋白偶联的琼脂糖镍珠的用量以及ssDNA文库浓度，逐次缩短筛选时间。正向筛选过程重复了5轮。

c)流式实验检测各轮筛选文库富集程度

为了检测筛选进程，取1μL洗涤重悬后的琼脂糖镍珠与1μg S100P蛋白室温孵育30min，洗涤除去未结合物。将Cy3标记的ssDNA文库(或核酸适配体)95℃变性冷却至室温后，加入上述制备好的S100P蛋白偶联的琼脂糖镍珠中(终浓度200nM)，室温孵育1h。洗涤后使用流式细胞仪(BD bioscience，FACS verse)检测ssDNA文库(或核酸适配体)的富集程度，观察荧光信号。如图2所示，第4轮与第5轮正向筛选得到的ssDNA文库已明显富集，且其他各文库均不与空白琼脂糖镍珠反应。

d)溶解曲线分析各轮文库富集情况

引物为不带标签的上下游引物，模板为各轮富集文库。PCR扩增条件同前。试剂：SsoFast^TM SuperMixs购自Bio-Rad公司。如图3所示，第5轮正向筛选得到的ssDNA文库较其他各轮文库相比已明显富集。

实施实例2：可与S100P结合的核酸适配体的鉴定与性能评估

a)高通量测序及高丰度序列二级结构分析

筛选得到可与S100P结合的核酸适配体第5轮文库(2，4，5轮文库)送上海生工进行高通量测序。数据经分析获得一条高丰度序列，命名为AptS100P-1，其序列如图1所示

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCACAGGACTGCTTAGGATTGCGAAGTGCATAGAGCGGCTATATGGACACGGTGGCTTAGT-3’。由于DNA分子中的嘌呤与嘧啶的配对以及静电作用等力量形成空间三维结构，通过MFold软件预测出AptS100P-1的二级结构，如图1所示，AptS100P-1由两个短茎区和相对的环区构成。从核酸适配体的性质和结构推测，该结构可能与核酸适配体对靶标的特异性结合有关。其次，top10序列核酸适配体在各轮文库中丰度的富集程度如图4所示，AptS100P-1核酸适配体在第5轮文库已明显富集，且其他序列核酸适配体均不反应。

b)流式测定AptS100P-1与S100P结合的亲合力

为测定核酸适配体AptS100P-1与S100P蛋白的亲和力，将5’端Cy3修饰AptS100P-1的最终工作浓度调整为400nM、200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM，用流式细胞仪(方法同前)测定AptS100P-1在不同浓度下与S100P蛋白结合的平均荧光密度(MFI)，并用公式Y＝Bmax X/(Kd+X)对亲和力(Kds)进行计算。图5为不同浓度下AptS100P-1与S100P蛋白结合的流式结果，结果显示，AptS100P-1与S100P蛋白结合的亲和力为94.8±30.1nM。c)流式分析AptS100P-1与S100P结合情况

流式检测具体方法详见实施例1的流式检测分析部分。结果如图6所示，AptS100P-1结合S100P蛋白后，其荧光强度明显增强(曲线a发生右移)，而其它对照荧光强度均没有明显增强。以上，流式测定AptS100P-1可与S100P蛋白特异性结合，排除了其他可能的假阳性反应。

d)Dot Blot实验分析AptS100P-1与S100P结合情况

将1μg S100P蛋白分次点样至硝酸纤维素膜(NC膜)上，室温干燥后用BindingBufferⅡ(3％BSA0.1％Tween-20，0.2mg/mL tRNA，DPBS，pH7.4)封闭。将带biotin标签的随机文库和AptS100P-1 95℃变性冷却后，用Binding BufferⅠ调整终浓度为200nM，与封闭好的NC膜室温孵育1h。将链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP)与NC膜室温反应45min，洗涤后曝光。结果如图7所示，AptS100P-1结合S100P蛋白后，曝光显示斑点印迹，而随机文库对照不显示。以上，Dot Blot实验测定AptS100P-1可与S100P蛋白特异性结合。

e)细胞免疫荧光验证AptS100P-1可与细胞内S100P靶向特异结合

在培养板中将已爬好细胞的玻片用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,简称PBS)浸洗3次，每次3min；用4％的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；0.3％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)室温通透20min；PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加5％牛血清白蛋白(BSA)，室温封闭1h；吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的一抗稀释液或含5’端Cy3修饰的AptS100P-1缓冲液放入湿盒，4℃孵育过夜；加荧光二抗(加5’端Cy3修饰的AptS100P-1缓冲液的可省略此步骤)：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，磷酸盐吐温缓冲液(PBST)浸洗切片3次，每次3min；复染核：滴加4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min 4次洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。如图8、9所示，S100P低表达细胞株SW480荧光强度弱，S100P高表达细胞株SW620、DLD-1和HT-29可见明显荧光，以上，AptS100P-1与S100P抗体效果一致，验证了AptS100P-1可与细胞内S100P靶向特异结合。

f)流式测定AptS100P-1可与细胞内S100P靶向特异结合

将处于对数生长期的细胞，包括SW480、SW620、DLD-1、HT-29四种结直肠癌细胞，分别用无酶消化液消化吹打成单个细胞悬液，1000rpm离心5min后去上清，用1mL 4℃预冷的PBS，反复吹打清洗两次，每次1000rpm离心5min后，去上清。然后分别加入含200nM核酸适配体的缓冲液200μL，室温摇床孵育30min，1000rpm离心5min，洗涤后重悬，用流式细胞仪(BDbioscience，FACS verse)检测荧光强度。结果如图10所示，S100P低表达细胞株SW480荧光强度弱，S100P高表达细胞株SW620、DLD-1和HT-29可见明显荧光，以上，AptS100P-1与S100P抗体效果一致，AptS100P-1可与细胞内S100P蛋白靶向特异结合。

g)Dot Blot实验分析AptS100P-1与细胞上清中分泌型S100P蛋白结合情况

将浓缩后的细胞上清液分次点样至NC膜上，室温干燥后用Binding BufferⅡ(3％BSA，0.1％Tween-20，0.2mg/mL tRNA，DPBS，pH7.4)封闭。将带biotin标签的随机文库和AptS100P-1核酸适配体95℃变性冷却后，用Binding BufferⅠ调整终浓度为200nM，与封闭好的NC膜室温孵育1h。将Streptavidin-HRP与NC膜室温反应45min，洗涤后曝光。结果如图11所示，AptS100P-1结合S100P蛋白后曝光显示斑点印迹，而随机文库对照不显示。同时做了S100P抗体对照(阳性对照)和HRP对照(阴性对照)，S100P抗体对照显示斑点印迹，而HRP对照不显示。以上，Dot Blot实验测定AptS100P-1可与HT-29细胞分泌上清中的S100P特异性结合。

实施实例3：AptS100P-1通过靶向结合S100P蛋白抑制结直肠癌细胞增殖和转移。

a)Transwell迁移实验测定AptS100P-1对SW480细胞、DLD-1细胞迁移影响。

胰酶消化细胞，制备成细胞悬液，无血清培养液洗涤细胞3次，调整细胞至合适浓度，取200μL细胞悬液加入上室并分别加入100nM S100P人重组蛋白和不同浓度的AptS100P-1核酸适配体处理，并将800μL含20％FBS的完全培养基置于下室，37℃培养箱孵育48h。固定与染色：4％多聚甲醛固定细胞30min，0.1％结晶紫染色5min，PBS清洗，3min 3次，棉签轻轻擦拭上室未穿膜细胞。倒置显微镜观察上室膜底部细胞，随机选取5个200倍视野并拍照，计数穿过膜的细胞数。如图12、13所示，AptS100P-1通过靶向结合S100P蛋白抑制结直肠癌细胞(SW480、DLD-1)迁移。

b)CCK8细胞增殖实验检测AptS100P-1对SW480细胞、DLD-1细胞生长的影响。

取对数生长期细胞，消化计数细胞数。调整细胞悬液到合适的浓度，每孔100μL的细胞悬液接种于96孔板，每组设3个复孔及1个空白孔。细胞铺板后，分别加入不同浓度的AptS100P-1核酸适配体和100nM S100P人重组蛋白孵育48h后，每孔分别加10μLCellCounting Kit-8(简称CCK-8)试剂，37℃孵育3h后测定吸光度。将反应溶液用酶标仪在450nm处测定吸光度。如图14所示，AptS100P-1对结直肠癌细胞(SW480、DLD-1)的生长有一定抑制作用。

序列表

<110> 温州医科大学附属第一医院

<120> 特异性结合S100P蛋白的核酸适配体及其筛选、鉴定和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atccagagtg acgcagcaca ggactgctta ggattgcgaa gtgcatagag cggctatatg 60

gacacggtgg cttagt 76

Claims (5)

1.特异性结合S100P蛋白的核酸适配体，命名为AptS100P-1，其特征在于，其序列如下：

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCACAGGACTGCTTAGGATTGCGAAGTGCATAGAGCGGCTATATGGACACGGTGGCTTAGT-3’。

2.特异性结合S100P蛋白的核酸适配体AptS100P-1的衍生物，其特征在于，权利要求1所述核酸适配体AptS100P-1的核苷酸序列上的某一位置被化学修饰或偶联不同的基团、蛋白、药物和纳米载体，得到与所述核酸适配体AptS100P-1具有同源核心序列，相同功能用途的核酸序列。

3.根据权利要求1所述的特异性结合S100P蛋白的核酸适配体的筛选，其特征在于，包含a)、b)、c)和d)四个步骤：

a)正向筛选

将重组人S100P蛋白与适量琼脂糖镍珠室温孵育一定时间，使其偶联至琼脂糖镍珠上，Binding BufferⅠ重悬备用，洗涤除去未结合物，以此为正向筛选的靶标，将合成的随机文库95℃变性，并缓慢冷却至室温后，加入上述制备好的S100P蛋白偶联的琼脂糖镍珠中室温孵育一定时间，将琼脂糖镍珠洗涤后用DEPC水重悬，95℃变性一定时间，离心后收集上清作为模板进行PCR扩增，PCR产物通过3％琼脂糖电泳鉴定，选择没有非特异条带的最高扩增循环数作为大量制备PCR产物的条件，以此对每轮筛选中的PCR循环数进行具体优化；

b)ssDNA文库制备

5’端Cy3修饰的ssDNA文库的制备方法如下：用5’端Cy3修饰的上游引物和5’端biotin修饰的下游引物进行PCR扩增，将biotin化的PCR产物偶联到链霉亲和素琼脂糖珠上，200mMNaOH解离上游单链，经NAP-5柱脱盐纯化，即为5’端Cy3修饰的ssDNA文库；5’端Biotin修饰的ssDNA文库的制备方法如下：用5’端biotin修饰的上游引物和无标签的下游引物扩增，将biotin化的PCR产物偶联至链霉亲和素琼脂糖珠，200mM NaOH解离后弃下游单链，加入50μL0.1％SDS，100℃煮沸5min，取离心后上清过NAP-5柱脱盐纯化，即为5’端biotin修饰的ssDNA文库；

c)流式实验检测各轮筛选文库富集程度

为了检测筛选进程，取洗涤重悬后的琼脂糖镍珠与S100P蛋白室温孵育一定时间，洗涤除去未结合物，将Cy3标记的ssDNA文库或核酸适配体95℃变性冷却至室温后，加入上述制备好的S100P蛋白偶联的琼脂糖镍珠中，室温孵育一段时间，洗涤后使用流式细胞仪检测ssDNA文库或核酸适配体的富集程度，观察荧光信号；

d)溶解曲线分析各轮文库富集情况

引物为不带标签的上下游引物，模板为各轮富集文库。

4.根据权利要求3所述的特异性结合S100P蛋白的核酸适配体的鉴定，其特征在于，筛选得到可与S100P结合的核酸适配体第5轮文库进行高通量测序。

5.权利要求1所述的特异性结合S100P蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体AptS100P-1标记荧光后可作为成像探针，用于荧光显微镜或流式细胞仪的分子成像技术。