CN113789331B - 一种识别肿瘤靶蛋白jup的方法及核酸适体pq-6与应用 - Google Patents

Abstract

一种识别肿瘤靶蛋白JUP的方法及核酸适体PQ‑6与应用，适体PQ‑6识别的靶蛋白JUP在多种肿瘤表面表达，且与肿瘤的侵袭性相关，因此核酸适体PQ‑6特异性识别JUP蛋白的能力可用于多种肿瘤的研究。此外，由于适体PQ‑6具有很强的细胞内化性，因此其可作为靶向载体，与抗肿瘤药物偶联构建靶向递送系统，从而实现肿瘤的靶向治疗同时减少化疗药的非靶效应带来的副作用。

Description

一种识别肿瘤靶蛋白JUP的方法及核酸适体PQ-6与应用

技术领域

本发明具体涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种识别肿瘤靶蛋白JUP的方法及核酸适体PQ-6与应用。

背景技术

细胞膜蛋白在所有生物体中起着重要的作用，包括细胞信号转导、细胞间的相互作用等。在肿瘤的发生与进展过程中，异常的膜蛋白改变可直接反应出癌细胞与其相应的正常细胞之间之间的不同，从而为癌症的诊断提供依据。此外，异常的肿瘤膜蛋白可用于研究肿瘤的发生和发展机制，也可作为肿瘤治疗的有效靶点。因此，肿瘤标志膜蛋白在肿瘤的诊断、进展预测以及检测治疗中都起着极其重要的作用。

JUP蛋白，又名γ连环蛋白，属于连环蛋白家族。其家族成员包括α、β、γ连环蛋白以及p120ctn蛋白。JUP蛋白和β连环蛋白以互斥的方式与钙粘蛋白的连环蛋白结合区域紧密结合，另一端与α连环蛋白结合。α连环蛋白又与肌动蛋白细胞骨架结合形成钙粘蛋白-连环蛋白复合体，在维持细胞正常信号传导和黏附功能中起着重要作用，且可参与肿瘤发生的信号传导，调节肿瘤进展。JUP蛋白已被报道与多种肿瘤的增殖、侵袭相关，如黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌、B细胞急性淋巴细胞白血病、胰腺导管腺癌等。有研究表明，在乳腺癌患者中，JUP蛋白的高表达可使肿瘤细胞粘附在一起，成群进入血液，促进肿瘤向远处转移，导致患者预后差。在卵巢癌的进展中，JUP蛋白的上调促使卵巢癌细胞相互聚集，形成球体，促进癌细胞释放到腹腔。因此，JUP蛋白是肿瘤发生进程中一个有意义的标志物及治疗靶点。

核酸适体是一类短小的能够持异性结合靶标的单链寡核苷酸分子，本质为ssDNA或者ssRNA。可通过体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)，从一个庞大的寡核苷酸文库中筛选得到靶向特异性靶标的核酸适体。核酸适体具有亲和力高、特异性强的优点，能够高效鉴别癌细胞和正常细胞。此外，相较于传统抗体，它还具有分子量小、易改造修饰、制备容易、无免疫原性、毒性低、生物安全性高等优点。因此，核酸适体在基础研究、临床诊断、药物研制等方面展现了广阔的应用前景。我们通过一系列实验证明核酸适体PQ-6通过结合细胞表面的JUP蛋白来特异性识别肿瘤细胞。

靶向配体的研究在肿瘤靶向治疗中具有重要的意义，目前研究比较多的靶向配体主要有抗体、多肽和小分子化合物等，但这些配体在实际应用中存在许多限制。比如：多肽虽然分子量小也易于合成，但其容易发生降解，限制了其在体内的应用；抗体虽然对靶点有较高的亲和力，但其免疫原性高、成本高；小分子化合物虽有诸多优点，但其要求肿瘤细胞表达较多的相应受体，才能实现其靶向作用。与它们相比，核酸适体具有多方面的优势。核酸适体对靶分子具有高特异性和高亲和力，所以其可实现抗癌药物的靶向传递。另外，它易于体外合成，成本低廉，且易于修饰，在体内稳定性好，组织穿透能力强。JUP蛋白在很多肿瘤细胞表面高表达而且可以被细胞内化。

发明内容

为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种识别肿瘤靶蛋白JUP的方法及核酸适体PQ-6与应用，可以用于多种肿瘤细胞的识别诊断、靶向药物系统构建以及肿瘤细胞的机制研究。

本发明采用的技术解决方案是：一种识别肿瘤靶标蛋白JUP的方法，所述的方法通过如下序列的核酸适体对JUP蛋白进行识别：5’-ACTCGCCGAGGGAGGGCTTTCCAGGGTTTCCACTAGGGGATA-3’，或在所述的序列两端均加上引物序列。

5’端所述的引物序列具有19个核苷酸，3’端所述的引物序列具有19个核苷酸。

所述的5’端的引物序列为ACCGACCGTGCTGGACTCA，所述的3’端的引物序列为ACTATGAGCGAGCCTGGCG。

所述的方法通过对核酸适体增加、删减、替换碱基来获得具有类似功能的核酸适体。

所述的核酸适体的两端连接上荧光基团、生物素、酶标记物质、放射性物质、治疗性物质等，来得到功能化的且同样具有结合JUP蛋白能力的核酸适体衍生物。

所述的方法包括以下步骤：

(1)通过胰蛋白酶、蛋白酶K消化实验证明适体PQ-6结合的靶标是细胞膜蛋白；

(2)利用细胞膜与细胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞膜蛋白；

(3)将提取得到的膜蛋白与生物素标记的PQ-6或随机文库孵育，再与包裹有链霉亲和素的琼脂糖球珠孵育，通过pull-down实验得到与适体PQ-6、随机文库结合的蛋白；

(4)利用SDS-PAGE胶分离蛋白，分析PQ-6与随机文库的差异蛋白；

(5)在SDS-PAGE胶上切出差异蛋白，酶解，进行质谱分析；

(6)再利用RNAi敲减技术和流式细胞术验证质谱分析结果，确定靶蛋白为JUP。

一种用于识别肿瘤靶标蛋白JUP的核酸适体PQ-6，所述的核酸适体序列为：

5’-ACCGACCGTGCTGGACTCAACTCGCCGAGGGAGGGCTTTCCAGGGTTTCCACTA

GGGGATAACTATGAGCGAGCCTGGCG-3’。

所述的序列两端或一端包括：放射性标记、治疗性药物连接、荧光标记或生物素标记在内的修饰或改造。

一种核酸适体在制备识别肿瘤靶标蛋白JUP的制剂上的应用。

所述的核酸适体的两端连接上荧光基团、生物素、酶标记物质、放射性物质、治疗性物质等，来得到功能化的且同样具有结合JUP蛋白能力的核酸适体衍生物。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种识别肿瘤靶蛋白JUP的方法及核酸适体PQ-6与应用，核酸适体PQ-6可以用于多种肿瘤细胞的识别诊断、靶向药物系统构建以及肿瘤细胞的机制研究，核酸适体具有靶向性好、结合能力强、可体外合成方便、易于修饰、制作成本低、内化性强等优点，JUP蛋白多种肿瘤表面高表达且其相关适体PQ-6可被细胞内化，所以可将特异性结合JUP的核酸适体PQ-6作为靶向配体，与抗癌药物偶联构建靶向递送系统。

附图说明

图1为靶标类型的鉴定和差异条带；其中图左为靶标类型的鉴定；右为差异条带。

图2为PQ-6与JUP抗体的共定位实验荧光信号图。

图3为Pull-down样本与JUP抗体结合图。

图4为RNAi敲减JUP蛋白后的PQ-6结合能力验证图。

图5为PQ-6和JUP蛋白的亲和力曲线及Kd值。

图6为JUP抗体与适体PQ-6竞争实验，其中图左为JUP抗体竞争适体PQ-6；右为适体PQ-6竞争JUP抗体。

图7为JUP抗体和适体PQ-6的细胞散点图。

图8为正常细胞及被肿瘤上清影响表型的正常细胞的明场及共聚焦成像。

图9为PQ-6的细胞内化性考察。

图10为图10适体PQ-6与阿霉素偶联的荧光图，其中图左为固定适体浓度，配置不同的适体-阿霉素摩尔比；右为固定阿霉素浓度，配置不同阿霉素-适体摩尔比。

图11为流式细胞术考察PQ-6-Dox嵌合体的靶向性，其中图左为PQ-6-Dox嵌合体与TE-1肿瘤细胞；右为PQ-6-Dox嵌合体与HEK-293T对照细胞。

图12为流式细胞术考察嵌合链和适体PQ-6的竞争性。

图13为流式细胞术分析PQ-6-Dox嵌合链的内化性。

图14为共聚焦成像分析PQ-6-Dox嵌合链的靶向性及内化性。

图15为PQ-6-Dox对肿瘤细胞及正常细胞的毒性作用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获的的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验所用细胞系包括：人食管癌细胞细胞系(TE-1)、人胰腺癌细胞(PANC-1)、人口腔鳞癌颈淋巴结转移癌细胞(GNM)、人胚肾细胞系(HEK-293T)、人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)，均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

洗涤缓冲液包含：DPBS，5mM MgCl2，4.5mg/ml葡萄糖。

结合缓冲液包含：DPBS，5mM MgCl2，4.5mg/ml葡萄糖，0.1mg/ml tRNA，1mg/mlBSA。

蛋白封闭液5％BSA溶液：1g BSA，20ml DPBS。

DAN封闭液：4ml结合缓冲液，1ml胎牛血清，5mg蛙鱼精DNA。

本实验所需核酸适体均交由上海生工生物工程有限公司合成。

购买试剂：

细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒、RIPA裂解液、PMSF(100mM)、Hoechst33342活细胞染色液均购自上海碧云天生物技术有限公司。

DPBS、BSA、胰蛋白酶、蛋白酶K、DMEM培养基及RPMI1640培养基等购于赛默飞公司。

无酶细胞消化液购自北京普利莱基因技术有限公司。

siRNA及RNAi转染试剂购自上海吉玛制药技术有限公司。

盐酸阿霉素购自上海麦克林生化科技有限公司。

Omni-PAGE预制胶、双色预染蛋白Marker、TBS/Tween缓冲液、快速转膜缓冲液、Omni-ECL超灵敏化学发光检测试剂盒、WB一抗稀释液、山羊抗兔IgG-HRP、ECL化学发光液、脱脂奶粉、loading buffer、考马斯亮蓝染色液等购于上海雅酶生物医药科技有限公司。

Anti-gamma catenin antibody购自北京博奥森生物技术有限公司；

gamma Catenin Antibody(CTNG/1664)[FITC]购自Novus Biologicals公司。

一、靶标类型的鉴定

1.ssDNA的准备：将ssDNA在13000rpm，4℃下高度离心3分钟，将粉末聚底，加入无菌DPBS溶液，配成100μM体系。取0.5μl核酸适体PQ-6和随机文库(Library)，加入199.5μl结合缓冲液，使得DNA终浓度在250nM,95℃变性10分钟后冰上静止10分钟，待用。

PQ-6序列：

ACCGACCGTGCTGGACTCAACTCGCCGAGGGAGGGCTTTCCAGGGTTTCCACTAGGGGATAACTATGA

GCGAGCCTGGCGLibrary序列：

ACCGACCGTGCTGGACTCA(N)₄₂ACTATGAGCGAGCCTGGCG

(2)细胞样品准备：培养TE-1细胞至对数生长期，用DPBS洗涤两次后，向其中两个皿细胞中分别加入胰蛋白酶和蛋白酶K，室温消化10min，其余皿细胞加入无酶消化液同等条件消化，随后加入完全培养基终止消化，离心、计数，使每组细胞数目为2×10⁵个。

(3)样品孵育：将随机文库链加入无酶消化液消化的细胞中，再将PQ-6分别加入到未特殊处理以及胰蛋白酶、蛋白酶K、无酶消化液消化的细胞中，4℃摇床避光孵育1h。孵育结束后，用洗涤缓冲液离心洗涤三次，再加入结合缓冲液重悬，流式细胞仪上机检测细胞的荧光强度。

结果如图1(左)所示，适体PQ-6可以特异性识别TE-1细胞，但是经过蛋白酶K和胰蛋白酶处理TE-1细胞的表面膜蛋白后，PQ-6失去识别能力。说明适体PQ-6识别的靶标类型是膜蛋白。

二、核酸适体靶标蛋白差异条带探索及质谱鉴定

1.膜蛋白的制备

(1)准备30个T75培养皿(细胞数约1.2*10^9)的TE-1细胞，细胞融合度在90-95％左右时，丢弃培养基，用预冷的DPBS洗涤3次。

(2)加入无酶消化液，37℃培养箱消化后加入DPBS，4℃，600g，5min，离心去上清。

(3)准备膜蛋白提取试剂：室温溶解并混匀抽提试剂A和B，融解后立即置于冰浴上，取适量抽提试剂A和B备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。

(4)细胞预处理：把加了PMSF的抽提试剂A加入细胞，充分悬浮细胞，冰浴放置10-15分钟。

(5)冻融法破碎细胞：把细胞混合物置于液氮中速冻1分钟，然后室温溶解，反复3-4次，直至70％以上细胞破碎。

(6)去除细胞核、未破碎细胞以及沉淀细胞膜碎片：4℃，700g离心10分钟后取上清，再将上清液4℃，14000g，离心30分钟，去上清。

(7)提取膜蛋白：加入抽提试剂B，最高速剧烈涡旋5秒沉淀，冰浴5-10分钟，重复此步骤2次，随后4℃，14000g离心5分钟，收集上清即为细胞膜蛋白溶液。

2.Pull-down实验

(1)取3个1.5ml的EP管，分别标记为空白、文库、适体组，加入链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠，用洗涤缓冲液洗涂3次。

(2)珠子的封闭：向每个EP管中加入5％BSA，在4℃旋转摇床，孵育1h。封闭完后，用WB洗涤5次，5500rpm，4℃，3min，离心之后冰上静置待用。

(3)蛋白的封闭：向收集的蛋白样品中加入DNA封闭液，4℃下孵育1h，封闭结束后，取出100ul蛋白样品留作全蛋白样品组。

(4)空白样珠子与收集的蛋白孵育：将封闭之后的膜蛋白加到空白组珠子孵育，4℃下孵育1h，孵育结束后离心(5500rpm，4℃，5min)，离心之后的上清用于下一步实验，珠子置于冰上。

(5)上一步中得到的上清与随机文库溶液孵育，4℃下孵育1h，孵育结束后与文库组珠子孵育，4℃下孵育1h，孵育结束后离心(5500rpm，4℃，5min)，离心之后的上清用于下一步实验，珠子置于冰上。

(6)上一步中得到的上清与PQ-6适体溶液孵育，4℃下孵育1h，孵育结束后与适体组珠子孵育，4℃下孵育1h，孵育结束后离心(5500rpm，4℃，5min)，离心之后的上清用于下一步实验，珠子置于冰上。

(7)用洗涤缓冲液离心洗涂三组珠子5次，向预留的全蛋白样品以及离心后的三组珠子样品中各加入Loading Buffer，100℃变性10min，冰上冷却10min，放-80℃保存。

3.SDS-PAGE电泳

(1)：将己经准备好的样品按Marker、全蛋白、空白珠子样、文库组珠子样、核酸适体珠子样、Marker顺序，将样品加入预制胶孔内，连通电源，直至溴酚蓝条带迁移至胶底层，结束电泳。

(2)考马斯亮蓝染色：加入适量考马斯亮蓝快速染液覆盖凝胶，室温下于水平摇床上染色2h。染色结束后，加入纯水洗涤4～5次，即可获得清晰的蛋白条带。差异蛋白条带位置如图1(右)所示。

4.质谱分析

找出差异条带后，小心切取差异条带，胶内酶解后，进行质谱分析。质谱原始数据经Proteome Discovery1.3分析，比对人类Uniprot蛋白数据，通过Sequset软件检索，获得差异蛋白条带中的相关蛋白信息。这些数据经过分析甄选后，结果如表一，根据膜蛋白和蛋白质出现的丰度等条件，初步确定JUP蛋白为PQ-6的靶蛋白。

表一差异蛋白质谱数据

三、PQ-6与JUP抗体的共定位

激光共聚焦显微成像技术可直观显示细胞表面的荧光信号，通过激光共聚焦荧光显微镜观察核酸适体PQ-6与JUP蛋白的共定位情况，进一步证明PQ-6的靶标就是JUP蛋白。

具体实验步骤如下；

1.细胞的准备：提前将TE-1细胞种在共聚焦皿中，待细胞的融合度达到90％左右时，洗涤缓冲液洗三次，待用。

2.样本准备：向装有200μL结合缓冲液的EP管中,加入50pmol标记有Cy5荧光基团的PQ-6，和FITC标记的JUP抗体。

3.孵育：将准各好的ssDNA和抗体的复合物加到细胞中，4℃，避光孵育1h。

4.共聚焦显微成像：结果如图2，Cy5标记的PQ-6的荧光信号与FITC标记的JUP抗体的荧光信号是重叠的。

四、Western Blot验证靶蛋白

1.根据实验方法二中的Pull-down步骤制作蛋白样品：全蛋白、空白珠子样、文库组珠子样、核酸适体PQ-6珠子样，将蛋白样品依次加入预制胶孔内，进行电泳。

2.转膜：电泳结束后，根据胶的大小裁剪相同大小滤纸和PVDF膜，按照滤纸、膜、胶、滤纸的顺序在板子上夹好，浸泡于转膜液中，在冰浴条件下，恒流300mA转膜90分钟。

3.封闭：转膜结束后，用脱脂奶粉室温封闭2h。

4.与一抗孵育：1：1000稀释JUP抗体，4℃，孵育过夜。结束后用TBST清洗3次。

5.与二抗孵育：4℃与二抗孵育2h，结束后用TBST清洗3次。

5.化学发光检测。

结果如图3，适体PQ-6珠子组结合的JUP蛋白的量远大于随机文库组珠子结合的JUP蛋白的量，进一步证明PQ-6识别的靶标是JUP蛋白。

五、小干扰RNA敲减并验证靶蛋白

1.提前24h选择状态良好的TE-1细胞，消化收集细胞悬液，测量细胞密度，接种在六孔板中，没孔接种1.5X10^6个细胞，放置于恒温细胞培养箱内培养。第二天观察细胞，进行siRNA转染。所用干扰RNA序列如下：

2.转染：在无菌EP管中加入无血清培养基，并添加适量的转染试剂，轻轻混匀，室温静置5分钟。再取新的无菌EP管，加入无血清培养基，并添加适量的siRNA oligo，轻轻混匀，室温静置5分钟。将GP-transfect-Mate培养基混合物滴加至siRNA培养基混合物中，轻轻混匀，室温静置15-20分钟，立即转染。

3.72h后Western Blot检测蛋白表达量(步骤同四述)，同时流式细胞数检测PQ-6与敲减了JUP后的细胞的结合能力。

结果如图4示：siRNA 1，siRNA 2干扰之后的TE-1细胞的JUP表达量大大下降，且与核酸适体PQ-6结合能力也下降，而空白对照组的TE-1细胞和NC序列干扰之后的TE-1细胞仍与核酸适配体PQ-6结合，说明核酸适体PQ-6识别肿瘤细胞的能力与JUP蛋白有关。

六、检测PQ-6与纯蛋白JUP的亲和力

1.把coating buffer及JUP纯蛋白加入Elisa孔板，4℃孵育过夜。孵育结束后，洗涤缓冲液洗三次，再加入封闭液，室温孵育1h。孵育结束后，洗涤缓冲液洗三次。

2.将核酸适体PQ-6用结合缓冲液配制成不同浓度的biotin-PQ-6加入孔板板，4℃摇床孵育1h。

3.把链霉亲和素包被的HRP试剂加入孔板,室温孵育1h。孵育结束后去溶液，洗涤缓冲液洗涤五次。洗涤后加入substrate solution，室温孵育30分钟，之后加入stopsolution。

4.酶标仪检测，根据吸收值，制作Kd值曲线。

如图5所示，计算得出PQ-6结合JUP蛋白的解离常数Kd＝63.27±19.66nM，说明PQ-6对JUP蛋白具有很强的亲和力。

七、JUP抗体与PQ-6的竞争性分析

为了进一步明确适体PQ-6与JUP抗体的关系，本实验分别用高浓度不带荧光标记的适体PQ-6竞争带有FITC荧光标记的JUP抗体，及用高浓度不带荧光标记的JUP抗体竞争带有FAM荧光标记的适体PQ-6,再用流式细胞术对荧光强度进行检测。

结果如图6，核酸适体PQ-6与JUP抗体无明显竞争现象，说明它们可能结合在同一个蛋白的不同位点。

八、细胞散点图考察JUP抗体与适体PQ-6之间的关系为进一步考察明确JUP抗体和适体PQ-6的关系，利用双标荧光的方法，结合流式细胞术，观察细胞散点图。设置样本如下：

第一组：空白细胞

第二组：细胞与对照文库孵育

第三组；细胞与适体PQ-6孵育

第四组；细胞与JUP抗体孵育

第五组：细胞同时与对照文库和JUP抗体孵育

第六组：细胞同时与适体PQ-6和JUP抗体孵育

孵育结束后，洗涤缓冲液洗涤三次，流式细胞术分析。结果如图7，核酸适体PQ-6的结合强度与JUP抗体的结合强度呈线性关系，说明JUP抗体和PQ-6结合的是同一个蛋白质的不同结合位点，进一步证明了PQ-6结合的靶标是JUP蛋白。

九、PQ-6可识别被肿瘤上清调控后表型改变的正常细胞

为了考察PQ-6是否可以识别被肿瘤因子影响表型发生改变的正常细胞，提取肿瘤上清，分别用正常RPMI1640培养基和加了肿瘤上清的培养基培养正常的ARPE-19细胞，在荧光显微镜下观察细胞的表型变化。之后，分别与带Cy5标记的PQ-6孵育，观察结合情况。同时，Western Blot监测正常ARPE-19细胞和被肿瘤因子调控后的正常细胞中的JUP蛋白表达量。

结果如图8，在肿瘤因子的影响下，ARPE-19细胞表型发生改变，且被调控后的正常细胞的JUP表达量远高于普通培养基培养的正常细胞。正常ARPE-19细胞不与PQ-6结合，而被肿瘤上清调控后表型改变的正常细胞却因为JUP表达量上升，可以和PQ-6结合。说明在肿瘤分泌因子可诱导正常细胞表型发生改变，使JUP蛋白表达上升，从而被PQ-6识别。PQ-6不仅能识别肿瘤细胞，也可一定程度上识别被肿瘤细胞影响表型发生改变的正常细胞。

十、考察PQ-6的细胞内化强度

将适体PQ-6-Cy5(红色)与肿瘤细胞在37℃下孵育3小时，孵育结束后，用洗涤缓冲液清洗三次，用Hoechst(蓝色)染细胞核，DiO(绿色)染细胞膜，在激光共聚焦显微镜下观察PQ-6的内化情况。

结果如图9所示，PQ-6全部内化进入胞浆，说明其内化性极强，为靶向递送药物系统的构建打下基础。

十一、构建肿瘤靶向载药体系PQ-6-Dox嵌合体

阿霉素是一种抗瘤谱很广的抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。但其毒性反应较大，限制了其在临床上的应用。故拟将适体与阿霉素偶联，探索是否能在靶向杀伤肿瘤细胞的同时，减少阿霉素对其他正常细胞的毒性。

改造后的适体，可以在结合缓冲液中，与药物通过物理作用相结合，但需要摸索适体PQ-6与盐酸阿霉素(Doxorubicin，Dox)偶联的最佳配比。

1.配置不同摩尔比的PQ-6-Dox嵌合体：分为两组：固定Dox浓度5μM不变，配制不同摩尔比的核酸适体PQ-6与Dox；固定适体PQ-6浓度5μM不变，配制不同摩尔比的核酸适体PQ-6与Dox。

2.在微孔板振荡器中震荡10s，用锡箔纸包裹孔板，于37℃恒温培养箱中孵育1h。

3.用全波长酶标仪，在480nm波长的激发光下，500-700nm范围内进行荧光光谱扫描。使用graphpad软件作图，选出最佳配比。

结果如图10，随着适体浓度的增大，Dox的荧光越来越弱，由此说明，Dox能有效插入到PQ-6中，且当PQ-6：Dox＝1:2时，荧光不再下降可知，表明1分子PQ-6中能够嵌入2分子的Dox。

十二、PQ-6-Dox嵌合体的靶向能力分析

本实验主要探索Dox的装载是否影响PQ-6的靶向能力。取带FAM标记的PQ-6与Dox以1:2的摩尔比室温下孵育一小时，孵育结束后冰上待用。其他带有FAM标记的随机文库与PQ-6变性冷却后置于冰上待用。将准备好的ssDNA与嵌合链与相应细胞孵育，孵育结束后用洗涤缓冲液洗涤，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。

结果如图11，说明装在有Dox的PQ-6-Dox嵌合体不会影响PQ-6的靶向肿瘤细胞的能力，且嵌合链不与对照细胞HEK-293T结合。

十三、PQ-6-Dox嵌合体与PQ-6的竞争性试验

为了探究装载了Dox的嵌合体与PQ-6在细胞中的结合位点是否相同，用不带荧光标记的嵌合链竞争带有FAM荧光基团的PQ-6。先用无标记的嵌合链孵育1小时，然后再用带有荧光标记的PQ-6孵育1小时，孵育结束后流式检测。对照组文库、适体PQ-6分别和细胞孵育1小时后流式检测。

结果如图12，嵌合链能竞争PQ-6，说明嵌合链和适体PQ-6结合的是同一位点。

十四、流式细胞术分析PQ-6-Dox嵌合链的内化性

本实验主要观察PQ-6-Dox嵌合链能否在生理条件有选择性地将Dox释放到不同的细胞中去，配制PQ-6:Dox的摩尔比为1：2的嵌合链(PQ-6不带荧光标记)，室温下孵育一小时，孵育完后，分别将Dox溶液、PQ-6-Dox嵌合链与对应细胞在37℃下孵育1小时，之后上机流式检测Dox的荧光强度。

结果如图13，在肿瘤细胞中，嵌合链的荧光强度强于自由的Dox荧光强度，而在正常细胞中，嵌合链中Dox的荧光强度远远低于自由的Dox荧光强度，说明，嵌合链能够装载着Dox选择性地释放到不同细胞中。

十五、共聚焦显微成像分析PQ-6-Dox嵌合链的靶向性

共聚焦显微成像可以直观观察到细胞的荧光信号。配制PQ-6:Dox的摩尔比为1：2的嵌合链(PQ-6不带荧光标记)，室温下孵育一小时，孵育完后，将PQ-6-Dox嵌合链与人胰腺癌细胞(PANC-1)、人口腔鳞癌颈淋巴结转移癌细胞(GNM)、人胚肾细胞系(HEK-293T)在37℃下孵育1小时，之后上机流式检测Dox的荧光强度。

结果如图14，在肿瘤细胞中，嵌合链的荧光强度与自由的Dox荧光强度相当，而在正常细胞中，嵌合链中Dox的荧光强度远远低于自由的Dox荧光强度，说明，嵌合链具有靶向性，可以选择性地把Dox释放到肿瘤细胞。

十六、PQ-6-Dox嵌合体对细胞的毒性作用

将对数生长期的各组癌细胞和正常细胞在96孔板中铺板，每孔种2000个细胞，配制PQ-6-Dox与细胞共孵育48h，孵育结束后加入10μl的CCK-8试剂，37℃孵育2h后，酶标仪(450nm波长)检测OD值，每个实验独立重复三次后计算细胞相对存活率。结果见图13，可见，PQ-6-Dox嵌合体比自由阿霉素更能杀伤肿瘤细胞，而在正常细胞中，PQ-6-Dox嵌合体相较于自由阿霉素对细胞毒性减少。这说明PQ-6-Dox嵌合体可实现靶向治疗作用，同时，可减少对其他正常细胞的毒副作用。

各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 一种识别肿瘤靶蛋白JUP的方法及核酸适体PQ-6与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accgaccgtg ctggactcaa ctcgccgagg gagggctttc cagggtttcc actaggggat 60

aactatgagc gagcctggcg 80

Claims (5)

1.一种核酸适体在制备识别肿瘤靶标蛋白JUP的制剂上的应用，其特征在于,所述的核酸适体的序列为：5’-ACTCGCCGAGGGAGGGCTTTCCAGGGTTTCCACTAGGGGATA-3’，或在所述的序列两端均加上引物序列，所述的5’端的引物序列为ACCGACCGTGCTGGACTCA，所述的3’端的引物序列为ACTATGAGCGAGCCTGGCG，通过所述的核酸适体对JUP蛋白进行识别。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的核酸适体的两端连接上荧光基团、生物素、酶标记物质、放射性物质、治疗性物质，来得到功能化的且同样具有结合JUP蛋白能力的核酸适体衍生物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过核酸适体对JUP蛋白进行识别包括以下步骤：

（1）通过胰蛋白酶、蛋白酶K消化实验证明适体PQ-6结合的靶标是细胞膜蛋白；

（2）利用细胞膜与细胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞膜蛋白；

（3）将提取得到的膜蛋白与生物素标记的PQ-6或随机文库孵育，再与包裹有链霉亲和素的琼脂糖球珠孵育，通过pull-down实验得到与适体PQ-6、随机文库结合的蛋白；

（4）利用SDS-PAGE胶分离蛋白，分析PQ-6与随机文库的差异蛋白；

（5）在SDS-PAGE胶上切出差异蛋白，酶解，进行质谱分析；

（6）再利用RNAi敲减技术和流式细胞术验证质谱分析结果，确定靶蛋白为JUP。

4.一种用于识别肿瘤靶标蛋白JUP的核酸适体PQ-6，其特征在于，所述的核酸适体序列为：

5’-ACCGACCGTGCTGGACTCAACTCGCCGAGGGAGGGCTTTCCAGGGTTTCCACTAGGGGATAACTATGAGCGAGCCTGGCG-3’。

5.根据权利要求4所述的核酸适体PQ-6，其特征在于，所述的序列两端或一端包括：放射性标记、治疗性药物连接、荧光标记或生物素标记在内的修饰或改造。

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