CN112007169A - 一种核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物领域，特别是涉及一种核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途。本发明提供一种核酸适配体药物偶联物，包括药物分子基团和核酸适配体片段，所述核酸适配体片段的多核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。本发明所提供的核酸适配体药物偶联物不仅具有核酸适配体所有的优点，还具有优越的血清稳定性，在生物体内循环时间长，对其稳定性考察方面发现，该适配体有良好的抗酶解能力，并且在核酸适配体5’端修饰小分子药物，提高了核酸适配体药物偶联物的稳定性。

Description

一种核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及药物领域，特别是涉及一种核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途。
背景技术
人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)是ErbB家族中表达最为广泛的跨膜受体蛋白，在多种恶性肿瘤如乳腺癌、胃癌、胰腺癌等中过表达，在正常上皮细胞中不表达或少量表达(差异为1–2million copies per cell)，其中，HER2在25％-30％的乳腺癌中过表达，能激活下游多条信号通路，包括PI3K和MAPK，促进肿瘤细胞的增殖和迁移，与病人的不良预后有重要关系。HER2是分子靶向治疗的重要靶点，抗HER2的治疗有着重要的临床意义。由于部分针对HER2的靶向抗体出现了不同程度的耐药，故在临床治疗中应用细胞毒素类药物与靶向药物联合治疗，如HER2抗体与小分子毒素药物(antibody-drug conjugate，ADC)DM1偶联物新药(T-DM1)治疗晚期乳腺癌。然而据报道，ADC药物也出现了如抗体一样耐药的问题。因此，研发无耐药风险的具有良好生物相容性的HER2靶向新药能解决临床的关键问题。
核酸适配体是一类能特异识别细胞膜表面受体蛋白的寡核苷酸，相较于蛋白抗体，核酸适配体具有分子量小，免疫原性小，对肿瘤组织渗透性强，易于修饰改造，制备工艺简单等优点。核酸适配体是作为开发HER2分子新型靶向药物的不二选择。鉴于此，HER2的三聚型DNA适配体有望取代抗体进行HER2的治疗研究。一些数据表明该适配体除了对细胞表面HER2受体有高特异性和选择性，还能促进HER2内吞进入细胞，在溶酶体中HER2受体被降解，避免了HER2与其他受体二聚的可能，细胞实验证明该DNA适配体与受体结合后使得膜上HER2表达量减少。适配体的这种作用方式可避免HER2抗体存在的耐药问题。然而，该适配体的血清稳定性以及体内的生物长时程稳定性在以往文献或专利中尚未有报道。
现有的针对HER2靶向治疗抗体与小分子毒素药物(ADC药物)存在耐药问题。抗体价格昂贵，生产工艺复杂，成本高。而核酸适配体作为HER2靶向载体能可控精确地偶联单个或多个药物分子，具有良好的靶向性，提高了药物的水溶性，在一定程度上减轻了毒素药物对机体正常组织的毒性。但核酸适配体在体内半衰期短，血清稳定性不够，有导致药物脱靶的风险。现有的核酸适配体药物偶联物，仅仅报道了在靶向性水溶性和疗效上有显著性的改善，体内稳定性不足，这势必会导致临床给药次数的增加，也增加了用药成本，不利于进一步临床应用。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种核酸适配体药物偶联物，包括药物分子基团和核酸适配体片段，所述核酸适配体片段的多核苷酸序列包括如SEQID NO.1所示的序列。
在本发明一些实施方式中，所述药物分子选自小分子毒素药物分子，优选选自美登素类药物分子。
在本发明一些实施方式中，所述药物分子包括-SH基团。
在本发明一些实施方式中，所述药物分子基团的结构式如下所示：
Figure BDA0002077997700000021
在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体药物偶联物还包括用于连接药物分子基团和核酸适配体片段的连接基团，优选的，所述药物分子基团和核酸适配体片段之间通过SMCC、SPDP或SPP连接。
在本发明一些实施方式中，所述连接基团的结构式如下之一所示：
Figure BDA0002077997700000022
在本发明一些实施方式中，所示核酸适配体片段的多核苷酸序列的5’端还包括3～5个T。
在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体片段5’端修饰有氨基基团，优选的，所述核酸适配体片段5’端修饰有C6氨基亚磷酰胺单体，所述核酸适配体片段的结构式如下所示：
Figure BDA0002077997700000023
在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体药物偶联物选自化学结构式如下之一所示的化合物：
Figure BDA0002077997700000031
本发明另一方面提供所述的核酸适配体药物偶联物的制备方法，包括：将药物分子与核酸片段连接，以提供所述的核酸适配体药物偶联物。
在本发明一些实施方式中，所述制备方法具体包括：将药物分子修饰连接分子，将修饰有连接分子的药物分子与核酸片段连接，以提供所述的核酸适配体药物偶联物。
本发明另一方面提供所述的核酸适配体药物偶联物在制备药物中的用途。
附图说明
图1显示为本发明ApDC和NCDC的HPLC分离图谱和质谱图，其中，a和b分别为ApDC和NCDC的HPLC分离图谱，c和d分别为ApDC以及NCDC的产物峰(15-20min之间)质谱图。
图2显示为本发明ApDC-cy5和NCDC-cy5的HPLC分离图谱和质谱图，其中，a和b分别为ApDC-cy5和NCDC-cy5的HPLC分离图谱，c和d分别为ApDC-cy5以及NCDC-cy5的产物峰(15-20min之间)质谱图
图3显示为本发明流式细胞技术检测ApDC的靶向性示意图。
图4显示为本发明ApDC药物在BT474肿瘤模型裸鼠中的靶向成像示意图。
图5显示为本发明ApDC在SKOV3裸鼠模型中的双模式靶向成像示意图。
图6显示为本发明ApDC药物对细胞的杀伤作用评价示意图。
图7显示为本发明ApDC对BT474肿瘤的靶向治疗作用评价示意图。
图8显示为本发明ApDC的血清稳定性和酶稳定性评价示意图。
具体实施方式
本发明发明人经过大量实践研究后意外地发现，将药物分子基团与特定的核酸适配体片段进行组合以获得核酸适配体药物偶联物，不仅可以使药物整体上具有良好的靶向性和治疗效果，其本身还具有优良的稳定性，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供一种核酸适配体药物偶联物，包括药物分子基团和核酸适配体片段，所述核酸适配体片段的多核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。所述核酸适配体片段是靶向HER2蛋白的，所述核酸适配体片段与药物分子基团结合后，能够使核酸适配体药物偶联物具有良好的靶向性，使药物分子富集于靶标组织，并可以进一步内吞进入靶标细胞，且可以使核酸适配体药物偶联物整体上具有良好的稳定性，长时间富集于靶标区域，从而可以有效抑制肿瘤细胞和肿瘤组织的增长。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物，可以包括药物分子基团。所述药物分子基团可以是各种适用于连接核酸适配体的药物分子与核酸适配体连接所形成的基团，例如，所述药物分子可以是包括但不限于多糖类药物、多肽类药物、多聚物类药物、SiRNA类药物等。在本发明一优选实施方式中，所述药物分子选自小分子毒素药物分子，优选选自美登素类药物分子，具体可以是化学结构式如下所示的化合物：
Figure BDA0002077997700000041
所述药物分子可以包括-SH基团，从而可以通过-SH基团与核酸适配体连接，以形成药物分子基团。在本发明一优选实施方式中，所述药物分子基团的结构式如下所示：
Figure BDA0002077997700000042
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物中，所述核酸适配体片段通常为合适的核酸片段，所述核酸适配体片段的多核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列：5’-GCA GCGGTG TGG GGG CAG CGG TGT GGG GGC AGC GGT GTG GGG-3’(SEQ ID NO.1)，所述核酸适配体片段通常靶向于HER2蛋白。所述核酸适配体片段通常为5’端被-NH2修饰的核酸片段，对核酸片段5’端进行-NH2修饰的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以使用C6氨基亚磷酰胺单体对核酸片段进行修饰，以获得5’端被-NH2修饰的核酸片段。在本发明一优选实施方式中，可以使用DNA固相合成的方法将C6氨基亚磷酰胺单体修饰在5’端，具体方法可以参照，原理参照Wurtz,N.R.；Turner,J.M.；Baird,E.E.；Dervan,P.B.,Fmocsolid phase synthesis of polyamides containing pyrrole and imidazole aminoacids.Org Lett 2001,3(8),1201-1203，所述C6氨基亚磷酰胺单体的化学结构式如下所示：
Figure BDA0002077997700000051
核酸片段5’端糖环上的羟基与亚磷酰胺单体交联，反应方程式如下所示：
Figure BDA0002077997700000052
其中，-O-连接的曲线部分表示核酸片段的剩余部分，实心圆表示固相支持物CPG。DNA磷酸骨架上进行了氨基修饰，制备获得的产物脱去保护基团，即可获得5’端被-NH2修饰的核酸片段，进一步通过该氨基基团与连接基团连接，可以获得结构式如下所示的核酸适配体片段：
Figure BDA0002077997700000053
核酸适配体片段的选择决很大程度上决定了所述核酸适配体药物偶联物的靶向性，也很大程度上决定了核酸适配体药物偶联物整体上的稳定性。在本发明一优选实施例中，所示核酸适配体片段的多核苷酸序列的5’端还包括3～5个T，T的间隔可以提高核酸适体的灵活性，使其呈现灵活的折叠空间结构，同时对偶联物的影响更小。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物中，所述药物分子基团可以直接与核酸适配体片段连接形成药物偶联物，所述核酸适配体药物偶联物也还可以包括用于连接药物分子基团和核酸适配体片段的连接基团。所述连接基团可以是SMCC所形成的基团、二硫键基团(包括二硫键的连接基团)、Val-Cit二肽等各种常用的连接分子所形成的连接基团。本领域技术人员可根据需要选择合适的连接基团及其对应的连接分子，例如，选择由SMCC所形成的基团，可以保护ApDC在血液中的稳定性，再例如，选择二肽连接基团，可以使ApDC实现在细胞中酶响应药物释放。所述连接基团的结构也通常取决于连接药物分子基团和核酸适配体片段的化合物分子，在本发明一优选实施例中，所述药物分子基团和核酸适配体片段之间通过SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯)连接，所述SMCC可以是化学结构式如下所示的化合物：
Figure BDA0002077997700000061
所述SMCC分子一端的NHS酯基团可以与核酸适配体片段5’端的氨基反应形成稳定的酰胺键，另一端(马来酰亚胺基团一端)可与药物分子的巯基发生特异性交联，从而可以形成化学结构式如下所示的连接基团：
Figure BDA0002077997700000062
在本发明另一优选实施例中，所述药物分子基团和核酸适配体片段之间通过N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)或N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶硫)戊酸酯(SPP)连接，SPDP和SPP的化学结构式分别如下所示：
Figure BDA0002077997700000063
所述SPDP或SPP分子一端的NHS酯基团可以与核酸适配体片段5’端的氨基反应形成稳定的酰胺键，另一端可与药物分子的巯基发生特异性交联，从而可以形成包括二硫键的结构式如下所示的连接基团：
Figure BDA0002077997700000064
在本发明一优选实施例中，核酸适配体药物偶联物的化学结构式如下所示：
Figure BDA0002077997700000071
其中，-NH-所连接的曲线部分为核酸片段。
在本发明另一优选实施例中，核酸适配体药物偶联物的化学结构式如下所示：
Figure BDA0002077997700000072
其中，-NH-所连接的曲线部分为核酸片段。
在本发明另一优选实施例中，核酸适配体药物偶联物的化学结构式如下所示：
Figure BDA0002077997700000073
其中，-NH-所连接的曲线部分为核酸片段。
本发明第二方面提供本发明第一方面所提供的核酸适配体药物偶联物的制备方法，包括：将药物分子与核酸片段连接，以提供所述的核酸适配体药物偶联物。所述核酸片段可以是5’端修饰有-NH2的核酸片段，在本发明一优选实施方式中，所述核酸片段可以是5’端修饰有C6氨基亚磷酰胺单体的核酸片段，对核酸片段进行-NH2修饰的方法具体可以参照如上所给出的文献。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物的制备方法中，当连接基团由SMCC形成时，所述制备方法具体可以包括：1)将含有-SH基团的药物分子修饰SMCC；2)将修饰有SMCC的药物分子与-NH2修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适配体药物偶联物。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物的制备方法中，将含有-SH基团的药物分子修饰SMCC，以提供修饰有SMCC的药物分子的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是：将含有-SH基团的药物分子和SMCC在合适的pH条件下反应，具体可以是pH＝7.2～7.5的条件。再例如，所述反应通常可以在合适的反应溶剂存在的条件下进行，具体可以是PB buffer等。再例如，反应通常可以在室温或加热的条件下进行，具体的反应温度可以是26-37℃。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物的制备方法中，将修饰有SMCC的药物分子与-NH2修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适配体药物偶联物的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是：将修饰有SMCC的药物分子和-NH2修饰的核酸片段在碱性条件下反应，所述碱性条件可以是pH＝7.9～8.1的条件。再例如，所述反应通常可以在合适的反应溶剂存在的条件下进行，具体可以是PB buffer等。再例如，反应通常可以在室温或加热的条件下进行，具体的反应温度可以是26-37℃。
在本发明一优选实施方式中，所述核酸适配体药物偶联物的制备方法中，将含有-SH基团的药物分子修饰SMCC的反应方程式如下所示：
Figure BDA0002077997700000081
在本发明一优选实施方式中，所述将修饰有SMCC的药物分子与-NH2修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适配体药物偶联物的反应方程式如下所示：
Figure BDA0002077997700000082
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物的制备方法中，当连接基团由SPDP或SPP形成时，所述制备方法具体可以包括：1)将含有-SH基团的药物分子修饰SPDP或SPP；2)将修饰有SPDP或SPP的药物分子与-NH2修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适配体药物偶联物。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物的制备方法中，将含有-SH基团的药物分子修饰SPDP或SPP，以提供修饰有SMCC的药物分子的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是：将含有-SH基团的药物分子和SPDP或SPP在合适的pH条件下反应，具体可以是pH＝7.2～7.5的条件。再例如，所述反应通常可以在合适的反应溶剂存在的条件下进行，具体可以是PB buffer等。再例如，反应通常可以在室温或加热的条件下进行，具体的反应温度可以是26-37℃。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物的制备方法中，将修饰有SPDP或SPP的药物分子与-NH2修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适配体药物偶联物的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是：将修饰有SPDP或SPP的药物分子和-NH2修饰的核酸片段在碱性条件下反应，所述碱性条件可以是pH＝7.9～8.1的条件。再例如，所述反应通常可以在合适的反应溶剂存在的条件下进行，具体可以是PB buffer等。再例如，反应通常可以在室温或加热的条件下进行，具体的反应温度可以是26-37℃。
在本发明一优选实施方式中，所述核酸适配体药物偶联物的制备方法中，将含有-SH基团的药物分子修饰SPDP的反应方程式如下所示：
Figure BDA0002077997700000091
在本发明一优选实施方式中，所述将修饰有SPDP的药物分子与-NH2修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适配体药物偶联物的反应方程式如下所示：
Figure BDA0002077997700000092
在本发明一优选实施方式中，所述核酸适配体药物偶联物的制备方法中，将含有-SH基团的药物分子修饰SPP的反应方程式如下所示：
Figure BDA0002077997700000101
在本发明一优选实施方式中，所述将修饰有SPP的药物分子与-NH2修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适配体药物偶联物的反应方程式如下所示：
Figure BDA0002077997700000102
本发明第三方面提供本发明第一方面所提供的核酸适配体药物偶联物在制备药物中的用途。本发明所提供的核酸适配体药物偶联物对于靶标细胞(例如，相对高表达HER2蛋白的细胞，再例如，可以是肿瘤细胞)具有良好的特异性和靶向性，核酸适配体药物在肿瘤部位更加富集，可以高效地靶向靶标，且肿瘤细胞对于核酸适配体药物偶联物具有明显的选择性内吞，在荷瘤鼠内，24小时之后仍能观察到核酸适配体药物偶联物在靶标部位的富集，具有明显地抑制靶标细胞或组织增殖的效果。另外，核酸适配体药物对非靶标细胞(例如，相对低表达或不表达HER2蛋白的细胞)的杀伤力明显交底，对正常的组织及器官毒性小。所以，所述核酸适配体药物可以作为一种有效的治疗药物。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物不仅具有核酸适配体所有的优点，还具有优越的血清稳定性，在生物体内循环时间长，对其稳定性考察方面发现，该适配体有良好的抗酶解能力，并且在核酸适配体5’端修饰小分子药物，提高了核酸适配体药物偶联物的稳定性。与上市的HER2靶向ADC药物相比，本发明制备的核酸适配体药物偶联物具有普适性，适应于所有不同表达水平HER2的肿瘤治疗，并且由于HER2核酸适体促进HER2内吞，在一定程度减少了HER2受体的循环，表面受体减少，减少了HER2受体与HER2家族其他受体形成异二聚体的几率，从而避免了因异二聚体形成的耐药问题。与报道的已有HER2靶向的核酸适配体药物偶联物相比，本发明利用能形成稳定结构的核酸适体，大大提高了该ApDC的生物稳定性，解决了核酸药物在体内降解快，滞留时间短的问题，延长了药物在肿瘤的聚集时间，提高了疗效。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1
(1)首先合成氨基修饰的适配体(核苷酸序列为SEQ ID NO.1)，该修饰的DNA适配体参照固相合成方法在DNA合成仪(德国POLYGEN 12柱DNA合成仪，产品型号：polygen12)上合成，C6氨基亚磷酰胺单体购自glen research，10-1906)。DNA合成仪获得氨基修饰的核酸适体，经2.5倍冰乙醇，1/10体积0.3M氯化钠沉淀离心，反相HPLC纯化，经过80％醋酸室温处理脱DMT保护，冷冻离心机冻干后，TE buffer或PBS溶解，紫外分光光度计定量，-20℃保存备用。将100nmol氨基修饰的适配体溶解于1ml PB buffer中(PH＝8.0)充分混匀待DNA溶解，将1000nmol的DM1-SMCC溶解于1mL DMSO中，DNA和药物的比例为1:10。将两者在室温下充分混匀，放置于37℃摇床中，转速150r/min，反应过夜(12-16h)。
(2)取出，在冷冻离心机中冻干成冻干粉，用0.1M TEAA流动相溶解粉末，0.45微米滤芯过滤，HPLC纯化获得产物，产物冻干后，一部分样品送质谱检测，具体结果如图1所示。
(3)冻干的产物用水溶解，脱盐，冻干，用水或PBS溶解后经紫外分光光度计测定浓度，-20℃保存备用。将此样品命名为ApDC。
实施例2
(1)将100nmol的氨基修饰的对照序列DNA溶解于200μL PB buffer中(PH＝8.0)充分混匀待DNA溶解(DNA合成和纯化方法和核酸适配体序列的方法一致，序列为：5’-NH2-ATTGCACTTACTATATTGCACTTACTATATTGCACTTACTAT-3’，SEQ ID NO.2)，将1000nmol的DM1-SMCC溶解于200μL PB DMSO中。将两者在室温下充分混匀，放置于37℃摇床中，转速150r/min，反应12-16h。
(2)取出，在冷冻离心机中冻干成冻干粉，用0.1M TEAA流动相溶解粉末，0.45微米滤芯过滤，HPLC纯化获得产物，产物冻干后，一部分样品送质谱检测，具体结果如图1所示。
(3)冻干的产物用水溶解，脱盐，冻干，用水或PBS溶解后经紫外分光光度计测定浓度，-20℃保存备用。将此样品命名为NCDC。
实施例3
(1)将20nmol的氨基和cy5双修饰的适配体，序列为5’-NH2-GCA GCG GTG TGG GGGCAG CGG TGT GGG GGC AGC GGT GTG GGG-3’-Cy5，其中多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。溶解于200μL PB buffer中(PH＝8.0)充分混匀待DNA溶解,将200nmol的DM1-SMCC溶解于200μL PB DMSO中。将两者在室温下充分混匀，放置于37℃摇床中，转速150r/min，反应12-16h。
(2)取出，在冷冻离心机中冻干成冻干粉，用0.1M TEAA流动相溶解粉末，0.45微米滤芯过滤，HPLC纯化获得产物，产物冻干后，一部分样品送质谱检测，具体结果如图2所示。
(3)冻干的产物用水溶解，脱盐，冻干，用水或PBS溶解后经紫外分光光度计测定浓度，-20℃避光保存备用。将此样品命名为ApDC-cy5。
实施例4
(1)将20nmol的氨基和cy5双修饰的对照DNA序列
(5’-NH2-ATTGCACTTACTATATTGCACTTACTATATTGCACTTACTAT-3’-Cy5，其中，多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)溶解于200μL PB buffer中(PH＝8.0)充分混匀待DNA溶解,将200nmol的DM1-SMCC溶解于200μL PB DMSO中。将两者在室温下充分混匀，放置于37℃摇床中，转速150r/min，反应12-16h。
(2)取出，在冷冻离心机中冻干成冻干粉，用0.1M TEAA流动相溶解粉末，0.45微米滤芯过滤，HPLC纯化获得产物，产物冻干后，一部分样品送质谱检测，具体结果如图2所示。
(3)冻干的产物用水溶解，脱盐，冻干，用水或PBS溶解后经紫外分光光度计测定浓度，-20℃避光保存备用。将此样品命名为NCDC-cy5。
实施例5
荧光标记的ApDC对HER2表达细胞的靶向性评价：
取指数增长期的BT474细胞，PBS洗涤一次，EDTA消化10-15min后，收集，1000rpm离心5min，结合缓冲液重悬。250nM FAM标记的ApDC和FAM标记的核酸适体(核苷酸序列为SEQID NO.1)，该FAM标记的核酸适体是通过利用FAM修饰的CpG，DNA固相合成技术合成，FAM荧光修饰在DNA的3’端，序列如下：5’-NH2-GCA GCG GTG TGG GGG CAG CGG TGT GGG GGC AGCGGT GTG GGG-3’-FAM，其中多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。溶解在结合缓冲液中与1X105个细胞在冰上孵育45min之后，用洗涤缓冲液洗两次后，流式细胞仪检测荧光的偏移。如图3所示，其中，绿色线条表示细胞背景荧光，深蓝色线条表示FAM-DNCDC，红色线条表示FAM-ApDC，黄色线条表示FAM-aptamer，天蓝色线条表示FAM-NC，对于HER2高标的BT474细胞株而言，FAM标记的ApDC和FAM标记的核酸适体一样有明显的荧光位移，而对照序列及药物无明显荧光偏移，在阴性细胞MDA-MB-231中，所有序列都不结合，荧光没有变化。
实施例6
荧光标记的ApDC对HER2表达荷瘤鼠的体内靶向性评价：
5-8周大小的BLB/c雌性裸鼠，在动物伦理规定的环境中饲养三天后，BT474肿瘤细胞以7*106个/100ul的密度的接种于小鼠右侧背部皮下，等待15天之后，当肿瘤大小在300-600立方毫米的时候，通过尾静脉注射向BT474乳腺癌荷瘤裸鼠注射cy5标记的ApDC或NCDC(40μM的)，每一只裸鼠注射体积为100μL，在2h，4h，6h，12h，24h等不同时间点进行小动物活体成像观察荧光药物在肿瘤部位富集点情况，24h之后，小鼠安乐死，取出肿瘤及主要器官，成像。用最后一次的荧光参数为参照调整所有时间点的光值，进行对比，结果如图4所示，其中，A为cy5标记的ApDC组，N为cy5标记的NCDC组。由图4a可知，ApDC在BT474模型中的动态成像，随着时间的推移，BT474肿瘤部位的荧光富集，而对照药物注射的裸鼠肿瘤部位没有观察到荧光，24小时之后，仍能观察到ApDC药物的荧光，解剖小鼠后，如图4b所示，主要器官成像表明，肿瘤部位荧光明显能观察到。肿瘤组织切片后，如图4c所示，通过confocal观察，ApDC处理的裸鼠肿瘤部位的cy5荧光仍存在，绿色为HER2抗体染色的，红绿荧光共定位部分为黄色，表明药物不仅进入了肿瘤组织，还顺利通过HER2受体的内吞进入了肿瘤细胞中。
实施例7
荧光标记的ApDC对HER2表达荷瘤鼠的体内双模式成像：
用稳定表达荧光素酶的细胞SKOV3卵巢癌细胞(构建方法参照Xin,L.B.；Zhao,R.；Lei,J.；Song,J.C.；Yu,L.；Gao,R.；Ha,C.B.；Ren,Y.Y.；Liu,X.；Liu,Y.X.；Yao,Z.；Yang,J.,SND1acts upstream of SLUG to regulate the epithelial-mesenchymaltransition(EMT)in SKOV3cells.Faseb J 2019,33(3),3795-3806)造模，该细胞是HER2阳性表达细胞株。方法同BT474模型操作。药物剂量一致，40μM的ApDC-cy5和NCDC-cy5，每一只裸鼠注射体积为100μL，为排除cy5染料小分子的干扰，设立了cy5小分子的对照组，结果如图5所示。从左至右，为cy5标记的NCDC、cy5标记的ApDC和cy5染料，如图5a所示，ApDC药物的靶向性非常好，cy5荧光与SKOV3肿瘤的生物发光完美地共定位，清晰地看到随着时间的变化，荧光由弱到强，由强转弱到过程。到了24小时，如图5b所示，荧光仍然滞留在肿瘤部位，而cy5小分子由于脂溶性滞留在肿瘤部位，但是在4h之后，肿瘤部位不再有荧光，之后的时间再也观察不到(以往文献报道，cy5小分子在肿瘤部位停滞时间约4-6小时)，这充分证明，ApDC-cy5能明确地富集在肿瘤部位超过24小时。据以往文献，适配体的成像几乎没有能做大于12小时的。
实施例8
ApDC对HER2表达细胞的靶向杀伤：
将待测细胞(BT474细胞、SKBR3细胞、MDA-MB-453细胞和MDA-MB-468细胞)分别以5000个每孔的密度种在96孔板种，培养过夜。ApDC以及对照药物(DM1-SMCC、NCDC)分别用R1640完全培养基(含10％FBS)等比稀释，每个药物设置8-9个浓度，每个浓度设置5-6个复孔。去除培养基，将配置好的药物加入细胞板，每孔100uL，72小时之后，去除培养基，之后用CCK8试剂盒(bimake，B34304)检测450nm的OD值，并进一步计算出细胞活性比例，用graphpad曲线模拟计算出IC50值。图6a-d表示HER2表达水平不同的细胞株，BT474、SKBR3和MDA-MB-453是高表达的阳性细胞，MDA-MB-468细胞是阴性细胞。其中ApDC在BT474细胞的IC50为0.827nM。
实施例9
ApDC对HER2表达荷瘤鼠的靶向治疗：
5-8周大小的BLB/c雌性裸鼠，在动物伦理规定的环境中饲养三天后，BT474肿瘤细胞以7*106个/100ul的密度的接种于小鼠右侧背部皮下，等待7-10天之后，当肿瘤大小在50-100立方毫米的时候，通过尾静脉注射向BT474乳腺癌荷瘤裸鼠注射ApDC或NCDC或DM1-SMCC药物，每组样本量为5只，每只动物的注射剂量为0.28μmol/kg(相当于DM1-SMCC为0.3mg/Kg)，100uL每只。每两天给药一次，并且监测体重和肿瘤体积，结果分别如图7a和图7c。当肿瘤大小超过1000或PBS组体重下降超过15％为治疗终点。动物实施安乐死后解剖，取出肿瘤与器官，对肿瘤进行了称重，结果如图7b和7d所示。其中，ApDC组的肿瘤体积最小，最轻，与PBS组相比，有显著性的差异。
实施例10
ApDC血清稳定性实验和酶稳定性实验：
1)血清稳定性实验：终浓度为4-5μmol/L的DNA样品包括核酸适配体(实施例1步骤1制备获得)、对照序列(实施例2步骤1制备获得)，ApDC(实施例1制备获得)和NCDC(实施例2制备获得)，与含有10％的R1640培养基或10％小鼠血清-PBS孵育，条件为37℃摇床中，转速150r/min，孵育时间分别为0、2、4、8、12、24、48、72、96小时，每个时间点取样10μL，经95℃加热10min使酶失活，放置在-20℃。样品收集完毕。配置3％的琼脂糖凝胶，通过DNA电泳分离，用凝胶成像仪成像并分析鉴定样品是否降解。结果如图8所示，ApDC的稳定性要强于NCDC，也要强于单独的核酸适配体。说明，ApDC的5’端修饰有效降低核酸外切酶的降解。另外由于aptamer含有G4结构，其稳定性强于对照序列。
2)脱氧核糖核酸酶I(DNase I)处理后稳定性分析。DNaseI是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。实验步骤：终浓度为4-5μmol/L的DNA样品包括核酸适配体(实施例1步骤1制备获得)、对照序列(实施例2步骤1制备获得)，ApDC(实施例1制备获得)和NCDC(实施例2制备获得)，与DNase1孵育，所用buffer和终止液参照DNase试剂盒说明书推荐方法(碧云天，D7076)，每一单位的酶与0.5μg DNA孵育。条件为37℃摇床中，转速150r/min，孵育时间分别为0，30min，60min，120min。每个时间点取样10μL，加入1μl 25mM EDTA，65℃孵育10分钟以失活DNase I，放置在-20℃。样品收集完毕。配置3％的琼脂糖凝胶，通过DNA电泳分离，用凝胶成像仪成像并分析鉴定样品是否降解。结果如图8所示，ApDC的稳定性最强。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 一种核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagcggtgt gggggcagcg gtgtgggggc agcggtgtgg gg 42
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attgcactta ctatattgca cttactatat tgcacttact at 42

Claims (10)

1.一种核酸适配体药物偶联物，包括药物分子基团和核酸适配体片段，所述核酸适配体片段的多核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。
2.如权利要求1所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述药物分子选自小分子毒素药物分子，优选选自美登素类药物分子；
和/或，所述药物分子包括-SH基团。
3.如权利要求2所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述药物分子基团的结构式如下所示：
Figure FDA0002077997690000011
4.如权利要求1所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述核酸适配体药物偶联物还包括用于连接药物分子基团和核酸适配体片段的连接基团，优选的，所述药物分子基团和核酸适配体片段之间通过SMCC、SPDP或SPP连接。
5.如权利要求4所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述连接基团的结构式如下之一所示：
Figure FDA0002077997690000012
6.如权利要求1所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所示核酸适配体片段的多核苷酸序列的5’端还包括3～5个T；
和/或，所述核酸适配体片段5’端修饰有氨基基团，优选的，所述核酸适配体片段5’端修饰有C6氨基亚磷酰胺单体，所述核酸适配体片段的结构式如下所示：
Figure FDA0002077997690000013
7.如权利要求1所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述核酸适配体药物偶联物选自化学结构式如下之一所示的化合物：
Figure FDA0002077997690000021
8.如权利要求1～7任一权利要求所述的核酸适配体药物偶联物的制备方法，包括：将药物分子与核酸片段连接，以提供所述的核酸适配体药物偶联物。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括：将药物分子修饰连接分子，将修饰有连接分子的药物分子与核酸片段连接，以提供所述的核酸适配体药物偶联物。
10.如权利要求1～7任一权利要求所述的核酸适配体药物偶联物在制备药物中的用途。
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