CN102060909B - 一种肿瘤特异性靶向多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可与肿瘤特异性结合的多肽。该多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1。本发明通过噬菌体展示体内筛选技术获得与肺癌特异结合的噬菌体，进行序列测定，合成特异结合的多肽。该多肽与聚酰胺-胺型树枝状高分子纳米材料连接后在体外可以很好的与多种肿瘤细胞结合。经体外实验鉴定后，该靶向多肽具有很高的肿瘤靶向性，作为靶向剂将在肿瘤的诊断显像和靶向治疗方面有广阔的应用。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质多肽技术领域，涉及噬菌体展示的多肽及其应用。更具体的说是一种可与肿瘤细胞特异性结合的多肽及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤在世界上是最常发生的癌症之一.有许多先进国家，其中肺癌的死亡率居所有癌病死亡率的第一位。目前肺癌的治疗主要有手术、放疗和化疗等手段。手术和放射性治疗都是局部治疗方式，无法控制晚期的转移，而且许多病人由于体质较弱，无法接受此类治疗；而化疗虽然有一些疗效不错的化疗药物，但由于都缺乏肿瘤细胞特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤大量的骨髓及其它增值旺盛的细胞，都具有较强的副作用，并且多次化疗之后往往会产生耐药性，大大降低药物疗效。所以目前对于肿瘤的靶向治疗是肿瘤治疗的热点。
噬菌体展示(phage dispaly)技术[1]是一项研究生物活性肽、肽类药物筛选和抗体制备等非常有用的手段。近年发展起来的噬菌体随机肽库体内筛选方法(phage display invivo)[2]，是寻找与组织，器官特异性结合多肽的有效手段。此方法可在受体分子尚不清楚的情况下，以受体天然存在的环境组织器官为配基，利用噬菌体短肽的抗原特异性，寻找未知的靶分子，确定其结构域。具有特异结合活体组织、器官并在体内具有稳定性好、特异性高等优点。这一方法可以在靶点分子机理未知的情况下直接筛选特异结合的配体，缩短了研究周期。而且筛选与治疗在相同条件下进行，避免了体外筛选得到的配体体内实验无效或活性低的缺点，最大程度保证了筛选到的短肽的靶向特异性。目前国际上已经通过噬菌体体内筛选技术成功得到了几组特异与小鼠脑、肾部位血管和肿瘤血管结合的小肽，而且将此小肽与阿霉素和肿瘤坏死因子TNF-α偶联后，在小鼠肿瘤模型中起到了良好的抗肿瘤作用[2.3，4]。
申请号01126429.2公开了一种抗小细胞肺癌多肽混合物一共有三种形式：SPDD多肽混合物，SPDD结构趋同化组合的多肽文库的多肽混合物，前两者混合的多肽混合物。作为拮抗剂，用于制备抗小细胞肺癌的多肽药物。
申请号03158296.6公开了一种具有抗肿瘤作用的多肽，由1Ala、1Glu、1Gly、1Leu、2Pro、1Thr、1Tyr组成的八肽，分子量为846.9，可应用ND100来治疗肿瘤。
申请号200710066323.0公开了一种具有肿瘤靶向性的多肽及其制备方法。它的氨基酸序列结构为：CASPSGALRSC；或CFPVPGHDLVC；或CFSVPGHDIVC；或CTPMSLSLSEC；或CYTYPLGWHIC人工合成具有肿瘤靶向性的多肽。
申请号02149419.3公开了一种癌胚抗原特异性结合肽及其与TNF-α的融合蛋白主要是通过噬菌体随机展示肽库筛选出与癌胚抗原特异性结合的结合肽，这些结合肽可以用作癌胚抗原阳性肿瘤导向治疗药物的载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可与肺癌细胞具有高亲和力和特异性结合的多肽。
本发明的另一个目的在于公开了可与肺癌细胞特异性结合多肽的构建方法。
本明的再一个目的在于公开了肿瘤特异性靶向多肽在制备作为肿瘤靶向剂药物方面的应用。其中的应用方法是将该多肽与聚酰胺-胺型树枝状高分子纳米材料连接，制成合成材料，然后向培养基中加入上述合成材料，转染四小时，测定合成材料进入各种细胞效率。
本发明的上述目的是通过如下的方法予以实现：
本发明通过噬菌体随机多肽文库体内筛选与肺癌组织特异结合的多肽，制备肽类肺癌早期诊断和治疗试剂。方法：通过噬菌体展示体内筛选技术获得与肺癌特异结合的噬菌体，进行序列测定，合成特异结合的多肽。结果通过四轮筛选获得了环七肽噬菌体多肽，该多肽与聚酰胺-胺型树枝状高分子纳米材料连接后在体外可以很好的与肿瘤细胞结合。结论该多肽可以很好的靶向与肿瘤细胞，将其作为靶向剂可以对肿瘤显像和治疗起到积极的作用。特别是对子宫颈癌细胞、人非小细胞肺癌细胞和人神经胶质瘤细胞将其作为靶向剂可以对肿瘤的诊断显像和靶向治疗将会有广阔的应用。
本发明公开的肿瘤特异性靶向多肽，其氨基酸序列为ACPLSHSLIC。起到靶向作用的主要是CPLSHSLIC中间的PLSHSLI。编码的核苷酸序列为GCAAATCAAACTATGAGAAAGAGGACAAGC。
本发明进一步公开了肿瘤特异性靶向多肽在制备肽类肿瘤早期诊断和治疗试剂方面的应用。特别是作为肿瘤靶向剂药物方面的应用。
本发明所述的肿瘤特异性靶向多肽的应用方法是：将该多肽与聚酰胺-胺型树枝状高分子纳米材料连接，制成合成材料，然后向培养基中加入上述合成材料，使终浓度达0.5umol/L，转染四小时，测定合成材料进入各种细胞效率。
本发明的具体制备方法如下：
噬菌体展示体内筛选多肽
一、人A460大细胞肺癌裸鼠模型的建立
1)取四周龄Balb/C雌性裸鼠(购于中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心)，放入SPF级动物房饲养。
2)培养人非小细胞肺癌NCI H460，取对数生长期肺癌细胞株，胰酶常规消化，调整细胞浓度为1x107个/ml，取200ul即2x106个细胞接种于每只裸鼠的前肢腋下皮下，观察细胞接种后的生长状况，大约5-6天后可见瘤块，待两周时肿瘤直径大小约为0.3～0.5cm，可做体内噬菌体筛选实验。
二、噬菌体展示多肽文库小鼠体内的筛选
(1)E.coli ER2738的培养
以无菌操作技术从ER2738大肠杆菌(New England Ph.D.-C7CTM噬菌体展示肽库试剂盒自带)的甘油冻存物中挑取一接种环，划线法接种于四环素抗性的LB平板上，37℃培养24h，待平板上可见白色透亮的菌斑形成后，将基本培养平板至于4℃保存。
平板上挑取E.coli ER2738单菌落接种于5mlLB培养液中，37℃225转振荡培养至对数生长中期(OD600约为0.5)。
(2)动物实验
1)取肿瘤小鼠，戊巴比妥钠(0.5％)按150mg/kg腹腔注射，麻醉后酒精棉消毒。
2)从New England购置Ph.D.-C7CTM噬菌体展示肽库，分别将含1011pfu 10μl的噬菌体混合于200μl RPMI1640中，注入小鼠尾静脉。
3)噬菌体在小鼠体内循环5分钟后，切开胸部暴露心脏，注意避免损失心脏和大出血。
4)充分暴露心脏后，通过左心室用静脉穿刺入主动脉，缓慢的推入20ml磷酸缓冲液，同时在右心耳处剪开一小口，可见血液流出，直至流出的血液变成淡红色为止。
5)取出肿瘤组织，称重，加入存放于4℃的1ml RPMI1640-PI，用组织匀浆器小心研磨。
6)把匀浆移入5ml离心管中，加入1ml冰RPMI1640-PI(含1％BSA)洗涤：涡旋10S充分混合组织和洗涤液，5000RPM离心5分钟，小心吸出上清。重复以上操作洗5次，注意每次加洗涤液后要充分洗涤匀浆沉淀。
7)把组织和对数期的2ml宿主菌混合，室温下静止30min。将LB培养液预温至37℃。
8)加入预温的LB培养基10ml，室温孵育30min。
9)噬菌体滴度测定：
①接种ER2738单菌落于5-10ml LB培养基中，摇床培养至对数中期(OD600～0.5)。
②细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45℃备用。
③37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。
④在LB中准备20倍系列稀释的噬菌体。
建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。每个稀释度换一新鲜吸头，使用带滤芯吸头以避免交叉污染。
⑤当菌体培养物达对数中期，分成200μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。
⑥每管加入10μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min。
⑦将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
⑧待平板冷却5min后，倒置于37℃培养过夜。
⑨检查平板，计数有～102个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。
10)噬菌体扩增：取5ml(约数)组织/宿主菌保存，其余的与2ml对数期.E.coli混合，倒入盛有200ml LBT培养基的锥形瓶中，37℃振荡孵育16h。
11)将培养液倒入50ml离心管中，4℃8000rpm离心15min，上清移入锥形瓶中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃沉降过夜。
12)4℃10000rpm离心15min，弃上清，在吸水纸上倒置离心管至完全干燥。用1mlRPMI1640重悬沉淀物，再次加入160μl PEG/NaCl溶液，冰浴1h，4℃10000rpm离心10min，弃上清，以200ul含0.02％NaN3的RPMI1640溶液重悬沉淀物，此即为第一轮扩增的噬菌体，4℃保存。
13)分别稀释106～1010测定噬菌体滴度。取1011pfu作为第二次筛选的噬菌体。重复以上操作，进行四轮筛选。
(3)噬菌体DNA的提取纯化及其序列测定
1)按上述方法进行噬菌斑扩增，在第一步离心后，将500μl含噬菌体上清转入一新鲜离心管。
2)加200μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10min。
3)离心10min，弃上清液。
4)短暂离心，小心吸去残余上清。
5)沉淀物彻底重悬于100μl碘化物缓冲液中，加入250μl乙醇。室温温育10min。短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。
6)离心10min，弃上清。用70％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。
7)沉淀重悬于30μl TE[10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA]中。
8)取5μl的上述模板溶液，用试剂盒自带的-96引物进行测序。
-96gIII测序引物：5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’样品送上海生工进行测序，部分测序结果如下：
环七肽噬菌体序列为：GCAAATCAAACTATGAGAAAGAGGACAAGC。
噬菌体测序序列如下：
TTCTGTATGGGATTTTGCTAAACAACTTTCAACAGTTTCGGCCGAACCTCCACCGCAAATCAAACTATGAGAAAGAGGACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACCACTAAAGGAATTGCGAATAATAATTTTTTCACGTTGAAAATCTCCAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCCTTTAATTGTATCGGTTTATCAGCTTGCTTTCGAGGTGAATTTCTTAAACAGCTTGATACCGATAGTTGCGCCGACAATGACAACAACCATCGCCCACGCATAACCGATATATTCGGTCGCTGAGGCTTGCAGGGAGTTAAAGGCCGCTTTTGCGGGATCGTCACCCTCAGCAGCGAAAGACAGCATCGGAACGAGGGTAGCAACGGCTACAGAGGCTIIGAGGACIAAAGACTTTTTCATGAGGAAGTTTCCATTAAACGGGTAAAATACGTAATGCCACTACGAAGGCACCAACCTAAAACGAAAGAGGCAAAAGAATACACTAAAACACTCATCTTTGACCCCCAGCGATTATACCAAGCGCGAAACAAAGTACAACGGAGATTTGTATCATCGCCTGATAAATTGTGTCGAAATCCGCGACCTGCTCCATGTTACTTAGCCGGAACGAGGCGCAGACGGTCAATCATAAGGGAACCGAACTGACCAACTTTGAAAGAGGACAGATGAACGGTGTACAGACCAGGCGCATAGGCTGGCTGACCTTCATCAAGAGTAATCTTGACAAGAACCGGATATTCATTACCCAAATCAACGTAACAAAGCTGCTCATTCAGTGAATAAGGCTTGCCCTGACGAGAAACACCAGAACGAGTA。
(4)多肽序列的合成
根据DNA序列可以推导出外源插入的环七肽蛋白序列为：ACPLSHSLIC，通过两个半胱氨酸的二硫键交联成环形七肽，环状多肽的结合主要是靠环形内的多肽与蛋白结合的，为了后续实验方便进行同位素标记，在环形多肽的末端加了一个酪氨酸，为了能够更好的与载体连接，将左侧末端的丙氨酸换成了精氨酸。多肽序列委托北京中科亚光生物科技有限公司进行合成，对产品进行HPLC纯化和质谱鉴定，纯度98％以上，分子量与理论值相符。
本发明的环七肽与现有技术相比所具有的有益效果在于：本发明筛选得到的多肽不但具有传统抗体分子优点，而且分子量小、穿透力强、容易到达肿瘤组织、具有良好的肿瘤靶向作用、诊断肿瘤更加灵敏，可用于制备诊断肿瘤的试剂盒，以及治疗肿瘤的药物和携带肿瘤药物的靶向剂方面的应用。
附图说明：
图1为人肺癌肿瘤模型及其体内筛选取出的肿瘤组织。
图2为多肽与PAMAM的连接示意图。
图3为多肽与PAMAM连接后测定材料进入各种细胞效率分析图。
具体实施方式：
为了更充分的解释本发明的实施，提供环七肽的制备实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。
实施例1
一、人A460大细胞肺癌裸鼠模型的建立
1)取四周龄Balb/C雌性裸鼠(购于北京医科院实验动物中心)，放入SPF级动物房饲养。
2)培养人非小细胞肺癌NCI H460，取对数生长期肺癌细胞株，胰酶常规消化，调整细胞浓度为1x107个/ml，取200ul即2x106个细胞接种于每只裸鼠的前肢腋下皮下，观察细胞接种后的生长状况，大约5-6天后可见瘤块，待两周时肿瘤直径大小约为0.3～0.5cm，可做体内噬菌体筛选实验。
二、噬菌体展示多肽文库小鼠体内的筛选
(1)E.coli ER2738的培养
以无菌操作技术从ER2738大肠杆菌(New England Ph.D.-C7CTM噬菌体展示肽库试剂盒自带)的甘油冻存物中挑取一接种环，划线法接种于四环素抗性的LB平板上，37℃培养24h，待平板上可见白色透亮的菌斑形成后，将基本培养平板至于4℃保存。
平板上挑取E.coli ER2738单菌落接种于5mlLB培养液中，37℃225转振荡培养至对数生长中期(OD600约为0.5)。(做动物实验前一天晚上接种)
(2)动物实验
1)取肿瘤小鼠，戊巴比妥钠(0.5％)按150mg/kg腹腔注射，麻醉后酒精棉消毒。
2)从New England购置环七肽噬菌体展示文库，分别将含1011pfu 10μl的噬菌体混合于200ulRPMI1640中，注入小鼠尾静脉。
3)噬菌体在小鼠体内循环5分钟后，切开胸部暴露心脏，注意避免损失心脏和大出血。
4)充分暴露心脏后，通过左心室用静脉穿刺入主动脉，缓慢的推入20ml磷酸缓冲液，同时在右心耳处剪开一小口，可见血液流出，直至流出的血液变成淡红色为止。
5)取出肿瘤组织，称重，加入存放于4℃的1ml RPMI1640-PI(RPMI1640中含1mM PMSF，20ug/ml aprotinin和1ug/ml leupeptin)，用组织匀浆器小心研磨。
6)把匀浆移入5ml离心管中，加入1ml冰RPMI1640-PI(含1％BSA)洗涤：涡旋10S充分混合组织和洗涤液，5000RPM离心5分钟，小心吸出上清。重复以上操作洗5次，注意每次加洗涤液后要充分洗涤匀浆沉淀。
7)把组织和对数期的2ml ER2738宿主菌混合，室温下静止30min。将LB培养液预温至37℃。
8)加入预温的LB培养基10ml，室温孵育30min。
9)噬菌体滴度测定：
①接种ER2738单菌落于5-10ml LB培养基中，摇床培养至对数中期(OD600～0.5)。
②细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管，保存于45℃备用。
③37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。
④在LB中准备20倍系列稀释的噬菌体。
建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。每个稀释度换一新鲜吸头，使用带滤芯吸头以避免交叉污染。
⑤当菌体培养物达对数中期，分成200μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。
⑥每管加入10μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min。
⑦将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
⑧待平板冷却5min后，倒置于37℃培养过夜。
⑨检查平板，计数有～102个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。
10)噬菌体扩增：5ml组织/宿主菌保存，其余的与2ml对数期.E.coli混合，倒入盛有200ml LBT培养基的锥形瓶中，37℃振荡孵育16h，使噬菌体在E.coli中大量繁殖，浓度达到1011pfu以上。
11)将培养液倒入50ml离心管中，4℃8000rpm离心15min，上清移入锥形瓶中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃沉降过夜。
12)4℃10000rpm离心15min，弃上清，在吸水纸上倒置离心管至完全干燥。用1mlRPMI1640重悬沉淀物，再次加入160μlPEG/NaCl溶液(聚乙二醇)，冰浴1h，4℃10000rpm离心10min，弃上清，以200μl含0.02％NaN3(叠氮钠)的RPMI1640溶液重悬沉淀物，此即为第一轮扩增的噬菌体，4℃保存。
13)分别稀释106～1010测定噬菌体滴度。取1011pfu作为第二次筛选的噬菌体。重复以上操作，进行四轮筛选。
(3)噬菌体DNA的提取纯化及其序列测定
1)按上述方法进行噬菌斑扩增，在第一步离心后，将500μl含噬菌体上清转入一新鲜离心管。
2)加200μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10min。
3)离心10min，弃上清液。
4)短暂离心，小心吸去残余上清。
5)沉淀物彻底重悬于100μl碘化物缓冲液中，加入250μl乙醇。室温温育10min。短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。
6)离心10min，弃上清。用70％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。
7)沉淀重悬于30μl TE[10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA]中。
8)取5μl的上述模板溶液，用试剂盒自带的-96引物进行测序。
-96gIII测序引物：5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’样品送上海生工进行测序，环七肽噬菌体氨基酸序列为ACPLSHSLIC。编码的核苷酸序列为GCAAATCAAACTATGAGAAAGAGGACAAGC。
LB培养基：称取(10g Tryptone，5g Yeast Extract，10g NaCl)置于1L的烧杯中，加入800ml的去离子水，充分溶解，用1M的NaOH调节PH值至7.0，用去离子水定容至1L，高温高压灭菌后，4℃保存。
PEG/NaCl溶液：20％(W/V)聚乙二醇，2.5M NaCl，高温灭菌，室温保存。
LBT：LB培养基中加入0.05M四环素
RPMI1640培养基：购自上海生工生物工程技术服务有限公司
RPMI1640-PI：RPMI1640中含1mM PMSF，20μg/ml aprotinin和1μg/ml leupeptinIPTG/Xgal储液：1.25gIPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、1.0gXgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)溶于25ml二甲基甲酰胺中，过滤除菌，-20℃避光保存。
LB/IPTG/Xgal平板：1L LB培养基中加入15g琼脂粉，高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml IPTG/Xgal储液，均匀倒平板，平板4℃避光保存。
(4)多肽序列的合成
根据DNA序列可以推导出外源插入的蛋白序列为：环七肽的氨基酸序列为ACPLSHSLIC。起到靶向作用的主要是CPLSHSLIC中间的PLSHSLI。编码的核苷酸序列为GCAAATCAAACTATGAGAAAGAGGACAAGC。通过两个半胱氨酸的二硫键交联成环形七肽，环状多肽的结合主要是靠环形内的多肽与蛋白结合的，为了后续实验方便进行同位素标记，在环形多肽的末端加了一个酪氨酸，为了能够更好的与载体连接，将左侧末端的丙氨酸换成了精氨酸。多肽序列委托北京中科亚光生物科技有限公司进行合成。
实施例2
环七肽的化学合成及其鉴定：
由环七肽的测序的结果推定，环七肽的氨基酸序列为ACPLSHSLIC。起到靶向作用的主要是CPLSHSLIC中间的PLSHSLI。合成并用FITC(异硫氰酸荧光素)作为检测的材料标记，环七肽通过HPLC纯化及质朴鉴定，结果表明合成的环七肽纯度98％以上，分子量与理论值相符。
实施例3
通过化学交联的方法将多肽与纳米材料聚酰胺-胺型树枝状聚合物(PAMAM)连接，并在PAMAM上连接异硫氰酸荧光素(FITC)作为检测标记。
1、四代PAMAM乙酰化
取PAMAM 1g溶于120ml无水甲醇中，加入0.35g三乙胺。将0.21g乙酰酐溶于60ml无水甲醇中，并逐滴加入到以上溶液里，室温搅拌过夜。旋转真空蒸发无水甲醇，剩余物溶于水中。通过透析袋透析，去除未反应的小分子物质，透析后进行冷冻干燥。
2、连接FITC
将乙酰化后的PAMAM称取0.4g溶于40ml DMSO中，将FITC38.9mg溶于8mlDMSO中，逐滴加入到PAMAM溶液中，搅拌过夜。反应液进行透析去除未反应小分子物质，并进行冷冻干燥。
3、丁二酸酐的连接
称取PAMAM-AC-FITC 0.1g、TEA 0.0245g溶于90ml无水甲醇中，丁二酸酐9.1mg溶于6ml无水甲醇中，逐滴加入前一溶液里，室温搅拌24h。旋转蒸发甲醇，剩余物溶于水中进行透析，透析液冷冻干燥处理。
4、多肽的连接
称取PAMAM-AC-FITC-丁二酸酐12.758mg、EDC 2.04mg溶于4ml水中反应3h。称取多肽7.2μmol，溶于1mlDMSO中，逐滴加入到前一溶液里，搅拌过夜。样品进行透析和冷干处理。
通过以上方法将多肽和FITC连接到PAMAM上。
培养293(人正常肾上皮细胞系)、Hela(人子宫颈癌细胞)、H460(人非小细胞肺癌细胞)和C6(人神经胶质瘤细胞)细胞。
向培养基中加入上述合成材料，使终浓度达0.5umol/L，转染四小时，进行流式细胞仪的测试，测定材料进入各种细胞的效率，结果表明：在靶向多肽的携带下，材料进入三种肿瘤细胞的效率远远大于进入正常细胞的效率(详见附图3)。与没有靶向多肽的材料相比，带有多肽的材料进入细胞的效率也远远高于未带多肽的材料。由此可见，该靶向多肽具有很高的肿瘤靶向性，对肿瘤的诊断显像和靶向治疗将会有广阔的应用。
参考文献：
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序列表
<110>中国医学科学院放射医学研究所
<120>一种肿瘤特异性靶向多肽及其应用
<160>2
<210>1
<211>30bp
<212>DNA
<213>基因序列
<220>
<221>gene
<222>(1)..(30)
<400>1
gcaaatcaaa ctatgagaaa gaggacaagc 30
<210>2
<211>10bp
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(10)
<400>2
Ala Cys Pro Leu Ser His Ser Leu Ile Cys
1 5 10
Claims (5)
1.一种肿瘤特异性靶向多肽，其氨基酸序列为ACPLSHSLIC。
2.编码权利要求1所述肿瘤特异性靶向多肽的核苷酸，其序列为GCAAATCAAACTATGAGAAAGAGGACAAGC。
3.权利要求1所述的肿瘤特异性靶向多肽在制备肽类肿瘤诊断试剂方面的应用。
4.权利要求1所述的肿瘤特异性靶向多肽在制备作为肿瘤靶向剂药物方面的应用。
5.权利要求3所述的应用，其特征在于将权利要求1所述肿瘤特异性靶向多肽与聚酰胺-胺型树枝状高分子纳米材料连接，制成合成材料，作为肿瘤诊断试剂，然后向培养基中加入上述合成材料，使终浓度达0.5μmol/L，转染四小时，测定合成材料进入各种细胞效率。
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