CN102325794A - 用于全身性癌症治疗的egfr导航双链rna载体 - Google Patents

用于全身性癌症治疗的egfr导航双链rna载体 Download PDF

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Abstract

公开了一种表皮生长因子受体（EGFR）-导航载体，其包含带有EGFR-结合肽或多肽的双链RNA（dsRNA）分子，与免疫细胞组合用于过量表达EGFR的癌症的治疗。

Description

用于全身性癌症治疗的EGFR导航双链RNA载体
发明领域
本发明属于癌症治疗的领域，涉及包含带有EGFR-结合试剂的双链RNA(dsRNA)的载体，所述EGFR-结合试剂能够将dsRNA特异性导向过量表达EGFR的癌细胞，从而动员免疫系统用于过量表达EGFR的肿瘤的治疗。
缩写：dsRNA：双链RNA；EGF：表皮生长因子；EGFR：EGF受体；PBMC：外周血单核细胞；PEG：聚(乙二醇)；PEI：聚乙烯亚胺；pIC，PolyIC：聚肌苷酸-聚胞苷酸双链RNA；pIC/MPPE：PolyIC/蜂毒素-分枝的聚乙烯亚胺-聚乙二醇-EGF；pIC/PPE：PolyIC/线性的聚乙烯亚胺-聚乙二醇-EGF；pIC/PPGE11：PolyIC/线性聚乙烯亚胺-聚乙二醇-(肽)GE11。
发明背景
表皮生长因子受体(EGFR)在各种实体人类肿瘤中过量表达，包括非小细胞肺癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、结肠直肠癌症、腺癌、卵巢癌症、膀胱癌和前列腺癌(Hynes et al.，2009)。美国癌症学会的新癌症病例和死亡的估计显现了2008年在美国1,437,180例新癌症病例以及565,650例癌症死亡。大多数癌症死亡的原因是癌症向内脏的转移，其实际上不可能通过常规方法来治疗。与死亡相关的所有癌症的大部分与EGFR的过量表达相关。因而，EGFR是靶向的癌症治疗的最重要的候选物之一。
两种最先进的EGFR靶向疗法是小的膜可透过的EGFR激酶抑制物，以及抗EGFR抗体，它们阻止受体活化和/或引起受体减量调节。这些试剂诱导临时或部份缓解，并表现某些存活效益，但是实际上不治愈患者。这很可能因为EGFR对于靶向的癌细胞的存活不是关键的。
PolyIC，一种合成的聚肌苷酸-聚胞苷酸双链RNA，是已知的细胞毒性试剂。非靶向的PolyIC的肿瘤内和肿瘤周施用已经展现了在抗肿瘤免疫治疗中是有效的(Fujimura et al.，2006)。这样的治疗仅限于局部的肿瘤，非靶向的PolyIC治疗癌症的全身性应用的尝试也已经显示了这一点。存活益处是最小的，同时观察到显著的全身毒性(Butowski et al.，2009；Salazar et al.，1996)。微弱的效果最可能是由不能将足够剂量的PolyIC导入肿瘤细胞而引起。大部分的非靶向性PolyIC可能通过正常组织扩散进入非癌细胞并诱导毒性反应。
近来，我们开发了利用EGFR的高水平表达，而不是它本身的活性的策略，作为肿瘤的致命点。通过利用负载PolyIC的EGFR导航化学载体实现了这一点(Shir et al.，2006；WO 04/045491)。PolyIC/蜂毒素-聚乙烯亚胺-聚乙二醇-EGF(PolyIC/MPPE)向颅内生长的过量表达EGFR的成胶质细胞瘤(～1×106个受体/细胞)、以及向裸鼠中作为异种移植物生长的过量表达EGFR的乳腺和表皮样癌的肿瘤内应用，引起了这些局部化肿瘤的完全消除，治愈了小鼠。此外，包含过量表达野生型EGFR的细胞以及带有突变的EGFRvIII的细胞的1∶1混合物的肿瘤，其不内在化所述载体，也被完全地消灭。这种“旁观者效应”是由于PolyIC/MPPE影响的肿瘤细胞在肿瘤位置产生的抗增殖细胞因子，例如干扰素-α。
发明概述
本发明涉及表皮生长因子受体(EGFR)-导航(homing)载体，其包含带有EGFR-结合肽或多肽的双链RNA(dsRNA)分子，与免疫细胞一起用于过量表达EGFR的癌症的治疗。
本发明进一步涉及治疗特征在于过量表达EGFR的细胞的癌症的方法，所述方法包括向需要的患者全身地施用以下的组合：(i)EGFR-导航载体，其包含带有EGFR-结合肽或多肽的dsRNA分子，所述EGFR-结合肽或多肽能够将所述载体靶向过量表达EGFR的肿瘤细胞；和(ii)免疫细胞。
在某些实施方式中，本发明提供用于全身性施用的药物组合物，其包含药学上可接受的载运体(carrier)和EGFR-导航载体(vector)，所述载体包含带有EGFR-结合多肽的双链dsRNA分子。
在某些其他实施方式中，本发明提供了治疗特征在于过量表达EGFR的细胞的癌症的方法，所述方法包括向需要的患者全身地施用有效量的EGFR-导航载体，所述载体包含带有EGFR-结合多肽的双链dsRNA分子。
在某些实施方式中，EGFR-导航载体进一步包含核酸载运体，例如，由与聚乙二醇(PEG)共价连接的聚乙烯亚胺(PEI)组成，dsRNA是与载体的PEI部分非共价缔合的polyIC，EGFR-结合肽或多肽是与载运体的PEG部分共价连接的EGF或肽GE11。
本发明的载体、组合物和方法预期用于选自非小细胞肺癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、结肠直肠癌、腺癌、卵巢癌、膀胱癌或前列腺癌以及其转移的癌症的治疗。
附图的简要说明
附图1A-C描绘了柱形图，其显示了PBMC通过PolyIC/MPPE转染的MDA-MB-468和A431细胞的培养基被选择性地活化。如“方法”中描述的，500,000个PBMC播种到24孔平板中，在0.5ml培养基中生长过夜。PBMC然后用从PolyIC/PEI-PEG-EGF+PEI-Mel转染的A431、MDA-MB-468、U87MG或U138MG细胞转染后48小时移去的0.5ml培养基攻击。在攻击后24和48小时采集PBMC培养基，使用ELISA分析测量IFN-γ、IL-2和TNF-α。(1A)攻击后24和48小时，PBMC的培养基中IL-2的表达。(1B)攻击后48小时，PBMC的培养基中IFN-γ的表达。(1C)攻击后48小时，PBMC的培养基中TNF-α的表达。“未处理”显示了在未攻击的PBMC中细胞因子的表达。“UT”显示了用未转染的细胞的培养基攻击的PBMC的细胞因子表达。聚谷氨酸(pGlu)/MPPE被用作对照。
附图2A-D显示了免疫细胞向PolyIC/MPPE+PBMC治疗的过量表达EGFR的肿瘤中的浸润，但是不浸润入U138MG细胞(没有EGFR表达)。A431(2A)或MDA-MB-468(2B)细胞皮下地注射(s.c.)入SCID-NOD小鼠的右肋，U138MG(2C-2D)注射入左肋(比较附图2A与附图2C，以及附图2B与附图2D)。当肿瘤达到大约100mm3时，用3次连续的PolyIC/MPPE I.V.注射5μg/小鼠/天启动治疗。最后的PolyIC/MPPE注射之后24小时，3百万个PBMC I.P.注射，24小时后提取肿瘤，固定在4％福尔马林中。然后制备石蜡切片，用H&E染色，进行组织病理学分析。短划线显示了免疫细胞浸润的区域。
附图3A-D显示了PBMC介导的旁观者效应。附图3A.为了展现PBMC介导的旁观者效应，100,000个MDA-MB-468细胞播种到6孔平板中，与2mL培养基生长过夜(Shiret al.，2006)。细胞然后用Poly IC/MPPE以标明的浓度转染。转染后48小时，来自转染的细胞的0.5mL培养基(“条件培养基”)添加到500,000个PBMCs中，所述PBMC早先24小时播种到24孔平板中并在0.5ml培养基中生长。来自攻击的PBMC的0.1ml培养基然后交换为来自早先24小时播种的另外的未转染的MDA-MB-468细胞(“指示细胞”)的0.1ml培养基。在用来自PBMC的培养基攻击后48小时，这些细胞的存活通过次甲基蓝分析来测定(图画中的黑色柱)。并行地，为了显示直接旁观者效应，0.1ml的条件培养基用于替换来自早先24小时播种到96孔平板并在0.2ml培养基中生长的、未转染的MDA-MB-468细胞(“指示细胞”)的0.1ml培养基。这些细胞的存活在添加条件培养基后48小时使用次甲基蓝测定(画阴影线的柱)；附图3B显示了poly IC转染的MDA-MB-468细胞对未转染的U138MG细胞的旁观者效应；附图3C-3D显示了poly IC转染的A431细胞分别对未转染的A431细胞和未转染的U138MG细胞的旁观者效应。“未处理”显示了不经历任何培养基交换的指示细胞的存活率。“PBMC UT”显示了用来自未攻击的PBMC的培养基处理的指示细胞的存活率。“UT”显示了用来自未转染的细胞攻击的培养基的PBMC的培养基处理的指示细胞的存活。“无PBMC”(灰色柱)表示如下时的存活，当条件培养基添加到PBMC生长培养基但是不存在PBMC时，将这在48小时后用于攻击指示细胞。这个最后的对照被用于检测在不存在PBMC的PBMC培养基中孵育之后，条件培养基的可能残余的直接旁观者效应。
附图4A-C显示了活化的PBMC的体外癌细胞杀伤。细胞如在方法中描述的来生长。细胞然后用0.1μg/ml的PolyIC/MPPE转染。24小时后，500,000个PBMCs/孔添加到癌细胞，共孵育另外24小时。细胞凋亡细胞(亮点)使用Annexin-V-Biotin试剂盒(Biosource，Inc.)显现。为了辨别肿瘤细胞和PBMC，肿瘤细胞用FITC-轭合的EGFR抗体(Biosource，Inc.，灰色细胞)来标记。细胞用荧光显微镜显现并利用数字照相机拍照：A431细胞、MDA-MB-468细胞和U138MG细胞分别在附图4A、4B和4C中显示。
附图5A-E显示了PolyIC/MPPE/PBMC治疗对带有弥散性(disseminated)肿瘤的小鼠的存活的影响。弥散性肿瘤如方法中所描述的来建立。(5A)在治疗开始时小鼠肺的组织病理学分析(细胞注射后15天)。箭头指向肺毛细血管中的肿瘤。(5B，5C)细胞注射后15天，动物随机分组(每组5只小鼠)，用24小时间隔的20μg PolyIC/MPPE的4次连续的静脉内注射来开始治疗。最后的PolyIC注射后24小时，动物用四百万PBMC注射一次。(5B)显示了带有A431肿瘤的动物的存活。(5C)显示了带有MDA-MB-468肿瘤的动物的存活。pGlu/MPPE，聚谷氨酸/MPPE；UT，未治疗的。(5D，5E)细胞注射后10天，动物随机分组(每组5只小鼠)，用24小时间隔的20μg PolyIC/MPPE的3或4次连续的静脉内注射的3个循环来开始治疗(共10次注射)。循环之间的间隔时间是48小时。这个操作消除了治疗样体重损失的有毒影响(数据未显示)。对照组包括用pGlu/MPPE(聚谷氨酸/MPPE)治疗的小鼠，来确定没有PolyIC的轭合物和HBG缓冲液(Hepes-缓冲的葡萄糖)的作用(2)。(5D)显示了带有A431肿瘤的动物的存活。(E)显示了带有MDA-MB-468肿瘤的动物的存活。UT，未治疗的。
附图6描绘了载体pIC/MPPE和pIC/PPE对用它们转染的细胞的存活的影响。使用的细胞是U87MG和MDA-MB468(每种4000个细胞)，它们表达不同水平的EGFR(U87MG表达1×105的EGFR；MDA-MB468表达2×106的EGFR)，和U138MG(3000个细胞)(其不表达EGFR)。细胞播种到96孔平板中并生长过夜。细胞然后用与轭合物MP25BrPE或P221PE配制的pIC转染。通过次甲基蓝分析在转染后48小时分析细胞的存活。UT，未处理的细胞。pGlu，聚谷氨酸处理的细胞。
附图7描绘了载体pIC/PPE和pIC/PPGE11对用它们转染的细胞的存活的影响。使用的细胞是MCF7、MDA-MB231(MDA231)、U87MG、U87MGwtEGFR和MDA-MB468(MDA468)(每种4000个细胞)，它们表达不同水平的EGFR(MDA231表达3-7×105，U87MG表达1×105的EGFR；MDA468表达2×106的EGFR)和U138MG(3000个细胞)(其不表达EGFR)。细胞播种到96孔平板中并生长过夜。细胞然后用与轭合物P251PE或P251PGE11配制的pIC转染。通过次甲基蓝分析在转染后48小时分析细胞的存活。UT，未处理的细胞。
附图8A-B显示了不同载体(pGlu/MPPE、pGlu/PPE、pIC/MPPE和pIC/PPE)对裸鼠中s.c.A431生长的体内的作用。对于8A中描绘的实验，雌性4-5周龄小鼠用溶于200μl PBS中的2百万A431细胞(表达高水平的EGFR的人上皮癌细胞系)s.c.注射。当肿瘤达到～80mm3时，小鼠分成5组，每组5只动物。与标明的轭合物配制的10μg pIC每48小时IV注射。对于8B中描绘的实验，雌性6-7周龄小鼠用溶于100μl PBS的2百万U138MG细胞s.c.注射。当肿瘤达到～75mm3时，小鼠分成3个组，每组9只动物。然后小鼠IV注射标明剂量的pIC/P221PE(每48小时10或25μg/小鼠一次)。pGlu，聚谷氨酸。
发明的详细说明
在某些实施方式中，本发明提供了EGFR-导航载体，其包含dsRNA分子，一种已知其细胞毒性和细胞穿透能力的试剂；带有能够将所述载体靶向过量表达EGFR的肿瘤细胞的EGFR结合肽或多肽，与免疫细胞组合使用用于治疗过量表达EGFR的肿瘤。
在某些其他实施方式中，本发明提供了治疗特征在于过量表达EGFR的细胞的癌症的方法，所述方法包括向需要的患者全身地施用以下的组合：(i)包含带有EGFR-结合肽或多肽的dsRNA分子的EGFR-导航载体，所述EGFR-结合肽或多肽能够将所述载体靶向过量表达EGFR的肿瘤细胞；以及(ii)免疫细胞。
本发明中使用的dsRNA分子是合成的双链分子，其在每条链中可以包括不同、但是优选相同，的数量的核糖核苷酸。dsRNA分子的每条链可以包含相同的或不同类型的核糖核苷酸，包括肌苷酸(I)、胞苷酸(C)、腺苷酸(A)、鸟苷酸(G)和尿苷酸(U)。在某些优选的实施方式中，每条链由单一种类的核糖核苷酸组成，更优选的，两条链的核糖核苷酸是匹配的核糖核苷酸对，例如，腺苷酸-尿苷酸，或肌苷酸-胞苷酸配对。
在某些优选的实施方式中，dsRNA完全由匹配的核糖核苷酸对组成，更优选的，肌苷酸(I)-胞苷酸(C)对。因而，dsRNA分子包括聚肌苷酸链和聚胞苷酸链，在此称为“polyIC”或“pIC”。通过诱导干扰素-γ产生，Poly IC可以刺激细胞毒性细胞因子的释放，可以提高各种免疫造血细胞的数量和破坏瘤的活性。
本发明的载体的polyIC可以由RNA链组成，所述RNA链各自包含至少22个、优选的至少85个核糖核苷酸。在某些实施方式中，每条链具有100-300范围内的核糖核苷酸数量。能够将载体靶向过量表达EGFR的肿瘤细胞的EGFR-结合肽或多肽可以是多肽，例如，EGF本身。在某些实施方式中，EGFR-结合肽是EGFR的肽配体，例如，分离自噬菌体文库的序列YHWYGYTPQNVI的12-mer肽GE11，其是合成的并显示了与EGF竞争性结合EGFR(Li et al.，2005；Song et al.，2008)。
dsRNA优选地与载体的靶向部分非共价缔合。这方便于在到达目标细胞/组织以及它在肿瘤细胞/组织中内在化之后dsRNA从目标部分的解离，引起将免疫细胞吸引到肿瘤位置的趋化因子的产生。
polyIC与靶向分子的非共价的缔合优选地通过核酸载运体来实现，所述核酸载运体与dsRNA分子和靶向部分两者缔合。
核酸载运体可以包含聚阳离子聚合物和/或非离子的水溶性聚合物。可以用作核酸载运体的聚阳离子聚合物包括聚-L-赖氨酸，或优选的，聚乙烯亚胺(PEI)。PEI是一种聚阳离子聚合物，由于双链RNA分子的聚阴离子特性，具有与双链RNA分子非共价地缔合的能力，从而中和dsRNA分子的负静电电荷，并因此抵抗dsRNA与阴离子分子化学反应的任何倾向。聚乙烯亚胺在用多核苷酸转染细胞中的运用是本领域公知的；然而，在它的传统用途中，聚乙烯亚胺携带dsRNA到细胞膜，附着在膜上，经历内体摄取，以及随后在内体膜降解时dsRNA的细胞质递送。相比之下，在本发明中，dsRNA向癌细胞表面上EGFR受体的靶向和结合是dsRNA内在化的主要路线。
在本发明中用作核酸载运体的非离子的水溶性聚合物优选地是聚(乙二醇)(PEG)，其是生物相容的、生物学惰性的，并且被广泛地用于携带体内药物。
在某些优选的实施方式中，本发明中使用的dsRNA载运体包含聚乙烯亚胺(PEI)和聚乙二醇(PEG)两者，PEG共价连接到PEI。PEG为复合物赋予了极好的水溶性和组织分布，并提高了它的血清半衰期。
PEI可以是分枝或线性的，具有选自约1-25kDa、约5-23kDa、约15-25kDa的分子量，PEG具有选自约0.3-50kDa、约1-20kDa、约3-10kDa的分子量。在某些实施方式中，dsRNA载运体包含25kDa的分枝的PEI。在某些优选的实施方式中，dsRNA载运体由与3，4kDa的PEG共价连接的22kDa的线性PEI组成。
载体的靶向部分，即，EGFR-结合肽或多肽优选地共价结合到PEI-PEG轭合物的PEG部分，而polyIC非共价地与PEI部分缔合，例如，通过离子缔合。
在某些实施方式中，核酸载运体可以进一步包含能够促进内体膜降解的化合物，从而便于dsRNA分子从目标细胞/组织内体向细胞质内的释放，此时dsRNA最佳地介导细胞毒性。在某些实施方式中，这种化合物是蜂毒素或蜂毒素衍生物，其优选地与dsRNA载运体的聚乙烯亚胺共价缔合。
根据本发明可以使用的EGFR-导航载体的实例包括，无限制地，在此称为pIC/MPPE的载体(包含polyIC/蜂毒素-分枝的25kDa PEI-PEG-mEGF，Shir et al.，2006和WO 04/045491中描述的)以及新的载体pIC/PPE(包含polyIC/线性22kDa PEI-PEG-mEGF)和pIC/PPGE11(包含polyIC/线性22kDa PEI-PEG-肽GE11)。
因而，在某些实施方式中，本发明提供了新的EGFR-导航载体pIC/PPE以及pIC/PPGE11，在此表示为第二代载体(相对于第一代载体，例如，WO04/045491中描述的pIC/MPPE)。
第二代载体不包含蜂毒素，包含线性的PEI代替分枝的PEI。此外，在第二代载体之一中，重组的小鼠EGF(mEGF)用12-mer肽GF11替换。与第一代相比除了第二代载体的制备过程的简化之外，本发明还发现，用线性PEI替代分枝PEI提供了杀伤癌细胞的更高的效力。这是相当令人惊讶的，因为在第二代载体中，在每个线性PEI分子上仅有一个EGF分子，相比之下第一代载体的分枝PEI上有几个EGF，预期第二代载体对EGFR有更低的亲和力。
为了建立肿瘤，它必需避免免疫系统的消灭。许多癌症发展了抑制免疫监督的机制，甚至可以在存在识别癌症抗原的免疫淋巴细胞的情况下生长。这种局部抑制的机制是不清楚的，虽然已经检查了许多理论。PolyIC，一种有效的佐剂，以及干扰素，一种强免疫激活物，可以很好地克服这种局部抑制作用，并且活化先存的癌症特异性免疫淋巴细胞，另外吸引和活化其他免疫细胞。
我们早先显示了(Shir et al.，2006)，用EGFR靶向的poly IC转染的癌细胞分泌细胞因子Gro-α(生长调节癌基因-α)以及IP-10，其已知能够吸引免疫细胞。然而不清楚的是，这些细胞因子是否以足够的数量分泌，以实际地引起免疫细胞在癌细胞位置的积累。
根据本发明已经发现的是，由靶向的PolyIC诱导的这些细胞因子将免疫细胞吸引到转染的肿瘤，并且强烈地增强杀伤肿瘤细胞的效力。这诱导了显著的协同效应，引起弥散性肿瘤的完全消除，即使当以EGFR靶向的poly IC的很低的总剂量在一定距离治疗时(见实施例6)。活化的免疫细胞强烈增强IFN-α导致的旁观者效应(参见实施例4)，其将促进异质的癌症的杀伤。由于PolyIC/MPPE被选择性地靶向癌细胞，我们不预期发生显著的全身性免疫毒性反应。注射到小鼠中的人类PBMC不诱导移植物抗宿主反应、而是诱导强的抗肿瘤反应的事实支持了这一假定。
如上文中提及的，非靶向的PolyIC的肿瘤内或肿瘤周施用已经展现了在抗肿瘤免疫治疗中是有效的(Fujimura et al.，2006)。这样的治疗仅限于局部的肿瘤。相比之下，EGFR靶向的PolyIC在治疗不可能通过局部疗法来治疗的弥散性肿瘤方面是高效的。
如本发明所教导的，EGFR靶向的PolyIC因而可以与几种癌症免疫治疗组合。这些癌症免疫治疗包括癌症疫苗以及癌症靶向的(工程化的或提取的)T细胞。为了介导体内的抗肿瘤效应，癌症靶向的T细胞必需运送到肿瘤地点，从循环中外渗，然后介导效应物功能来引起癌细胞的破坏(Rosenberg，2008)。在肿瘤细胞中选择性地被靶向的PolyIC强烈地诱导的IP-10和Gro-α(表2，3)将促进向肿瘤的运输和外渗，而干扰素将增强T细胞介导的癌症杀伤。
此外，同种异体的免疫细胞移植来活化移植物抗肿瘤反应(Ciceri et al.，2007)可以与在此所示的本发明的EGFR-导航载体组合。在本发明中外源的PBMC向PolyIC/MPPE治疗的小鼠的注射(附图5B，C)实际上类似于这样的组合。移植的免疫细胞应赋予比患者自己的免疫细胞更强的抗肿瘤效应。
与本发明的EGFR-导航载体组合使用的免疫细胞的实例有肿瘤浸润性T细胞(TILs)，肿瘤特异性的工程化T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。工程化的T细胞是被遗传地重新编程或“重新指导”以表达肿瘤反应性T细胞受体(TCR)或嵌合TCR分子的细胞，其展现了抗体样肿瘤识别能力，称为“T-体”。T-体方法组合了抗体识别和T细胞效应物功能。它基于表达嵌合受体的T细胞，所述嵌合受体由连接到淋巴细胞触发分子的、作为它们的细胞外识别元件的抗体衍生的Fv或scFv。不同于抗体，T细胞非常适合于穿透和破坏实体肿瘤。
免疫细胞可以伴随载体来施用，但优选地所述载体和免疫细胞连续地施用。在某些优选的实施方式中，载体首先全身地施用，随后以期望的时间间隔施用免疫细胞。重要地，载体和免疫细胞在杀伤肿瘤细胞方面展现了协同作用。
鉴于本发明的载体与PBMC组合在小鼠中获得的实验结果，这种组合的治疗可能是有益的，产生了在具有功能性免疫系统的癌症患者中的完全治愈。
因而，在此我们首次展现了在SCID小鼠中消灭弥散性过量表达EGFR的肿瘤的策略，所述小鼠的免疫系统已经用人类外周血淋巴细胞(PBMC)重构。蜂毒素-聚乙烯亚胺-聚乙二醇-EGF(PolyIC/MPPE)静脉内递送4天，随后在第五天4百万PBMC的一次腹膜内注射，诱导了带有预先建立的弥散性过量表达EGFR肿瘤的SCID-NOD小鼠中的完全治愈，没有不良副作用。免疫细胞和它们产生的细胞因子可以局限于治疗的动物的肿瘤位点。治疗停止后十二个月，治疗的小鼠仍然是无癌症的和健康的。我们在此步展现了由于内在化的polyIC所产生的趋化因子，免疫系统导航向肿瘤的位置，表明装载polyIC的EFGR-导航载体可以动员免疫系统来治疗以及可能治愈带有弥散性过量表达EGFR的肿瘤的患者。
本发明的组合EGFR-导航载体/免疫细胞可以用于特征在于EGFR的表达的癌症的治疗。在此使用的术语“表达”应当理解为还包括术语“过量表达”，其在性质上是相对的术语，在本领域中常常通过测量与正常细胞上存在的受体数量相比较的癌细胞上存在的受体的相对的基因扩增或数量来评估，例如在表1中示出的。因而，过量表达可以定义为如通过荧光原位杂交(FISH)测定的、EGFR基因的两倍或更高的扩增，或在免疫组织化学(IHC)分析中使用抗EGFR抗体的阳性(1+、2+或3+)染色。本领域中测定过量表达的其他指标有用特异性抗体标记的细胞膜的部分；因而EGFR的过量表达可以定义为至少1％的膜染色以及1+强度，或至少10％的膜染色。此外，细胞可以分类为不表达或具有不可检测水平的EGFR的细胞，表达低水平EGFR(约1000到约100,00个受体/细胞)、中水平的EGFR(约10,000到约100,000个受体/细胞)的细胞，以及表达高水平EGFR的细胞(约1×106或更多个受体/细胞)。因此，对使用本发明的组合的治疗敏感的癌症是特征在于EGFR基因的两倍或更高扩增的、阳性(1+、2+或3+)IHC分析、至少1％或至少10％膜染色、中水平的EGFR，以及优选的特征在于高水平EGFR的癌细胞，的癌。
在此使用的术语“治疗癌症”是指癌细胞生长的抑制。优选的，这样的治疗还引起肿瘤生长的退化，即，肿瘤的大小的降低或完全衰退。在优选的实施方式中，该术语是指弥散性肿瘤，即，转移的治疗和缓解或完全治愈。
术语“肿瘤”和“癌症”在此可互换地使用。特别地，本发明的组合在过量表达EGFR的癌症的治疗中是有用的，所述癌症选自非小细胞肺癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、结肠直肠癌、腺癌、卵巢癌、膀胱癌或前列腺癌以及其转移。
表1.各种临床研究中HER1/EGFR过量表达/扩增的流行率。
Figure BDA00000851013700101
在我们第一代载体(Shir et al.，2006)的早先的公开中，我们显示了通过polyIC-EGFR靶向载体的肿瘤内注射的局部肿瘤的成功的根除。这没有教导我们可能通过载体的全身性施用来治疗弥散性肿瘤，因为完全不清楚的是治疗有效量的载体是否将到达肿瘤。
在以下的实施例中，我们现在首次发现并在此显示了，EGFR靶向的PolyIC的全身性施用甚至在令人惊讶地低浓度(低至10ng/ml pIC)下在消灭肿瘤方面是有效的，本领域技术人员将不会预期在肿瘤中以治疗有效的水平积累到足够高。此外，另一个优点是EGFR靶向的PolyIC仅影响癌细胞，正常细胞不受伤害。如我们早先公开的，EGFR靶向的PolyIC载体发挥了强的旁观者效应，也就是说，它杀伤过量表达EGFR的细胞以及邻近的肿瘤细胞，不管它们是否表达EGFR或其突变的版本EGFRvIII。显示的是，用EGFR靶向的PolyIC转染的过量表达EGFR的细胞分泌抗增殖细胞因子IFN-α，其可能引起至少部分的旁观者效应。这是关键的，因为即使显示了EGFR的强过量表达的肿瘤对于EGFR表达通常是异源的.同时，EGFR靶向的PolyIC对肿瘤细胞是高度选择性的，对周围的正常的组织以及远距离的正常组织有最小的毒性影响。靶向的PolyIC快速地活化多种抗增殖/促细胞凋亡途径，最小化引起药物抗性的突变的可能性。
因而，在某些实施方式中，在此公开EGFR-导航载体(第一和第二代载体两者)预期用于全身性施用。
因而本发明进一步提供用于全身性施用的药物组合物，其包含药学上可接受的载运体和EGFR-导航载体，所述载体包含带有EGFR-结合多肽的双链dsRNA分子。本发明更进一步提供了治疗特征在于过量表达EGFR的细胞的癌症的方法，所述方法包括向需要的患者全身地施用有效量的EGFR-导航载体，所述载体包含带有EGFR-结合多肽的双链dsRNA分子。
在某些实施方式中，本发明涉及通过免疫系统的动员治疗特征在于EGFR的过量表达的癌症的方法，其包括向需要的受试者全身地施用治疗有效量的EGFR-导航载体，所述载体包含带有EGFR-结合多肽的双链dsRNA分子，从而产生将免疫细胞吸移到肿瘤位置的细胞因子并引起肿瘤细胞杀伤效力增强。
根据本发明使用的药物组合物可以利用一种或更多种药学上可接受的载运体，其包含赋形剂和辅助剂，来以常规的方式配制。配制和施用药物的技术可以在例如″Remington′sPharmaceutical Sciences″，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新的版本中找到。
本发明的药物组合物被配制用于通过任何适合的途径全身性施用，例如，胃肠外的递送，包括肌肉内的、静脉内的、皮下的、鞘内的或腹膜内注射。
对于本发明的方法中使用的任何组合物，治疗有效量或剂量可以根据体外的和细胞培养分析来初步估计。例如，可以在动物模型中配制剂量来实现期望的浓度或滴度。这种信息可用于更精确地测定人类中有用的剂量。如以下实施例中显示的，5μg载体/小鼠/天的剂量足以消灭小鼠中预先建立的肿瘤。向人类施用的预期的近似等效剂量可以利用已知的公式来计算，为20μg/kg，或对于60kg的成年人1.2mg/天，对100kg的成年人2.0mg/天。因而，在人类中全身性施用的剂量，剂量应当在0.1mg/天到20mg/天的范围内。
现在将通过以下非限制性实施例来说明本发明。
实施例
在以下的实施例中，载体以缩写的形式描述。
材料和方法
(i)试剂和分析。Poly IC获自Sigma(Rehovot，Israel)。分子量可以是批次与批次间不同的，从90,000到1,400,000的范围内，平均200,000到500,000。因为碱基对具有680Da的Mw，90,000Da＝133bp；1,400,000Da＝2059bp；200,000Da＝294bp；以及500,000Da＝735bp(MW信息来自Sigma网站)。它溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)-处理的双蒸水中。聚乙烯亚胺(PEI)，PEI25，分枝的，以及琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)购自Sigma-Aldrich(Munich，Germany)。NHS-PEG-MAL(MW1/43400)获自NektarTherapeutics(Huntsville，Alabama，USA)，重组小鼠EGF(mEGF)来自Pepro Tech EC Ltd.(London，UK)。轭合物的PEI含量通过TNBS分析在405nm分光光度地测定。PEI中的二硫吡啶接头的数量在用二硫苏糖醇(DTT)还原等分量，随后通过在343nm吸光测量释放的吡啶-2-硫酮来测定。mEGF∶二硫吡啶的摩尔比在280和340nm分光光度地测定。二硫吡啶的数量如[6，7]描述的测定。mEGF的产量(mg)以两种公式计算。公式1：A280(a)＝DTT的A340×5.1/8.1。公式2：A280修正的＝A280-A280(a)。公式2的结果是按照mg的mEGF的数量。Ellman分析用于mEGF-SH中巯基的测定。轭合物的液相层析使用来自AmershamBiosciences(Little Chalfont，UK)的
Figure BDA00000851013700121
基本系统进行。蜂毒素(Mel)(D-Mel-SH；e2801/45570，MW1/42893.6)购自IRIS Biotech GmbH(Marktredwitz，Germany)。所有其他化学品，包括线性PEI，购自Sigma-Aldrich。
pIC：载运体复合物成分：具有100-300核糖核苷酸长度的RNA链的、合成的聚肌苷酸聚胞苷酸复合物(pIC)形式的dsRNA获自Pharmacia-Amersham。对于载体的制备，polyIC与在此描述的轭合物MPPE、PPE或PEGE11混合。FuGENE6转染试剂获自Roche。共价地轭合的聚乙烯亚胺(PEI)2s-聚(乙二醇)(PEG)-表皮生长因子(EGF)和PEh-蜂毒素(MEL)dsRNA载运体如以下描述的合成。
共价地轭合的PEI25-PEG-EGF载运体(PPE)的制备
在Current Protocols In Human Genetics，Supplement 11，Chapter：Vectors for Gene Therapy，12.3.17；12.3.18.John Wiley & Sons，Inc.，1996中提供了制备共价地轭合的PEI2s-PEG-EGF载运体的一般指导。
试剂：通过光散射测定的平均MW 25kDa的分枝PEI(PEhs)以及SPDP购自Sigma-Aldrich(Munich，Germany)。N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇马来酰亚胺(NHS-PEG-MAL，MW＝.4kDa)获自Nektar Therapeutics。化合物NHS-PEG-MAL用于将具有适合的反应基团的部分轭合到PEG。重组小鼠EGF购自Pepro Tech EC Ltd.(London，UK)。
液相层析：液相层析使用Waters 626泵以及996二极管阵列检测器进行。
PEI的定量：轭合物的PEI含量通过2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)分析在405nm如早先描述的分光光度地测定(Snyder and Sobocinski，1975.Anal.Biochem.64，284-288)。
二硫吡啶接头的数量的测定：在PEI25中可能产生的用于轭合的二硫吡啶接头的数量在用二硫苏糖醇(DTT)还原等分量、随后通过在343nm(8＝80801M cm)吸光测量释放的吡啶-2-硫酮来测定。
NHS-PEG-MAL中反应性马来酰亚胺基团的定量：NHS-PEG-MAL中反应性马来酰亚胺基团的数量作为300nm(A300)下吸光度的函数分光光度地计算。在水中1mg/ml NHS-PEG-MAL的溶液的1cm通路长度具有0.15的OD300。PEI25-PEG-MAL轭合物中反应性马来酰亚胺基团的数量通过向100微升样品中添加10微升1摩尔DTT溶液之前和之后A300的差异来类似地计算(添加DTT通过电子离域作用除去了马来酰亚胺基团的A300)。
EGF浓度的定量：可溶的重组EGF的浓度通过在280nm测量溶液中EGF的吸收来计算：在水中1mg/ml EGF的溶液产生3.1的OD(1cm通路长度)。EGF-PDP轭合物中EGF与二硫吡啶的摩尔比在280和340nm分光光度地测定。对于二硫吡啶的数量，吸收在340nm测量(参见上文)。轭合物的初步吸收在280nm(A280)测量；为了校正280nm处二硫吡啶的吸收，这个值通过以下公式校正。
公式1：A280(a)＝DTT的A340×5.1/8.1。
公式2：A280修正的＝A280-A280a。
公式2的结果用于计算EGF的终浓度。Ellman分析用于EGF-SH中巯基的测定。
PEI25-PEG-MAL的合成：通过凝胶过滤(Sephadex G-25，superfine；AmershamBiosciences)获得的1.6微摩尔等分量的PEI25溶于0.25M NaCl中，通过小心的添加HCl调节到pH 4.4。添加溶于0.4ml水中的6.4微摩尔NHS-PEG-MAL等分量，在室温下反应1小时后，盐浓度调节到1M NaCl。这个混合物加载到阳离子交换柱(Macro-prep High S；10/10；BioRad，Munich，Germany)上，利用20mM乙酸钠pH 4.5中的1-3M NaCl盐梯度、0.5ml/分钟的流速来分级。使用缓冲液A(20mM乙酸钠，pH 4.5)和缓冲液B(3MNaCl，20mM乙酸钠，pH 4.5)进行分级，如下：时间＝0-15分钟：56％缓冲液A，44％缓冲液B；时间＝15-20分钟：44-100％缓冲液B；时间＝20-60分钟：100％缓冲液B。检测器设置在240和300nm，产物在时间＝40-50分钟时洗脱。PEI25和反应性马来酰亚胺基团的摩尔比是1∶1.6。
EGF-PDP的合成：EGF的5mg等分量(MW＝6kDa)相对于20mM HEPES pH7.1(用氩气脱气的)透析过夜。0.5微摩尔等分量的EGF和来自100％乙醇中的10mM储备物的5微摩尔等分量的SPDP混合。混合物中乙醇的浓度是大约33％(v/v)。在室温下3小时后，反应混合物加载到凝胶-过滤柱(G-IO；5HRIO/30柱，Amersham Biosciences，Germany；20mM HEPES，pH 7.1，具有20％乙醇)上。产物(4ml)在300nm检测，在时间＝18-26分钟时洗脱。用0.77微摩尔二硫吡啶修饰的EGF，产量是3.36mg。
EGF-SH的合成：0.56微摩尔等分量的EGF与50当量的DTT在100微升水中混合。在室温下5分钟后，反应混合物加载到凝胶-过滤柱上(G-10；HR10/30柱，AmershamBiosciences，Germany；20mM HEPES，pH 7.1，具有20％乙醇)。产物(5.5ml)在280nm检测，在时间＝17-28分钟时洗脱。EGF与-SH基团的摩尔比是1∶1.82。
PEI25-PEG-EGF(PPE)的合成：含有0.51微摩尔硫醇基团的0.28微摩尔等分量的EGF在氩气下，与含有0.51微摩尔反应性马来酰亚胺基团的PEI2s-PEG-MAL混合。反应混合物的最终的pH值是6，最终的盐浓度是0.3M NaCl。在室温下孵育26小时后，反应混合物的盐浓度用3M NaCl调节到0.5M，反应混合物加载到阳离子交换柱上(Macro-prep HighS；1011 0；BioRad，Munich，Germany)用20mM HEPES，pH 7.1中0.5-3M NaCl的盐梯度，0.5ml/分钟的流速以及设置在280nm的检测器来分级。使用缓冲液A(20mMHEPES，pH 7.1)和缓冲液B(20mM HEPES，pH 7.1，3M NaCl)进行分级，如下：时间＝0-20分钟：78％缓冲液A，22％缓冲液B；时间＝20-80分钟：22-100％缓冲液B；时间＝80-90分钟：100％缓冲液B。轭合物在2.4-3M NaCl洗脱(集中了10ml)。等度部分中的级分(时间＝10-28分钟，产物B)也被集中(9ml)。产物在4℃相对于HBS缓冲液(20mM HEPES pH 7.1，150mM NaCl)，pH 7.3(用氩气脱气的)透析过夜。轭合物(0.65mg)中以及产物B(0.98mg)中EGF的数量在280nm分光光度地测量。轭合物(136nmol)和产物B(38nmol)中PEI25的浓度通过TNBS分析在405nm分光光度地测量。轭合物中EGF与PEI25的摩尔比是0.8∶1。
Mel-PEI25-PEG-mEGF的合成.mEGF-PEG-PEI25(83nmol PEI)在氩气下与SPDP(100％乙醇中664nmol)混合。在室温下3h后，约2ml的混合物加载到凝胶过滤柱(Sephadex G25superfine；HR10/30；20mM HEPES[pH 7.1]，0.5M NaCl；AmershamBiosciences)上。含有309nmol PDP的纯化的PDP(吡啶二硫丙酰基)官能化的轭合物(5ml)通过快速真空浓缩到1.5ml。对于与蜂毒素(Mel)反应，称出464nmol的Mel，溶于用氩气脱气的0.5ml的0.5M NaCl，100mM HEPES[pH 7.4]中。两种成分在氩气下混合。在室温下20h之后，mEGF-PEG-PEI25-Mel通过凝胶过滤来纯化。为了凝胶过滤轭合物，使用Superdex 75制备级柱10/30，其用PEI25条件化的(10mg PEI25/60ml凝胶材料)。在相对HBS透析过夜(MWCO 14000；Visking type 27/32；Roth，Karlsruhe，Germany)之后，获得6ml的mEGF-PEG-PEI25-Mel(MPPE)轭合物；这些含有66nmol PEI(1.64mg)、350nmolMel和70nmol EGF。
细胞：A431(
Figure BDA00000851013700141
No.CRL-1555TM)、MDA-MB-468(
Figure BDA00000851013700142
No.HTB-132TM)、U-138MG(
Figure BDA00000851013700151
No.HTB-16TM)、MCF7、MDA-MB-231(
Figure BDA00000851013700152
No.HTB-26TM)、U87MG(
Figure BDA00000851013700153
No.HTB-14TM)和U87MGwtEGFR细胞。
PBMC提取.来自健康人类供体的PBMC在Ficoll Plaque(Pharmacia)上分离，用50ml RPMI 1640培养基洗涤两次，以4×106/ml的密度重悬浮，在补充有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素的这个培养基中培养。
细胞因子测量：Gro-α、IP-10、IFN-β、IFN-γ、IL-2、TNF-α用细胞因子特异性ELISA(Biosource，Inc)测量。
肿瘤和血液中细胞因子的表达。细胞s.c.注射到SCID/NOD小鼠的右肋(A431或MDA-MB-468)和左肋(U138MG)中。17天后，当肿瘤达到约100mm3时，启动如下的治疗：5μg/小鼠/天的3次连续的PolyIC/MPPE I.V.注射。最后的PolyIC/MPPE注射后24小时，I.P.注射4百万新鲜的PBMC。48hr后提取肿瘤，用每克组织1.5ml提取缓冲液(含有10mM Tris pH 7.4，150mM NaCl，1％Triton X-100)利用匀浆器来匀化。组织匀浆在4℃在13,000×g离心10分钟，保存在-70℃，然后进行ELISA。也对最后一次PolyIC/MPPE注射后24小时(“血液3天”)和PBMC注射后48小时(“血液”)采集的血液样品进行ELISA。数字显示每1克组织的细胞因子的pg数(1ml的血液＝1克)。
PBMC介导的旁观者效应。100,000个MDA-MB-468细胞或A431细胞播种到6-孔平板中，用每反应孔2ml培养基生长过夜(2)。细胞然后用Poly IC/MPPE转染，到0.1或0.5μg/ml的终浓度。转染后48小时，来自转染的细胞的0.5mL培养基(“条件培养基”)添加到500,000个PBMCs中，所述PBMC早先24小时播种到24孔平板中并在0.5ml培养基中生长。来自攻击的PBMC的0.1ml培养基然后交换为来自早先24小时在96孔平板上播种的另外的未转染的MDA-MB-468细胞以及U138MG细胞(“指示细胞”)的0.1ml培养基。在用来自PBMC的培养基攻击后48小时，这些细胞的存活通过次甲基蓝分析来测定(2)。
并行地，为了显示直接旁观者效应，0.1ml的条件培养基用于替换来自早先24小时播种到96孔平板上并在0.2ml培养基中生长的、未转染的指示细胞的0.1ml培养基。这些细胞的存活在添加条件培养基后48小时使用次甲基蓝测定。
活化的PBMC的体外癌细胞杀伤。20,000个A431、30,000个MDA-MB-468或20,000个U138MG细胞播种到24孔平板上，在补充有10％FCS和抗生素的1ml RPMI培养基中生长过夜。然后细胞用0.1mg/ml的PolyIC/MPPE转染。24小时后，500,000个PBMCs/孔添加到癌细胞，共孵育另外24小时。细胞凋亡的细胞(红荧光)使用Annexin-V-Biotin试剂盒(Biosource，Inc.)显现。为了辨别肿瘤细胞和PBMC，肿瘤细胞用FITC-轭合的EGFR抗体(Biosource，Inc.，绿色荧光)来标记。细胞用荧光显微镜显现，使用数字照相机拍照。
PolyIC/MPPE/PBMC治疗对带有弥散性肿瘤的小鼠的存活的影响。雌性SCID-NOD小鼠(Harlan)用悬浮在200μl PBS中的1百万A431或MDA-MB-468细胞IV注射。10或15天后，动物随机分组(每组5只小鼠)，用一系列的20μg PolyIC/MPPE的静脉内注射来开始治疗。最后的PolyIC注射后24小时，动物用四百万PBMC注射一次。
实施例1.PolyIC/MPPE诱导A431和MDA-MB-468细胞中免疫活性细胞因子的表达在我们早先的研究中(2)，我们显示了低剂量的EGFR靶向的PolyIC诱导过量表达EGFR的成胶质细胞瘤细胞(U87MGwtEGFR)中IFN-α、IP-10和Gro-α的表达，但在具有低水平EGFR的细胞(U87MG)中不会。这些数据支持了观点，仅当一定阈值水平的dsRNA被内在化时细胞产生这些细胞因子，这种剂量仅在过量表达EGFR的细胞中达到。在这项研究中，我们将分析延伸到两种另外的过量表达EGFR的癌细胞系：A431(外阴癌)和MDA-MB-468(乳腺癌)。当这些细胞用PolyIC/MPPE(2.5μg/ml)转染时，我们检测到高达5.1pg/ml的IFN-β；148pg/ml的Gro-α和188pg/ml的IP-10(表2)。Gro-α和IP-10是对T细胞向表达它们的区域征募负责的趋化因子。因而，在用PolyIC/MPPE攻击之后，A431和MDA-MB-468细胞，如U87MGwtEGFR细胞将细胞因子分泌到培养基中。
表2.Poly IC/MPPE转染的细胞的培养基中细胞因子的表达。
实施例2.人类免疫细胞的体外活化。
考虑到上述结果，我们猜测，来自用PolyIC/MPPE处理的A431和MDA-MB-468细胞的细胞因子富集的培养基将刺激免疫系统。通过测试来自PolyIC转染的癌细胞的培养基对健康人类外周血单核细胞(PBMC)的影响，我们检查了是否如此。PBMC由几种类型的免疫细胞(NK、T细胞、NK-T细胞、巨噬细胞)组成。当活化时，这些细胞产生有毒的细胞因子，例如，IFN-γ和TNF-α，已知对各种癌细胞是有效的。PBMC还相互作用，引起协同的、高度的抗增殖效应。例如，活化的T细胞和NK细胞产生IFN-γ，其活化巨噬细胞并刺激TNF-α的产生。IL-2向培养基中的释放直接与PBMC活化相关，可以通过ELISA方便地定量。因而PBMC是研究针对PolyIC转染的肿瘤细胞的选择性免疫反应的方便的系统。
用来自PolyIC/MPPE转染的癌细胞的培养基攻击PBMC。为此，如方法中描述的，500,000个PBMC播种到24孔平板中，在0.5ml培养基中生长过夜。PBMC然后用从PolyIC/PEI-PEG-EGF+PEI-Mel转染的A431、MDA-MB-468、U87MG或U138MG细胞转染后48小时移去的0.5ml培养基攻击。在攻击后24和48小时采集PBMC培养基，使用ELISA分析测量IFN-γ、IL-2和TNF-α。附图1A显示了攻击后24和48小时PBMC的IL-2表达的诱导。来自用PolyIC/MPPE(0.1μg/ml)转染的A431和MDA-MB-468细胞的培养基使得PBMC产生高达165pg/ml的IL-2。相比之下，来自PolyIC/MPPE处理的U87MG细胞(具有为A431和MDA-MB-468细胞的～1/12的EGFR表达)或U138MG细胞(无EGFR表达)不影响PBMC。当检查其他细胞因子的表达时获得了相似的结果：IFN-γ(附图1B)和TNF-α(附图1C)在用来自PolyIC/MPPE转染的A431和MDA-MB-468细胞的培养基攻击的PBMC中被诱导，但在来自PolyIC/MPPE转染的U87MG和用0.1μg/ml的PolyIC/MPPE转染的U138MG细胞的培养基没有。
实施例3.在体内PBMC的活化。
过量表达EGFR的肿瘤中这些细胞因子选择性地表达也在体内证实了(表3)。在右肋带有过量表达EGFR的皮下肿瘤和在左肋带有U138MG肿瘤的SCID-NOD小鼠用PolyIC/MPPE的4次连续的每日注射静脉内地治疗，最后四百万PBMC的单次腹膜内注射。表达，以高得多的浓度，在过量表达EGFR的肿瘤中(表3)。这些细胞因子预计选择性地吸引PBMC到过量表达EGFR的肿瘤，在此PBMC将被活化。
表3体内细胞因子表达模式。
Figure BDA00000851013700181
我们然后提出了问题，载体转染的过量表达EGFR的肿瘤上细胞因子的浓度是否足够高以实际地吸引和活化免疫细胞。在独立的实验中，细胞s.c.注射到SCID-NOD小鼠的右肋(A431或MDA-MB-468)和左肋(U138MG)。当肿瘤达到大约100mm3时，用3次连续的PolyIC/MPPE I.V.注射5μg/小鼠/天启动治疗。最后的PolyIC/MPPE注射后24小时，I.P.注射3百万PBMC。24小时后，提取肿瘤，在4％福尔马林中固定。然后制备石蜡切片，用H&E染色，进行组织病理学分析。附图2中的短划线显示了免疫细胞浸润的区域，其中检出了PBMC向polyIC/+PBMCs治疗的动物的过量表达EGFR的肿瘤中的浸润。在不过量表达EGFR的U138MG肿瘤中没有检出免疫细胞浸润。检测了polyIC/+PBMCs治疗的动物。在不过量表达EGFR的U138MG肿瘤中没有检出免疫细胞浸润。
实施例4.PBMC介导的旁观者效应。
强力的抗肿瘤细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达介导了未转染的癌细胞的直接旁观者杀伤。然后问题是，细胞因子的水平是否足够高，不仅吸引免疫细胞，还活化它们。为了检查PBMC介导的旁观者效应，A431或MDA-MB-468细胞首先用PolyIC/MPPE转染，48小时后用来自转染的细胞的培养基攻击PBMC(方法)。在另外48小时后，来自攻击的PBMC的培养基添加到新播种的、未转染的细胞中(附图3)。PBMC介导的旁观者效应在培养基交换后24和48小时检查，与PolyIC/MPPE处理的A431和MDA-MB-468细胞的培养基所介导的“直接”旁观者效应比较(附图3A和3C)。直接和PBMC介导的旁观者效应都在附图3中清楚地显示了。PBMC介导的效应是特别强的，杀伤高达90％的未转染的细胞。根本不表达EGFR的U138MG细胞也被两种类型的培养基有效地抑制(附图3B和3D)。当pIC被聚谷氨酸(pGlu)代替时没有观察到效果，聚谷氨酸与MPPE类似地形成颗粒，但是不诱导免疫反应。这些结果表明，PolyIC/MPPE和PBMC的组合将协同地有效杀伤癌细胞。
实施例5.PBMC强烈地增强体外的PolyIC/MPPE癌细胞杀伤。
为了检查协同的癌症杀伤效应，肿瘤细胞(如方法中描述的生长的)用低剂量(0.1μg/ml)的PolyIC/MPPE转染。24小时后，500,000个PBMCs/孔添加到癌细胞，其孵育另外24小时，随后添加PBMC(附图4)。为了辨别肿瘤细胞和PBMC，肿瘤细胞用FITC-轭合的EGFR抗体(绿色荧光)来标记。经历细胞凋亡的肿瘤细胞用Annexin-V-Biotin试剂盒，Biosource Inc.(红色荧光)来检测。用单独的PolyIC/MPPE或单独的PBMCs处理的细胞显示了非常弱的细胞凋亡信号。相比之下，当过量表达EGFR的细胞用PolyIC/MPPE和PBMC两者处理是获得了强细胞凋亡信号(附图4A、B)。U138MG细胞不经历可检测的细胞凋亡(附图4C)。因而，PBMCs向PolyIC/MPPE处理的肿瘤细胞的添加强烈增强肿瘤细胞细胞凋亡。
实施例6.与PBMCs组合的PolyIC/MPPE的全身性应用治愈带有弥散性肿瘤的小鼠。
考虑到我们较早的发现，PolyIC加载的EGFR导航载体对组织培养或体内的正常脑细胞没有毒性作用(Shir et al.，2006)，我们检查了EGFR靶向的PolyIC/MPPE是否可以全身地应用，用于体内弥散性过量表达EGFR的肿瘤的治疗。在不存在过量表达EGFR的肿瘤的小鼠模型的情况下，我们如方法中所描述的将2百万人类A431或MDA-MB-468细胞i.v.注射到SCID-NOD小鼠中。细胞注射后10天，用20μg PolyIC/MPPE的每日注射的两个3天循环和一个4天循环，每个循环之间24小时时间间隔(即，总共10次注射，在12天之中)，来启动治疗。这个操作消除了治疗样体重损失的有毒影响(数据未显示)。接受PolyIC/MPPE的带有A431肿瘤的小鼠存活为未治疗的小鼠的至少3倍长，三只小鼠完全痊愈(附图5D)。用PolyIC/MPPE治疗的带有MDA-MB-468肿瘤的小鼠存活是未治疗的小鼠的两倍久(附图5E)。
这些结果，与在体外PBMCs强烈增强PolyIC/MPPE的作用的发现相组合，鼓励我们测试PBMCs是否将类似地增强体内的PolyIC/MPPE作用。对于这些实验，我们在SCID-NOD小鼠中注射A431或MDA-MB-468细胞之后等待了15天，在这个时点可以在肺部检测到达到500μm的大肿瘤(附图5)。小鼠然后用20μg的PolyIC/MPPE的4次连续的每日静脉内注射来治疗。对照组包括用pGlu/MPPE(聚谷氨酸/MPPE)治疗的小鼠，来确定没有PolyIC的轭合物的作用。最终的PolyIC注射后24小时，小鼠用四百万的人类PBMC注射一次。利用人类PBMC的SCID-NOD小鼠免疫系统的“重构”是常规的。如在较早的实验中，带有A431肿瘤的PolyIC-MPPE治疗的小鼠比未治疗的小鼠存活更久。用PolyIC-MPPE和人类PBMC两者治疗的小鼠存活超过一年，不显示任何肿瘤的病征(附图5B)。类似地，用单独的PolyIC/MPPE治疗的带有MDA-MB-468肿瘤的小鼠存活达到未治疗小鼠的两倍久，而用PolyIC/MPPE和PBMCs两者治疗的小鼠存活超过一年，并且不显示任何肿瘤的病征(附图5C)。在治疗期间或之后，没有观察到显著的毒性、体重的降低或异常行为。因而，通过导入人类PBMC，我们能够显著地降低PolyIC/MPPE的剂量并消灭建立的弥散性肿瘤。因此，PBMC在肿瘤根除中起到关键作用。
实施例7.第二代载体与第一代载体的比较
本发明提供的改进的第二代载体，在此称为pIC/P221PE和pIC/P221PGE11，分别由与轭合物P221PE和P221PGE11复合的PolyIC组成。这些轭合物包含线性聚乙烯亚胺、PEG和EGF或肽GE11，而不是第一代载体的轭合物MPPE中的分枝的聚乙烯亚胺，生产上显著更简单，可以在更大的更均一的批次中制造，产生的载体展现了相比第一代载体改进的癌细胞杀伤活性。
7.1新轭合物P221PE和P221PGE11的制备
对于新的轭合物的合成，使用双功能的PEG(NHS-PEG2k-OPSS，来自Nektar Therapeutics，USA)；它在一个末端将线性PEI PEG化，并在远端通过OPSS(邻-吡啶基二硫化物)部分通过二硫键与HS-mEGF或HS-GE11连接。这种简单的两步操作避免了用于MPPE的合成的冗长的纯化方法(参见上文的方法，项目(ii))，产生高得多的总体产率。
肽GE11可以通过本领域公知的重组方法来合成，或它可以利用公知的化学合成技术来合成，例如，通过使用自动合成仪(可从例如Applied Biosystems，Germany获得)，例如通过使用t-丁氧羰基(t-Boc)技术的公司的方案。纯化可以通过反相HPLC进行。
载体pIC/P221PE(pIC/PPE)和pIC/P221PGE 11(pIC.PPGE)通过混合polyIC与轭合物PPE或PPGE11来获得。
7.2体外的第一和第二代载体的比较。
由于细胞对本发明的载体的敏感性是它们的EGFR表达水平的函数，感兴趣的是评估不同载体对于杀伤具有各种EGFR表达水平的细胞的能力。为此，表4中显示的3000个细胞的U138MG和4000个细胞的每种其他细胞系播种到96孔平板中并生长过夜。细胞然后用与标明的轭合物配制的pIC转染。通过次甲基蓝分析在转染后48小时分析细胞的存活。表4显示了使用的细胞和EGFR表达的水平：
表4.使用的细胞系和它们EGFR表达的水平。
如在附图6中可以看出的，与第一代载体pIC/MPPE相比，新的第二代载体pIC/P221PE对高EGFR表达的细胞(MDA-MB-468)具有稍微更强的效果，对较低EGFR表达的细胞(U87MG)具有显著更强的效果。因而，pIC/P221PE应当对相对更低EGFR表达的肿瘤是显著更有益的。
7.3在体外PPE与PPGE11的比较。
具有EGFR结合肽代替EGF作为靶向部分的载体pIC/P221PGE11的细胞杀伤能力与pIC/P221PE的比较。如附图7所示，P221PE具有很高的效率，在仅0.01μg/ml的pIC下杀伤达到90％的MDA-MB-468细胞。在这个pIC浓度下，对于EGFR低表达或不表达的细胞没有观察到效果。pIC/P221PGE11是稍微较低有效的。仍然，达到80％的MDA-MB468细胞可以被0.1μg/ml的pIC/PPGE11杀伤，对对照细胞有最小的影响。
7.4在体内第一和第二代载体的效力。
在体内进一步比较pIC/P221PE和pIC/MPPE的效力。雌性小鼠用溶于PBS的2百万A431细胞s.c.注射。当肿瘤达到约75-80mm3的大小时，小鼠分成5个组。与标明的轭合物配制的pIC每48小时IV注射。与pIC/MPPE相比，在抑制A431肿瘤生长方面，pIC/PPE显示甚至更强的效力(附图8A)，并且pIC/PPE保存了它的选择性，这可以从甚至在高剂量下对U138MG肿瘤(其不表达EGFR)的生长没有影响来看出(附图8B)。
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Claims (23)

1.一种表皮生长因子受体（EGFR）导航载体，其包含带有EGFR-结合肽或多肽的双链RNA（dsRNA）分子，与免疫细胞组合用于特征在于过量表达EGFR的细胞的癌症的治疗。
2.权利要求1的EGFR-导航载体，其中所述dsRNA分子由每条链中具有至少22个核糖核苷酸的聚肌苷酸链和聚胞苷酸链（poly IC）组成。
3.权利要求2的EGFR-导航载体，其中所述polyIC在每条链中具有85-300个核糖核苷酸。
4.权利要求1到3的任一项的EGFR-导航载体，进一步包含dsRNA载运体。
5.权利要求4的EGFR-导航载体，其中所述dsRNA分子非共价附着于所述dsRNA载运体上。
6.权利要求4的EGFR-导航载体，其中所述dsRNA载运体是聚阳离子聚合物和/或非离子的水溶性聚合物。
7.权利要求6的EGFR-导航载体，其中所述聚阳离子聚合物是聚乙烯亚胺或聚-L-赖氨酸，所述非离子的水溶性聚合物是聚（乙二醇）（PEG）。
8.权利要求5的EGFR-导航载体，其中所述dsRNA载运体是共价附着于PEG的聚乙烯亚胺。
9.权利要求4的EGFR-导航载体，其中所述EGFR-结合肽或多肽共价附着于所述dsRNA载运体。
10.权利要求4的EGFR-导航载体，其中所述EGFR-结合多肽是EGF。
11.权利要求4的EGFR-导航载体，其中所述EGFR-结合肽是序列YHWYGYTPQNVI的肽GE11。
12.权利要求4的 EGFR-导航载体，进一步包含能够促进内体膜的降解的化合物。
13.权利要求12的 EGFR-导航载体，其中所述化合物是蜂毒素。
14.权利要求4的EGFR-导航载体，选自载体polyIC/蜂毒素-分枝的聚乙烯亚胺-聚乙二醇-mEGF（pIC/MPPE）、polyIC/线性聚乙烯亚胺-聚乙二醇-mEGF（pIC/PPE）和polyIC/线性聚乙烯亚胺-聚乙二醇-肽GE11（pIC/PPGE11）。
15.权利要求1到14的任一项的EGFR-导航载体，其中所述免疫细胞是肿瘤浸润性T细胞（T-TIL）、肿瘤特异性工程化的T细胞或外周血单核细胞（PBMC）。
16.权利要求15的EGFR-导航载体，其中所述载体和所述免疫细胞连续地施用。
17.权利要求1的载体，其中所述癌症是非小细胞肺癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、结肠直肠癌、腺癌、卵巢癌、膀胱癌或前列腺癌以及其转移。
18.一种治疗特征在于过量表达EGFR的细胞的癌症的方法，所述方法包括向需要的患者全身地施用以下的组合：（i）包含带有EGFR-结合肽或多肽的dsRNA分子的EGFR-导航载体，所述EGFR-结合肽或多肽能够将所述载体靶向过量表达EGFR的肿瘤细胞；以及（ii）免疫细胞。
19.权利要求18的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、结肠直肠癌、腺癌、卵巢癌、膀胱癌或前列腺癌以及其转移。
20.一种用于全身性施用的药物组合物，其包含药学上可接受的载运体和EGFR-导航载体，所述载体包含带有EGFR-结合多肽的双链dsRNA分子。
21.一种治疗特征在于过量表达EGFR的细胞的癌症的方法，所述方法包括向需要的患者全身地施用有效量的EGFR-导航载体，所述载体包含带有EGFR-结合多肽的双链dsRNA分子。
22.权利要求20的药物组合物或权利要求21的方法，其中所述载体选自载体polyIC/蜂毒素-分枝的聚乙烯亚胺-聚乙二醇-mEGF（pIC/MPPE）、polyIC/线性聚乙烯亚胺-聚乙二醇-mEGF（pIC/PPE）和polyIC/线性聚乙烯亚胺-聚乙二醇-肽GE11（pIC/PPGE11）。
23.选自polyIC/线性聚乙烯亚胺-聚乙二醇-mEGF（pIC/PPE）或polyIC/线性聚乙烯亚胺-聚乙二醇-肽GE11（pIC/PPGE11）的EGFR-导航载体。
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