CN102872463A - 含有rna配体的纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

提供了制备具有核心的纳米颗粒的材料和方法，核心包括金属和/或半导体原子，该核心与多个包含RNA配体的配体共价连接。RNA配体可包括siRNA或miRNA。还提供了这些纳米颗粒在治疗和诊断中的用途。

Description

含有RNA配体的纳米颗粒
本分案申请是基于申请号为201207160023797.0，申请日为2005年05月24日，发明名称为“含有RNA配体的纳米颗粒”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及纳米颗粒，更具体地涉及含有RNA配体如小干扰RNA（siRNA）和微RNA（miRNA）的纳米颗粒，及其在各种应用中的用途。
背景技术
已经发现小RNA分子在调节基因表达中起着多种作用。这些作用包括小干扰RNA（siRNA）对mRNA的定向降解，转录后基因沉默（PTG），微RNA（miRNA）对mRNA的发育可控型序列特异性翻译抑制作用和定向转录基因沉默。RNA i活性限制了转座子转移并提供了抗病毒防御（Pal-Bhadra等，2004）。也已经证明了RNAi机构和小RNA在异染色质复合物的寻靶以及特定染色体位点上的外遗传基因沉默中的作用（Verdel等，2004）。双链RNA（dsRNA）依赖性转录后沉默，也称为小抑制RNA（siRNA）或RNA干扰（RNAi），是其中dsRNA复合物可以靶向准特异性的同源基因以在短时间段内沉默的现象。它作为促进具有序列同一性的mRNA降解的信号。20-nt siRNA通常足够长以诱导基因特异性沉默，而且足够短以避开宿主应答（Elbashir等，2001）。定向基因产物表达的降低可以是大范围的，具有由几个siRNA分子诱导的90%沉默。
由于小分子寡核苷酸的递送可以绕过与基因治疗相关的困难，所以使用siRNA可能具有优于传统基因治疗的优势。迄今为止，基于载体的治疗基因的体内有效递送仍然是成功的基因治疗中的障碍。已经观察到尽管通过siRNA对靶基因的剔除不是永久性的，单独的siRNA转染可以导致亲本以及子代细胞中靶蛋白的抑制延长（Tuschl，2001）。然而，siRNA的递送在本领域中仍然存在问题。
WO 02/32404（Consejo Superior de InvestigacionesScientificas）公开了由金属或半导体原子形成的纳米颗粒，其中包含碳水化合物的配体与纳米颗粒的核心共价连接。这些纳米颗粒用于调节碳水化合物介导的相互作用且是可溶而无毒的。享有GB-A-0313259.4（Consejo Superior de InvestigacionesScientificas和Midatech Limited）优先权的PCT申请公开了具有核心的磁性纳米颗粒，该核心包含钝态的磁性金属原子，核心与配体共价连接。
发明内容
泛泛地说，本发明涉及具有核心的纳米颗粒，该核心包含金属和/或半导体原子，核心与RNA配体共价连接。RNA配体通常是设计来模拟小干扰RNA（siRNA）和微RNA（miRNA）序列的短RNA序列。纳米颗粒可以用于递送RNA配体并具有广泛的用途，可在体外系统中应用和用于治疗或诊断。例如，本发明的纳米颗粒可以用于（1）定向转录基因沉默，（2）定向mRNA降解，（3）mRNA成象，（4）通过使用相同或不同纳米颗粒上的多种RNA配体来抑制各种途径，（5）气雾剂递送，例如至肺，（6）结合mRNA沉默用于靶向siRNA抗性mRNA和（7）用作功能基因组中的工具。
在本领域中，根据其来源将短RNA序列称为“短干扰RNA”（siRNA）或“微RNA”（miRNA）。两种类型的序列都可以通过结合互补RNA（nmRNA）和引发mRNA消除（RNAi）或阻止mRNA翻译成蛋白质用于下调基因表达。siRNA通过长双链RNA的加工来产生，且实际上发现时通常是外源的。微干扰RNA（miRNA）是内源编码的小非编码RNA，通过短发夹的加工来产生。siRNA和miRNA都可以抑制带有部分互补靶序列的mRNA的翻译而没有RNA剪切，且可以降解带有完全互补序列的mRNA。RNAi途径还作用于基因组，如描述于Science，301：1060-1061，2003。
与纳米颗粒相连的RNA可以是单链或双链的（双链体）。将miRNA样序列用作配体的情况中，RNA序列可以是发夹，即包括部分互补区，接近它们可以退火形成发夹的末端。纳米颗粒可以任选地包含另外类型的配体，如碳水化合物来形成糖纳米颗粒，和/或多于一种的siRNA。以下将更详细地讨论纳米颗粒及其用途。有利地，siRNA与纳米颗粒的连接可以提供对siRNA的保护使之不受血液、组织培养基中或细胞内存在的核糖核酸外切酶的影响。
因此，第一个方面中，本发明提供了含有核心的纳米颗粒，该核心包括金属和/或半导体原子，其中核心与多种配体共价连接且配体包括RNA配体。
形成纳米颗粒的siRNA配体可以是单链或双链的（双链体）。然而，为了最佳化RNA介导的靶基因功能下调的有效性，优选的是选择siRNA分子的长度来确保RISC复合物对siRNA的正确识别，所述RISC复合物介导mRNA靶被siRNA的识别且优选体内施用纳米颗粒时，siRNA足够短来降低宿主应答。
miRNA配体通常是单链的并具有能够使配体形成发夹的部分互补区。miRNA通常是单链RNA的形式，并认为调节其他基因的表达。miRNA是从DNA转录，但不翻译成蛋白质的RNA基因。编码miRNA基因的DNA序列比miRNA长。该DNA序列包括miRNA序列和近似反向互补体。当该DNA序列转录成单链RNA分子时，miRNA序列及其反向互补体碱基对形成双链RNA节段；总的来说，该RNA的结构称为发夹结构（‘短发夹RNA’或shRNA）。然后Dicer酶从发夹结构中切掉双链区，而释放成熟miRNA。
通过在RNA聚合酶III启动子如人H1或7SK启动子的控制下用编码shRNA序列的DNA构建体转染细胞，可以在细胞内生产shRNA。或者，可以在外部合成shRNA并直接引入细胞中。
通常，旨在模拟siRNA和miRNA效果的RNA配体具有10至40个核糖核苷酸（或其合成类似物），更优选17至30个核糖核苷酸，更优选19至25个核糖核苷酸，最优选21至23个核糖核苷酸。在使用双链siRNA的本发明的一些实施方案中，该分子可具有对称的3’突出端，例如，一个或两个（核糖）核苷酸的3’突出端，通常是dTdT的UU3’突出端。
在通过shRNA的剪切来产生mi RNA的情况中，shRNA序列优选40至100个碱基长，更优选40至70个碱基长。发夹的茎区优选19至30个碱基对长。茎区可以含有G-U配对来稳定发夹结构。
在使用双链RNA的实施方案中，有义和反义链可以退火形成双链体。通过在反应混合物中包含双链体来形成纳米颗粒，在颗粒自动装配的过程中RNA可以连接至核心。根据双链siRNA衍化末端（每条链的四个可能的5’和3’端）的数量，至多四个纳米颗粒可以连接至单个siRNA双链体上，且对于每个双链siRNA，理论上形成至多十五个可能的构建体，这些中的一个具有四个纳米颗粒（每个末端两个），四个具有一个纳米颗粒，六个具有两个纳米颗粒和四个具有三个纳米颗粒。在使用单链siRNA的情况中，纳米颗粒核心可以连接在siRNA的任一个或两个衍化末端（即，5’或3’端）上，例如，产生三种不同的纳米颗粒。这些纳米颗粒可以以这种形式来使用或该方法可以任选地包括使含有纳米颗粒的siRNA与siRNA的互补链退火，从而在预先形成的纳米颗粒上原位形成双链体的另外的步骤。在miRNA样配体的形成过程中，通常一个或两个纳米颗粒连接在RNA序列的末端上。
因此，在另一方面中，本发明提供了在此所述纳米颗粒的生产方法。通常，该方法包括将RNA配体与纳米颗粒的核心缀合，通过用连接物衍化RNA链并将衍化的RNA包含于由此合成纳米颗粒核心的反应混合物中。在纳米颗粒自动装配的过程中，纳米颗粒核心通过连接物连接至RNA上。优选，连接物是二硫化物连接物，例如混合的二硫化物连接物，尽管也可以使用亚乙基连接物或肽连接物。示例连接基团由通式HO-(CH2)n-S-S-(CH2)m-OH来表示，其中n和m独立地为1至5。RNA通过末端磷酸基团，在优选的混合二硫化物连接物的情况中，通过一个末端羟基，可以方便地与间隔物连接。当合成纳米颗粒时，连接物的-S-S-断裂形成两个含硫连接物，各自通过-S-基团可以共价连接至纳米颗粒的核心上。使用混合的二硫化物连接物有助于避免RNA二聚物的形成。
如上所述，在与纳米颗粒核心连接的RNA是单链的情况中，该方法可包括使与第一链互补的RNA分子退火以提供连接至纳米颗粒上的双链RNA配体的另外的步骤。还可以制备具有退火的双链RNA的纳米颗粒，该RNA的一条或两条链由二硫化物连接物功能化。备选地或另外地，该RNA的有义和反义链可以连接到不同的纳米颗粒上并一起退火。
本发明的优选实施方案中，为了将双链RNA掺入自动装配中的纳米颗粒中，可以用混合的二硫化物来衍化该RNA的一个或两个末端。将双链体掺入纳米颗粒中后，将RNA和混合二硫化物的化学成分都掺入珠粒中。因此，混合二硫化物的化学成分可以凭本身的性质，如靶向特性包含重要的信息（例如，特异性结合对的成员），或有可能给最终形成的纳米颗粒提供另外的物理特性。可以将混合的二硫化物连接在有义或反义链的3’端或5’端上。
一实施方案中，使用首次在WO 02/32404中所述的方法可以合成具有核心的纳米颗粒，该核心包含金原子，其中使用二硫化物连接物来衍化配体并在还原剂存在下使衍化的配体与HAuCl4（四氯金酸）反应来生成纳米颗粒。根据该方法，可以将甲醇或水中的二硫化物保护的RNA加入四氯金酸的水溶液中。优选的还原剂是硼氢化钠。该方法的这些和其他特征描述于WO 02/32404中。
一些应用中，可以使用许多不同的RNA分子。可以作为与一组纳米颗粒缀合的不同配体来提供这些不同的RNA分子或不同的RNA分子可以是单独的纳米颗粒群，并任选地混合在一起。第一种情况中，本领域技术人员将意识到由RNA与纳米颗粒缀合形成产品混合物的情况中，一组纳米颗粒可以包含多种如上所述的产品。在使用多个配体的情况中，可以使用模拟siRNA和miRNA的配体。
除了RNA分子，纳米颗粒可以包含一种或多种另外类型的配体和/或RNA配体除了RNA组分外还可以包含一种或多种不同类型的基团或结构域。例如，另外的配体，或配体的基团或结构域，可以包括一种或多种肽，蛋白质结构域，核酸分子，脂质基团，碳水化合物基团，任何有机或阴离子或阳离子基团。碳水化合物基团可以是多糖，寡糖或单糖基团。优选的配体包括糖缀合物，从而形成糖纳米颗粒。如以下在纳米颗粒用途的讨论中所指出的，配体（RNA或另外的配体）可以是特异性结合对的成员并用于将纳米颗粒靶向其中存在特异性结合对的另一成员的靶位置。在除了RNA配体以外还存在核酸分子的情况中，该核酸分子可以包括单或双链DNA或RNA。颗粒可以具有多于一种固定于其上的配体，例如，2，3，4，5，10，20或100种不同配体。备选地或另外地，可以一起使用多种不同类型的纳米颗粒。优选实施方案中，连接到颗粒单个金属核心上的全部配体的平均数为至少一个配体，更优选50个配体，最优选60个配体。
优选，纳米颗粒具有平均直径为0.5至50nm，更优选0.5至10nm，更优选1.0至5nm，再更优选3.0至7.0nm的核心。当除了核心以外还考虑配体时，优选颗粒的总平均直径为5.0至100nm，更优选5至50nm，最优选10至30nm。可以使用本领域公知的技术如透射电子显微镜法来测量平均直径。
核心材料可以是金属或半导体并可以由多于一种类型的原子形成。优选，核心材料是选自Au，Fe或Cu的金属。纳米颗粒核心还可以由合金来形成，所述合金包括Au/Fe，Au/Cu，Au/Gd，Au/Fe/Cu，Au/Fe/Gd和Au/Fe/Cu/Gd，并可以用于本发明中。优选的核心材料是Au和Fe，最优选的材料是Au。纳米颗粒的核心优选包含约100至500个原子（例如，金原子）来提供纳米级的核心直径。向其他特别有用的核心材料中掺杂一种或多种NMR活性的原子，使得在体外和体内都可以使用NMR来检测纳米颗粒。NMR活性原子的实例包括Mn+2，Gd+3，Eu+2，Cu+2，V+2，Co+2，Ni+2，Fe+2，Fe+3和镧系元素+3，或本申请别处所述的量子点。
可以检测含有半导体原子的纳米颗粒核心，因为纳米级半导体晶体能够作为量子点，即它们可以吸收光，从而将材料中的电子激发到更高的能级，随后以材料的特征性频率释放光的光子。半导体核心材料的实例是硒化镉，硫化镉，碲化镉。还包括锌化合物，如硫化锌。
一些实施方案中，本发明的纳米颗粒或RNA分子包含可检测的标记。该标记可以是纳米颗粒核心或RNA配体或另一种配体的成分。由于纳米颗粒的该成分的固有特性或通过与另一种可检测部分连接，缀合或相连，该标记是可检测的。优选的标记实例包括为荧光基团，放射性核素，磁性标记或染料的标记。荧光基团包括荧光素，若丹明或四甲基若丹明，Texas-红，Cy3，Cy5等，可以通过荧光标记的激发并使用拉曼散射光谱测定法检测所发射的光来检测（Y.C.Cao，R.Jin，C.A.Mirkin，Science 2002，297：1536-1539）。
一些实施方案中，纳米颗粒可以包括放射性核素，用于使用放射性核素发射的放射性来检测纳米颗粒，例如，使用PET，SPECT，或用于治疗，即用于杀灭靶细胞。本领域中常用的易于调整以适合于本发明的放射性核素实例包括99mTC，其以多种氧化态存在，尽管最稳定的是TcO4-；32P或33P；57Co；59Fe；通常以Cu2+盐使用的67Cu；通常以Ga3+盐使用的67Ga，例如，柠檬酸镓；68Ge；82Sr；99Mo；103Pd；通常以In3+盐使用的111In；通常以碘化钠使用的125I或131I；137Cs；153Gd；153Sm；158Au；186Re；通常以Tl+盐如氯化铊使用的201Tl；39Y3+；71Lu3+；和24Cr2+。放射性核素用作标记和示踪剂的一般用途是本领域公知的且本领域技术人员可以容易地调整以适合用于本发明的各方面中。通过将其掺杂于纳米颗粒的核心或包括它们作为固定于纳米颗粒上的配体一部分存在的标记，可以非常容易地使用放射性核素。
另外地或可替换地，可以使用本领域公知的多种技术，使用如上所述的与纳米颗粒相连的标记或通过使用它们的特性来检测本发明的纳米颗粒，或它们与其它组分相互作用的结果。这些检测纳米颗粒的方法可以从检测纳米颗粒结合另一种组分时发生的聚集，例如，通过简单的目测或使用光散射（含有纳米颗粒溶液的透射率），至使用尖端技术如透射电子显微镜法（TEM）或原子力显微镜法（AFM）来观察纳米颗粒。检测金属颗粒的另外的方法是使用等离振子共振，即在金属表面的电子激发，通常由光照射引起。表面等离振子共振（SPR）现象存在于金属（如Ag或Au）和绝缘材料如空气或水的界面上。随着分析物结合至固定于纳米颗粒表面上的配体改变了界面的折射率，SPR发生了改变。SPR的另一个优势是可以用于监控实时相互作用。如上所述，如果纳米颗粒包括或掺杂了NMR活性原子，那么该技术可以用于使用本领域公知的技术在体外或体内检测该颗粒。还可以使用基于定量信号放大的系统，利用纳米颗粒促进的银（I）还原来检测纳米颗粒。如果纳米颗粒包括作为荧光探针的配体，则可以使用荧光光谱测定法。此外，碳水化合物的同位素标记可以用来帮助它们的检测。
本发明提供了呈现配体的球形阵列的方法，该阵列具有优于现有技术中提出的其他类型阵列的优势。特别地，纳米颗粒在大多数有机溶剂中，尤其在水中是可溶的。这可以用于它们的纯化中且重要地意味着可以在溶液中使用，用于呈现固定于颗粒表面的配体。事实是可溶的纳米颗粒具有呈现天然构象配体的优势。对于治疗应用，纳米颗粒在生理条件下是无毒的，可溶的且是稳定的。
一些实施方案中，纳米颗粒的核心可以是磁性的并包含磁性金属原子，任选地与钝态金属原子结合。例如，钝态金属可以是金且铂，银或铜，且磁性金属可以是铁或钆。优选实施方案中，钝态金属是金且磁性金属是铁。在这种情况中，核心中钝态金属原子与磁性金属原子的适当比例是约5:0.1至约2:5。更优选地，比例为约5:0.1至约5:1。如本文所用的，术语“钝态金属”指的是没有显示出磁性特性且对于氧化是化学上稳定的金属。本发明的钝态金属可以是抗磁性的。抗磁性指的是具有全部成对电子的材料，因此其每个原子不具有永久的净磁矩。磁性材料具有一些未成对的电子且对于外部磁场是绝对敏感的-即，外部磁场诱导电子随着外加磁场排列起来，因此电子的磁矩得到调整。磁性材料可以是顺磁性的，超顺磁性的或铁磁性的。顺磁性材料对外部磁场不是非常敏感，并在除去外部磁场时不再保持它们的磁性特性。铁磁性材料对外部磁场高度敏感，甚至在没有外部磁场存在时也含有磁畴，因为邻近的原子合作使得它们的电子自旋是平行的。外部磁场调整邻近区域的磁矩，扩大了磁性效应。通常具有铁磁性特性材料的非常小的颗粒不是铁磁性的，因为在300nm或更小的颗粒中不产生合作效应，使得材料不具有永久的磁性。然而，颗粒对外部磁场仍然非常敏感并具有强烈的顺磁性特性，称为超顺磁性。优选，本发明的纳米颗粒是超顺磁性的。
具有包含顺磁性金属核心的纳米颗粒的实例，包括含有Mn+2，Gd+3，Eu+2，Cu+2，V+2，Co+2，Ni+2，Fe+2，Fe+3和镧系元素+3的那些。
可以从能够形成纳米颗粒（磁性流体）的材料如MnFe（尖晶石铁氧体）或CoFe（钴铁氧体）来形成其他磁性纳米颗粒，添加或不添加另外的如上所述的核心材料。Biotechnol.Prog.，19：1095-100（2003），J.Am.Chem.Soc.125：9828-33（2003），J.ColloidInterface Sci.255：293-8（2002）中给出了用于生产这样纳米颗粒的自动装配连接化学的实例。
另一方面中，本发明提供了组合物，包含一个或多个以上所定义颗粒的群。一些实施方案中，纳米颗粒群可以具有不同密度的相同或不同的连接于核心的配体。一些情况中，理想的是将纳米颗粒装入胶囊以能够将多个纳米颗粒递送至靶位点。合适的胶囊化技术是本领域技术人员公知的。胶囊化的纳米颗粒群可以是一种，两种，三种或多种不同的类型。一实施方案中，本发明提供了在此所定义的纳米颗粒的气雾剂组合物。气雾剂组合物可以包含纳米颗粒和任选的稀释剂。以下讨论这些组合物用途的实例。
通过说明而非限制的方式来提供以下纳米颗粒应用的实例以支持在此所述技术的广泛适用性。Dorseet & Tuschl，Nature Reviews，3：318-329，2004中提供了siRNA一般用途的综述。
另一方面中，本发明提供了以上定义的纳米颗粒用于治疗或诊断中的用途。
另一方面中，本发明提供了以上定义的纳米颗粒用于制备药物的用途，该药物用于治疗通过给予纳米颗粒得到缓解的病症。以下描述了根据本发明可以治疗的具体用途的实例，与纳米颗粒的其他应用一起，包括体外和体内的用途。例如，在此所述的纳米颗粒或其衍生物可以配制于药物组合物中，并以各种形式给药于患者，特别是用于治疗通过给予RNA配体得以缓解的病症。例如，这可以用于治疗通过由RNA下调基因的表达来缓解的病症，其中通过RNA来下调基因，或用于治疗与通过RNA靶向并下调的基因的超表达相关的病症。
基因表达的调节
包含RNA配体的纳米颗粒可以以多种方式用于调节基因表达，包括通过小干扰RNA（siRNA）mRNA的定向降解，转录后基因沉默（PTG），通过微-RNA（miRNA）mRNA的发育可控型序列特异性翻译抑制和定向转录基因沉默。
一般而言，本发明提供了在此所述的纳米颗粒用于下调靶基因的用途。本申请中，下调可以是体外的，例如，来研究基因表达，或者是体内的，在目标实验系统中或用于医学用途，即纳米颗粒可用于制备治疗通过RNA下调靶基因的表达来缓解的病症或治疗与靶基因超表达相关的病症的药物。例如，该病症可以包括癌症，例如，乳癌，其可以使用基于Her2/Neu序列的RNA来治疗。如在此所述的，因为由RNA提供的下调实际上可能是暂时的，所以，一些实施方案中，优选纳米颗粒进一步包含放射性核素，药物或其他药剂，所述药剂用于治疗或杀灭其中纳米颗粒下调靶基因的细胞。
RNA干扰可以用于治疗任何与过于活跃的基因相关的疾病，例如大多数形式的癌症，例如，使用RNA用于致癌基因抑制。特定基因如肝炎或过于活跃的基因表达有助于疾病病理学的其他病症中细胞死亡受体的停止运转也是RNA治疗的靶。使用本发明纳米颗粒治疗的合适病症的另外的实例是眼睛中的黄斑变性，或利用RNA的天然作用作为通过使病毒的RNA失去能力来对抗致病性病毒的方法，这些病毒特别包括HIV，丙肝或流感（Check，2003；Zamore等，2003；Song等，2003；Matzke & Matzke，2003）。
途径的下调
特别值得注意的是本发明允许递送多于一种的RNA分子，这以前在本领域中一直是不可能的事情。因此，一些实施方案中，本发明提供了含有至少两种不同RNA序列的纳米颗粒组合物，该RNA序列与相同的纳米颗粒缀合或存在于至少两种不同类型的纳米颗粒的组合物中，可以用来下调基因途径中的表达。组合物中存在的RNA配体的数目将取决于途径的复杂性和需要靶向用于下调的基因数目。可以靶向的途径的实例，用于研究或治疗，包括引起炎症的途径，抗病毒途径，癌症中的信号途径，转移途径或代谢途径。例如，这包括对于II型糖尿病中葡萄糖产生的新糖生成途径的调节。
另一相关的实施方案中，通过设计RNA来靶向家族成员之间保守的结构域，RNA-纳米颗粒可以用于下调基因家族的表达。
在纳米颗粒用于使用RNA抑制基因表达的任一种用途中，纳米颗粒还可以包含siRNA序列和mRNA沉默序列来靶向mRNA。这些纳米颗粒可以用于抑制siRNA抗性mRNA。这可以用于其中靶细胞对siRNA沉默是抗性的情况中，因为它们表达阻断siRNA抑制机构的蛋白质。在这种情况中，可以通过将siRNA对准表达来诱导抗性的基因产物来改善siRNA抗性。
使用其他配体或使用RNA的靶向应用
一种应用中，本发明的纳米颗粒组合物可以用于赋予靶向特性，用于将RNA递送至靶细胞。这可以通过提供具有另外类型的与合纳米颗粒核心缀合的配体或与RNA配体相连的能够使RNA纳米颗粒与靶细胞群特异性相互作用的结构域的纳米颗粒来实现。例如，含有RNA的纳米颗粒可以优先导向细胞群，通过提供具有配体的纳米颗粒，该配体是能够特异性结合存在于靶细胞表面或内部的结合伴侣的特定结合对的成员，例如，靶向特定细胞结构如核。适于用作与用于靶向的纳米颗粒缀合的配体的特定结合对的实例包括配体和受体，且许多备选物是本领域技术人员显而易见的。例如，葡萄糖衍化的纳米颗粒可以用于靶向含有蛋白质GLUT家族成员的细胞（18）。可以使用其他的用于纳米颗粒的糖配体，如Glcβ4GlcNAc或Glcβ4GlcNH2。前者可以用于首先将含有siRNA的纳米颗粒靶向细胞表面的GLUT转运蛋白，然后在进入细胞时（在葡糖苷酶剪切后），GlcNAc将会进一步将siRNA纳米颗粒靶向核。后一构建体将正电荷添加至纳米颗粒的表面，进一步促进粘附并吸收至细胞中。由于自动装配的纳米颗粒可以用于掺入异源配体如脂质，肽或任何其他化学成分（例如，如上配体讨论中所述的），其通过间隔物与二硫化物连接，多种其他靶向分子可以用于将RNA纳米颗粒靶向特定的细胞类型。例如，这些技术可以用于将携带RNA的纳米颗粒靶向肿瘤细胞。
纳米颗粒用于靶向细胞类型用途的另一实例中，纳米颗粒的RNA配体可以用作提供纳米颗粒靶向的实体，将纳米颗粒导向其中与RNA配体相互作用的mRNA得以表达的细胞。可以以这种方式靶向的靶细胞类型的实例是肿瘤细胞或病毒感染的细胞，使用RNA来靶向靶细胞中病毒基因或肿瘤标记或致癌基因的表达。该实施方案中，优选RNA-纳米颗粒能够透过细胞膜，这是由它们的小尺寸提供的并可以任选地通过用膜转位信号衍化纳米颗粒来增强的一种效果（参见NatureBiotechnology 18：410-414，2000）。RNA-纳米颗粒对其中表达相应mRNA的细胞的靶向具有以细胞选择性方式下调靶mRNA的优势。然而，因为这种作用通常是暂时的，所以优选提供具有放射性核素或药物的纳米颗粒，使得使用RNA靶向的细胞被选择性杀灭。可以将靶细胞和处理过程成象，接着标记纳米颗粒，例如如上所述的使用放射性或磁性的纳米颗粒。
使mRNA成象
另一方面中，本发明提供了mRNA检测和/或成象的方法，其使用了在此所述的纳米颗粒。特别地，在本发明之前，现有技术中不存在已知的使mRNA成象方法。该方法可以包括在其中存在于纳米颗粒上的RNA配体与靶mRNA相互作用的条件下使体内或样品中的RNA接触纳米颗粒，并检测纳米颗粒-RNA-mRNA复合物。检测复合物的步骤可以使用纳米颗粒的固有特性或通过检测与纳米颗粒相连的标记。适用于本发明这方面中的标记的优选实例包括含有磁性基团、量子点或放射性核素的纳米颗粒。量子点，例如，通过硒化镉的纳米晶体提供的，或除了硒化物以外还可以使用其他阴离子如硫化物，其在生物成象、电子和光学设备、量子计算机和候选药物的筛选中具有潜在的用途。
RNA-纳米颗粒作为功能基因组的工具
基因组筛选通常利用随机产生的RNA序列，然后将其转染至测试细胞中并监控蛋白质表达的变化。本发明的纳米颗粒具有两个优于这些现有技术的基因组筛选方法的显著优势。首先是许多随机siRNA序列实际上没有效果，但是目前测试细胞需要单个筛选，增加了这种形式的这些实验的人工和成本。本发明允许作为纳米颗粒上的配体包括多个siRNA序列，从而提供了加快筛选速率的可能。因此，如果在细胞中观察到效果，则可以筛选珠粒上存在的RNA分子来确定是由哪个序列引起这种效果的。此外，因为纳米颗粒提供了用于RNA的递送系统，所以可以避免现有技术中需要的转染试剂的使用。这是所需要的优势，因为转染试剂自身可以导致测试细胞中蛋白质表达的改变。因此，另一方面中，本发明的纳米颗粒可以用作功能基因组的工具，例如如Nature Reviews，第3卷，2004年4月，318-329页中所述的。纳米颗粒可以具有每个颗粒多于两个，多于5个，多于10个或多于20个或多于100个的RNA序列来研究体内的基因功能并且作为用于全基因组范围的筛选的工具。
气雾剂递送
另一方面中，本发明提供了在此所述的纳米颗粒在气雾剂中的用途。这是因纳米颗粒的小尺寸而成为可能的。气雾剂组合物可以用于递送RNA配体，特别是递送至肺，用于成象和/或治疗用途，例如，在治疗感染肺的病症中。
上述任一方面中，纳米颗粒可以与治疗活性物质连接，如抗体或肿瘤杀伤药物。纳米颗粒的磁性特性还可以用于靶向肿瘤，通过使用磁场来引导纳米颗粒至肿瘤细胞。然而，单独使用磁场来将纳米颗粒导向肿瘤细胞不总是可行的或准确的，因此本发明提供了一种优势，使纳米颗粒通过肿瘤特异性配体能够特异性地导向肿瘤细胞。这将允许使用较少的药物并降低副作用的可能性，因为药物只针对需要它的细胞而不针对健康的细胞。
本发明纳米颗粒的另一优势是它们特别小的尺寸，这使得它们更适宜被细胞吸收，甚至当与靶向或治疗分子连接时。
另一方面中，其中配体是抗原的纳米颗粒可以作为疫苗给药，例如，通过弹道，使用递送枪来加速它们通过表皮外层的经皮穿透。然后纳米颗粒可例如通过树突细胞来吸收，随着它们通过淋巴系统的迁移而成熟，导致免疫应答的调节和对抗抗原的疫苗接种。
本发明的纳米颗粒可以配制成固体或液体组合物形式的药物组合物。这样的组合物通常包含某种载体，例如固体载体如明胶或助剂或惰性稀释剂，或液体载体如水，石油，动物或植物油，矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液，或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。这样的组合物和制剂通常含有至少0.1wt%的化合物。
可以通过许多不同途径将纳米颗粒组合物给药于患者。非肠道给药包括通过以下途径的给药：静脉内，皮肤的或皮下的，鼻的，肌内，眼内，经上皮，腹膜内和局部（包括皮肤，眼，直肠，鼻，吸入和气雾剂），和直肠全身途径。对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在病痛部位的注射，活性成分将是非肠道可接受的水溶液形式，其是无热原的并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域有关技术人员完全能够制备合适的溶液，使用例如化合物或其衍生物的溶液，例如，在生理盐水中的溶液，用甘油、液体聚乙二醇或油制备的分散体。
除了一种或多种化合物以外，任选地结合其他活性成分，组合物还可以包含一种或多种药物学上可接受的赋形剂，载体，缓冲剂，稳定剂，等渗剂，防腐剂或抗氧化剂或本领域技术人员公知的其他物质。这样的物质应当是无毒的并应当不干扰活性成分的功效。载体或其他物质的确切性质可以取决于给药途径，例如，口服或非肠道。
通常配制液体药物组合物使其具有约3.0至9.0，更优选约4.5至8.5，再更优选约5.0至8.0的pH。可以通过使用缓冲剂如醋酸盐，柠檬酸盐，磷酸盐，琥珀酸盐，Tris或组氨酸来维持组合物的pH，通常的使用范围为约1mM至50mM。另外可以通过使用生理学上可接受的酸或碱来调节组合物的pH。
药物组合物中通常包括防腐剂来阻止微生物生长，延长组合物的保存期并允许多重用途包装。防腐剂的实例包括苯酚，间-甲酚，苄醇，对-羟基苯甲酸及其酯，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，苯扎氯铵，氯化苄乙氧铵。防腐剂通常的使用范围为约0.1至1.0%（w/v）。
优选，以预防有效量或治疗有效量（视具体的情况而定，尽管预防可以视是治疗）将药物组合物给予个体，这足以显示出对个体的益处。通常，这将导致给个体提供益处的治疗上有用的活性。所给予的化合物的实际量，给药速率和时间进程，将取决于待治疗病症的性质和严重程度。治疗的处方，例如，对剂量等的决定，是全科医生和其他内科医生职责内的，且通常考虑待治疗的疾病，个体患者的状况，递送部位，给药方法和医师已知的其他因素。上述技术和实验方案的实例可以在Handbook of Pharmaceutical Additives（药物添加剂手册），第2版（编辑M.Ash和I.Ash），2001，（Synapse InformationResources，Inc.，Endicott，纽约，USA），Remington’s PharmaceuticalScience（雷明顿药物科学），第18版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1990；和Hankbook of Pharmaceutical Excipients（药物赋形剂手册），第2版，1994中找到。例如，优选以每kg体重约0.01至100mg活性化合物，且更优选约0.5至10mg/kg体重的剂量将组合物给药于患者。
现在参照附图举例而非限制地来描述本发明的实施方案。
附图说明
图1显示了RNA-Au-Glc纳米颗粒的透射电子显微照片。
图2显示了测试制得的纳米颗粒中RNA的存在。（a）无UV光：1.RNA-Au-Glc纳米颗粒+EtBr；2.Glc-Au+EtBr；3.Glc-Au；4.洗涤溶液的残余物+EtBr。（b）用UV光：1.RNA-Au-Glc纳米颗粒+EtBr；2.Glc-Au+EtBr；3.Glc-Au；4.洗涤溶液的残余物+EtBr。
图3a显示了Her-2/neu siRNA转染后48小时来自等体积的SKBR3细胞裂解物的Her-2/neu蛋白的蛋白质印迹。C=对照（未处理）细胞；Au=用结合到金纳米颗粒上的siRNA处理的细胞，无RNAiFectamine；S=具有RNAiFectamine的沉默siRNA；NS=具有RNAiFectamine的非沉默siRNA。
图3b显示了Her-2/neu siRNA转染后72小时来自等体积的SKBR3细胞裂解物的Her-2/neu蛋白的蛋白质印迹。C=对照（未处理）细胞；Au=用结合到金纳米颗粒上的siRNA处理的细胞，无RNAiFectamine。
图4显示了本发明的包含siRNA和碳水化合物配体的优选纳米颗粒的图示。
图5显示了对用siRNA单独（A）或用每1000个细胞0.25μg（菱形），0.5μg（正方形），1.0μg（三角形），1.5μg（灰色叉）和2.0μg（黑色叉）siRNA-纳米颗粒的siRNA-纳米颗粒（B）转染的OVCAR细胞的细胞增殖的效果。X轴=天数；Y轴=细胞数（log10）。
图6显示了对用siRNA-纳米颗粒转染的OVCAR细胞的细胞增殖的效果，用和不用转染试剂。使用了三种浓度的纳米颗粒：
1．使用转染试剂（正方形）和不使用转染试剂（菱形）；
2．使用转染试剂（灰色叉）和不使用转染试剂（三角形）；
3．使用转染试剂（圆）和不使用转染试剂（黑色叉）；
X轴=天数；Y轴=细胞数（log10）。
具体实施方式
Her-2/neu致癌基因及其编码的产物p185Her-2/neu属于上皮生长因子受体酪氨酸激酶（Bargmann等，1986）。HER受体家族由四种跨膜酪氨酸激酶：EGFR（也称为Her-1或erbB-1），erbB-2（Her-2），erbB-3（Her-3）和erbB-4（Her-4）组成。已知Her-2/neu信号途径在细胞生长和分化、恶性转化和对化疗剂的抗性中起关键作用（Yarden& Sliwkowski，2001）。在约三分之一的人乳癌或卵巢癌病例中，Her-2/neu是超表达的，而其超表达与差的预后相关（Berchuck等，1990）。
已经作出许多尝试来抑制癌细胞中的Her-2/neu表达作为潜在的治疗方法。针对Her-2/neu的人源化单克隆抗体（曲妥单抗或赫赛汀）在Her-2/neu-超表达转移性癌症中是有效的（Mendelsohn & Baselga，2000；Baselga等，1996）但发现上调Her-3的表达。已经表明针对Her-2/neu的反义寡核苷酸诱导超表达Her-2/neu的人乳癌细胞系的凋亡（Roh等，2000）。使用E1A的基因治疗，通过脂质体或通过腺病毒载体递送，可以降低Her-2/neu-超表达卵巢癌模型中带有肿瘤小鼠的死亡率并可以降低乳癌模型中远距离转移的发生率（Chang等，1996）。
发现Her-2/neu表达的下调导致PI3K，Akt和磷酸化Akt的减少，其导致细胞周期蛋白D1降低的表达，细胞周期蛋白D1是一种参与G0/G1细胞败育和致癌基因转化的调节的（细胞周期蛋白Sherr &Robert，1999）。比较反义寡核苷酸和siRNA功效的最新研究证明了在nM基础上siRNA对使受体基因沉默至少10倍更有效（Miyagishi等，2003）。以前的几项研究已经证明Her-2/neu促进VEGF的转录，VEGF是有效的促血管生成因子（Kumar & Yarmand-Bagheri，2001），在Her-2/neu表达沉默后其水平显著降低。逆转录siRNA对Her-2/neu的下调提高了血小板反应蛋白-1的水平，血小板反应蛋白-1是有力的血管生成抑制剂（Izumi等，2002）。体外数据证明了HER2siRNA治疗还显著上调人肿瘤中的HLAI类表面表达（Choudhury等，2004）。
a.策略：沉默
Her2/Neu cDNA靶序列：AAG CCT CAC AGA GAT CTT GAA
a）有义：5’-G CCU CAC AGA GAU CUU GAAdTdT-3’
b）反义：3’-dTdTC GGA GUG UCU CUA GAA CUU-5’
c）有义：5’-G CCU CAC AGA GAU CUU GAAdTdT-3’SS
d）反义：3’SS-dTdTC GGA GUG UCU CUA GAA CUU-5’
b.退火
沉默：5’        （a）        3’
      3’        （b）        5’
      5’        （a）        3’
      3’SS      （d）        5’
      5’        （c）        3’SS
      3’        （b）        5’
      5’        （a）        3’SS
      3’SS      （d）        5’
c.可能的GNP组合
Figure BDA00002185579100181
X=该研究中所用的。
d.方法
1.细胞系
来自ATCC的SK-BR-3乳腺癌（目录号HTB-30）。来自NCI-Frederick癌症DCTD肿瘤/细胞系贮物器（小瓶0502296）的OVCAR-3人腹水腺癌。
2.siRNA 储备溶液
选择的Her-2/neu DNA靶序列是AAGCCTCACAGAGATCTTGAA。
有义siRNA具有序列r（GCCUCACAGAGAUCUUGAA）d（TT）3ThSS（K-盐的MW 7416.25），反义序列r（UUCAAGAUCUCUGUGAGGC）d（TT）3ThSS（K-盐的MW 7409.57）是从Qiagen获得的。
对照（非沉默）siRNA双链序列（目录号1022076）来自Qiagen，其中有义序列为r（UUC UCC GAA CGU GUC ACG U）d（TT）和反义序列为r（ACG UGA CAC GUU CGG AGA A）d（TT），退火的K-盐的MW为14839.5。
将一个有义siRNA管的内含物（296.65μg）溶解于1ml无菌缓冲液（100mM醋酸钾，30mM Hepes-KOH，2mM醋酸镁，pH7.4）中来形成40μM储液。每μl含有0.297μg siRNA。
将一个反义siRNA管的内含物（296.38μg）溶解于1ml无菌缓冲液（100mM醋酸钾，30mM Hepes-KOH，2mM醋酸镁，pH7.4）中来形成40μM储液。每μl含有0.296μg siRNA。
为了退火，将各自3μl的RNA寡聚物溶液与15μl的5X退火缓冲液合并。最终缓冲液的浓度为DEPC-处理的水中50mM Tris，pH7.5-8.0，100mM NaCl。终体积为75μl，siRNA双链体的终浓度为16μM。
将溶液在90-95℃的水浴中温育1分钟，并使其冷却至室温（即，低于30℃）。将管子短暂离心来收集管子底部的所有液体。缓慢冷却至室温需要45-60分钟。所得到的溶液储存在-20℃备用且耐受反复的冻融。
3.siRNA纳米金储备溶液
一般方法
从Aldrich化学公司购买HAuCl4（99.999%）和NaBH4。在cur实验室中使用标准方法来合成2-硫代乙基-β-D-吡喃型葡糖苷。对于所有的实验和溶液，使用用DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的纳米纯水（18.1mΩ）。所有微量离心管，刮勺和小瓶都是无RNA酶的。
从Qiagen-Xeragon Inc购买退火的双链siRNA。规格是：
DNA靶序列AAGCCTCACAGAGATCTTGAA。
有义siRNA r（GCCUCACAGAGACUUGAA）d（TT）3’上的3’-巯基-（SS）-C3-连接物
（K-盐的MW 7416.25）
反义siRNA r（UUCAAGAUCUCUGUGAGGC）d（TT）
（K-盐的MW 7409.57）
e.RNA-Au-Glc纳米颗粒的制备
向100mM，pH7.7的TRIS缓冲液（250μL）中的2-硫代乙基-β-D-吡喃型葡糖苷（0.9mg，3.75μmol）和siRNA（0.148mg，0.01μmol）溶液中，加入HAuCl4水溶液（22μL，0.025M）。然后，将1N NaBH4水溶液（30μL）分几份加入，并快速振荡。将所形成的棕色悬浮液在4℃另外振荡1小时。通过离心过滤（AMICON MW 10000，30分钟，4℃，14000rpm）来纯化悬浮液。将该过程重复两次，用125μL TRIS缓冲液洗涤。将AMICON滤器中的残余物溶解于250μL的TRIS缓冲液中并冻干，获得4mg的RNA-Au-Glc纳米颗粒（固体在1mL水中的重悬浮应当获得RNA在20mMTRIS缓冲液中的6±1μM溶液）。使用AMICON（MW3000，4℃，14000rpm）将滤液脱盐并冻干。残余物的重量<50μg。图1中所示的透射电子显微照片（TEM）显示颗粒的平均粒度为2.8nm，平均807个金原子/颗粒，siRNA和100个分子的葡萄糖衍生物如图4中所示并具有近似的MW>160,000。
f.检查纳米颗粒中RNA的存在
将 RNA-Au-Glc 纳米颗粒、Glu-Au 纳米颗粒和洗涤可能含有 RNA寡核苷酸和葡萄糖衍生物的 RNA-Au-Glc 纳米颗粒的残余物各自溶解于30μL水中。将这些溶液的等份试样（1μL）与溴化乙锭（EtBr）的水溶液（1μL，0.1%v/v）混合。在UV灯下观察荧光（参见图2），证明了这样制备的纳米颗粒具有掺入的siRNA（图2b，管1），而只含有葡萄糖的纳米颗粒没有显示出任何荧光（图2b，管2）。
将4mg从148μg siRNA 产生的 siRNA/纳米金复合物溶解于1ml水中来获得 20mM tris中的6±1μM储液。每μl溶液含有 0.078μgsiRNA 的等价物。
细胞平板培养
1．在转染前24小时，将6×104个细胞吸移至 24 孔平板中并用合适的培养基将体积补足至0.5ml。
2．使细胞达到50-80%汇合，大概需要24小时。
3．除去培养基并由300μl新鲜培养基/孔替代。
用siRNA复合物转染细胞
1．将3.3μl合适的双链siRNA储液（或12.8μl纳米金复合物）分配至对应含有细胞的24孔平板中。
2．向每个孔中，加入96.7μl合适的培养基（或对于纳米金复合物87.2μl）并通过上下吸移5次来充分混合。
3．向每个孔中（除了纳米金复合物孔以外），加入6μlRNAiFect并通过上下吸移5次来充分混合。
4．将溶液在室温下温育10-15分钟使复合物形成。
5．用100μl合适的转染复合物覆盖于300l培养基中的细胞上。
6．将平板轻微摇动来混合以避免涡旋。
7．将平板在CO2培养箱中于37℃下温育48-72小时。
8．除去培养基并用冰冷PBS将细胞洗涤三次。
9．将细胞裂解，并测定裂解物的蛋白质含量。
10．通过SDS-PAGE分离蛋白质，接着使用 Cell SignallingTechnology的Her2/ErbB2 多克隆兔抗体（目录号2242）来进行蛋白质印迹分析。
11．用抗兔IgG-HRP缀合物处理印迹，接着ECL显色。
g.结果
图3a和3b中显示了使用1μg siRNA/孔的初步观测结果。将siRNA-金纳米颗粒加入细胞中，没用 RNAiFectamine。SKBR3 细胞达到80%汇合比OVCAR细胞慢。SKBR 3结果来自转染后48小时的裂解物而OVCAR 结果来自转染后72小时的裂解物。纳米颗粒的示意图显示于图4中。
siRNA-Au-Glc纳米颗粒对细胞无毒性
单独用siRNA和用与金糖纳米颗粒缀合的siRNA来转染细胞。图5显示了纳米颗粒缀合的siRNA是有效的且无毒性作用。观察到对细胞数的剂量依赖性作用，表明siRNA纳米颗粒提高了细胞增殖。
SiRNA-Au-Glc纳米颗粒进入细胞
用siRNA-纳米颗粒转染OVCAR细胞，用或不用通常用siRNA转染细胞所需要的转染试剂。图6显示了对于siRNA-纳米颗粒进入细胞不需要转染试剂。结果表明 siRNA纳米颗粒有效地递送至细胞中，甚至在转染试剂不存在的情况下；实际上，没用转染试剂的递送看来更有效。对细胞数的剂量依赖性作用表明了对siRNA-纳米颗粒的真正响应。
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在此提及的参考文献全部特意引入作为参考。
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Claims (10)

1.含有核心的纳米颗粒在制备用于治疗由基因表达的下调缓解的病症或与基因的超表达相关的病症的药物中的用途，所述核心包括金属和/或半导体原子，其中所述核心与多个配体共价连接，该配体包括（i）至少一个含有碳水化合物基团的配体和（ii）至少一个RNA配体，该RNA配体包括siRNA、shRNA或miRNA分子，其中所述RNA配体靶向并下调所述基因，并且其中所述纳米颗粒用于在缺乏转染剂的情况下给药。
2.权利要求1的用途，其中所述病症是癌症、病毒感染或眼睛黄斑变性。
3.权利要求2的用途，其中所述癌症是乳癌或所述病毒是HIV、肝炎或流感。
4.权利要求1的用途，其中所述纳米颗粒与RNA配体通过连接基团共价连接。
5.权利要求4的用途，其中所述连接基团是巯基基团、亚乙基基团或肽基团。
6.前述权利要求任一项的用途，其中所述配体是siRNA配体并包括2个核糖核苷酸的3’突出端。
7.权利要求1的用途，其中RNA分子的第一有义链通过其3’端与纳米颗粒核心共价连接。
8.权利要求1的用途，其中所述RNA配体基于Her2基因序列。
9.权利要求1的用途，其中所述纳米颗粒的核心包括金原子并且具有0.5至10nm的平均直径。
10.权利要求1或8的用途，其中所述RNA配体具有下述：
10至40个核糖核苷酸之间，
17至30个核糖核苷酸之间，
19至25个核糖核苷酸之间，或
21至23个核糖核苷酸之间。
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