KR20120035498A - 사람 혈청 알부민-ｓｉＲＮＡ 나노입자 전달체 - Google Patents

사람 혈청 알부민-ｓｉＲＮＡ 나노입자 전달체 Download PDF

Info

Publication number
KR20120035498A
KR20120035498A KR1020100097038A KR20100097038A KR20120035498A KR 20120035498 A KR20120035498 A KR 20120035498A KR 1020100097038 A KR1020100097038 A KR 1020100097038A KR 20100097038 A KR20100097038 A KR 20100097038A KR 20120035498 A KR20120035498 A KR 20120035498A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sirna
serum albumin
human serum
transporter
poly
Prior art date
Application number
KR1020100097038A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101223484B1 (ko
Inventor
김광명
권익찬
최귀원
윤인찬
허명숙
이소진
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to KR1020100097038A priority Critical patent/KR101223484B1/ko
Priority to US13/245,180 priority patent/US8513402B2/en
Priority to CN2011103093521A priority patent/CN102441175A/zh
Publication of KR20120035498A publication Critical patent/KR20120035498A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101223484B1 publication Critical patent/KR101223484B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 사람 혈청 알부민에 siRNA가 결합된 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체 및 그의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 사람 혈청 알부민 고분자와 siRNA가 생분해성 공유결합으로 연결된, 생체 내에서 안정한 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체 및 그의 용도에 관한 것이다.
사람 혈청 알부민과 siRNA가 생분해성 공유결합으로 연결된 본 발명의 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체는 생체 내에서 표적 부위로의 siRNA 전달 효율이 높다. 따라서, 상기 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체에 의하면, 비교적 낮은 농도의 투여로도 치료용 siRNA가 생체 내의 암조직 등의 표적 부위로 효율적으로 전달될 수 있으므로, 각종 질병의 치료를 위하여 광범위하게 사용될 수 있다.

Description

사람 혈청 알부민-ｓｉＲＮＡ 나노입자 전달체{HUMAN SERUM ALBUMIN-siRNA NANO-SIZED CARRIER SYSTEM}
본 발명은, 사람 혈청 알부민에 siRNA가 결합된 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체 및 그의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 사람 혈청 알부민을 siRNA와 결합시켜서 제조한, 생체 내에서의 안정성을 높인 사람 혈청 알부민-siRNA 나노 입자 전달체 및 그의 용도에 관한 것이다.
유전자 치료에는, 유전자의 손실 혹은 변이 등으로 인하여 특정 단백질이 발현되지 않는 경우, 해당세포에 특정 유전자를 전달, 발현하도록 함으로써 손상된 기능을 회복시키는 방법과 질병을 유발시키는 단백질의 과발현 혹은 불필요한 단백질의 과발현을 siRNA와 같은 유전자 전달을 통하여 선택적으로 억제함으로써 정상적인 기능으로 회복시켜주는 방법이 있다. 이와 같은 유전자 단계에서의 단백질 발현 조절은 질병의 원인에 접근하는 것인 바 이상적인 치료 방법으로 여겨지고 있다.
siRNA를 이용한 유전자 치료에 있어서 최대관건은 강한 음전하를 띠고 있는 siRNA를 어떻게 원하는 조직 내로 전달하여 부작용을 최소화하고 효율을 나타내느냐에 달려있다. 그러나 siRNA는 세포에 대한 투과성이 낮으며 생체 환경 내에서 유전자 분해효소 등에 대한 민감성으로 인하여 필요 농도를 유지하지 못하고 쉽게 분해되어 버리므로, 상기 siRNA 자체를 치료제로서 사용하기에는 많은 제약이 따른다.
이러한 문제를 극복하기 위하여, siRNA가 생체 내의 면역 세포 등에 의하여 제거되거나 배출되지 않고 효과적으로 순환하며, 특정 질환 부위에 안정하게 전달?축적되고, 적절히 생분해될 수 있도록 돕는 유전자 전달체의 개발이 요구된다. 생체내 고분자 물질중 하나인 혈청 알부민은 생체 적합성이 우수할 뿐 아니라, 혈액 내에서 반감기가 19일에 이르는 매우 안정한 단백질로서 암조직과의 친화성이 우수하여 효과적인 암 축적능을 보이는 것으로 알려져 있어 유전자 전달체로서 적용하기에 적합하다.
본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, siRNA의 생체 내 안정성과 전달 효율을 높일 수 있는 신규한 siRNA 전달체와 상기 siRNA 전달체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 체내 전달 효율을 높이기 위하여 siRNA와 효과적으로 복합체를 형성하여 수계에서는 나노 입자 형태를 형성할 수 있으며, 특정 생체 환경 하에서는 siRNA와 분해될 수 있는 결합이 도입된 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체를 제공한다.
본 발명에 의한 siRNA 전달체는 사람 혈청 알부민을 수식하여 siRNA와 생분해성 공유결합으로 결합시켜 제조된 안정적인 나노 입자 형태의 siRNA 전달체로서, 이는 생체 내에서 안정적으로 siRNA를 표적 부위에 전달할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 siRNA 전달체는 다양한 암뿐 아니라 기타의 질병 모델에 적용할 수 있으므로 향후 광범위한 질병 치료를 위하여서도 사용될 수 있어 유용하다.
도 1은 traut's reagent를 사용하여 아민을 갖는 사람 혈청 알부민 (human serum albumin, HSA)에 -SH (thiol group)을 도입하여 티올화시킨 사람 혈청 알부민 (T-HSA)을 제작하는 모식도를 나타낸 그림이다.
도 2는 양쪽 말단 그룹이 -SH (thiol group)인 poly-siRNA와 티올화시킨 사람 혈청 알부민 (T-HSA)을 반응시켜서 이황화결합에 의하여 복합체가 형성되는 모식도를 나타낸 그림이다.
도 3은 이황화결합에 의하여 형성된 poly-siRNA와 T-HSA의 복합체를 전기영동으로 나타낸 사진이다.
도 4는 RFP (Red Fluorescence Protein) 유전자 과발현 세포에, RFP 유전자에 대한 Poly-siRNA와 T-HSA이 결합된 복합체를 농도별로 처리하여 RFP 유전자의 발현 억제 효과 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 2의 방법으로 제조된 T-HSA/poly-siRNA 복합체를 마우스에 주입한 후, RFP를 발현하는 암 조직에서의 유전자 발현 억제 효과를 나타낸 것이다 (실시예 4의 방법으로 실험).
도 6은 암 성장 관련인자인 VEGF에 대한 poly-siRNA를 실시예 2의 방법으로 T-HSA/poly-siRNA 복합체를 제작하여, 사람 전립선암 세포주를 이식한 마우스에 주입한 경우, VEGF poly-siRNA전달에 의하여 암의 증식이 억제됨을 나타낸 그래프이다(실시예 5의 방법으로 실험).
이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 siRNA를 생체 내에서 효율적으로 전달하기 위하여 사람 혈청 알부민 고분자와 siRNA를 결합하여 제조한 siRNA 전달체를 제공하되, 상기 siRNA 전달체는 사람 혈청 알부민 고분자와 siRNA가 결합된 것이 특징이다. 특히, 사람 혈청 알부민 고분자와 siRNA가 생분해성 공유결합으로 결합된 것이 특징이다.
본 발명에 의한 siRNA 전달체는 사람 혈청 알부민과 다양한 형태의 siRNA가 결합하여 제조되는 것으로, 상기 결합은 생분해성 공유 결합에 의한 것으로 그 구조는 하기와 같이 나타낼 수 있다.
A-B (A; 사람 혈청 알부민, B; 다양한 형태의 poly-siRNA)
상기에서, A는 생분해성 작용기가 도입된 사람 혈청 알부민이다. 구체적으로, 상기 사람 혈청 알부민 (A)는, 수용액 상에서 효율적으로 여러 형태의 siRNA와 복합체를 이루어 나노크기의 자기조립체 (self-assembly)를 형성하여, 특정 질병 부위에 선택적으로 축적될 수 있다 (예 : 신생혈관 표적형 EPR, 암 류마티즘 염증성 질환).
생체내 고분자 물질중 하나인 혈청 알부민은 생체 적합성이 우수할 뿐 아니라, 혈액 내에서 반감기가 19일에 이르는 매우 안정한 단백질로서 암조직과의 친화성이 우수하여 효과적인 암 축적능을 보인다. 따라서, 혈청 알부민은 다양한 저분자량 화학 약물, 단백질, 항체 등과 화학적으로 결합되어, 여러 약물의 생체 내에서의 안정성을 향상시키고 표적 암부위로 그 약물을 효과적으로 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 대표적 소수성 항암제인 독소루비신 (doxorubicin; Drug Delivery 6 (1999) 1-7)이나 메토트렉세이트 (methotrexate, MTX; Anticancer Drugs 8 (1997) 835-844) 등을 화학적으로 알부민에 결합시켜 암 표적성을 향상시키고, 약물의 혈액내 안정성을 향상시킨 연구가 보고된 바 있다. 또한, 알부민의 약물 전달체로서의 이용에 관하여는, 알부민의 암 조직에 대한 높은 표적성에 기초하여 암이 이식된 소동물에 알부민에 형광체를 붙이거나 방사선 동위원소로 표지하여 주입한 뒤 이를 영상화했을 때 많은 양의 알부민이 암 조직에 선택적으로 축적되는 것이 보고되었으며 (Cancer Research 46 (1986) 6387-6392), 이는 암 조직 주변의 느슨한 혈관에서 발생하는 증가된 침투 지연 (The Enhanced Permeability and Retention; EPR) 효과에 의해서 나타나는 것임을 알 수가 있다. 이와 같이 항암제 전달체로서의 알부민의 우수함은 알려진 바 있으나, 알부민 자체만으로는 강한 음전하를 띠는 siRNA 전달체로서 사용하기에는 결합력이 부족하다. 따라서 알부민의 고유한 특성은 유지하되 결합력을 증가시킬 수 있도록 변형이 필요하다.
이에, 본 발명자는 siRNA와 효과적으로 결합하여 생체 내에서 안정적으로 siRNA를 전달할 수 있는 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체를 제조하기 위하여, 상기 사람 혈청 알부민과 siRNA가 안정적으로 결합될 수 있는 방법을 연구하였다. 이에, siRNA가 사람 혈청 알부민과 생분해성 공유 결합으로 연결되는 경우, siRNA와 사람 혈청 알부민이 서로 안정적으로 결합될 수 있으며, 또한 생체 내에서는 효과적으로 분해될 수 있으므로 siRNA의 전달체로서 적합하다는 것을 발견하였다. 참고로, 본 발명자는 siRNA의 5’말단에 티올기를 도입하여 siRNA간의 이황화결합에 의하여 siRNA를 결합시켜 siRNA의 크기를 증가시킴으로써, siRNA의 생체 내에서의 안정성과 유전자 발현효과가 증가된 poly-siRNA에 대하여 특허와 논문을 발표한 바 있다 (PCT/KR2010/001296, Journal of Controlled release, 2010. 141 (3): 339-346). 또한 생체 유래 고분자에 전하와 공유결합을 동시에 도입하여 반응성이 증가된 나노입자를 만들어 siRNA용 전달체로의 가능성을 확인 한 바 있다(특허 출원번호 제2010-0089081호).
본 발명의 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체의 사람 혈청 알부민(A)과 siRNA(B)는 생분해성 공유 결합으로 연결된다. 생분해성 공유 결합으로는 이황화 결합(disulfide bond), 에스테르 결합, 안하이드라이드(anhydride) 결합, 히드라존(hydrazone) 결합, 효소 특이적 펩티드 결합 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 생분해성 공유 결합은 특정 생체 환경 하에서 분해가 가능하므로 유용하다. 생체 환경 내에서 여러 가지 효소 및 산도 등에 의하여 생분해되는 본 발명의 siRNA와 사람 혈청 알부민간의 생분해성 결합은, 생체 내의 특정 효소 등에 의하여 분해되어 분리되어 나온 siRNA에 의한 타겟 유전자 발현의 억제를 가능하게 한다. 예컨대, 생분해성 공유 결합을 위한 작용기로서 siRNA의 말단과 고분자 말단에 티올기를 도입한 경우, siRNA와 고분자는 이황화 결합이라는 생분해성 결합을 형성하는데, 상기의 이황화 결합은 세포질 내의 글루타치온 (GSH)에 의하여 환원된다. 생체 내에 상기 이황화 결합을 갖는 siRNA와 사람 혈청 알부민 전달체가 도입되는 경우, 생체 내에 존재하는 글루타치온에 의하여 상기 결합이 분해됨으로써 전달체 내에서 siRNA가 분리되어 나올 수 있다. 특히, 암 세포에서는 글루타치온 (GSH)의 농도가 증가된다는 보고를 고려할 때, 본 발명의 사람 혈청 알부민-siRNA 나노 입자 전달체의 이황화 결합 등의 생분해성 결합이 암 조직 중에서도 효과적으로 생분해되어 siRNA를 표적 부위로 효과적으로 전달시킬 수 있음을 알 수 있다.
상기 생분해성 공유 결합을 위하여, 사람 혈청 알부민 (A)에는 생분해성 작용기가 도입되며, siRNA(B)이 한쪽 또는 양쪽 말단에도 사람 혈청 알부민 (A)과의 생분해성 공유 결합을 위하여 작용기가 도입된다. 목적하는 공유 결합의 종류에 따라 도입되는 작용기의 종류는 다르다.
상기에서, (B)는 작용기를 가진 여러 형태의 siRNA이다. 상기 siRNA는 단량체, 여러 개의 siRNA가 분해성 결합으로 연결된 poly-siRNA 또는 다량체 siRNA이다. 좋기로는, 상기 siRNA는 15개 내지 30개의 뉴클레오타이드 단량체 siRNA, 또는 그의 중합체인 100개 내지 600개의 뉴클레오타이드로 구성된 다량체 siRNA일 수 있으며, 상기 siRNA는 분자량이 10,000 내지 1,000,000 사이에서 선택되는 것이 바람직하다. 상기 siRNA의 서열은 치료 목적의 VEGF (vascular endothelial growth factor), Bcl2, EGFR 및 NF-kB 등에 대한 염기서열을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 하기 실시 예에서는 siRNA의 전달 효능을 형광으로 확인하기 위하여 RFP (Red fluorescence protein)에 대한 siRNA 염기 서열을 사용하였다. 상기 사람 혈청 알부민 (A)과 siRNA (B)는 좋기로는 약 10:1의 중량비로 혼합될 수 있다.
본 발명의 사람 혈청 알부민 (A)과 siRNA (B)의 결합에 의한 본 발명의 siRNA 전달체의 제조는 하기 방법에 의할 수 있다.
(a) 사람 혈청 알부민에 생분해성 공유결합을 위한 작용기를 도입시키는 단계,
(b) 다양한 형태의 siRNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에 작용기를 도입하거나 활성화시키는 단계, 및
(c) 상기 (a) 단계에서 제조한 사람 혈청 알부민과 상기 (b) 단계에서 제조한 siRNA를 생분해성 공유결합을 통해 안정적으로 결합하여 나노입자를 제조하는 단계.
상기 방법은, 결합 방식에 따라 단계들이 동시에 이루어져도 무방하다. 본 발명의 일 실시예에서는, 사람 혈청 알부민에 티올 (thiol)기를 도입시켜서, 티올화된 사람 혈청 알부민을 제작하고 (도 1 참조), 또한, 티올기를 말단기에 도입한 고분자 poly-siRNA와 결합하도록 하였다. 도입된 티올기에 의한 이황화결합에 의하여 사람 혈청 알부민과 poly-siRNA는 복합체를 형성할 수 있다. 이와 같이, 티올기 또는 티올기 이외의 작용기를 사람 혈청 알부민과 siRNA에 도입하여, 이들이 공유 결합에 의하여 복합체를 형성하도록 할 수 있다.
상기와 같이, 작용기가 도입된 여러 형태의 siRNA와 작용기가 도입된 사람 혈청 알부민은 수용액 상에서 효율적으로 복합체를 이루어 나노 크기의 자기조립체 (self-assemblｙ)를 형성할 수 있으며, 특정 질병 부위에 선택적으로 축척될 수 있다 (예 : 신생혈관 표적형 EPR, 암 류마티즘 염증성 질환). 이는, siRNA만으로는 음전하가 풍부하여 세포 내로의 침투가 어렵지만, siRNA와 결합되는 사람 혈청 알부민은 혈액 내에서의 반감기가 19일에 이르며 다양한 약물의 생체내 안정성을 향상시키는 약물전달시스템으로 시도되고 있는 매우 안정한 단백질이므로 알부민의 화학적 개질을 통하여 siRNA와 사람 혈청 알부민이 나노 크기의 자기 조립체를 형성함으로 가능하다. 개질 정도에 따라 siRNA등의 약물 결합 정도를 조절할 수 있다. 본 발명에 따른 전달체로 siRNA를 전달하는 경우, 생체내에서 효과적인 약물순환이 가능하고 암조직에 대한 축적이 높은 약물 전달시스템으로도 활용이 가능하다.
상기 방법에 의하여 제조된 본 발명에 의한 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체는 그 크기가 10 내지 2000 nm이며, 생체 내에서 나노 입자를 형성하므로, EPR 효과에 의하여 암 조직에 효과적으로 축적될 수 있으므로, 암 치료를 위하여 적합하다. 또한 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환의 경우에도 분비/유도된 염증 물질에 의해 혈관이 확장되며, 혈관압이 커지며 투과성이 증대하게 되어 혈관벽의 염증세포로 염증 억제 물질을 전달할 수 있으므로, 본 발명에 의한 siRNA 전달체는 염증성 질환의 치료를 위하여서도 적합하다.
한편, 본 발명의 siRNA 전달체는 약제학적 조성물의 유효 성분으로 사용될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체를 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 투여를 위해서 본 발명에 의한 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립가능 하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있다.
또한, 약제학적 조성물은 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화할 수 있으며, 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 이와 같은 임상투여를 위해 본 발명의 약제학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 사람 혈청 알부민에 티올(thiol)기 도입 (T-HSA 제작)
사람 혈청 알부민은 생체 내에 다량 존재하며 독성이 없고, 암 조직에 효율적으로 축적되지만 그 자체로는 강한 음전하의 siRNA와 효율적인 결합이 불가능하다. 따라서, 크로스 링커인 traut's reagent를 이용하여 알부민 중의 아민기에 티올(thiol)기를 도입하였다 (이때, traut's reagent 이외에 SPDP 크로스링커를 사용할 수도 있다). Traut's reagent를 이용한 알부민으로의 티올의 도입 과정은 수용액상에서 제작이 용이하며, 티올을 함유한 알부민은 siRNA의 한쪽 말단 혹은 양쪽 말단에 티올기를 가진 siRNA와 효율적으로 이황화결합을 이룰 수 있다. 이황화결합은 생체 환경의 세포질내 글루타치온에 의하여 이황화결합 부위가 특이적으로 분해되어 siRNA를 방출할 수 있게 해준다.
사람 혈청 알부민 (HSA, 분자량 66.5 kDa) 10mg을 pH가 8.0인 10ml의 인산염 버퍼 (phosphate buffer)에 녹인 후, 각각 0.2, 0.4, 2 그리고 4 mg의 traut's reagent (분자량 137.63 Da, 알부민에 대한 분자수비율 10, 20, 100 그리고 200배) 와 함께 4℃ 에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 후 cut-off가 12,000Da인 투석막을 이용하여 24시간 동안 투석하여 반응하지 않은 traut's reagent는 제거한 후 동결건조시켜서 티올화된 사람 혈청 알부민 (Thiolated human serum albumin; T-HSA)을 제작하였다 (도 1).
실시예 2. 티올기를 갖는 고분자 올리고 뉴클레오타이드와 사람 혈청 알부민 고분자와의 결합
티올 그룹을 말단에 도입시켜서 안정성과 음전하의 양을 증가시킨 고분자 poly-siRNA를 티올기를 도입시킨 사람 혈청 알부민(T-HSA)과 결합시켰다. 사람 혈청 알부민과 siRNA는 이황화 결합에 의하여 복합체를 형성하였다. 50 ㎍의 poly-siRNA (50mM Sodium Phosphate buffer, 5 mM EDTA, pH 8.0)와 티올 그룹을 가진 사람 혈청 알부민(T-HSA) 500 ㎍를 50 μL의 인산염 버퍼 (pH 8.0) 에 녹여 혼합한 뒤, 24 시간 동안 37℃에서 반응시켜서 안정된 복합체를 형성하였다 (도 2).
여러 가지 무게와 농도비로 poly-siRNA와 티올기를 도입시킨 사람 혈청 알부민 (T-HSA)를 혼합하여 24시간 동안 37℃에서 반응시켜서 제조한 복합체를 8% 폴리아크릴아미드 겔에서 150V로 전기영동을 35분간 실시하였다 (도 3). 이후, Et-Br로 염색하고 젤도큐멘트 장비로 복합체 형성시 반응하지 않은 여분의 poly-siRNA를 확인하였다.
이로써, 사람 혈청 알부민에 대하여 Traut's reagent를 100배의 분자수 비율로 첨가하고, T-HSA를 siRNA에 대하여 10배의 무게 비율로 넣어 반응시킨 경우, 가장 효과적인 poly-siRNA와의 복합체 형성을 확인할 수 있었다. poly-siRNA와 작용기를 도입하지 않은 순수한 사람 혈청 알부민만으로는 결합이 형성되지 않음을 확인할 수 있었는데, 이로써 poly-siRNA 와 T-HSA 간의 복합체 형성에는 전하 이외의 티올기가 작용하여 이황화결합이 형성되었음을 알 수 있었다.
실시예 3. 세포 실험을 통한 티올기가 도입된 사람 혈청 알부민 고분자와 고분자 올리고 뉴클레오타이드( poly - siRNA )의 복합체를 통한 siRNA 전달에 의한 유전자 발현 억제 효과 검증
실시예 2에 따라 제조된 poly-siRNA와 T-HSA의 복합체 나노 입자를 siRNA 농도가 20 nM, 50 nM 그리고 100 nM이 되도록하여 RFP가 과발현되는 흑색종 세포주인 RFP-B16/F10 (1.2*105/dish)세포에 처리하여 24시간 후, RFP발현 억제 효능을 형광현미경 영상으로 확인하였다. 본 실험에서는 형광 단백질인 RFP (Red Fluorescent Protein)를 타겟으로 하는 siRNA를 선정하여 사용하였다. 세포 수준에서의 유전자 발현 억제효과의 검증을 위하여, 아무것도 처리하지 않은 것 (대조군; control군), 전달체없이 poly-siRNA만을 처리한 것 (free poly-siRNA)과 Poly-siRNA/LF 처리군 및 poly-siRNA/T-HSA를 투여한 군으로 나누어 실험하였다(도 4). Poly-siRNA/LF의 LF는 In vitrogen 사의 LipofectamineTM 2000 을 표기한 것이다. 본 실험을 통하여 T-HSA에 의한 poly-siRNA전달이 RFP 유전자 발현 억제에 효율적임을 확인하였다.
실시예 4. 동물 실험을 통한 티올기가 도입된 사람 혈청 알부민 고분자와 고분자 올리고 뉴클레오타이드( poly - siRNA )의 복합체 전달에 의한 유전자 발현 억제효과 검증
누드 마우스에 1 x 106개의 RFP-B16/F10 흑색종 세포주를 등쪽 허리 아래부위로 주사하여 동물 암모델을 만들고, 광학영상장비를 통해 마우스에서 RFP 형광이 검출될 때부터 실시예 2의 방법으로 제조된 T-HSA/poly-siRNA 복합체를 3회(day 0, day 1, day 3) 꼬리 정맥으로 주사하여, 혈관을 통하여 전달된 poly-siRNA에 의한 암 조직 중의 RFP 발현 억제 효과를 확인하였다. T-HSA/poly-siRNA 복합체를 주사한 경우 암 조직의 RFP의 발현이 현저히 감소한 것을 알 수 있었다 (도 5). 또한 6일째에 암 조직을 적출하여 암 조직 중의 RFP의 발현 양을 형광현미경으로 비교하여 T-HSA/poly-siRNA를 주사한 마우스의 조직에서 효율적인 RFP의 발현 감소를 확인하였다.
실시예 5. 동물 실험을 통한 티올기가 도입된 사람 혈청 알부민 고분자와 고분자 올리고 뉴클레오타이드( poly - siRNA )의 복합체 전달에 의한 종양크기 감소 효과 검증
누드 마우스에 1 x 106개의 PC-3 사람 전림선암 세포주를 등쪽 허리 아래부위로 주사하여 동물 암모델을 만들고, 암 증식에 직접적인 영향을 미치는 혈관내피증식인자인 VEGF에 대한 poly-siRNA를 제작하여 실시예 2의 방법으로 제조된 T-HSA/poly-siRNA 복합체를 제작하였다. 암의 크기가 50~100 mm3정도 되었을 때부터 2일 간격으로 T-HSA/poly-siRNA를 꼬리 정맥으로 주사하여 혈관을 통하여 전달된 VEGF poly-siRNA에 의한 종양크기의 감소를 3주간 측정하였다. T-HSA/poly-siRNA 복합체를 주사한 경우 암 조직중의 VEGF억제에 의한 종양크기의 현저한 증식억제를 확인하였다 (도 6).
상기에서 살펴본 바와 같이, 생분해성 공유 결합으로 연결되어 제조된 나노입자 형태를 갖는 새로운 제형의 본 발명에 따른 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체는, 수용액 상에서 나노입자를 형성하고 siRNA를 생체 내에서 안정적으로 표적 부위로 전달할 수 있으므로 siRNA에 의한 치료 효율을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체는 다양한 암 및 질병 모델에 적용할 수 있으므로 유용하다.

Claims (10)

  1. 사람 혈청 알부민 (A)과 siRNA (B)가 생분해성 공유결합으로 연결된 하기 구조의 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체.
    A-B
    (상기에서, A는 생분해성 작용기가 도입된 사람 혈청 알부민 고분자이고, B는 한쪽 또는 양쪽 말단에 작용기가 도입된 siRNA이다)
  2. 제1항에 있어서, 상기 사람 혈청 알부민 (A)과 siRNA (B)는 생분해성 공유 결합으로 서로 연결되기 위한 작용기가 도입된 것인 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 사람 혈청 알부민 (A)과 siRNA (B) 간의 생분해성 공유 결합은 이황화 결합(disulfide bond), 에스테르 결합, 안하이드라이드(anhydride) 결합, 히드라존(hydrazone) 결합 및 효소 특이적 펩티드 결합 중에서 선택되는 것인 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 siRNA (B)는 단량체, 여러 개의 siRNA가 분해성 결합으로 연결된 폴리 siRNA, 또는 다량체 siRNA인 것인 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 siRNA (B)는 15개 내지 30개의 뉴클레오타이드 단량체 siRNA 또는 그의 중합체인 100개 내지 600개의 뉴클레오타이드로 구성된 다량체 siRNA인 것인 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 사람 혈청 알부민 (A)와 상기 siRNA (B)는 10:1의 중량비로 혼합되는 것인 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 전달체의 크기는 10 내지 2000 nm인 것인 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체는 암의 치료를 위하여 사용되는 것인 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 사람 혈청 알부민-siRNA 전달체를 유효량으로 포함하는 항암제 조성물.
  10. (a) 양전하를 갖는 사람 혈청 알부민 고분자에 생분해성 공유 결합을 위한 작용기를 도입시키는 단계;
    (b) siRNA, 폴리 siRNA 또는 다량체 siRNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에 작용기를 도입하거나 활성화시키는 단계;
    (c) 상기 (a) 단계에서 제조한 사람 혈청 알부민 고분자와 (b) 단계에서 제조한 siRNA를 생분해성 공유결합으로 결합시켜 나노 입자를 제조하는 단계;
    를 포함하는 siRNA 전달체의 제조 방법.
KR1020100097038A 2010-10-05 2010-10-05 사람 혈청 알부민-ｓｉＲＮＡ 나노입자 전달체 KR101223484B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100097038A KR101223484B1 (ko) 2010-10-05 2010-10-05 사람 혈청 알부민-ｓｉＲＮＡ 나노입자 전달체
US13/245,180 US8513402B2 (en) 2010-10-05 2011-09-26 Human serum albumin-siRNA nano-sized carrier system
CN2011103093521A CN102441175A (zh) 2010-10-05 2011-10-10 人血清白蛋白-siRNA纳米尺寸载体系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100097038A KR101223484B1 (ko) 2010-10-05 2010-10-05 사람 혈청 알부민-ｓｉＲＮＡ 나노입자 전달체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120035498A true KR20120035498A (ko) 2012-04-16
KR101223484B1 KR101223484B1 (ko) 2013-01-17

Family

ID=45890327

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100097038A KR101223484B1 (ko) 2010-10-05 2010-10-05 사람 혈청 알부민-ｓｉＲＮＡ 나노입자 전달체

Country Status (3)

Country Link
US (1) US8513402B2 (ko)
KR (1) KR101223484B1 (ko)
CN (1) CN102441175A (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101494839B1 (ko) * 2013-10-14 2015-02-25 서강대학교산학협력단 siRNA 전달용 복합체 및 그의 제조방법
US9744241B2 (en) 2013-04-01 2017-08-29 Samsung Electronics Co., Ltd. Method for nucleic acid delivery using hyaluronic acid

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014005596A1 (en) * 2012-07-03 2014-01-09 Aarhus Universitet Modified payload molecules and their interactions and uses
CN102830356A (zh) * 2012-09-07 2012-12-19 天津大学 人体嵌入式元器件的生物老化方法
CN105777893B (zh) * 2016-03-24 2019-10-25 杭州亚慧生物科技有限公司 一种高强度血清白蛋白骨修复材料及其制备方法
WO2017181088A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Use of mir-223-3p as a cancer therapeutic and method for treating cancer using the same
CN106806901A (zh) * 2016-12-19 2017-06-09 同济大学 一种氧化还原敏感型 VEGF‑siRNA/鸡卵清蛋白纳米颗粒及其制备

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5916596A (en) 1993-02-22 1999-06-29 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Protein stabilized pharmacologically active agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
WO2003069306A2 (en) 2002-02-13 2003-08-21 Medbridge, Inc. Protein carrier system for therapeutic oligonucleotides
US20060178297A1 (en) 2003-01-28 2006-08-10 Troy Carol M Systems and methods for silencing expression of a gene in a cell and uses thereof
AU2005212433B2 (en) * 2003-05-23 2010-12-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional sINA)
JP4259368B2 (ja) 2004-03-26 2009-04-30 三菱自動車工業株式会社 ノーズビューモニタ装置
DE102005013920B4 (de) 2004-03-26 2007-12-13 Mitsubishi Jidosha Kogyo K.K. Frontsicht-Überwachungsvorrichtung
US7740861B2 (en) 2004-06-16 2010-06-22 University Of Massachusetts Drug delivery product and methods
CA3054535A1 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Abraxis Bioscience, Llc Combinations and modes of administration of therapeutic agents and combination therapy
US8246995B2 (en) * 2005-05-10 2012-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Hydrophobic nanotubes and nanoparticles as transporters for the delivery of drugs into cells
GB0613884D0 (en) 2006-07-13 2006-08-23 Upperton Ltd Particles of proteinaceous material
JP2010500340A (ja) 2006-08-11 2010-01-07 パナセア バイオテック リミテッド 活性成分を送達するための粒子、その製造方法、および組成物
US9006191B2 (en) 2007-12-27 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA
JP2010074362A (ja) 2008-09-17 2010-04-02 Stanley Electric Co Ltd 距離画像生成装置
US8202544B2 (en) 2008-09-18 2012-06-19 Carestream Health, Inc. High capacity non-viral vectors
KR101286721B1 (ko) * 2009-06-05 2013-07-16 한국과학기술연구원 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민 및 이의 제조방법
US20110159098A1 (en) 2009-12-30 2011-06-30 Surmodics, Inc. Stabilization and delivery of nucleic acid complexes

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9744241B2 (en) 2013-04-01 2017-08-29 Samsung Electronics Co., Ltd. Method for nucleic acid delivery using hyaluronic acid
KR101494839B1 (ko) * 2013-10-14 2015-02-25 서강대학교산학협력단 siRNA 전달용 복합체 및 그의 제조방법
WO2015056917A1 (ko) * 2013-10-14 2015-04-23 서강대학교 산학협력단 siRNA 전달용 복합체 및 그의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
US8513402B2 (en) 2013-08-20
CN102441175A (zh) 2012-05-09
KR101223484B1 (ko) 2013-01-17
US20120083455A1 (en) 2012-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101223484B1 (ko) 사람 혈청 알부민-ｓｉＲＮＡ 나노입자 전달체
KR100883471B1 (ko) siRNA의 세포내 전달을 위한 siRNA와 친수성 고분자 간의접합체 및 그의 제조방법
Iversen et al. Optimized siRNA-PEG conjugates for extended blood circulation and reduced urine excretion in mice
US8969543B2 (en) SiRNA-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of siRNA and method thereof
KR101179471B1 (ko) 자기 집합체 고분자 나노입자를 이용한 ｓｉＲＮＡ 전달 시스템
KR101223483B1 (ko) 전하결합 및 생분해성 공유결합으로 동시에 연결된 고분자―ｓｉＲＮＡ 나노입자 전달체
JP2016028605A (ja) Ｒｎａ干渉効果が高い脂質修飾２本鎖ｒｎａ
JP7067802B2 (ja) アプタマー－薬物コンジュゲート及びその用途
CN105188764B (zh) Dna嵌入剂的细胞递送
JP2021525508A (ja) 核酸治療薬のための調節可能な共カップリングポリペプチドナノ粒子送達系の組成物および方法
CN114681619B (zh) 基于Biotin-SA的核酸适体复合物及其应用
KR101336552B1 (ko) 전립선암 특이적 ｓｉＲＮＡ 전달체
KR101183989B1 (ko) 세포내 유전자 전달용 복합체, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 세포내로의 유전자 전달 방법
CN114438088A (zh) 一种溶酶体靶向的核酸嵌合体的制备及应用
Wu et al. Selective anti-melanoma effect of phosphothioated aptamer encapsulated by neutral cytidinyl/cationic lipids
KR101184928B1 (ko) 작은 올리고뉴클레오티드의 중합 방법 및 상기 중합 방법에 의하여 제조된 고분자 올리고뉴클레오티드의 용도
KR102170266B1 (ko) 다당류 고분자-siRNA 그라프트 접합체, 이를 포함하는 siRNA 전달체 및 이의 제조방법
US20230203085A1 (en) Multi-conjugates comprising multiple ligands
WO2023092089A1 (en) Therapeutic compounds for red blood cell-mediated delivery of an active pharmaceutical ingredient to a target cell
Tang et al. A blood–brain barrier-and blood–brain tumor barrier-penetrating siRNA delivery system targeting gliomas for brain tumor immunotherapy
TW202018080A (zh) Rna奈米結構，其製備方法和用途
KR20160112375A (ko) siRNA의 암 표적화된 전달을 위한 비타민 기반 나노입자 복합체 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151229

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161226

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171227

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190107

Year of fee payment: 7