CN114438088A - 一种溶酶体靶向的核酸嵌合体的制备及应用 - Google Patents
一种溶酶体靶向的核酸嵌合体的制备及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114438088A CN114438088A CN202011211323.7A CN202011211323A CN114438088A CN 114438088 A CN114438088 A CN 114438088A CN 202011211323 A CN202011211323 A CN 202011211323A CN 114438088 A CN114438088 A CN 114438088A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- aptamer
- chimera
- protein
- ltr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 145
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 135
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 135
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 35
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 94
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 60
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 claims description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 14
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 claims description 8
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 229910052774 Proactinium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 abstract description 22
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 abstract description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 101001028831 Homo sapiens Cation-independent mannose-6-phosphate receptor Proteins 0.000 description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 description 24
- 102100037182 Cation-independent mannose-6-phosphate receptor Human genes 0.000 description 22
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 21
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 21
- 101000606465 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase 7 Proteins 0.000 description 20
- 102100039813 Inactive tyrosine-protein kinase 7 Human genes 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 17
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 102000008022 Proto-Oncogene Proteins c-met Human genes 0.000 description 12
- 108010089836 Proto-Oncogene Proteins c-met Proteins 0.000 description 12
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 12
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 7
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 5
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- -1 CeNA Proteins 0.000 description 3
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000026938 proteasomal ubiquitin-dependent protein catabolic process Effects 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 101710145225 Cation-independent mannose-6-phosphate receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000006674 lysosomal degradation Effects 0.000 description 1
- 230000006655 lysosomal degradation pathway Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000007180 physiological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
- C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
Abstract
本发明提供了一种溶酶体靶向的核酸嵌合体的制备及应用。具体地,涉及基于核酸构建溶酶体靶向嵌合体用于特异性降解细胞内外生物大分子及制备相关药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域,具体地,本发明涉及一种溶酶体靶向的核酸嵌合体的制备及应用。
背景技术
靶向单个蛋白的治疗方法多数依赖于与靶蛋白的特异性活性调节相互作用,如酶抑制或配体阻断。然而多数治疗相关的蛋白因缺乏酶活性或者表面缺乏成药位点等原因而成为不可成药的靶点。对于难以靶向的蛋白,已经开发了水解靶向蛋白嵌合体(Proteolysis-targeting Chimaeras,PROTACs)等蛋白质降解平台的方法。然而,这些方法涉及细胞内蛋白的降解机制,因此对蛋白质种类有限制。例如,这些蛋白质需含有可结合配体并募集必需细胞成分的细胞内结构域。但不含上述细胞内结构域的胞外蛋白和膜相关蛋白是一些重要疾病中的关键因子,例如癌症、衰老相关疾病和自身免疫性疾病等。针对这些蛋白的靶向降解对人类健康有重大意义,具有重要的研究潜力。
与蛋白酶体途径不同,降解蛋白的溶酶体途径不限于具有细胞内结构域的蛋白质。细胞表面的溶酶体靶向受体(lysosome-targeting receptors,LTRs)家族可促进蛋白质向溶酶体转运。可通过抗体或者目的蛋白配体识别LTR等蛋白,促进蛋白降解。然而,基于抗体构建靶向识别溶酶体和蛋白质等生物大分子的方法具有一定的技术难度,且耗时耗力。因此上述方法具有生产周期长、工作量大、成本高等缺点。
因此,本领域迫切需要开发一种高效稳定、适于生产的降解蛋白等生物大分子的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效稳定、适于生产的降解蛋白等生物大分子的方法。
在本发明的第一方面,提供了一种核酸嵌合体,所述核酸嵌合体具有式I所示的结构:
A1-L-A2 (I)
式中,
A1为针对溶酶体靶向受体(lysosome-targeting receptor,LTR)的核酸适配体元件,所述核酸适配体元件特异性结合于所述的溶酶体靶向受体;
L为无或接头序列(Linker);
A2为靶向待降解蛋白的适配体元件;
各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。
在另一优选例中,所述的核酸适配体元件包括一个或多个LTR结合域,所述LTR结合域特异性地与所述溶酶体靶向受体(LTR)结合。
在另一优选例中,所述的LTR结合域由特异性识别并结合于LTR的核酸序列构成。
在另一优选例中,所述的核酸适配体元件还含有除了LTR结合域之外的其他结构域。
在另一优选例中,所述的LTR的核酸序列包括单链核酸序列。
在另一优选例中,所述的核酸序列包括DNA、RNA、LNA、PNA、HNA、CeNA、NAN、FANA,或其组合。
在另一优选例中,所述的核酸序列包括天然和非天然的碱基,例如选自下组的碱基:A、T、C、G、U、I、M-fC、I-fC、isoG、isoC、Ds、Pa、F、X、Y、Z、P。
在另一优选例中,所述的溶酶体靶向受体(LTR)位于细胞表面,较佳地位于细胞膜的外表面上。
在另一优选例中,所述的溶酶体靶向受体(LTR)位于细胞内的膜结构表面,较佳地位于内体(endosome)表面。
在另一优选例中,所述的溶酶体靶向受体选自下组:IGF2R、Rab、ESCRT,或其组合。
在另一优选例中,所述的A1为靶向IGF2R的核酸适配体元件。
在另一优选例中,所述的细胞为哺乳动物(如人和非人哺乳动物)的细胞。
在另一优选例中,所述的细胞选自下组:肿瘤细胞、免疫细胞、神经细胞、上皮细胞、干细胞。
在另一优选例中,所述的A1和A2通过接头序列、碱基互补配对或磷酸二酯键连接。
在另一优选例中,所述的L为通过核酸互补形成的核酸连接子。
在另一优选例中,所述的核酸连接子的长度为6-80nt,较佳地10-50nt,更佳地15-40nt。
在另一优选例中,所述的核酸连接子包括第一连接单链L1和第二连接单链L2,所述的第一连接单链L1和第二连接单链L2的部分或全部区域形成核酸互补结构。
在另一优选例中,所述的核酸适配元件A1为第一核酸适配单链,并且所述的第一连接单链L1与所述的第一核酸适配单链的一端(如5'或3')相连。
在另一优选例中,所述的核酸适配元件A2为第二核酸适配单链,并且所述的第二连接单链L2与所述的第二核酸适配单链的一端(如5'或3')相连。
在另一优选例中,所述的第一连接单链L1还与所述的第二核酸适配单链的一端(如5'或3')相连。
在另一优选例中,所述的第二连接单链L2还与所述的第一核酸适配单链的一端(如5'或3')相连。
在另一优选例中,所述的待降解蛋白包括膜蛋白、分泌蛋白、胞内蛋白。
在另一优选例中,所述的待降解蛋白选自下组:原癌蛋白、神经退行性疾病靶标蛋白、免疫反应相关蛋白、内分泌相关蛋白、生殖相关蛋白或外源蛋白。
在另一优选例中,所述的待降解蛋白选自下组:Met、PTK7、EGFR。
在本发明的第二方面,提供了一种组合物,所述组合物包括:
(i)如本发明的第一方面所述的核酸嵌合体;
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的组合物为药物组合物。
在本发明的第三方面,提供了一种制备如本发明第一方面所述的核酸嵌合体的方法,包括步骤:
(S1)提供A1、A2;
(S2)将A1和A2进行连接,从而形成式I结构的核酸嵌合体。
在本发明的第四方面,提供了一种如本发明第一方面所述的核酸嵌合体的用途,用于制备降解靶向蛋白质、核酸或脂肪的药物。
在另一优选例中,所述药物用于降解细胞外蛋白、细胞膜蛋白或细胞内蛋白。
在另一优选例中,所述核酸嵌合体作为制备抗肿瘤治疗药物中的应用。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1A显示了核酸嵌合体结构示意图,其中A1和A2分别表示两个不同的核酸适配体(A1为IGF2R核酸适配体,A2为c-Met核酸适配体),Linker为连接A1、A2的接头;1B为通过不同连接方式合成的三种核酸嵌合体D1、D2和D3;1C为D1、D2和D3的核酸非变性胶分析。
图2A显示了D1、D2和D3核酸嵌合体稳定性分析的核酸非变性胶图;2B显示了D1、D2和D3核酸嵌合体细胞亲和力的细胞流式分析图。
图3显示了核酸嵌合体对细胞膜蛋白c-MET降解能力的western分析和免疫荧光分析;其中,3A显示了D1、D2和D3核酸嵌合体对c-Met蛋白水平的影响,CTR为对照组细胞,GAPDH为阴性对照;3B为D3对c-Met蛋白水平的浓度梯度效应;3C为D3对c-Met蛋白水平的时间梯度效应;3D显示了经D3处理的HeLa细胞固定和抗体染色图(比例尺为10μm)。图中,aptamer表示适配体。
图4A显示了D3核酸嵌合体在不同处理时间下对细胞膜蛋白c-MET降解能力的细胞流式分析;4B为细胞流式分析所用细胞的激光共聚焦分析。
图5A显示了D3'核酸嵌合体对细胞膜蛋白PTK7降解能力的western分析;5B为D3'核酸嵌合体对细胞膜蛋白PTK7的细胞流式分析。
图6显示了本发明中核酸适配体及相应核酸嵌合体的二级结构,图中aptamer表示适配体;
其中,6A为IGF2R适配体二级结构;
6B为c-Met适配体二级结构;
6C为PTK7适配体二级结构;
6D为D1核酸嵌合体的二级结构,其中,D1核酸嵌合体包括一个6A所示的IGF2R适配体和一个6B所示为c-Met适配体,其中l inker为polyT(单链的T10);
6E为D2核酸嵌合体的二级结构,其中,D2核酸嵌合体包括一个6A所示的IGF2R适配体和一个6B所示为c-Met适配体,其中l inker为17bp的双链核酸;
6F为D3核酸嵌合体的二级结构,D3核酸嵌合体包括一个6A所示的IGF2R适配体和一个6B所示为c-Met适配体,其中linker为23bp的双链核酸,包括来自c-Met适配体自身10bp的双链互补结构;
6G为D3'核酸嵌合体的二级结构,D3'核酸嵌合体包括一个6A所示的IGF2R适配体和一个6C所示为PTK7适配体,其中linker为22bp的双链核酸,包括来自PTK7适配体自身的9bp的双链互补结构。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次开发了一种结构独特的核酸嵌合体结构A1-L-A2(式I),同时结合溶酶体靶向受体与待降解蛋白。具体地,将溶酶体靶向受体IGF2R的核酸适配体与c-MET或PTK7的核酸适配体通过核酸序列、碱基互补配对或磷酸二酯键连接的方式,连接两个核酸适配体,形成同时结合IGF2R与靶标蛋白的核酸嵌合体。在此基础上完成了本发明。
本发明构建靶向溶酶体的核酸嵌合体,可用于蛋白质(细胞外蛋白、膜蛋白以及胞内蛋白)、核酸等生物大分子特异性降解,以及降解物相关的生理过程调控与疾病治疗。特别是涉及靶向LTR(例如IGF2R)的核酸结构(包含靶向IGF2R的核酸适配体等),基于该核酸构建嵌合体(A1-L-A2),使其同时靶向LTR(A1)和特定的生物大分子(A2),从而将蛋白等生物大分子通过IGF2R等溶酶体靶向受体转运至溶酶体进行靶向降解,特异性调控目的蛋白等生物大分子参与的生理过程以及应用于相应疾病的治疗。
术语
本发明中的“本发明的核酸嵌合体”、“溶酶体靶向嵌合体”、“本发明的溶酶体靶向嵌合体”可互换使用,均指本发明中具有式I结构的核酸嵌合体。
如本文所用,所述的“含有”,“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”;“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
溶酶体靶向受体
与蛋白酶体途径不同,用于蛋白质降解的溶酶体途径不限于具有细胞内结构域的蛋白质。已有报道细胞表面的溶酶体靶向受体(lysosome-targeting receptors,LTRs)家族可促进蛋白质向溶酶体的转运。
本发明中的IGF2R为溶酶体靶向受体,即不依赖阳离子的甘露-6-磷酸受体CI-M6PR。
适配体元件
适配体(aptamer)是一种核酸(NA)探针,其产生于体外过程,称为SELEX(通过指数富集的配体系统进化)。通过折叠成不同的三级结构,适配体可以特异性地识别一组目标物,如金属离子、有机分子和蛋白质,其解离常数可达皮摩尔值。适配体基于低分子量,能快速穿透组织和肿瘤,并能快速清除血液。由于适配体由核苷酸组成,是非免疫原性的,因此,它们可以很容易地被合成和修饰,进而对荧光染料、放射性核素、药物和药代动力学修饰剂的偶联进行位点特异性修饰。重要的是,从SELEX产生的适配体可以区分正常细胞和癌细胞的分子特征。因此,适配体作为分子探针在癌症诊断和治疗中受到了广泛的关注。
如本文所用,术语“核酸适配体元件”指由核酸序列构成的或基本上由核酸序列构成的适配体,并且所述核酸适配体元件与靶目标(如LTR或其他靶蛋白)的结合至少部分或全部来源于所述的核酸序列。应理解,在本发明中,对核酸适配元件而言,“基本上由核酸序列构成”指至少30%,较佳地至少50%,更佳地至少80%的适配元件的成分为核酸。
应理解,在本发明中,A1和A2中的至少一个或两个为核酸适配体元件。
以针对或靶向LTR的核酸适配体元件为例,A1为靶向IGF2R的核酸适配体元件。
接头序列(Linker)
接头序列Linker(L)可以为核酸单链、碱基互补配对的双链、肽链以及其他化学键等,将核酸适配体元件A1和A2连接在一起。
应理解,本发明中的A1或者A2可以通过其他化学或生物的方式连接,例如通过点击化学、生物正交反应等方式。
在本发明中,对于接头序列Linker(L)没有特别的限制,只要该接头序列可以将核酸适配体元件A1和A2连接在一起,并且对A1和A2各自的功能没有影响或基本上没有影响。
一种优选的接头序列是核酸类接头序列。优选的接头序列为连接A1、A2的一段核酸,包括单链核酸(如polyT)、双链核酸、或其组合(如具有部分单链区和部分双链区的核酸)。
应理解,当接头序列为核酸类接头序列时,其长度为1nt-50nt(或1-50bp),较佳地5-40nt(或bp),更佳地8-30nt(或bp)。
优选地,在本发明中,可以预先将核酸类接头序列连接于核酸适配体元件A1和/或A2,然后在合适的条件下进行退火、延伸和/或核酸连接,从而形成本发明的核酸嵌合体。
在另一优选例中,所述的核酸适配体元件A1和A2中的任何两者以头-头、头-尾、或尾-尾方式相连。
在另一优选例中,所述的“头部”指核酸适配体元件末端的5’端。
在另一优选例中,所述的“尾部”指核酸适配体元件末端的3’端。
由于可以通过人工合成方法方便地制备预先带有完整或部分核酸类接头序列的核酸适配体元件,另外退火、延伸和/或核酸连接反应的条件较为温和和高效,因此更为高效和方便地制备本发明的核酸嵌合体,并保留核酸适配体元件A1和A2的各自的功能(如各自的结合特性)。
应理解,在本发明中,虽然核酸类接头序列可以完全采用核酸适配体元件A1和/或A2自身结构之外核苷酸序列(如图6D中所示的核酸嵌合体D1中所采用的polyT),但是核酸类接头序列也可以采用部分来自核酸适配体元件A1和/或A2自身结构的部分序列,尤其是对核酸适配体元件A1和A2的各自功能基本无影响的部分序列,例如来自核酸适配体元件二级结构中某一末端,例如图6B中c-Met核酸适配体元件末端的8个bp的互补序列以及3’端两个未配对的核苷酸(或其中的一部分);或图6C中PTK7核酸适配体元件末端的8个bp的互补序列以及5’端一个未配对的核苷酸(或其中的一部分)。
因此,在本发明中,除了额外增加的序列,接头序列还包括核酸适配体A1的部分序列和/或核酸适配体A2的部分序列。
优选地,在本发明中,核酸适配体元件A1具有粘性末端ST1(stick tail 1),和核酸适配体元件A2具有粘性末端ST2(stick tail 2),其中ST1和ST2可互补形成配对结构,进而形成将核酸适配体元件A1和A2连接在一起的接头结构。
在一具体实施例中,接头可以是10个T碱基的单链DNA(SEQ ID NO:4)、17个碱基对(SEQ ID NO:7)、23个碱基对(SEQ ID NO:10,D3中的linker)或22个碱基对(D3'中的linker)的核酸连接子。
核酸嵌合体
本发明提供了一种核酸嵌合体,所述核酸嵌合体具有式I所示的结构:
A1-L-A2 (I)
式中,
A1为针对溶酶体靶向受体(lysosome-targeting receptor,LTR)的核酸适配体元件,所述核酸适配体元件特异性结合于所述的溶酶体靶向受体;
L为无或接头序列(Linker);
A2为靶向待降解蛋白的适配体元件;
各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。
本发明中所述溶酶体靶向嵌合体的设计与开发可以如以下所述:
(1)将靶向溶酶体靶向受体的核酸适配体元件(A1)与目的生物大分子的核酸适配体元件(A2)通过单链核酸的接头序列、碱基互补配对、磷酸二酯键等方法连接,L为连接A1和A2的接头序列,进而合成双靶向的核酸嵌合体(A1-L-A2);
(2)将靶向溶酶体靶向受体的核酸适配体(A1)与目的生物大分子的小分子、肽段等配体(A2)通过化学、生物等方法连接(L),合成双靶向的核酸嵌合体(A1-L-A2)。
(3)将靶向溶酶体靶向受体的其他核酸结构(A1)与结合目的生物大分子的配体(A2)通过化学、生物等方法连接(L),合成双靶向的核酸嵌合体(A1-L-A2)。
(4)将结合溶酶体靶向受体的肽段等配体(A1)与结合目的生物大分子的核酸结构(A2)通过化学、生物等方法连接(L),合成双靶向的核酸嵌合体(A1-L-A2)。
应理解,虽然本发明的核酸嵌合体可由A1、L和A2通过组装(包括退火、延伸和/或连接)而形成,或通过连接反应而形成,但是,也可以直接合成包含A1、L、A2的前体,例如当A1、L1、L2和A2均为核酸序列时,可以直接合成包含A1、L1、L2和A2的核酸前体序列(单链),然后在合适的条件下进行退火和连接,从而形成式I结构的核酸嵌合体。
本发明还提供了一种组合物,它含有有效量(如0.000001-90wt%;较佳的0.1-50wt%;更佳的,5-40wt%)的本发明的核酸嵌合体,以及药学上可接受的载体。
通常,可将本发明的核酸嵌合体配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地,pH约为6-8。
如本文所用,术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用,“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的核酸嵌合体以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
核酸嵌合体的制法和应用
酶抑制或配体阻断等依赖于与靶蛋白的特异性活性调节相互作用的方法对于缺乏酶活性或者表面缺乏成药位点等的蛋白质不可成药。依赖于蛋白酶体途径将目的蛋白泛素化后靶向降解方法(PROTACs)依赖于蛋白质降解机制,对蛋白质种类有限制,且需要寻找目的蛋白的可结合配体,具有一定的难度。溶酶体降解途径不限于具有细胞内结构域的蛋白质,且适用于蛋白质、核酸等多种生物大分子。然而基于抗体构建靶向识别溶酶体和蛋白质等生物大分子的嵌合体的方法具有一定的技术难度,且耗时耗力。
本发明的目的在于提供一种合成简单、易于人工化改造的靶向溶酶体的方法,能将蛋白质、核酸等生物大分子运输如溶酶体内进行特异性降解,突破上述方法的局限性,进一步丰富靶向降解物种类。且本发明方法是基于核酸结构开发的嵌合体,能大规模生产和长时间保存,可实现精确的位点修饰和标记,具有很好的稳定性,对运输条件要求宽松,同时其免疫原性小、组织渗透性好等。该发明进一步加速了靶向目的生物大分子的药物成药过程。
本发明提供的核酸嵌合体同时靶向溶酶体靶向受体和蛋白质等生物大分子,并将生物大分子运输入溶酶体进行特异性降解的技术,以及在靶标生物大分子参与的生理病理过程中的应用和相关药物开发。
另外,本发明还提供一种靶向溶酶体的核酸嵌合体在靶标生物大分子参与的生理过程、疾病中的应用。
本发明还提供一种靶向溶酶体的核酸嵌合体在调理相应生理过程的技术或药物中的应用。
本发明还提供一种靶向溶酶体的核酸嵌合体在制备相应疾病治疗药物中的应用。
本发明通过非变性胶鉴定两个核酸适配体是否有连接上以及在血清中的稳定性;通过结合试验与细胞流式分析核酸嵌合体与具有靶标蛋白的细胞的亲和力;利用细胞流式、激光共聚焦、免疫荧光、western等方法检测核酸嵌合体对靶标蛋白的降解能力。
在本发明的一优选例中,核酸嵌合体的制备和表征如下:
1)合成核酸嵌合体的几种方法以及非变性胶分析
两个核酸适配体(A1和A2)通过linker连接在一起,形成同时靶向两种蛋白的核酸嵌合体(A1-L-A2)(图1A)。分别通过核酸序列、碱基互补配对与T4连接酶形成磷酸二酯键的方法将IGF2R核酸适配体和c-Met的核酸适配体合成核酸嵌合体D1、D2和D3(图1B),并通过非变性胶确定核酸嵌合体的合成结果(图1C)。
2)合成核酸嵌合体稳定性和与靶标细胞结合能力分析
模拟细胞培养条件,将合成的核酸嵌合体与10%FBS于37℃孵育不同时间后,发现D1在3h左右被完全降解,而D2和D3相对稳定(图2A)。通过细胞结合实验与细胞流式分析,发现D3对含有靶标的细胞亲和力最好,而D2的细胞亲和力最低(图2B)。
3)核酸嵌合体对细胞膜蛋白c-MET降解能力分析
Western实验结果表明,单独的核酸适配体、D1和D2无蛋白降解能力,D3能显著降解的细胞上c-Met蛋白(图3A),且具有很好的浓度梯度效应(图3B)和时间梯度效应(图3C)。细胞膜免疫荧光(图3D)以及c-Met核酸适配体与细胞膜结合情况(图4A和B)则进一步证实了D3的降解能力。
4)核酸嵌合体对细胞膜蛋白PTK7降解能力分析
通过T4连接酶的方法将IGF2R核酸适配体和PTK7核酸适配体合成核酸嵌合体D3'。Western和细胞流式实验结果表明,D3'能有效降解细胞上的PTK7蛋白(图5A),且具有显著的时间梯度效应(图5B)。
本发明的主要优点包括:
1)本发明中所用的核酸嵌合体制备条件和步骤简单,易于操作和人工化改造,具有产业化合成的前景;
2)本发明中所制备的核酸嵌合体免疫原性小,且能特异性靶向溶酶体;
3)本发明中所制备的核酸嵌合体能特异性降解目的蛋白,且非常迅速(1h内);
4)本发明中所制备的核酸嵌合体加速靶向特定生物大分子的药物成药,用于生理调节与疾病治疗。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
序列
实施例中采用的核酸嵌合体及其构成元件的序列见表1。
表1.本发明的核酸嵌合体序列
注:
(a)“P-”代表磷酸化的5'结构,例如P-C表示5'的C的磷酸化的;
(b)茎环结构中的接头序列通过“下划线”标出。
实施例1核酸嵌合体的合成方法以及非变性胶分析
核酸的嵌合体能同时靶向溶酶体靶向受体IGF2R和靶标细胞膜蛋白质,通过溶酶体靶向受体IGF2R将靶标细胞膜蛋白质运输入溶酶体中特异性降解。核酸的嵌合体的结构为A1-L-A2(图1A),其中A1和A2为核酸适配体(一个为IGF2R核酸适配体,另一个为c-Met核酸适配体),L为连接A1和A2的linker。我们合成了三种核酸嵌合体(图1B),其中D1是通过10个T碱基将A1和A2连接为1条核酸链;D2通过碱基互补配对将A1和A2连接在一起;D3是将A1和A2核酸链的5'端磷酸化修饰,通过T4连接酶将A1和A2的5'端和3'端连接在一起。通过非变性PAGE胶分析,在D1、D2和D3标记的泳道中观测到目的分子量条带,表明通过D1、D2和D3不同的连接方式,A1和A2连接在一起形成核酸嵌合体(图1C)。
实施例2合成核酸嵌合体稳定性和与靶标细胞结合能力分析
为了进一步检测合成的D1、D2和D3的稳定性,将合成的D1、D2和D3分别与10%FBS于37℃孵育不同时间,发现D1在3h左右被完全降解,而D2和D3相对稳定(图2A)。HeLa细胞同时表达IGF2R和c-Met膜蛋白。将cy5标记的D1、D2和D3以及单独的IGF2R和c-Met核酸适配体与HeLa细胞孵育,进行结合实验。
通过细胞流式分析,发现D3对HeLa细胞的亲和力(KD=20.12nM)显著高于单独的核酸适配体以及D1和D2,D1对HeLa细胞的亲和力与单独的核酸适配体对HeLa细胞的亲和力无显著变化,而D2对HeLa细胞的亲和力最低(图2B)。这些结果说明相对于D1和D2,D3同时具有高的细胞亲和力与较好的稳定性。
实施例3核酸嵌合体对细胞膜蛋白c-MET降解能力分析
细胞表面的溶酶体靶向受体(如IGF2R受体)家族可促进蛋白质向溶酶体的转运以及在溶酶体中降解。将合成的D1、D2、D3以及单独的IGF2R核酸适配体和c-Met的核酸适配体分别与HeLa细胞孵育24h后,通过western blot(图1A、B和C)和免疫荧光(图3D)检测c-Met蛋白的水平变化。GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)作为内参蛋白。
如图3A所示,与没有处理的对照组细胞(CTR)相比,D3能显著降低细胞中c-Met蛋白水平,而D1、D2和单独的核酸适配体对c-Met蛋白水平没有显著影响。D3对c-Met蛋白水平的影响具有显著的浓度梯度效应(图3B)和时间梯度效应(图3C),且D3处理细胞1h内就能显著降低c-Met水平。同时,将核酸嵌合体处理的HeLa细胞固定和抗体染色后,发现D3处理细胞后,细胞膜上c-Met蛋白水平显著降低(图3D)。
为了进一步证明D3的作用,将无荧光标记的D3处理HeLa细胞不同时间后,利用cy5标记的c-Met核酸适配体与处理后的HeLa细胞进行结合实验。通过细胞流式分析(图4A),发现D3处理细胞1h后细胞表面结合的c-Met核酸适配体荧光强度显著下降,表明D3显著降低了细胞膜上c-Met蛋白水平。将细胞流式分析用的细胞进行激光共聚焦分析(图4B)。图中显示,经红色荧光标记的细胞膜上的荧光强度,经D3处理后显著降低,进一步证实了D3对细胞表面c-Met蛋白水平的影响。
以上结果说明,D3具有特异性降低细胞内c-Met蛋白水平的能力,在很短的时间内(如1h)就能发挥作用,而D1和D2无效果。
实施例4核酸嵌合体对细胞膜蛋白PTK7降解能力分析
为了进一步分析A1-L-A2嵌合体对靶标蛋白质水平的影响以及降解作用,我们通过T4连接酶的方法将IGF2R核酸适配体和PTK7核酸适配体合成核酸嵌合体D3'。将IGF2R核酸适配体、PTK7核酸适配体和D3'分别处理CEM细胞24h,通过western blot检测发现(图5A),与无处理的细胞相比,D3'能显著降低CEM细胞中PTK7蛋白水平,而单独的核酸适配体对PTK7蛋白水平无影响。同时,将D3'与CEM细胞孵育不同时间后,利用cy5标记的PTK7核酸适配体与CEM细胞进行结合实验。
通过细胞流式分析发现(图5B),D3'处理CEM细胞1h就能显著降低CEM细胞表面结合的PTK7核酸适配体数量,表明D3'显著降低了CEM表面PTK7蛋白水平,且具有时间梯度效应。
讨论
在本发明中,发明人以膜蛋白为例,说明基于核酸开发的同时靶向溶酶体靶向受体IGF2R与膜蛋白c-Met或者PTK7的核酸嵌合体(A1-L-A2)能特异性地将c-Met或者PTK7运输入溶酶体内降解。该核酸嵌合体能同时结合细胞表面IGF2R和细胞膜蛋白c-Met或者PTK7,进行诱导靶标的溶酶体降解,从而提供了一种通过在细胞外空间起作用的结合剂来加速蛋白降解的手段。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 韩达
<120> 一种溶酶体靶向的核酸嵌合体的制备及应用
<130> P2020-2092
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggcgcgtag atgacgagca gtcctaacat cgtttaggac 40
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcaggctgg atggtagctc ggtcggggtg ggtgggttgg caagtctgat a 51
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41
<210> 4
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttttttttt 10
<210> 5
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcaggctgg atggtagctc ggtcggggtg ggtgggttgg caagtctgat aatttttttt 60
ttgggcgcgt agatgacgag cagtcctaac atcgtttagg ac 102
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggcgcgtag atgacgagca gtcctaacat cgtttaggac cgtaaatcag tcatact 57
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgtaaatcag tcatact 17
<210> 8
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcaggctgg atggtagctc ggtcggggtg ggtgggttgg caagtctgat aaagtatgac 60
tgatttacg 69
<210> 9
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgactgattt acggggcgcg tagatgacga gcagtcctaa catcgtttag gac 53
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agtctgataa tgactgattt acg 23
<210> 11
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgtaaatcag tcattatcag gctggatggt agctcggtcg gggtgggtgg gttggcaagt 60
ctgataa 67
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cggttagatt gactgattta cg 22
<210> 13
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgtaaatcag tcaatctaac tgctgcgccg ccgggaaaat actgtacggt tagat 55
Claims (10)
1.一种核酸嵌合体,其特征在于,所述核酸嵌合体具有式I所示的结构:
A1-L-A2 (I)
式中,
A1为针对溶酶体靶向受体(lysosome-targeting receptor,LTR)的核酸适配体元件,所述核酸适配体元件特异性结合于所述的溶酶体靶向受体;
L为无或接头序列(Linker);
A2为靶向待降解蛋白的适配体元件;
各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。
2.如权利要求1所述的核酸嵌合体,其特征在于,所述的核酸适配体元件包括一个或多个LTR结合域,所述LTR结合域特异性地与所述溶酶体靶向受体(LTR)结合。
3.如权利要求1所述的核酸嵌合体,其特征在于,所述的LTR结合域由特异性识别并结合于LTR的核酸序列构成。
4.如权利要求1所述的核酸嵌合体,其特征在于,所述的核酸适配体元件还含有除了LTR结合域之外的其他结构域。
5.如权利要求1所述的核酸嵌合体,其特征在于,所述的LTR的核酸序列包括单链核酸序列。
6.如权利要求1所述的核酸嵌合体,其特征在于,所述的核酸序列包括天然和非天然的碱基,例如选自下组的碱基:A、T、C、G、U、I、M-fC、I-fC、isoG、isoC、Ds、Pa、F、X、Y、Z、P。
7.一种组合物,其特征在于,所述组合物包括:
(i)如权利要求1所述的核酸嵌合体;
(ii)药学上可接受的载体。
8.一种制备如权利要求1所述的核酸嵌合体的方法,其特征在于,包括步骤:
(S1)提供A1、A2;
(S2)将A1和A2进行连接,从而形成式I结构的核酸嵌合体。
9.一种权利要求1所述的核酸嵌合体的用途,其特征在于,用于制备降解靶向蛋白质、核酸或脂肪的药物。
10.一种权利要求1所述的核酸嵌合体的用途,其特征在于,所述药物用于降解细胞外蛋白、细胞膜蛋白或细胞内蛋白。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011211323.7A CN114438088A (zh) | 2020-11-03 | 2020-11-03 | 一种溶酶体靶向的核酸嵌合体的制备及应用 |
PCT/CN2021/128209 WO2022095853A1 (zh) | 2020-11-03 | 2021-11-02 | 一种溶酶体靶向的核酸嵌合体的制备及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011211323.7A CN114438088A (zh) | 2020-11-03 | 2020-11-03 | 一种溶酶体靶向的核酸嵌合体的制备及应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114438088A true CN114438088A (zh) | 2022-05-06 |
Family
ID=81361274
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011211323.7A Pending CN114438088A (zh) | 2020-11-03 | 2020-11-03 | 一种溶酶体靶向的核酸嵌合体的制备及应用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114438088A (zh) |
WO (1) | WO2022095853A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024003300A1 (en) * | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Aptadegrad, S.L. | Dna aptamer conjugates recognizing and degrading coronavirus proteins |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20170304432A1 (en) * | 2014-06-23 | 2017-10-26 | Immunomic Therapeutics, Inc. | Nucleic acids for treatment of peanut allergies |
WO2020132100A1 (en) * | 2018-12-19 | 2020-06-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Bifunctional molecules for lysosomal targeting and related compositions and methods |
-
2020
- 2020-11-03 CN CN202011211323.7A patent/CN114438088A/zh active Pending
-
2021
- 2021-11-02 WO PCT/CN2021/128209 patent/WO2022095853A1/zh active Application Filing
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20170304432A1 (en) * | 2014-06-23 | 2017-10-26 | Immunomic Therapeutics, Inc. | Nucleic acids for treatment of peanut allergies |
WO2020132100A1 (en) * | 2018-12-19 | 2020-06-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Bifunctional molecules for lysosomal targeting and related compositions and methods |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2022095853A1 (zh) | 2022-05-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102666879B (zh) | 模板化的纳米缀合物 | |
US20220143062A1 (en) | Circular polyribonucleotides and pharmaceutical compositions thereof | |
DE60310944T3 (de) | Weitere neue formen von interferierende rns moleküle | |
JP2021533200A (ja) | 顔面・肩甲・上腕筋ジストロフィーを処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用 | |
KR20210081323A (ko) | 근육 표적화 복합체 및 근긴장성 이영양증을 치료하기 위한 그의 용도 | |
US20110110960A1 (en) | Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells | |
JP2021532195A (ja) | 筋萎縮の処置における筋標的化複合体およびそれらの使用 | |
JP2021533197A (ja) | ポンペ病を処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用 | |
JP6060178B2 (ja) | 高効率のナノ粒子型二本鎖オリゴrna構造体およびその製造方法 | |
KR20220125801A (ko) | 근육 표적화 복합체 및 안면견갑상완 근육 이영양증을 치료하기 위한 그의 용도 | |
KR20230046297A (ko) | 근육 표적화 복합체 및 안면견갑상완 근육 이영양증을 치료하기 위한 그의 용도 | |
US20120122801A1 (en) | Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells | |
JP5906508B2 (ja) | Rna干渉効果が高い2本鎖脂質修飾rna | |
KR20210086600A (ko) | 근육 표적화 복합체 및 진행성 골화성 섬유이형성증을 치료하기 위한 그의 용도 | |
JP2021532832A (ja) | フリートライヒ運動失調症を処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用 | |
CN107548401A (zh) | 用于细胞内递送分子的肽和纳米颗粒 | |
CN110446506B (zh) | 纳米脂质体-微泡缀合物及包含其的用于改善或治疗毛发脱落的组合物 | |
Taskova et al. | Synthetic nucleic acid analogues in gene therapy: an update for peptide–oligonucleotide conjugates | |
CN105705638A (zh) | 改善的具有高效能的纳米颗粒型寡核苷酸结构及其制备方法 | |
US20230061936A1 (en) | Methods of dosing circular polyribonucleotides | |
KR101223484B1 (ko) | 사람 혈청 알부민-siRNA 나노입자 전달체 | |
US9790498B2 (en) | Phase changing formulations of nucleic acid payloads | |
CN114438088A (zh) | 一种溶酶体靶向的核酸嵌合体的制备及应用 | |
KR20210093851A (ko) | 표적과의 상보적 상호 작용을 통해 유전자 발현을 조절하는 다수의 올리고뉴클레오티드로 구성된 다중-표적화 핵산 구조체 | |
JP5252622B2 (ja) | 高いヌクレアーゼ耐性と優れたrna干渉効果を発現可能な二本鎖rna |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |