CN113491773A

CN113491773A - 一种青蒿素衍生物核酸适体药物偶联物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN113491773A
Application number: CN202010258662.4A
Authority: CN
Inventors: 谭蔚泓; 王雪强; 李颖颖
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2021-10-12
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: CN113491773B

Abstract

本发明涉及药物领域，特别是涉及一种青蒿素衍生物核酸适体药物偶联物及其制备方法和用途。本发明提供一种核酸适体药物偶联物，包括青蒿琥酯基团和核酸适体片段，所述核酸适体片段的多核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。本发明所提供的核酸适体药物偶联物不仅药物整体上具有良好的水溶性和靶向性，并且在细胞实验中表现出优越的细胞毒性，可以特异性地高效杀伤PTK7高表达的细胞，具有靶向PTK7高表达的肿瘤细胞的能力，从而可以实现高效的肿瘤靶向治疗，具有良好的产业化前景。

Description

一种青蒿素衍生物核酸适体药物偶联物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及药物领域，特别是涉及一种青蒿素衍生物核酸适体药物偶联物及其制备方法和用途。

背景技术

1973年，中国科学家屠呦呦首次从黄花蒿中分离提取得到了一种治疗疟疾的有效成分，并将其命名为“青蒿素”。在疟疾的治疗中，青蒿素价格低廉，高效且低毒，挽救了成千上万患者的生命。但是，青蒿素水溶性差、生物利用度低，目前已开发了多种青蒿素衍生物，比如双氢青蒿素(DHA)、蒿乙醚(ARE)、蒿甲醚(ARM)和青蒿琥酯(ART)等。青蒿素及其衍生物都属于新型倍半萜内酯化合物，结构中均含有过氧桥结构，化学结构式具体如下：

近年来，科学研究表明青蒿素具有抗肿瘤、抗真菌和免疫调节等功能。青蒿素的抗癌活性吸引了科学家的广泛关注。青蒿素对肝癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞等多种肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。经研究表明，青蒿素及其衍生物的抗疟性和抗肿瘤的作用机制相同，即通过青蒿素分子结构中的过氧桥断裂产生的自由基来实现抗癌和抗疟。它还可以通过阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管形成、调节肿瘤相关基因的表达以及损伤细胞线粒体等作用机制而实现抗肿瘤作用。

由于青蒿素及其单体类似物对癌细胞的毒性相对较低、半衰期较短，一般不足以保证杀死癌细胞。为了提高青蒿素及其衍生物的毒性，科学家做出了许多尝试，比如合成青蒿素二聚体或三聚体，把青蒿素串联到癌细胞靶向小分子中等措施。到目前为止，各种青蒿素及其衍生物对癌细胞的IC50仍旧停留在uM级别，远未达临床使用的抗癌药物的nM级别。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种青蒿素衍生物核酸适体药物偶联物及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种核酸适体药物偶联物，包括青蒿琥酯基团和核酸适体片段，所述核酸适体片段的多核苷酸序列包括如SEQ IDNO.1所示的序列。

在本发明一些实施方式中，所述青蒿琥酯基团的化学结构式如下所示：

在本发明一些实施方式中，所述核酸适体片段由5’端被-NH₂修饰的核酸片段形成。

在本发明一些实施方式中，所述青蒿琥酯基团和核酸适体片段5’端之间通过酰胺键连接。

在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体片段的化学结构式如下所示：

在本发明一些实施方式中，所述核酸适体药物偶联物的化学结构式如下所示：

本发明另一方面提供上述的核酸适体药物偶联物的制备方法，包括：将青蒿琥酯分子与核酸片段连接，以提供所述的核酸适体药物偶联物。

在本发明一些实施方式中，所述制备方法具体包括：将青蒿琥酯分子与5’端-NH₂修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适体药物偶联物。

本发明另一方面提供上述的核酸适体药物偶联物在制备药物中的用途。

在本发明一些实施方式中，所述药物选自用于治疗PTK7高表达的相关疾病的药物。

附图说明

图1显示为本发明实施例2、实施例3、实施例4、实施例5中核酸适体连接示意图。

图2显示为本发明实施例2中青蒿琥酯-核酸适体药物偶联物高效液相色谱色谱纯化示意图。

图3显示为本发明实施例2中青蒿琥酯-核酸适体药物偶联物质谱鉴定图。

图4显示为本发明实验案例3中青蒿琥酯-核酸适体对照序列药物偶联物高效液相色谱色谱纯化示意图。

图5显示为本发明实验案例3中青蒿琥酯-核酸适体对照序列药物偶联物质谱鉴定图。

图6显示为本发明实验案例4中青蒿琥酯-核酸适体(Cy5荧光标记)药物偶联物高效液相色谱色谱纯化示意图。

图7显示为本发明实验案例4中青蒿琥酯-核酸适体(Cy5荧光标记)药物偶联物质谱鉴定图。

图8显示为本发明实验案例5中青蒿琥酯-核酸适体对照序列(Cy5荧光标记)药物偶联物高效液相色谱色谱纯化示意图。

图9显示为本发明实验案例5中青蒿琥酯-核酸适体对照序列(Cy5荧光标记)药物偶联物质谱鉴定图。

图10显示为本发明实施例6中青蒿琥酯-核酸适体药物偶联物肿瘤细胞特异性靶向实验结果示意图。

图11显示为本发明实施例7中青蒿琥酯-核酸适体药物偶联物的小鼠肿瘤靶向性实验结果示意图；其中，(a)为ASC在HCT119模型中的动态成像示意图；(b)为小鼠主要器官解剖成像示意图。

图12显示为本发明实施例8中细胞毒性实验实验结果示意图。

图13显示为本发明实施例9中血清稳定性实验结果示意图。

具体实施方式

本发明发明人经过大量实践研究后意外地发现，将青蒿琥酯基团与合适的核酸适体片段进行组合以获得核酸适体药物偶联物，不仅使药物整体上具有良好的水溶性和靶向性，并且在细胞实验中表现出优越的细胞毒性，在此基础上完成了本发明。

本发明第一方面提供一种核酸适体药物偶联物，包括青蒿琥酯基团和核酸适体片段，所述核酸适体片段的多核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。通过细胞毒性实验可知，通过青蒿琥酯基团和包括上述序列的核酸适体片段所形成的药物偶联物，相对于未连接核酸适体的青蒿琥酯和通过其他连接片段连接的核酸适体药物偶联物具有更佳的靶向性，且具有更强的肿瘤细胞杀伤能力，其对于肿瘤细胞的IC₅₀可以达到nM级别。

本发明所提供的核酸适体药物偶联物，可以包括青蒿琥酯基团，所述青蒿琥酯基团通常可以由其对应的青蒿琥酯分子所形成。所述青蒿琥酯分子通常通过羧基与修饰有氨基的核酸适体连接，所述青蒿琥酯基团的化学结构式具体可以如下所示：

用于形成青蒿琥酯基团的青蒿琥酯分子的化学结构式具体可以如下所示：

本发明所提供的核酸适体药物偶联物中，可以包括核酸适体片段，所述核酸适体片段通常由合适的核酸片段形成，核酸适体片段的选择决很大程度上决定了所述核酸适体药物偶联物的靶向性，也很大程度上决定了核酸适体药物偶联物整体上的稳定性。所述核酸适体片段的多核苷酸序列可以包括如SEQ ID NO.1所示的序列，从本发明的相关实施例中可以发现，本发明所提供的核酸适体药物偶联物(ASC)整体上具有很好的稳定性，在培养基和血清中，均可以具有较低的降解速度。所述核酸适体片段通常靶向于其所对应的蛋白，例如，靶标蛋白可以是肿瘤细胞表面高表达的PTK7蛋白。所述核酸适体片段通常可以由5’端被-NH₂修饰的核酸片段形成，从而可以使青蒿琥酯基团和核酸适体片段5’端之间通过酰胺键连接，具体可以是结构式如下所示的基团：

在本发明一优选实施方式中，可以使用DNA固相合成的方法将C6氨基亚磷酰胺单体修饰在核酸片段的5’端，以获得5’端被-NH₂修饰的核酸片段，所述C6氨基亚磷酰胺单体的化学结构式如下所示：

上述合成方法中，核酸片段5’端糖环上的羟基可以与C6氨基亚磷酰胺单体交联，反应方程式如下所示：

其中，五元杂环支链上的-CH₂-连接的曲线部分表示核酸片段的剩余部分，实心圆表示固相支持物CPG。DNA磷酸骨架上进行了氨基修饰，制备获得的产物脱去保护基团，即可获得5’端被-NH₂修饰的核酸片段，进一步通过该-NH₂基团与青蒿琥酯分子连接，可以获得结构式如下所示的核酸适配体片段：

在本发明一优选实施例中，核酸适体药物偶联物的化学结构式如下所示：

其中，-NH-及其所连接的曲线部分为核酸适配体片段。

本发明第二方面提供本发明第一方面所提供的核酸适体药物偶联物的制备方法，包括：将青蒿琥酯分子与核酸片段连接，以提供所述的核酸适体药物偶联物。所述核酸片段可以是5’端修饰有-NH₂的核酸片段，对核酸片段进行-NH₂修饰的方法具体可以参照如上所给出的文献。

本发明所提供的核酸适体药物偶联物的制备方法中，将青蒿琥酯分子与5’端-NH₂修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适体药物偶联物。将青蒿琥酯分子与5’端-NH₂修饰的核酸片段反应的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以将青蒿琥酯分子与5’端-NH₂修饰的核酸片段充分混合；再例如，所述反应通常可以在合适的反应溶剂存在的条件下进行，具体可以是磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)、DMSO等；再例如，反应前还可以对青蒿琥酯分子的羧基进行活化，对青蒿琥酯分子的羧基进行活化的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，具体可以使用NHS/DCC体系等；再例如，反应通常可以在室温或加热的条件下进行，具体可以是在35～40℃的温度条件下进行。

本发明第三方面提供本发明第一方面所提供的核酸适体药物偶联物在制备药物中的用途。所述药物具体可以是用于治疗PTK7高表达的相关疾病，比如急性淋巴细胞白血病,人结直肠癌等。本发明所提供的核酸适体药物偶联物对于靶标细胞(例如，PTK7高表达细胞，具体可以是肿瘤细胞，更具体可以是白血病细胞、结肠癌细胞等)具有良好的特异性和靶向性，核酸适体药物偶联物在肿瘤部位更加富集，可以高效地靶向靶标。此外，本发明所提供的核酸适体药物偶联物具有显著提高的肿瘤细胞毒性，对靶标细胞具有更高的杀伤能力，对于肿瘤细胞的IC₅₀可以达到nM级别(IC₅₀≤100nM)，从而可以用于制备用于治疗肿瘤的药物。

本发明所提供的核酸适体药物偶联物不仅药物整体上具有良好的水溶性和靶向性，并且在细胞实验中表现出优越的细胞毒性，可以特异性地高效杀伤PTK7高表达的细胞，具有靶向PTK7高表达的肿瘤细胞的能力，从而可以实现高效的肿瘤靶向治疗，具有良好的产业化前景。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1

(1)首先合成氨基修饰以及氨基和Cy5双修饰的sgc8c和sgc8c control(对照序列)，该序列参照固相合成方法在DNA合成仪(德国POLYGEN 12柱DNA合成仪，产品型号：Polygen 12)上合成，C6氨基亚磷酰胺单体购自glen research，10-1906。DNA合成仪获得氨修饰的核酸适体，经2.5倍冰乙醇，1/10体积0.3M氯化钠沉淀离心，反相HPLC纯化，经过80％醋酸室温处理脱DMT保护，冷冻离心机冻干后，PBS溶解，紫外分光光度计定量，-20℃保存备用。序列详细信息如表1所示：

表1

实施例2

(1)将1000nmol的青蒿琥酯，DCC(1000nmol)和NHS(2500nmol)溶解于1mL DMSO中，室温下活化1小时。将100nmol氨基修饰的sgc8c溶解于1ml PB缓冲液中(pH＝8.0)充分混匀待DNA溶解，DNA和药物的摩尔比例为1:10。将两者在室温下充分混匀，放置于37℃摇床中，转速150r/min，反应过夜(12-16h)，连接示意图如图1所示。

(2)取出，在冷冻离心机中冻干成冻干粉，用0.1M TEAA流动相溶解粉末，0.45微米滤芯过滤，HPLC纯化获得产物，偶联物的高效液相色谱色谱纯化图如图2所示，产物冻干后，一部分样品送质谱检测，质谱检测结果如图3所示。

(3)冻干的产物用水溶解，脱盐，冻干，用水或PBS溶解后经紫外分光光度计测定浓度，-20℃保存备用。将此样品命名为ASC。

实施例3

(1)将1000nmol的青蒿琥酯，DCC(1000nmol)和NHS(2500nmol)溶解于1mL DMSO中，室温下活化1小时。将100nmol的氨基修饰的对照序列sgc8c control溶解于1ml PB缓冲液中磷酸盐缓冲液中(pH＝8.0)充分混匀待DNA溶解(。DNA和药物的摩尔比例为1:10。将两者在室温下充分混匀，放置于37℃搅拌并反应12-24小时。

(2)取出样品，在冷冻离心机中冻干成冻干粉，用0.1M TEAA流动相溶解粉末，0.45微米滤芯过滤，HPLC纯化获得产物，高效液相色谱色谱纯化图如图4所示，产物冻干后，一部分样品送质谱检测，质谱检测结果如图5所示。

(3)冻干的产物用水溶解，脱盐，冻干，用水或PBS溶解后经紫外分光光度计测定浓度，-20℃保存备用。将此样品命名为ACC。

实施例4

(1)将1000nmol的青蒿琥酯，DCC(1000nmol)和NHS(2500nmol)溶解于1mL DMSO中，室温下活化1小时。将20nmol的氨基和Cy5双修饰的sgc8c，溶解于200μL PB buffer中(pH＝8.0)充分混匀待DNA溶解。DNA和药物的摩尔比例为1:10。将两者在室温下充分混匀，放置于37℃摇床中，转速150r/min，反应12-16h。

(2)取出，在冷冻离心机中冻干成冻干粉，用0.1M TEAA流动相溶解粉末，0.45微米滤芯过滤，HPLC纯化获得产物，高效液相色谱色谱纯化图如图6所示，产物冻干后，一部分样品送质谱检测，质谱检测结果如图7所示。

(3)冻干的产物用水溶解，脱盐，冻干，用水或PBS溶解后经紫外分光光度计测定浓度，-20℃避光保存备用。将此样品命名为ASC-cy5。

实施例5

(1)将1000nmol的青蒿琥酯，DCC(1000nmol)和NHS(2500nmol)溶解于1mL DMSO中，室温下活化1小时。将20nmol的氨基和Cy5双修饰的对照序列sgc8c control，溶解于200μLPB buffer中(PH＝8.0)充分混匀待DNA溶解。DNA和药物的摩尔比例为1:10。将两者在室温下充分混匀，放置于37℃摇床中，转速150r/min，反应12-16h。

(2)取出，在冷冻离心机中冻干成冻干粉，用0.1M TEAA流动相溶解粉末，0.45微米滤芯过滤，HPLC纯化获得产物，高效液相色谱色谱纯化图如图8所示，产物冻干后，一部分样品送质谱检测，质谱检测结果如图9所示。

(3)冻干的产物用水溶解，脱盐，冻干，用水或PBS溶解后经紫外分光光度计测定浓度，-20℃避光保存备用。将此样品命名为ACC-cy5。

实施例6

荧光标记的ASC对PTK7表达细胞的靶向性评价：

取指数增长期的CEM细胞(阳性对照)和Ramos细胞(阴性对照)，PBS洗涤一次，收集，1000rpm离心5min，用结合缓冲液重悬。250nM Cy5标记的ASC核酸适体(实施例4制备获得ASC-cy5)、Cy5标记的ACC核酸适体(实施例5制备获得ACC-cy5)、Cy5-sgc8c(即实施例2中合成的氨基和Cy5双修饰的适配体)、Cy5-sgc8c control(即实施例3中合成的氨基和cy5双修饰的适配体)，分别溶解在结合缓冲液中，并分别与两个细胞系(1X10⁵个细胞)在冰上孵育45min之后，用洗涤缓冲液洗两次后，流式细胞仪检测荧光的偏移。如图10所示，其中，红色峰表示细胞背景荧光，蓝色峰表示Cy5-sgc8c，橘黄色峰表示Cy5-sgc8c control，浅绿色峰表示ACC，深绿色峰表示ASC，对于PTK7高标的CEM细胞株而言，Cy5标记的ASC和Cy5标记sgc8c的核酸适体一样有明显的荧光位移，而对照序列sgc8c control及对照序列偶联药物ACC无明显荧光偏移，在阴性细胞Ramos中，所有序列都不结合，荧光没有变化。

实施例7

荧光标记的ASC对PTK7表达荷瘤鼠的体内靶向性评价：

5-8周大小的BLB/c雌性裸鼠，在动物伦理规定的环境中饲养三天后，HCT116人结直肠癌细胞和K562人慢性髓原白血病细胞以7*10⁶个/100ul的密度的接种于小鼠右侧背部皮下，等待15天之后，当肿瘤大小在300-600立方毫米的时候，通过尾静脉注射向HCT116人结直肠癌荷瘤裸鼠以及K562人慢性髓原白血病细胞荷瘤裸鼠注射Cy5标记的ASC或ACC(50μM，分别由实施例3和实施例4制备获得的ASC-Cy5和ACC-Cy5)，每一只裸鼠注射体积为100μL，在30min、100min、180min、300min、500min、600min等不同时间点进行小动物活体成像观察荧光药物在肿瘤部位富集点情况，10h之后，小鼠安乐死，取出肿瘤及主要器官，对小鼠器官荧光成像。用最后一次的荧光参数为参照调整所有时间点的光值，进行对比，结果如图11所示。由图11(a)可知，ASC在HCT119模型中的动态成像，随着时间的推移，HCT116肿瘤部位的荧光富集，而对照药物注射的裸鼠肿瘤部位及阴性细胞K562裸鼠肿瘤部位没有观察到荧光，10小时之后，仍能观察到ASC药物的荧光，解剖小鼠后，如图11(b)所示，主要器官成像表明，肿瘤部位荧光明显能观察到。

实施例8

ASC对PTK7表达细胞的靶向杀伤：

将待测细胞(CEM细胞、HCT116细胞、HepG2细胞和LO2细胞)分别以5000个每孔的密度种在96孔板种，培养过夜。ASC(实施例1制备获得)以及对照药物(artesunate、ACC)分别用1640完全培养基(含10％FBS)等比稀释，每个药物设置8-9个浓度，每个浓度设置6个复孔。去除培养基，将配置好的药物加入细胞板，每孔100uL，72小时之后，去除培养基，之后用CCK8试剂盒(bimake，B34304)检测450nm的OD值，并进一步计算出细胞活性比例，用graphpad曲线模拟计算出IC₅₀值。图12表示PTK7表达水平不同的细胞株，CEM、HCT116是高表达的阳性细胞，HepG2细胞是阴性细胞，LO2是正常人肝细胞系。其中ASC在CEM和HCT116细胞的IC50分别为31.25nM和62.50nM，对其他对照细胞系的细胞毒性IC50大于1000nM。

实施例9

ASC血清稳定性实验：

终浓度为2μmol/L的DNA样品包括核酸适体(实施例1制备获得)、ASC(实施例2制备获得)与含有10％的1640培养基或10％小鼠血清(90％DPBS)孵育，条件为37℃摇床中，转速150r/min，孵育时间分别为0、2、4、8、12、24、36小时，每个时间点取样10uL，经95℃加热10min使酶失活，放置在-20℃。样品收集完毕后，

配置3％的琼脂糖凝胶，通过DNA电泳分离，用凝胶成像仪成像并分析鉴定样品是否降解。结果如图13所示，ASC的稳定性略强于单独的核酸适体。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 湖南大学

<120> 一种青蒿素衍生物核酸适体药物偶联物及其制备方法和用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atctaactga ttattattat tattattatt attcggttag a 41

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atctaactga ttattattat tattattatt attcggtt 38

Claims

1.一种核酸适体药物偶联物，包括青蒿琥酯基团和核酸适体片段，所述核酸适体片段的多核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。

2.如权利要求1所述的核酸适体药物偶联物，其特征在于，所述青蒿琥酯基团的化学结构式如下所示：

3.如权利要求1所述的核酸适体药物偶联物，其特征在于，所述核酸适体片段由5’端被-NH₂修饰的核酸片段形成。

4.如权利要求1所述的核酸适体药物偶联物，其特征在于，所述青蒿琥酯基团和核酸适体片段5’端之间通过酰胺键连接。

5.如权利要求1所述的核酸适体药物偶联物，其特征在于，所述核酸适配体片段的化学结构式如下所示：

6.如权利要求1所述的核酸适体药物偶联物，其特征在于，所述核酸适体药物偶联物的化学结构式如下所示：

7.如权利要求1～6任一权利要求所述的核酸适体药物偶联物的制备方法，包括：将青蒿琥酯分子与核酸片段连接，以提供所述的核酸适体药物偶联物。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括：将青蒿琥酯分子与5’端-NH₂修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适体药物偶联物。

9.如权利要求1～6任一权利要求所述的核酸适体药物偶联物在制备药物中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述药物选自用于治疗PTK7高表达的相关疾病的药物。