CN105727304A - 核酸偶联物、其制备方法及其应用 - Google Patents

核酸偶联物、其制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105727304A
CN105727304A CN201610083905.9A CN201610083905A CN105727304A CN 105727304 A CN105727304 A CN 105727304A CN 201610083905 A CN201610083905 A CN 201610083905A CN 105727304 A CN105727304 A CN 105727304A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
seq
serial
sirna
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610083905.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105727304B (zh
Inventor
杨志民
贺慧宁
叶俊晓
王建新
黄永焯
龚俊波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Medical University
Original Assignee
Tianjin Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Medical University filed Critical Tianjin Medical University
Priority to CN201610083905.9A priority Critical patent/CN105727304B/zh
Publication of CN105727304A publication Critical patent/CN105727304A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105727304B publication Critical patent/CN105727304B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种核酸偶联物、其制备方法及其应用。该核酸偶联物的分子式为X?Y?B，其中，X为穿膜肽，Y是与X共价连接的柔性链段，B是与Y共价连接的核酸药物。该核酸偶联物通过利用柔性链段来连接核酸药物和穿膜肽，由于柔性链段能够在物理空间上间隔核酸药物和穿膜肽，阻止强电负性的核酸药物与呈正电性的穿膜肽之间相互吸引形成发夹结构，从而避免了核酸药物与穿膜肽间因静电作用而发生聚集沉淀的问题，使得核酸药物进入细胞后能够在细胞质或细胞核内发挥其生物活性，提高其生物利用度。

Description

核酸偶联物、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及药物制剂与临床药学领域，具体而言，涉及一种核酸偶联物、其制备方法及其应用。
背景技术
世界癌症报告Globocan2013的数据显示，我国每年新发癌症病例282万例，因癌症死亡病例196万例，预计到2020年，每年新发和死亡癌症病例将达到388万例和276万例。恶性肿瘤的治疗始终是医药学领域研究的热点与难点。随着生命科学的飞速发展，科技的不断进步，人们对生命体的认识越来越深入，通过对各类疑难杂症在基因水平上进行治疗使医学发生了革命性的变化，给患者带来福音。基因治疗作为一种新兴的治疗手段，己经成为当今医药学领域研究的前沿。
当前，RNA干扰技术已经被广泛用于肿瘤、病毒感染、乙型肝炎以及肿瘤等多种疾病的治疗。作为RNA诱导沉默复合体的主要成员，siRNA是RNA干扰的效应分子，可在体内诱导进而产生RNA干扰效应，激发与之互补的目标mRNA沉默。但是裸siRNA在体内容易被核酶(RNase)所降解，且半衰期短，转染效率低。因此，如何解决裸siRNA在体内的稳定性问题使之免受核糖核酸酶降解，显得尤其重要。另外，siRNA需要借助载体才能进入细胞发挥治疗作用，因此设计开发转染效率高的siRNA传送体系，以提高siRNA的入胞能力同样非常重要。
细胞穿透肽(Cell Penetrating Peptides，CPPs，又称穿膜肽)的发现为克服细胞膜屏障带来了希望。它是一大类由10～30个氨基酸组成的短肽，也称为蛋白质转导域或“特洛伊木马”肽或转导肽等。这些肽分子不会产生细胞膜永久性损伤，并且毒性低。到目前为止，已发现了多种穿膜肽，它们共有的性质：①具有净正电荷性和两亲性；②穿膜转运效率高；③可以导入近乎所有的细胞；④可以携带多种活性物质进入细胞；⑤可以通过固相合成或原核表达制备，方法成熟简便。当前穿膜肽介导的核酸类药物递送的方法可以分为两种：一是通过穿膜肽表面的正电荷与核酸表面的负电荷之间的静电相互作用，形成穿膜肽与核酸类药物的物理共混物。二是通过共价键使穿膜肽与核酸类药物形成小型、单体的穿膜肽-siRNA共价偶联物。
第一种方法是一种将siRNA通过静电作用与穿膜肽结合简单有效的方法，需要过量的穿膜肽才能与siRNA形成穿膜肽/siRNA复合物。如在形成寡聚精氨酸/siRNA复合物时，精氨酸肽段和siRNA的混合比例为电荷12∶1，摩尔比为56∶1；使用MPG肽段时，电荷比为10∶1，摩尔比是84∶1。但采用非共价结合的复合物时，大量的阳离子穿膜肽可能与细胞中负电分子发生非特异性的相互作用或者将胞外的负电分子带入胞内而引起副作用。
第二种方法是目前认为传递siRNA最有潜力的方法，可得到可溶性单体的siRNA偶联物。但是，由于带有正电的细胞穿膜肽与带有负电的siRNA易于凝结使得这种方法难以利用，如何避免两者之间通过静电作用形成非共价的复合物是合成的关键。目前应用比较广泛的是二硫键和硫酯键。由于穿膜肽的核定位特性和RNA诱导沉默复合体机制的细胞质定位特性，使得连接穿膜肽与siRNA分子的共价键在细胞环境内必须是可逆的。而以二硫键共价连接形成的偶联物在细胞基质内可被分解，释放出连接物。因而使用穿膜肽与siRNA所形成的特定的二硫共价键偶联物，是最佳的穿膜肽介导siRNA递送的方式。二硫键可由穿膜肽上的甘氨酸和外源物质的巯基来形成，一些不含有巯基的外源物质则可使用化学修饰来添加巯基，形成二硫键。
虽然通过共价偶联siRNA是递送siRNA的最佳方式，但目前只有极少数描述siRNA与穿膜肽通过二硫键共价偶联的报道。而在已有的报道中，siRNA与穿膜肽两者间因静电作用发生聚集、沉淀的问题也未得到较好的解决。因此，如何有效解决上述技术问题成了诸如siRNA之类的核酸药物传递研究中的当务之急。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种核酸偶联物、其制备方法及其应用，以解决现有技术中核酸类药物在细胞内容易聚集发生沉淀的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种核酸偶联物，该核酸偶联物的分子式为X-Y-B，其中，X为穿膜肽，Y是与X共价连接的柔性链段，B是与Y共价连接的核酸药物。
进一步地，柔性链段是由中性聚合物形成的线性结构的链段。
进一步地，柔性链段由聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯以及聚丙烯酰胺中的任意一种中性聚合物形成。
进一步地，中性聚合物的分子量为1000～10000，更优选为2000～5000。
进一步地，B与Y共价连接的共价键包括二硫键、腙键、酰胺键、酯键或醚键。
进一步地，穿膜肽选自如下任意一种：序列号为SEQ ID NO:1的LMWP、序列号为SEQID NO:2的Tat48-60、序列号为SEQ ID NO:3的Tat48-60-P10、序列号为SEQ ID NO:4的CAI、序列号为SEQ ID NO:5的HIV-TAT、序列号为SEQ ID NO:6的MAP、序列号为SEQ ID NO:7的MPGα、序列号为SEQ ID NO:8的M918、序列号为SEQ ID NO:9的R6Pen、序列号为SEQ ID NO:10的penetratin、序列号为SEQ ID NO:11的Pep-1-K、序列号为SEQ ID NO:12的ARF1-22、序列号为SEQ ID NO:13的Tp10、序列号为SEQ ID NO:14的POD、3～100个赖氨酸残基组成的聚赖氨酸以及4～9个精氨酸残基组成的聚精氨酸；优选聚精氨酸为8个精氨酸组成的聚精氨酸R8。
进一步地，核酸药物包括核苷酸单体或寡聚核苷酸，优选寡聚核苷酸为非取代的寡核苷酸或取代的寡核苷酸，取代的寡核苷酸为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，非取代的寡核苷酸选自锁核酸、siRNA、microRNA、核酸适体、肽核酸、诱骗ODN、催化性RNA以及CpG二核苷酸中的任意一种；更优选寡聚核苷酸为长度为19～23bp的siRNA。
进一步地，19～23bp的siRNA为SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:172中的任意一种。
进一步地，核酸偶联物的给药途径为静脉注射、皮下注射、黏膜给药或者经皮给药；黏膜给药包括鼻腔黏膜、口腔黏膜、直肠黏膜和阴道黏膜中的任意一种。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种上述核酸偶联物的制备方法，制备方法包括：穿膜肽的活化步骤，将穿膜肽的N端或C端特异性地与中性聚合物进行共价结合，得到活化的穿膜肽；核酸药物的活化步骤，在核酸药物反义链的3’端或者正义链的任意一端引入不同于磷酸基团或羟基基团的反应活性基团，得到活化的核酸药物；以及共价连接步骤，活化的穿膜肽与活化的核酸药物通过亲核反应或亲电加成反应得到核酸偶联物。
进一步地，中性聚合物为包括聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯以及聚丙烯酰胺；优选中性聚合物的分子量为1000～10000，更优选为2000～5000。
进一步地，反应活性基团包括氨基、巯基、羧基、马来酰亚胺基和N-羟基琥珀酰亚胺基中的任意一种。
进一步地，穿膜肽选自如下任意一种：序列号为SEQ ID NO:1的LMWP、序列号为SEQID NO:2的Tat48-60、序列号为SEQ ID NO:3的Tat48-60-P10、序列号为SEQ ID NO:4的CAI、序列号为SEQ ID NO:5的HIV-TAT、序列号为SEQ ID NO:6的MAP、序列号为SEQ ID NO:7的MPGα、序列号为SEQ ID NO:8的M918、序列号为SEQ ID NO:9的R6Pen、序列号为SEQ ID NO:10的penetratin、序列号为SEQ ID NO:11的Pep-1-K、序列号为SEQ ID NO:12的ARF1-22、序列号为SEQ ID NO:13的Tp10、序列号为SEQ ID NO:14的POD、3-100个赖氨酸残基组成的聚赖氨酸以及4～9个精氨酸残基组成的聚精氨酸；优选聚精氨酸为8个精氨酸残基组成的聚精氨酸R8。
进一步地，核酸药物包括核苷酸单体或寡聚核苷酸，优选寡聚核苷酸为非取代的寡核苷酸或取代的寡核苷酸，取代的寡核苷酸为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，非取代的寡核苷酸选自锁核酸、siRNA、mircoRNA、核酸适体、肽核酸、诱骗ODN、催化性RNA以及CpG二核苷酸中的任意一种；更优选寡聚核苷酸为长度为19～23bp的siRNA。
进一步地，19-23bp的siRNA为SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:172中的任意一种。
根据本发明的另一方面，提供了一种上述任一种核酸偶联物在体外筛选药物中的应用。
应用本发明的技术方案，核酸偶联物通过柔性链段连接核酸药物和穿膜肽，柔性链段能够在物理空间上间隔核酸药物和穿膜肽，进而阻止强电负性的核酸药物与呈正电性的穿膜肽之间相互吸引形成发夹结构，从而避免了核酸药物与穿膜肽间因静电作用而发生聚集沉淀的问题，使得核酸药物进入细胞后能够在细胞质或细胞核内发挥其生物活性，提高其生物利用度。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了本发明的核酸偶联物CPP-PEG-siRNA的结构示意图；
图2示出了本发明的一种优选实施例中核酸偶联物的合成路线图；
图3示出了本发明一种优选实施例中所制备的核酸偶联物LMWP-PEG-S-S-siRNA的琼脂糖凝胶电泳结果，泳道1为核酸标准物(Marker)，泳道2为siRNA，泳道3为LMWP-PEG，泳道4为LMWP-PEG-S-S-siRNA，泳道5为siRNA的二聚体，泳道6为LMWP-PEG-S-S-siRNA用谷胱甘肽还原后的siRNA；
图4A至图4E示出了本发明一种优选实施例中所制备的核酸偶联物LMWP-PEG-S-S-siRNA的质谱表征结果；其中，图4A示出了LMWP的分子量；图4B示出了NHS-PEG-Mal的分子量分布；图4C示出了LMWP与PEG共价偶联后形成的LMWP-PEG分子量分布；图4D示出了MOE的分子量；图4E示出了LMWP-PEG-S-S-MOE的分子量分布；
图5A示出了本发明一种优选实施例中所制备的核酸偶联物LMWP-PEG-S-S-siRNA与现有技术制备的药物经激光扫描共聚焦显微镜(Confocol)观察到的在MDA-MB-231细胞中的摄取比对情况；其中，1代表PBS缓冲液的空白对照组；2代表不含有任何转染试剂的裸siRNA组；3代表脂质体包裹的siRNA复合体；4代表LMWP-PEG与siRNA按摩尔比1：1混合的物理共混物；5代表LMWP与siRNA按摩尔比1：1混合的物理共混物；6代表偶联物LMWP-PEG-S-S-siRNA；
图5B示出了一种优选实施例中所制备的核酸偶联物LMWP-PEG-S-S-MOE与现有技术制备的药物经Confocol观察到的在MDA-MB-231细胞中的摄取比对情况；其中，1代表PBS缓冲液的空白对照组；2代表不含任何转染试剂的裸MOE组；3代表脂质体包裹的MOE复合体；4代表LMWP与MOE按摩尔比1：1混合的物理共混物；5代表LMWP-PEG-S-S-MOE；
图6A和图6B显示了两种不同的核酸偶联物可以在不同的目的位置发挥作用；图6A示出了细胞对两种不同的核酸偶联物的摄取能力无明显区别，均很强；图6B示出了两种不同的核酸偶联物中，可以在胞质内发生降解的共价键诸如二硫键共价偶联得到的核酸偶联物多分布在胞质内；而不可以在胞质内发生降解的核酸偶联物则易聚集在细胞核中，体现出穿膜肽的趋核性；
图7A至7C示出了核酸偶联物的基因沉默能力；其中，图7A示出了利用激光共聚焦显微镜定性表征的核酸偶联物的基因沉默能力；图7B和图7C分别示出了利用FACS(流式细胞仪)、蛋白印迹法(Western-Blot)方法定性表征的核酸偶联物的基因沉默能力；
图8A示出了PEG分子量的变化趋势对穿膜肽与阳离子交换柱的结合能力的影响；以及
图8B示出了不同分子量大小的PEG与LMWP形成核酸偶联物LMWP-PEG-siRNA的影响。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
名词解释：
锁核酸：(Locked Nucleic Acid，LNA)是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O，4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸骨架局部结构的稳定性。
核酸适体：指的是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子，与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适体在生物传感器、新药开发以及纳米技术等方面有着广泛的用途。而体外筛选技术SELEX是指对随机寡核苷酸文库施加选择压力(结合靶目标)，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程。
肽核酸(PNA)：一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，是丹麦有机化学家Ole Buchardt和生物化学家Peter Nielsen于20世纪80年代开始潜心研究的一种新的核酸序列特异性试剂。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。
诱骗ODN：模拟目的基因调节区域的顺式作用元件合成的寡核苷酸，通过外源的转染将诱骗寡核苷酸加入到靶细胞中与内源的顺式作用元件形成竞争性结合，降低目的基因与内源顺式元件的作用，从而降低相关基因的表达。
催化性RNA：是有催化活性的核糖核酸，按核糖核酸催化剂的作用方式可分为剪切型(把RNA前体的多余部分切除)和剪接型(把R NA前体的内含子部分切除并把不连续的外显子部分连接起来)，因为RNA催化剂能损害编码不同蛋白质的RNA分子，核糖核酸催化剂有重要的药物和生物工程应用价值。
MOE：反义寡核苷酸2′-O-甲氧乙基(2′-O-MOE)，为杜兴肌肉萎缩症基因治疗方法提供一种候选的反义寡核苷酸药物。
中性聚合物：是指当聚合物溶解于水环境中时，该聚合物水溶液的pH值为中性的聚合物。
柔性链段：是指在水溶液中具有良好的溶解性和延展性的线性结构的高分子聚合物链段。
如背景技术部分所提到的，现有技术中，在利用穿膜肽将诸如siRNA之类的核酸药物向细胞内运送时，存在容易聚集形成沉淀而使得运送效率低或者运送效率高但核酸药物活性低等技术问题，为改善上述状况，发明人对核酸药物的胞内运送进行了深入研究，具体研究如下：
由于siRNA之类的核酸药物的强电负性与呈正电性的CPPs通过非共价结合很容易形成核酸核酸偶联物而被运到胞内，但这种运送方式需要的CPPs的量比较大，对细胞的毒性也较大。而两者通过共价结合的方式进行运送时，由于电荷作用，两者很容易相互吸引形成发夹结构，从而影响核酸药物在胞内发挥药效。因而，发明人把上述问题的解决思路集中到如下方面：如何改进共价连接的CPP-核酸核酸偶联物能够改善核酸药物在细胞质内的生物活性。
发明人做了各种尝试，试着在核酸药物与穿膜肽之间添加各种结构，以破坏或者减弱核酸药物与穿膜肽之间的作用力，最终发现当在核酸药物与穿膜肽之间共价连接一个诸如PEG(聚乙二醇)链段之类的柔性链段时，不仅具有较高的细胞穿透效率，而且被运送到细胞内的诸如siRNA之类的核酸药物的生物活性对靶标具有显著的抑制作用。由此表明，利用柔性链段将核酸药物与穿膜肽进行间隔而形成的核酸偶联物，可用于提高核酸药物的细胞膜穿透性及其在细胞内的生物利用度。
在上述研究结果的基础上，根据本发明一种典型的实施方式，发明人提出了一种核酸偶联物，如图1所示，该核酸偶联物的分子式为X-Y-B，其中，X为穿膜肽，Y是与X共价连接的柔性链段，B是与Y共价连接(共价键图1示为Z)的核酸药物。具有上述柔性链段的核酸药物不仅具有较高的细胞膜穿透率，而且能够将药物定位到细胞内的目的位置发挥生物学功能，从而使核酸药物保持较高的生物活性，提高了核酸药物的生物利用度。
上述核酸偶联物中，柔性链段能够在物理空间上间隔核酸药物和穿膜肽，进而阻止强电负性的核酸药物与呈正电性的穿膜肽之间相互吸引形成发夹结构，从而避免核酸药物进入细胞质内后形成包涵体或者聚集沉淀而抑制核酸药物在胞内的生物活性。因而，任何能够起到间隔作用的柔性链段均适用于本发明，只要能够递送核酸药物到细胞内，并且使核酸药物在胞质内的目的位置发挥相应的生物学活性即可。
在本发明一种优选的实施例中，该柔性链段为具有较弱电解能力的中性聚合物形成的线性结构的高分子链段。呈电中性能够避免所增加的柔性链段与强电负性的核酸药物相互作用而形成发夹结构影响核酸药物的活性。选择直链的柔性链段更有利于在一定程度上屏蔽穿膜肽表面的正电荷以及保持良好的分子动力学性能，同时维持核酸偶联物结构和构象上的专一性和稳定性。比较适合的柔性链段可以是常用的聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯以及聚丙烯酰胺中的任一种去除端部基团后所形成的链段。选择这些中性聚合物所形成的柔性链段具有较好分子动力学特征和对穿膜肽表面正电荷的屏蔽效果好的优点。
在上述优选实施例中，柔性链段的分子量的大小可以根据所递送的核酸药物的具体种类、穿膜肽的具体种类以及两者所带电荷的强弱差异而进行合理调整，以达到隔离电荷之间的相互作用为准。在本发明另一种优选的实施例中，柔性链段的分子量为1000～10000，更优选为2000～5000。分子量过小的物理隔离作用相对较弱，分子量过大容易对穿膜效率造成不利影响。而分子量在上述范围内的柔性链既能满足隔离穿膜肽与核酸药物之间的电荷作用，又不影响穿膜效率，因而，既能满足核酸药物被递送入细胞内，又利于核酸药物在细胞质内发挥相应的药物活性。
在本发明的上述药物中，连接核酸药物与柔性链的共价键可以根据所欲递送的核酸药物在胞内发挥药效作用的目的场所的不同而进行合理选择，只要是能够将核酸药物递送至细胞内的目的位置的共价键均适用于本发明。在本发明一种优选的实施例中，连接核酸药物与柔性链的共价键Z包括二硫键、腙键、酰胺键、酯键或醚键。其中，上述二硫键在细胞质内更容易被还原形成巯基，腙键更容易在酸性条件下水解断裂而释放核酸药物，因而使用上述两种共价键更容易在细胞质内断裂，使所携带的核酸药物在细胞质内发挥药效作用。酰胺键、酯键或醚键形成的共价键相对比较稳定，能够使核酸药物在穿膜肽的引导下穿过细胞膜后，经过细胞质进入细胞核内发挥作用。
在本发明的上述药物中，核酸药物可以是现有的各种核酸药物，包括核苷酸单体或寡聚核苷酸，优选寡聚核苷酸为非取代的寡核苷酸或取代的寡核苷酸，取代的寡核苷酸为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，非取代的寡核苷酸选自锁核酸、siRNA、microRNA、核酸适体、肽核酸、诱骗ODN、催化性RNA以及CpG二核苷酸中的任意一种；优选寡聚核苷酸为长度为19～23bp的siRNA。更优选地，这些19～23bp的siRNA选自表1和表2中SEQ ID NO:17至SEQ IDNO:172中的任意一种(序列表中所示序列为各siRNA的反义链)在临床上具有重要意义的siRNA(具体见表1)。需要说明的是，SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:172的序列中，SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:69至SEQ ID NO:72以及SEQ ID NO:102的序列3’端末尾带有一个悬垂碱基T(悬垂碱基的存在是为了促进siRNA与目标链的结合能力而进行的常规设计)，而其余的3’端末尾带有两个悬垂碱基T。
上述各种核酸药物的主体结构中都含有磷酸骨架，与蛋白质药物相比，都是电负性比较强的药物。与能够通过直接与穿膜肽共价结合而实现胞内递送且不影响药物活性的蛋白质药物相比，核酸药物无法通过同样的与穿膜肽的共价结合而实现胞内递送且不影响药物活性。上述核酸药物中的核苷酸单体包括四种脱氧核糖核苷酸单体和四种核糖核苷酸单体。
在本发明的上述药物中，穿膜肽根据不同的核酸药物，可以从如下穿膜肽中合理选择其中的任意一种：序列号为SEQ ID NO:1的LMWP(Low Molecular Weight Protein，低分子量蛋白)、序列号为SEQ ID NO:2的Tat48-60、序列号为SEQ ID NO:3的Tat48–60-P10、序列号为SEQ ID NO:4的CAI、序列号为SEQ ID NO:5的HIV-TAT、序列号为SEQ ID NO:6的MAP、序列号为SEQ ID NO:7的MPGα、序列号为SEQ ID NO:8的M918、序列号为SEQ ID NO:9的R6Pen、序列号为SEQ ID NO:10的penetratin、序列号为SEQ ID NO:11的Pep-1-K、序列号为SEQ ID NO:12的ARF1-22、序列号为SEQ ID NO:13的Tp10、序列号为SEQ ID NO:14的POD、3-100个赖氨酸残基组成的聚赖氨酸以及4～9个精氨酸残基组成的聚精氨酸；优选聚精氨酸为8个精氨酸残基组成的聚精氨酸R8。
表1：
siRNA名称 SEQ ID NO: 反义链(5′----3′)
anti-eGFP 15 UGCGCUCCUGGACGUAGCCUU
单链MOE 16 GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT
REST 17 UUCUUAGCACUGUGAACUCUG
p68 18 AUAUUCAGCAGCUACUUGCUU
MYC 19 UUUGUGUUUCAACUGUUCUC GUCGU
vEGFR1 20 CAGGAUGGUAAAGACUACA
JARID1d 21 ACAAGGAGAUGUUCAUUAUUU
GFP 22 GGCUACGUCCAGGAGCGCACC
USP28No.1 23 CUGCAUUCACCUUAUCAUU
USP28No.2 24 UUGGUUUAGUGCUGUUAUU
USP25 25 ACAAGUUCCUUAUCGAUUA
Chk2 26 GAACCUGAGGACCAAGAAC
DRAM No.1 27 UAUCUUGUAUACAUCGUGG
DRAM No.2 28 UCACCAUUGAUUUCUGUGG
ATG5No.1 29 CAAUCCCAUCCAGAGUUGC
ATG5No.2 30 UAUCCGGGUAGCUCAGAUG
HDAC7 31 UUGAAGGCGAGGUCAGUGA
PTEN 32 UUAGCCAUUGGUCAAGAUCUU
XLF No.1 33 GCAUUACAGUGCCAAGUGATT
XLF No.2 34 CGCUGAUUCGAGAUCGAUUGATT
XRCC4 35 AUAUGUUGGUGAACUGAGATT
VEGF 36 GAUCUCAUCAGGGUACUCCTT
Bcl-2 37 AAUGGAUGUACUUCAUCACTT
EG5 38 AGUUAGUUUAGAUUCUCGATT
GL3luciferase 39 CUUACGCUGAGUACUUCGATT
EGFR 40 CCUUAGCAGUCUUAUCUAATT
panFOXO 41 AAGGAUAAGGGCGACAGACCTT
USP7 No.1 42 ACCCUUGGACAAUAUUCCUTT
USP7 No.2 43 AGUCGUUCAGUCGUCGUAUTT
CSF-1 No.1 44 CUCUGUUGACUCGAGGGUCTT
CSF-1 No.2 45 GUAUUCACAGUGCAAUGGCTT
c-fms No.1 46 UCACCUUAAGCCAGAUGCCTT
c-fms No.2 47 GCUGGCUCUGAAUGAUCACTT
P-gp 48 AAGAAGGAAAAGAAACCAACUTT
β-tubulin 49 UCUCU UCAGG CCUGA CAAUTT
OTX2 50 GGACA CUAAU UCAUC UGUATT
表2：
上述各种穿膜肽分别具有良好的入胞能力，因而都适用于核酸药物的细胞内递送。其中，LMWP具有易于制备、成本低廉以及卓越的穿膜能力等更优异的性能，因而，更优选穿膜肽为LMWP。
对于本发明的上述药物，由于具有较高的细胞膜穿透性，且在细胞内核酸药物也具有很高的生物利用度。而该药物作为药物的一种形式，可适应药物的各种给药途径，包括但不仅限于静脉注射、皮下注射、黏膜给药或者经皮给药；黏膜给药包括鼻腔黏膜、口腔黏膜、直肠黏膜和阴道黏膜中的任意一种。
根据上述实际给药途径的不同，上述药物还可以制备成各种合适的给药剂型，包括但不仅限于针剂、喷雾剂、涂抹剂、生物可降解的包埋剂、凝胶剂、膜剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、脂质体、透皮贴剂、栓剂、冻干粉针剂、或贴片等。
在本发明另一种典型的实施方式中，提供了一种核酸偶联物的制备方法，该制备方法包括：穿膜肽的活化步骤：将穿膜肽的N端或C端特异性地与柔性聚合物进行共价结合，得到活化的穿膜肽；核酸药物的活化步骤：在核酸药物反义链的3’端或者正义链的任意一端引入不同于磷酸基团或羟基基团的反应活性基团，得到活化的核酸药物；共价连接步骤：活化的穿膜肽与活化的核酸药物通过亲核反应或亲电加成反应得到核酸偶联物。
本发明的上述制备方法，通过将现有的穿膜肽与柔性聚合物共价结合形成活化的穿膜肽，同时也将核酸药物的末端修饰为可以与柔性链段末端共价连接的反应活性基团，然后通过亲核反应或亲电加成反应使得核酸药物与连接有柔性链段的穿膜肽共价结合为核酸药物。该制备方法简单且所制备的药物细胞膜穿透性高，且进入细胞内之后核酸药物的生物利用度高。
上述制备方法中，柔性链段作为穿膜肽与核酸药物的间隔，其由柔性聚合物同时提供两个不同的反应活性基团反应而成。穿膜肽活化时提供一个反应活性基团与穿膜肽的一端反应，另外一个反应活性基团与活化的核酸药物所提供的活性基团反应，从而形成以柔性链段为间隔的穿膜肽-柔性聚合物链-核酸药物共价核酸偶联物。柔性聚合物优选聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯或者聚丙烯酰胺；优选柔性聚合物的分子量为1000-10000，更优选为2000-5000。
上述制备方法中，柔性聚合物是用来在核酸药物与穿膜肽之间形成物理间隔的，因而，柔性聚合物两端需要分别与核酸药物和穿膜肽的末端进行共价连接反应，且处于核酸药物穿透细胞膜之后，是需要在细胞质内被释放而发挥生物学功能的，因而，在此目的前提下，任何能够满足上述目的的反应活性基团都能用于核酸药物与柔性链段之间的共价连接反应。而对于参与柔性聚合物与穿膜肽的共价连接的反应活性基团，则无特殊要求，只要能形成共价键且不影响穿膜肽的细胞膜穿透性即可。在本发明一种优选的实施例中，上述核酸药物活化过程中在核酸药物的一端连接的反应活性基团为氨基、巯基、羧基、马来酰亚胺基和N-羟基琥珀酰亚胺基中的任意一种。这些反应活性基团容易形成酰胺键、二硫键或者酯键，能够在被还原或被水解的状态下顺利释放核酸药物。
上述制备方法中，核酸药物包括核苷酸单体或寡聚核苷酸，优选寡聚核苷酸为非取代的寡核苷酸或取代的寡核苷酸，取代的寡核苷酸为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，非取代的寡核苷酸选自锁核酸、短干扰RNA、微小RNA、核酸适体、肽核酸、诱骗ODN、催化性RNA以及CpG二核苷酸中的任意一种；优选寡聚核苷酸为长度为19-23bp的siRNA。更优选地，这些19～23bp的siRNA选自SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:172中的任意一种(序列表中列的序列为各siRNA的反义链)在临床上具有重要意义的siRNA(具体见表1和表2所示)。需要说明的是，表1和标2所示的SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:172的序列中，SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQID NO:69至SEQ ID NO:72以及SEQ ID NO:102的序列3’端末尾带有一个悬垂碱基T(悬垂碱基是为了促进siRNA与目标RNA链的结合能力而进行的常规设计)，而其余的3’端末尾带有两个悬垂碱基T。
同样，上述制备方法中，穿膜肽选自如下任意一种：序列号为SEQ ID NO:1的LMWP、序列号为SEQ ID NO:2的Tat48-60、序列号为SEQ ID NO:3的Tat48–60-P10、序列号为SEQID NO:4的CAI、序列号为SEQ ID NO:5的HIV-TAT、序列号为SEQ ID NO:6的MAP、序列号为SEQ ID NO:7的MPGα、序列号为SEQ ID NO:8的M918、序列号为SEQ ID NO:9的R6Pen、序列号为SEQ ID NO:10的penetratin、序列号为SEQ ID NO:11的Pep-1-K、序列号为SEQ ID NO:12的ARF1-22、序列号为SEQ ID NO:13的Tp10、序列号为SEQ ID NO:14的POD、3～100个赖氨酸残基组成的聚赖氨酸以及4～9个精氨酸残基组成的聚精氨酸；优选聚精氨酸为8个精氨酸残基组成的聚精氨酸R8。
在本发明又一种典型的实施方式中，提供了一种上述任意一种核酸偶联物在体外筛选药物中的应用。根据不同药物研究中体外筛选目的的不同，上述核酸偶联物可以作为阳性对照或阴性对照。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。
由于核苷酸单体与寡居核苷酸都具有电负性，区别就在于核苷酸数目的不同，而核苷酸数目的多少对于合成具有柔性链段共价连接核酸药物与穿膜肽的药物来说并无影响，步骤都是相同的。因此，下面以siRNA为例来进一步说明与载体连接的药物的制备方法及其在药物活性方面的效果。以下实施例中，所用到的试剂或药品，除特殊说明外，均来自于天津光复精细化工研究所。下列实施例中的LMWP发明人自制的序列如SEQ ID NO:1所示的低分子量蛋白。
实施例1双链siRNA偶联物LMWP-PEG-siRNA以及单链寡聚核苷酸偶联物LMWP-PEG-MOE的合成和表征
1.LMWP-PEG-siRNA的合成(结构图如图1所示，按照图2所示的流程进行合成)
1.1.LMWP-SH的合成
分别将10mg自制的序列为SEQ ID NO:1的穿膜肽LMWP溶于5mL PBS中，95mg的NHS-PEG-Mal(MW＝3500Da，北京键凯科技有限公司)溶于0.5mL无水二甲基亚砜(DMSO)(天津西恩斯生化科技有限公司)中。再将溶有NHS-PEG-Mal的溶液逐滴加入到溶有LMWP的PBS溶液中。室温下反应2h，过滤反应液，之后用肝素管纯化得到LMWP-PEG-Mal。
接着将2mg半胱氨酸(天津西恩斯生化科技有限公司)溶解于0.1M的稀盐酸溶液中，再向得到的LMWP-PEG-Mal溶液中逐滴加入溶解的半胱氨酸溶液。室温下反应2h，0.45μm滤膜过滤，用肝素柱纯化活化的LMWP。然后将5mg SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Thermo Fisher Scientific)，一种异-双官能试剂，用于交联氨基和巯基)溶于1ml DMSO中，再缓慢地滴加到LMWP溶液中。室温下反应2h，0.45μm滤膜过滤。用肝素柱纯化得到LMWP-PEG-Mal-Cys-SPDP溶液。再向上述得到的LMWP-PEG-Mal-Cys-SPDP溶液中加入20μL 1M的二硫苏糖醇(DTT)(Thermo Fisher Scientific)于室温下反应15min得到LMWP-PEG-Mal-SH。
1.2.核酸药物的活化
称量1.25mg的碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HC，Thermo Fisher Scientific)并加入到一个离心管中，再向离心管中迅速加入100μL含有5′磷酸基团的溶于0.1M MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)(Sigma)缓冲液得到最终溶度为1mg/mL的siRNA(anti eGFP siRNA,反义链SEQ ID NO:15：5′-UGCGCUCCUGGACGUAGCCUU-3′,广州锐博生物科技有限公司)以及单链的MOE(SEQ ID NO:16：5′-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3′，上海吉玛制药技术有限公司)溶液。之后立刻加入5μL的溶于0.1M咪唑配置成的0.25M的胱胺(pH＝6.0，Thermo FisherScientific)中。用涡旋振荡器最大转速涡旋5min。再加入20μL 0.1M的咪唑(pH＝6.0)，混合，室温下最大转速涡旋反应30min。加入20μL 1M的DTT于室温下反应15min。使用脱盐柱过滤纯化SH-标记的siRNA-SH或者MOE-SH(洗脱液：20mM磷酸二氢钠，10mM EDTA，pH＝6.9)。洗脱液于-80℃冰箱中贮存备用。
1.3.LMWP-PEG-S-S-MOE以及LMWP-PEG-S-S-siRNA的合成
将75nM siRNA-SH或者MOE-SH溶于950μL的溶液(配方：10mM磷酸二氢钠，0.15M氯化钠，pH＝7.2)中。再分别将MOE-SH或者siRNA-SH溶液缓慢滴加到适量肝素柱纯化过的LMWP-PEG-Mal-SH溶液中，边滴加边振荡，将上述混合物置于40℃空气浴摇床连续摇动反应2h(转速100rmp/min)。未反应的MOE-SH或者siRNA-SH用阳离子柱除去。核酸偶联物LMWP-PEG-S-S-siRNA和MOE-S-S-PEG-LMWP储存在-20℃用于进一步分析。
2.LMWP-PEG-S-S-siRNA以及LMWP-PEG-S-S-MOE的表征
使用琼脂糖凝胶电泳和MALDI-TOF来评价所得LMWP-PEG-S-S-siRNA的分子量，结果分别见图3和图4A至图4E。
在图3中，泳道1为核酸标准物(Marker)，泳道2为siRNA，泳道3为LMWP-PEG，泳道4为LMWP-PEG-S-S-siRNA，泳道5为siRNA的二聚体，泳道6为LMWP-PEG-S-S-siRNA用谷胱甘肽还原后的siRNA。从中可以看出，所得LMWP-PEG-S-S-siRNA的为单一条带，纯化较高。
从图4A中可以看出小分子量鱼精蛋白LMWP的分子量为1880Da；图4B显示了MW＝3500的NHS-PEG-Mal的分子量分布；图4C表明了LMWP与PEG共价偶联后形成的LMWP-PEG分子量分布；图4D显示了MOE的分子量为6497.48；图4E显示LMWP-PEG-S-S-MOE的分子量分布。由此表明，琼脂糖凝胶电泳和MALDI-TOF MS均验证，上述共价偶联物合成成功。
实施例2LMWP-PEG-S-S-siRNA以及LMWP-PEG-S-S-MOE的纯化与分离
第一步，用截留分子量为3500的离心超滤管除去反应体系中多余的盐。取2mL的LMWP-PEG-S-S-siRNA偶联物用纯水稀释至10mL，将稀释后的偶联物反应体系的体积浓缩至1mL以下。
第二步，使用肝素亲和层析柱(根据具体穿膜肽的不同可选择合适的阳离子亲和层析柱)将合成产物中所有带有LMWP的分子吸附，接着收集洗脱液洗脱下的产物，以除去未反应的核酸。然后使用截留分子量为3500的离心超滤管除去多余的盐，超滤液体至1mL以下。其中，肝素亲和层析柱的柱分离条件：流速1.0mL/min，A相：50mM磷酸二氢钠，10mMEDTA，pH＝7.2；B相：50mM磷酸二氢钠，10mMEDTA，2M氯化钠，pH＝7.2。
第三步，使用离子交换柱(HiTrapTM1mL DEAE FF，GE Healthcare)吸附带有阴离子的siRNA，除去未与siRNA结合的LMWP，分别收集洗脱液洗脱下的LMWP-PEG-S-S-siRNA偶联物以及LMWP-PEG-S-S-MOE偶联物。最后使用截留分子量为3500的离心超滤管除去溶液中多余的盐即可。其中，离子交换柱分离条件如下：流速1.0mL/min，A相：20mM磷酸氢二钠，pH＝6.9；B相：1M氯化钠，20mM/L磷酸氢二钠，pH＝6.9。
实施例3LMWP-PEG-S-S-siRNA和LMWP-PEG-S-S-MOE的MDA-MB-231细胞摄取实验
该实验的目的是：使用FITC对核酸药物siRNA和MOE分别进行标记，考察与LMWP-PEG共价结合前后MDA-MAB-231细胞对其的摄取能力。具体步骤如下：
使用含有10％胎牛血清、1％非必氨基酸(Non-essential amino acid，简称NEAA)、2mM谷氨酰胺和100单位/mL青霉素和链霉素的DMEM(dulbecco's modified eaglemedium)培养基于25cm2的培养瓶中，在温度为37℃、二氧化碳体积含量为5％的饱和湿度条件下，培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞。将处于对数生长期的人乳腺癌MDA-MB-231细胞收集，调整细胞悬液浓度，按照5×104个/孔的密度接种于24孔板。在温度为37℃、二氧化碳体积含量为5％的饱和湿度条件下，孵育过夜备用。
分别将1、2、3、4、5和6六种样品按照100μg/mL的浓度加入上述盛有备用细胞的24孔板中，其中，1代表仅含有PBS缓冲液的空白对照；2代表裸siRNA；3代表脂质体包裹的siRNA复合体；4代表LMWP-PEG与siRNA按摩尔比1：1混合的物理共混物；5代表LMWP与siRNA按摩尔比1：1混合的物理共混物；6代表LMWP-PEG-S-S-siRNA。
同样，对于核酸药物MOE，分别用5个样品进行上述类似实验，其中，1代表仅含有PBS缓冲液的空白对照；2代表裸MOE；3代表脂质体包裹的MOE复合体；4代表LMWP与MOE按摩尔比1：1混合的物理共混物；5代表LMWP-PEG-S-S-MOE。
将细胞置于37℃、二氧化碳体积含量为5％的饱和湿度的条件下孵育2h；2h后取出细胞板吸取弃去细胞板孔中液体，用PBS清洗6～7遍。然后加入4％的多聚甲醛固定30min，再用PBS清洗3～4遍。接着加入2μg/mL DAPI染色10min，然后用PBS清洗6～7遍。于准备好的每片载玻片上各滴加5μL的抗荧光淬灭封片剂，将玻璃片从细胞板孔中取出按标号盖于封片液上，注意不要引入气泡，将上述制得的样品于4℃冰箱保存，或者直接将其置于激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope，CLSM)下观察细胞摄取状况。细胞对上述siRNA各类药物以及对MOE各类药物的摄取状况分别见图5A和图5B。
图5A和图5B分别显示了各种siRNA药物以及各种MOE核酸药物进入细胞内的能力。其中，DAPI为细胞核染料，在显微镜下呈现蓝色；FITC绿色荧光标记，其携带siRNA药物，在显微镜下呈现绿色；BF是Bright Field的简称，指在白光下看到的视野；Merge是三种视野下的图像叠加后的视图。
从图5A和图5B可以看出，没有任何包裹的裸双链siRNA或者单链MOE是无法进入细胞的，与阴性对照PBS一样。而由脂质体包裹的siRNA被细胞摄取的能力也很差，几乎没有能够进入细胞内的。而将核酸药物直接与LMWP物理共混的核酸偶联物从绿色荧光和蓝色荧光叠合之后可以看出，绿色基本是在细胞膜周围的，细胞内的也相对较少。siRNA与LWMP-PEG形成的物理共混物的也是很难入胞，从图5A编号为4的样品可以看出。从图5A中的样品6和图5B的样品5也可以看出(样品4是纳米粒而样品5则是均一的物质，尽管样品4部分位置荧光比较强，但是不是所有细胞都有，通过荧光定量计算，样品4的荧光值要明显低于样品5)，LMWP-PEG-S-S-siRNA以及LMWP-PEG-S-S-MOE在细胞内的亮度很强，其细胞膜穿透性是siRNA与LMWP物理共混复合物的2倍以上。
由此可见，与LMWP形成LMWP-PEG-S-S-siRNA或LMWP-PEG-S-S-MOE能够显著提高核酸药物的细胞摄取，即能显著提高核酸药物的细胞膜穿透性。
此外，发明人也尝试了上述细胞用巯基化的siRNA-SH与巯基化的LMWP-SH氧化形成二硫键而得到共价连接的偶联物，在合成的过程中巯基化的siRNA-SH与巯基化的LMWP-SH由于电荷的作用发生聚集，此类偶联物的细胞摄取情况，其与siRNA与LMWP按摩尔比1:1进行物理共混的实验组是一致的，两者都无法形成均一的偶联物，细胞学实验结果也相似，此处未在图中显示。
实施例4不同共价键修饰的偶联物对核酸药物的影响
发明人采用用实施例1相同的方法，将LMWP-PEG与siRNA偶联的化学键替换为马来酰亚胺键，制备了LMWP-PEG-S-mal-siRNA，并比较LMWP-PEG-S-S-siRNA和LMWP-PEG-S-mal-siRNA两种不同化学键修饰的核酸药物在细胞摄取能力和细胞内分布的影响。实验结果见图6A和图6B。
从图6A中可以看出，细胞对上述两种不同化学键修饰的偶联物核酸药物的摄取能力无明显差别，即两种核酸药物在细胞膜穿透性方面没有明显差异，核酸偶联物的入胞能力都很强。而图6B示出了可降解的共价键形成的核酸偶联物LMWP-PEG-S-S-siRNA在细胞内的分布。LMWP-PEG-S-S-siRNA中的二硫键在胞质内谷胱甘肽的还原作用下，形成siRNA-SH以及LMWP-PEG-SH，siRNA更多分布在细胞质中(因而能够在视野下观察到完整的细胞形态)。而不可降解偶联物LMWP-PEG-S-mal-siRNA的细胞在细胞质内不能发生降解，该偶联物在穿膜肽的趋核性的介导下更多地分布在细胞核中(穿膜肽LMWP具有明显的趋核性，图6B中因主要是细胞核中，因而难以分辨完整的细胞形态)。
实施例5LMWP-PEG-S-S-siRNA的基因沉默能力评价
在这部分实验中，采用具有稳定表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231(记为MDA-MB-231-EGFP)，来评价能够与EGFP基因链互补的不同形式的siRNA(anti-EGFP)对EGFP的基因沉默能力。MDA-MB-231-EGFP的培养条件与MDA-MB-231一致：在37℃、5％的CO2体积浓度以及饱和湿度条件，培养基采用含有10％的FBS、1％的非必需氨基酸(non-essential amino acid,NEAA)、2mM的L-谷氨酰胺和100单位/mL青霉素和链霉素的DMEM(dulbecco's modified eaglemedium)培养基于25cm2的培养瓶。转染时，使用处于对数生长期的人乳腺癌MDA-MB-231-EGFP，按照5×104个/孔的密度接种于24孔板。在上述的培养条件下孵育过夜备用。
取下列样品：siRNA、siRNA/脂质体、LMWP/siRNA物理共混物、LMWP-PEG-S-S-siRNA偶联物按照siRNA(anti-EGFP)50nM/孔的浓度加入24孔板中。细胞置于37℃，CO2体积浓度为5％的饱和湿度的条件下孵育12～24h；孵育结束后将培养板中的含药培养剂更换为新鲜的完全培养基，结束转染继续培养72h。用Confocal定性观察EGFP的表达量，用流式细胞术、Western-Blot以及荧光测量技术来定量EGFP的表达量。具体检测结果见图7A至7C。
从图7A、图7B以及图7C中，1代表仅含有PBS缓冲液的空白对照；2代表阴性对照siRNA；3代表裸siRNA；4代表脂质体包裹的siRNA复合体；5代表LMWP与siRNA按摩尔比1：1混合的物理共混物；6代表LMWP-PEG-S-S-siRNA。
从图7A中可以看出，上述各种形式的siRNA药物中，LMWP-PEG-S-S-siRNA转染的细胞中，EGFP基因所表达出来的荧光强度最低，几乎看不到绿色荧光。而其他形式的siRNA药物转染的细胞中均能明显地看到大量的绿色荧光。表明本发明的siRNA核酸偶联物不仅具有很高的细胞膜穿透性，而且进入细胞内后，能够显著抑制目的基因的表达。
上述效果趋势从图7B至图7C的不同角度的检测中也能看出来。图7B是流式细胞仪检测到的各种形式的siRNA转染细胞后的绿色荧光强度的大小，本发明的siRNA偶联物所转染的细胞中EGFP的表达强度仅为21.15％，与siRNA/LMWP物理共混物的表达强度41.24％相比，抑制作用增加了近一倍。图7C直接从EGFP蛋白表达水平检测。可以看出，样品6中EGFP蛋白的表达水平近乎检测不到。表明本发明的siRNA药物的递送效率高，且不影响药物生物活性，核酸药物的生物利用度高。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明的核酸药物-柔性链段-穿膜肽共价偶联物可用于提高核酸药物分子的细胞膜穿透性，并能显著提高核酸药物的生物利用度。
实施例6核酸偶联物LMWP-PEG-siRNA中PEG分子量对偶联物的影响
本部分中主要展开了两部分的工作：
第一部分：通过PEG分子量的变化趋势对穿膜肽与阳离子交换柱的结合能力的影响来表征PEG对LMWP的屏蔽能力。
依次选择分子量为1000Da、3500Da、10000Da以及20000Da的PEG与LMWP反应后形成的LMWP-PEG与强阳离子交换柱的结合能力，以此来表征PEG对LMWP的屏蔽能力；
第二部分：不同分子量大小的PEG与LMWP形成LMWP-PEG-siRNA偶联物以及LMWP+PEG+siRNA的物理共混物的影响来评价PEG的分子量对LMWP-PEG-siRNA偶联物的影响。
针对分子量依次为1000Da、3500Da、10000Da以及20000Da的PEG分别制备了LMWP-PEG-siRNA偶联物以及LMWP+PEG+siRNA的混合物，来评价PEG的分子量对LMWP-PEG-siRNA偶联物的影响。
LMWP与mPEG-NHS(1000Da)、mPEG-NHS(3500Da)、mPEG-NHS(10000Da)、mPEG-NHS(20000Da)在pH＝7.2的缓冲液中室温下反应2h，LMWP上唯一的一个伯氨基与NHS反应生成1#LMWP-PEG(1000Da)、2#LMWP-PEG(3500Da)、3#LMWP-PEG(10000Da)和4#LMWP-PEG(20000Da)。上述mPEG-NHS中的mPEG表示一端为甲氧基的PEG，m表示封端基团，表示该端没有活性基团。
上述得到的LMWP-PEG利用肝素亲和层析柱进行柱分离，分离条件如下：流速1.0mL/min，A相：50mM磷酸二氢钠，10mMEDTA，pH＝7.2；B相：50mM磷酸二氢钠，10mMEDTA，2M氯化钠，pH＝7.2。线性梯度：30min目标物B的浓度从0％增加到100％。
结果如图8A所示：LMWP在B的组成>60％的时候才能被洗脱下来，而1#至4#样品均在B的组成比例比较低的时候被洗脱，此外随着PEG分子量的增加LMWP-PEG被洗脱下来时B的组成越低。从上述结果可以看出LMWP与PEG反应生成LMWP-PEG后，PEG分子的存在会不同程度地屏蔽LMWP上的正电荷，PEG的分子量越大对LMWP表面的正电荷的屏蔽效应越显著，那么对应的穿膜肽介导其他分子入胞的能力也越差，因此PEG的分子量不宜过大否则穿膜肽会损失入胞能力。
另外分别将LMWP与siRNA(摩尔比1:1)加入等摩尔的mPEG-NHS(1000Da)、mPEG-NHS(3500Da)、mPEG-NHS(10000Da)、mPEG-NHS(20000Da)在pH＝7.2的缓冲液中室温下混合，如图8B所示，各组混合物均呈现乳白色，表明带有正电荷的LMWP与带有负电荷的siRNA在电荷的作用下发生物理聚集而形成的不溶性复合物(1#为siRNA-SH+LMWP-SH，2#为siRNA+LMWP，3#为siRNA-SH+LMWP+PEG1000，4#为siRNA-SH+LMWP+PEG3500，5#为siRNA-SH+LMWP+PEG10000，6#为siRNA-SH+LMWP+PEG20000)。
而当LMWP分别与mPEG-NHS(1000Da)、mPEG-NHS(3500Da)、mPEG-NHS(10000Da)、mPEG-NHS(20000Da)反应生成LMWP-PEG(1000Da)、LMWP-PEG(3500Da)、LMWP-PEG(10000Da)、LMWP-PEG(20000Da)后与siRNA-SH发生反应得到各自的偶联物。具体形态如图8B下排所示(1#为siRNA-SH+LMWP-SH，7#LMWP-PEG1000-siRNA，8#LMWP-PEG3500-siRNA，9#LMWP-PEG10000-siRNA，10#为LMWP-PEG20000-siRNA)。从图8B中的下排可以看出LMWP-PEG-siRNA偶联物当PEG分子量>3500Da时，偶联物体系均呈现透明澄清的状态，显示没有不溶性颗粒的出现。
采用粒度仪分别对7#至10#样品进行粒度测量，7#样品的LMWP-PEG1000-siRNA的平均粒径为14nm，而8#至10#样品的粒径与纯水的粒径相同，即不存在颗粒物。
上述两个实验的结果表明，虽然PEG的分子量较小<1000Da时，PEG屏蔽LMWP电荷的能力稍差，但当LMWP与PEG反应形成LMWP-PEG时，均能有效地阻止LMWP与siRNA之间由于电荷作用而发生的团聚。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种核酸偶联物，其特征在于，所述核酸偶联物的分子式为X-Y-B，其中，X为穿膜肽，Y是与所述X共价连接的柔性链段，B是与所述Y共价连接的核酸药物。
2.根据权利要求1所述的核酸偶联物，其特征在于，所述柔性链段是由中性聚合物形成的线性结构的链段。
3.根据权利要求1或2所述的核酸偶联物，其特征在于，所述柔性链段由聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯以及聚丙烯酰胺中的任意一种中性聚合物形成。
4.根据权利要求3所述的核酸偶联物，其特征在于，所述中性聚合物的分子量为1000～10000，更优选为2000～5000。
5.根据权利要求1所述的核酸偶联物，其特征在于，所述B与所述Y共价连接的共价键包括二硫键、腙键、酰胺键、酯键或醚键。
6.根据权利要求1所述的核酸偶联物，其特征在于，所述穿膜肽选自如下任意一种：序列号为SEQ ID NO:1的LMWP、序列号为SEQ ID NO:2的Tat48-60、序列号为SEQ ID NO:3的Tat48-60-P10、序列号为SEQ ID NO:4的CAI、序列号为SEQ ID NO:5的HIV-TAT、序列号为SEQ ID NO:6的MAP、序列号为SEQ ID NO:7的MPGα、序列号为SEQ ID NO:8的M918、序列号为SEQ ID NO:9的R6Pen、序列号为SEQ ID NO:10的penetratin、序列号为SEQ ID NO:11的Pep-1-K、序列号为SEQ ID NO:12的ARF1-22、序列号为SEQ ID NO:13的Tp10、序列号为SEQID NO:14的POD、3～100个赖氨酸残基组成的聚赖氨酸以及4～9个精氨酸残基组成的聚精氨酸；优选所述聚精氨酸为8个精氨酸组成的聚精氨酸R8。
7.根据权利要求1所述的核酸偶联物，其特征在于，所述核酸药物包括核苷酸单体或寡聚核苷酸，优选所述寡聚核苷酸为非取代的寡核苷酸或取代的寡核苷酸，所述取代的寡核苷酸为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，所述非取代的寡核苷酸选自锁核酸、siRNA、microRNA、核酸适体、肽核酸、诱骗ODN、催化性RNA以及CpG二核苷酸中的任意一种；更优选所述寡聚核苷酸为长度为19～23bp的siRNA。
8.根据权利要求7所述的核酸偶联物，其特征在于，所述长度为19～23bp的siRNA为SEQID NO:17至SEQ ID NO:172中的任意一种。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸偶联物，其特征在于，所述核酸偶联物的给药途径为静脉注射、皮下注射、黏膜给药或者经皮给药；所述黏膜给药包括鼻腔黏膜、口腔黏膜、直肠黏膜和阴道黏膜中的任意一种。
10.一种核酸偶联物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
穿膜肽的活化步骤，将穿膜肽的N端或C端特异性地与中性聚合物进行共价结合，得到活化的穿膜肽；
核酸药物的活化步骤，在所述核酸药物反义链的3’端或者正义链的任意一端引入不同于磷酸基团或羟基基团的反应活性基团，得到活化的核酸药物；以及
共价连接步骤，所述活化的穿膜肽与所述活化的核酸药物通过亲核反应或亲电加成反应得到所述核酸偶联物。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述中性聚合物为包括聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯以及聚丙烯酰胺；优选所述中性聚合物的分子量为1000～10000，更优选为2000～5000。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述反应活性基团包括氨基、巯基、羧基、马来酰亚胺基和N-羟基琥珀酰亚胺基中的任意一种。
13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述穿膜肽选自如下任意一种：序列号为SEQ ID NO:1的LMWP、序列号为SEQ ID NO:2的Tat48-60、序列号为SEQ ID NO:3的Tat48-60-P10、序列号为SEQ ID NO:4的CAI、序列号为SEQ ID NO:5的HIV-TAT、序列号为SEQ ID NO:6的MAP、序列号为SEQ ID NO:7的MPGα、序列号为SEQ ID NO:8的M918、序列号为SEQ ID NO:9的R6Pen、序列号为SEQ ID NO:10的penetratin、序列号为SEQ ID NO:11的Pep-1-K、序列号为SEQ ID NO:12的ARF1-22、序列号为SEQ ID NO:13的Tp10、序列号为SEQID NO:14的POD、3-100个赖氨酸残基组成的聚赖氨酸以及4～9个精氨酸残基组成的聚精氨酸；优选所述聚精氨酸为8个精氨酸残基组成的聚精氨酸R8。
14.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述核酸药物包括核苷酸单体或寡聚核苷酸，优选所述寡聚核苷酸为非取代的寡核苷酸或取代的寡核苷酸，所述取代的寡核苷酸为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，所述非取代的寡核苷酸选自锁核酸、siRNA、mircoRNA、核酸适体、肽核酸、诱骗ODN、催化性RNA以及CpG二核苷酸中的任意一种；更优选所述寡聚核苷酸为长度为19～23bp的siRNA。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述长度为19-23bp的siRNA为SEQID NO:17至SEQ ID NO:172中的任意一种。
16.一种权利要求1至9中任一项所述的核酸偶联物在体外筛选药物中的应用。
CN201610083905.9A 2016-02-06 2016-02-06 核酸偶联物、其制备方法及其应用 Active CN105727304B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610083905.9A CN105727304B (zh) 2016-02-06 2016-02-06 核酸偶联物、其制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610083905.9A CN105727304B (zh) 2016-02-06 2016-02-06 核酸偶联物、其制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105727304A true CN105727304A (zh) 2016-07-06
CN105727304B CN105727304B (zh) 2019-11-01

Family

ID=56245153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610083905.9A Active CN105727304B (zh) 2016-02-06 2016-02-06 核酸偶联物、其制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105727304B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106831949A (zh) * 2017-03-01 2017-06-13 中国药科大学 与细胞膜标记相关的亲和肽
CN109453187A (zh) * 2018-09-27 2019-03-12 天津医科大学 具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物及其制备方法和应用
CN110339367A (zh) * 2018-04-02 2019-10-18 北京键凯科技股份有限公司 一种具有靶向性的穿膜肽-多臂聚乙二醇-药物偶联物及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1797901A1 (en) * 2005-12-16 2007-06-20 Diatos Cell penetrating peptide conjugates for delivering nucleic acids into cells
CN101287835A (zh) * 2005-08-17 2008-10-15 株式会社百奥尼 用于siRNA细胞内输送的siRNA-亲水性聚合物结合物及其方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101287835A (zh) * 2005-08-17 2008-10-15 株式会社百奥尼 用于siRNA细胞内输送的siRNA-亲水性聚合物结合物及其方法
EP1797901A1 (en) * 2005-12-16 2007-06-20 Diatos Cell penetrating peptide conjugates for delivering nucleic acids into cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUNXIAO YE ET AL.: ""High-Yield Synthesis of Monomeric LMWP(CPP)-siRNA Covalent Conjugate for Effective Cytosolic Delivery of siRNA"", 《THERANOSTICS》 *
SUNG WON CHOI ET AL.: ""Multifunctional siRNA Delivery System: Polyelectrolyte Complex Micelles of Six-arm PEG Conjugate of siRNA and Cell Penetrating Peptide with Crosslinked Fusogenic Peptide"", 《BIOTECHNOLOGY PROGRESS》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106831949A (zh) * 2017-03-01 2017-06-13 中国药科大学 与细胞膜标记相关的亲和肽
CN106831949B (zh) * 2017-03-01 2020-06-30 中国药科大学 与细胞膜标记相关的亲和肽
CN110339367A (zh) * 2018-04-02 2019-10-18 北京键凯科技股份有限公司 一种具有靶向性的穿膜肽-多臂聚乙二醇-药物偶联物及其应用
US20220047713A1 (en) * 2018-04-02 2022-02-17 Jenkem Technology Co., Ltd. (Beijing) Cell-penetrating peptide-multiarm pol yethylene glycol-drug conjugate having targeting property and application thereof
CN109453187A (zh) * 2018-09-27 2019-03-12 天津医科大学 具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物及其制备方法和应用
CN109453187B (zh) * 2018-09-27 2020-12-29 天津医科大学 具有双重酶敏感特性的抗体核酸药物偶联物及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105727304B (zh) 2019-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Odeh et al. Aptamers chemistry: Chemical modifications and conjugation strategies
Zhen et al. Targeted delivery of CRISPR/Cas9 to prostate cancer by modified gRNA using a flexible aptamer-cationic liposome
CN107469088B (zh) 一种基于dna折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法及其应用
CN117731805A (zh) 用于crispr/cas成分的脂质纳米颗粒制剂
US11020487B2 (en) Compositions for introducing nucelic acid into cells
JP2017093448A (ja) 細胞内貫通能を持ってｒｎａ干渉を誘導する核酸分子およびその用途
US20220389451A1 (en) Compositions and methods for delivering cargo to a target cell
BR112014016562B1 (pt) Estrutura de oligo-rna de dupla hélice, nanopartícula e método de preparação
CN109402176A (zh) 从血红细胞分离的细胞外囊泡和其用途
CN108175759A (zh) 一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用
US20130196432A1 (en) Biologically active molecules for influencing virus-, bacteria-, parasite-infected cells and/or tumor cells and method for the use thereof
Glud et al. Naked siLNA-mediated gene silencing of lung bronchoepithelium EGFP expression after intravenous administration
CN105727304A (zh) 核酸偶联物、其制备方法及其应用
KR20200136978A (ko) 치료제의 표적화된 전달을 위한 엑소좀의 용도
Wang et al. Cellular uptake, tissue penetration, biodistribution, and biosafety of threose nucleic acids: Assessing in vitro and in vivo delivery
US20130108686A1 (en) Method for the delivery of oligonucleotides
KR20110002794A (ko) 아르기닌―기제 양친성 펩티드 마이셀
CN116744979A (zh) 包含甘露糖的脂质纳米颗粒或其应用
AU2014284835B2 (en) Dengue virus-specific siRNA, double helix oligo-RNA structure comprising siRNA, and composition for suppressing proliferation of dengue virus comprising RNA structure
US20110287547A1 (en) Nucleic acid delivery compositions and methods
Cheng et al. Advanced delivery and therapeutic applications of RNAI
EP4183879A1 (en) Double-stranded oligonucleotide and composition for treating covid-19 containing same
Nothisen et al. Cationic Oligospermine-Oligonucleotide Conjugates Provide Carrier-free Splice Switching in Monolayer Cells and Spheroids
CA3140004A1 (en) Analysis of materials for tissue delivery
CN104189920A (zh) 逆转肿瘤多药耐药的基因组合物h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant