CN105435241A - 一种iRGD-抗癌药物偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种iRGD-抗癌药物偶联物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种iRGD-抗肿瘤药物偶联物及其制备方法和应用，该偶联物是由抗肿瘤药物通过化学键与iRGD连接而成，结构式如式(I)其中，X1为抗肿瘤药物前体，L为连接桥。本发明的iRGD-抗肿瘤药物偶联物在水中具有较好的溶解性，可直接静脉注射或加工成其它剂型；本发明的iRGD-抗肿瘤药物偶联物能较好的抑制肿瘤细胞的生长，为肿瘤治疗研究提供了新的方案。

Description

一种iRGD-抗癌药物偶联物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物领域，具体涉及iRGD-抗癌药物偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
化学疗法，简称化疗，依然是目前癌症治疗的主要手段。小分子抗肿瘤药物虽然具有渗透性好、细胞毒性较强的优势，但其特异性低，往往引起严重的毒副作用，使之不能获得理想的临床效益。
抗体药物偶联物(antibody-drugconjugates,ADC)作为一种新型的生物靶向抗癌药物，结合了单克隆抗体的高靶向选择性和小分子毒素的高效性，在提高抗体药物疗效的同时也扩大了小分子毒素的临床应用范围，目前ADC药物已成为了肿瘤治疗研究的热点方向。ADC药物以大分子的抗体作为载体，利用抗体特异性识别肿瘤细胞表面抗原的特性，引导药物到达癌细胞表面，通过胞吞作用后药物进入细胞，并在细胞内低pH值环境或溶酶体蛋白酶的作用下发生化学键的断裂，释放出细胞毒药物，从而达到专一性杀死癌细胞而不损伤正常组织细胞的作用。
美登素(maytansine)是一种具有抗肿瘤作用的天然产生的柄型大环内脂，具有中期阻滞抗有丝分裂的特征，是一类比阿霉素和长春碱类抗癌活性高1000多倍的强效抗癌药。将美登素衍生物DM1与抗体偶联，体外实验结果显示偶联物可以有效抑制肿瘤的生长(T.T.Junttila,G.Li,K.Parsons,G.L.PhillipsandM.X.Sliwkowski,Trastuzumab-DM1(T-DM1)retainsallthemechanismsofactionoftrastuzumabandefficientlyinhibitsgrowthoflapatinibinsensitivebreastcancer.Breastcancerresearchandtreatment.2011；128:347)。
美登素DM1的结构式为：
奥利他汀类(auristatin)抗肿瘤药物是一种从印度洋截尾海兔中分离出来的缩肽衍生物，它通过作用于微管蛋白抑制肿瘤生长，活性高达传统化疗药物的1000倍以上，已被广泛用于ADC并取得巨大成功，在ADC中占有主导地位。目前应用于ADC的auristatin类药物主要有两种，即auristatinE(MMAE)和auristatinF(MMAF)。MMAE对多种人血液恶性肿瘤和实体瘤细胞(黑素瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌和肾癌)具有较强的生长抑制活性，在体内试验中也显示较好的药代动力学性。MMAE与抗体偶联后对阳性细胞选择性抑制活性高达传统化疗药物多柔比星的10～1000倍。MMAF与抗体偶联后，通过抗体的內吞作用将MMAF带入细胞，使药物活性提高2200倍(王彦明，郝伯钧，钟武，周辛波，李松，auristatin类抗体药物偶联物研究进展，国际药学研究杂志，2015,42:427-438)。
MMAE和MMAF的结构式分别为：
然而，抗体虽然靶向性强，但由于其相对分子量大，难以有效穿透实体瘤，对肿瘤的治疗效果有限。此外，抗体制备困难，成本昂贵，特异性偶联细胞毒性分子更提高了制备成本。抗体偶联药物后可能导致抗体产生免疫原性使ADC药物的临床应用受到限制。因此利用小分子或者多肽片段作为识别肿瘤细胞表面抗原的分子，同时偶联具有细胞毒性的药物构建类似于ADC结构的小分子药物具有非常显著的临床实用价值。
iRGD是一种具有环状结构的穿膜肽，分子量较小，且具有较高的水溶性，其序列为CRGDKGPDC，其中的RGD序列具有整合素靶向的功能，能够靶向到整合素表达较高的肿瘤部位，而经过肿瘤部位附近特定酶切割之后的残基片段，则能够与肿瘤表面的神经菌毛素(NRP-1)相互作用，介导发生细胞膜穿透效应(SugaharaKN,TeesaluT,KarmaliPP,KotamrajuVR,AgemyL,GirardOM,etal.Tissue-PenetratingDeliveryofCompoundsandNanoparticlesintoTumors.Cancercell.2009；16:510)。因此，iRGD这种多功能的多肽受到广泛的关注和研究。与直接用紫杉醇纳米粒相比，与iRGD联用后的纳米粒药物到达肿瘤部位的药量提高了12倍(SugaharaKN,TeesaluT,KarmaliPP,KotamrajuVR,AgemyL,GreenwaldDR,etal.Coadministrationofatumor-penetratingpeptideenhancestheefficacyofcancerdrugs.Science.2010；328:1031)。
通过偶联一些具有肿瘤细胞靶向性的水溶性小分子多肽iRGD，制备抗癌药物，不仅能够解决药物的溶解性问题，而且能赋予药物对肿瘤细胞的靶向能力，具有良好的市场前景与临床应用价值。
目前尚未见有将iRGD与美登素类和奥利他汀类抗肿瘤药物联用的相关报道。
发明内容
本发明提供了一种iRGD-抗肿瘤药物偶联物，提高了抗肿瘤药物在水中的溶解性，扩大药物的临床应用范围，并有效提高抗肿瘤药物的靶向性及抗肿瘤效果。
本发明还提供了一种iRGD-抗肿瘤药物偶联物的制备方法，该方法步骤简单，可工业化大批量生产。
本发明还提供了一种iRGD-抗肿瘤药物偶联物在制备抗癌药物中的应用。显著提高药物的生物利用度和减小药物对正常组织和细胞产生毒副作用。另一方面，iRGD具有靶向穿透性，可增强药物靶向肿瘤细胞的能力，在临床用药时可望降低对正常细胞的杀伤力。
一种iRGD-抗癌药物偶联物，是由抗肿瘤药物通过化学键与iRGD连接而成，结构式如式(I)：
其中，X1为抗肿瘤药物前体，L为连接桥。
上述技术方案中，所述化学键为可断裂的双硫键或不可断裂的共价键，例如C-S键。
作为优选，所述抗肿瘤药物前体选自美登素类(maytansine)抗肿瘤药物和奥利他汀类(auristatin)抗肿瘤药物。进一步优选为美登素衍生物DM1、奥利他汀E(MMAE，MonoMethylauristatinE)、奥利他汀F(MMAF，MonoMethylAuristatinF)等。作为更进一步优选，所述抗肿瘤药物前体选自美登素衍生物DM1。
所述iRGD-抗癌药物偶联物的结构为式(I-1)～(I-4)所示化合物：
式(II)中，n＝2～10；
采用上述技术方案，iRGD通过双硫键或共价键与抗肿瘤药物偶联。双硫键在循环系统中稳定，在胞内还原条件下被分解，可直接释放出抗癌药物，显著提高药物的生物利用度，避免药物在非肿瘤部位释放，减小药物对正常组织和细胞产生毒副作用。
本发明还提供了一种上述iRGD-抗癌药物偶联物的制备方法，包括：抗肿瘤药物前体与连接桥化合物反应，然后再与iRGD反应制备得到所述的iRGD-抗癌药物偶联物。
作为优选，所述连接桥化合物为以下化合物中的一种：
n＝2～10；
作为进一步优选，式(I-1)所示的iRGD-美登素DM1偶联物的制备方法，包括：
(1)将美登素衍生物DM1与2,2-二硫二吡啶反应，得到式(h)所示结构的美登素衍生物DM1；该步骤中，美登素衍生物DM1与2,2-二硫二吡啶的摩尔比为1:(1.2～2)，进一步优选为1:(1.2～1.8)。
(2)将步骤(1)产物(h)与iRGD反应，获得结构式如式(I-1)所示的由可断裂的双硫键结合的iRGD-美登素DM1偶联物；
步骤(1)产物与iRGD和TEA的摩尔比为1:(1～1.1):(1.5～2.5)，进一步优选为1:1:2。上述各步骤均可在室温下进行。
本发明中的iRGD-抗肿瘤药物偶联物通过在抗肿瘤药物分子上连接水溶性靶向穿透肽iRGD，使抗肿瘤药物的水溶性和肿瘤靶向性大大提高，使用时，只需要用水溶解即可，不需要有机助溶剂，大大降低了药物使用过程中产生的毒性。
本发明还提供了一种上述任一技术方案所述iRGD-抗癌药物偶联物在制备抗癌药物中的应用。特别是在抗肠癌药物或抗肝癌药物中的应用。
本发明的iRGD-抗肿瘤药物偶联物在水中具有较好的溶解性，可直接静脉注射或加工成其它剂型；本发明的iRGD-抗肿瘤药物偶联物能较好的抑制肿瘤细胞的生长，为肿瘤治疗研究提供了新的方案。
附图说明
图1为iRGD-美登素DM1双硫键偶联物1的合成路线图；
图2为iRGD-美登素DM1双硫键偶联物1的高效液相色谱；
图中，DMF表示N,N-2甲基甲酰胺。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明并不受其限制。
实施例1iRGD-美登素DM1偶联物1(双硫键连接)的制备
合成路线如图1所示。
取美登素DM1(50mg，0.07mmol)，2.2-二硫二吡啶(22mg，0.10mmol)，DMAP(397mg，3.25mmol)溶于5mL甲醇中，25℃搅拌2h，除去溶剂；固体用柱层析色谱分离纯化(DCM:MeOH＝50:1)，得到目标产物3(45mg，收率62％)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):0.75(s,3H),1.10-1.12(d,3H,J＝6.4),1.16-1.17(d,3H,J＝6.8),1.42-1.48(m,2H),1.55(s,3H),1.99-2.03(m,2H),2.43-2.47(m,2H),2.65-2.67(t,4H),2.77-2.80(d,1H,J＝9.6),2.88-2.96(m,2H),3.05-3.08(d,5H,J＝12.8),3.25(s,3H),3.92(s,3H),4.02-4.08(t,1H),4.49-4.52(m,1H),5.27-5.34(m,1H),5.53-5.59(m,1H),6.41-6.42(m,1H),6.53-6.60(m,2H),6.91(s,1H),7.02-7.03(d,1H,J＝1.6),7.16-7.19(m,1H),7.58-7.60(d,1H,J＝8.4),7.69-7.73(m,1H),8.32-8.34(m,1H).
HR-ESIQq-LTMS：计算值：[C40H51ClN4O10S2]+[M+H]+＝847.2815；检测值：847.2788.
将化合物3(20mg，0.02mmol)溶于DMF中，加入iRGD(24.8mg,0.02mmol)，25℃搅拌16h，高效液相分离，得到目标产物1(18mg，收率42％)。
HR-ESIQq-LTMS：计算值：[C75H108ClN17O25S4]+[M+H]+＝1787.2876；检测值：1787.6374.
iRGD-美登素DM1偶联物1的高效液相色谱如图2所示。
实施例2iRGD-美登素DM1偶联物1(双硫键连接)体外细胞毒性评价
考察实施例1中iRGD-美登素DM1偶联物1(双硫键连接)对肿瘤细胞增长的抑制作用，具体方法如下：
取对数生长期细胞，接种于96孔培养板(5000个细胞/孔)。放入在37℃细胞培养箱中恒温培养24h后，加入iRGD-美登素DM1偶联物1，取7个浓度梯度，以美登素DM1(溶于二甲亚砜)作为对照组，每种药每个浓度4个重复值，加完药后将96孔细胞板放入细胞培养箱中培养48或72h后，在96孔板的每孔内加入30μL的四甲基偶氮唑蓝(MTT)，继续放入细胞培养箱中培养4h后，吸弃培养基，每孔加入100μL二甲亚砜，用酶标仪检测490nm处的吸光值。计算细胞存活率，绘制出细胞存活曲线，得到药物对细胞生长的IC50(半数抑制浓度)。
iRGD-美登素DM1偶联物1对各种肿瘤细胞的体外毒性结果见表1。
表1各试验药物的体外细胞毒性评价结果(nM)
表1结果显示，与肿瘤细胞共培养48h后，iRGD-美登素DM1偶联物1对三种肿瘤细胞的存活率都有一定的影响。其中，iRGD-美登素DM1偶联物1对肝癌细胞系BEL-7402的IC50值为290.8μM；对肠癌细胞系HT-29的IC50值为310.2μM。与肿瘤细胞共培养72h后，iRGD-美登素DM1偶联物1对两种肿瘤细胞的存活率影响更明显。其中，iRGD-美登素DM1偶联物1对肝癌细胞系BEL-7402的IC50值分别为10.96μM；对肠癌细胞系HT-29的IC50值为48.03μM。
细胞毒性实验表明，iRGD-美登素DM1偶联物1具有明显的诱导肿瘤细胞凋亡的能力，证实iRGD-美登素DM1偶联物1具有广阔的抗肿瘤应用前景。

Claims (7)

1.一种iRGD-抗癌药物偶联物，其特征在于，是由抗肿瘤药物通过化学键与iRGD连接而成，结构式如式(I)：
其中，X1为抗肿瘤药物前体，L为连接桥。
2.根据权利要求1所述的iRGD-抗癌药物偶联物，其特征在于，所述抗肿瘤药物前体选自美登素类抗肿瘤药物和奥利他汀类(auristatin)抗肿瘤药物。
3.根据权利要求1所述的iRGD-抗癌药物偶联物，其特征在于，所述连接桥为可断裂的双硫键或不可断裂的共价键。
4.根据权利要求1所述的iRGD-抗癌药物偶联物，其特征在于，所述iRGD-抗癌药物偶联物的结构为式(I-1)～(I-4)所示化合物：
式(II)中，n＝2～10；
5.一种iRGD-抗癌药物偶联物的制备方法，其特征在于，包括：抗肿瘤药物前体与连接桥化合物反应，然后再与iRGD反应制备得到所述的iRGD-抗癌药物偶联物。
6.根据权利要求5所述的iRGD-抗癌药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述连接桥化合物为以下化合物中的一种：
7.一种权利要求1-4任一权利要求所述iRGD-抗癌药物偶联物在制备抗癌药物中的应用。
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