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Hintergrund der Erfindung
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid mit osteogener Wirkung
und einen osteogenen Beschleuniger, der das Selbe als einen aktiven
Wirkstoff enthält.
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Das
Peptid und der osteogene Beschleuniger, der das Selbe enthält als einen
aktiven Wirkstoff, die durch die vorliegende Erfindung bereit gestellt
werden, welche osteogene Wirksamkeit besitzen, sind nützlich für die Behandlung
von Knochenbrüchen,
zur Verhinderung einer Abnahme der Knochsubstanz bei Osteoporose
und Zahnwurzel-Erkrankungen und zur Vermeidung von Knochenbrüchen in
Verbindung mit Osteoporose und rheumatoider Arthritis und dergleichen.
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2. Beschreibung des Fachgebietes
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Das
Knochen-morphogenische Protein (Bone Morphogenic Protein, BMP) ist
ein Mitglied der transformierenden Wachstumsfaktor (TGF) β-Familie
(Wozney, J.M. et al, Science, 242, 1528 (1988)) und seine wirksame
Form existiert als ein Homodimer mit einem Molekulargewicht von
etwa 18 kD. BMP hat die Funktion, auf undifferenzierte mesenchymale
Zellen zu wirken, um deren Differenzierung in Chondroblasten und
Osteoblasten zu induzieren und um Chondrogenese und Osteogenese
zu bewirken (Wang, E.A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2220
(1990)). Aus diesem Grund wird von BMP erwartet, bei der Behandlung
von Knochenbrüchen,
der Verhinderung einer Abnahme der Knochsubstanz bei Osteoporose
und Zahnwurzel-Erkrankungen, und bei der Verhinderung von Knochenbrüchen bei
Osteoporose und rheumatioder Arthritis und dergleichen wirksam zu
sein.
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Allerdings
wird das oben beschriebene BMP nicht in einer wirksamen Menge absorbiert,
wenn es oral oder transdermal Verabreicht wird und verschwindet
aus dem Blut oder dem Gewebe innerhalb weniger Minuten, wenn es
direkt in Blutgefäße oder
Gewebe verabreicht wird. Jedoch kann BMP, wenn es in großen Mengen verabreicht
wird, verschieden Nebenwirkungen haben, einschließlich toxischer
Wirkungen auf Leber und Nieren. Darüber hinaus hat BMP eine immunogene
Wirkung auf Grund seines großen
Molekulargewichtes und kann möglicherweise
einen anaphylaktischen Schock hervorrufen, wenn es wiederholt verabreicht
wird. Weiterhin wird, wenn BMP zur Verwendung in Matrizen aus entkalzifizierten
Knochen oder Kollagen imprägniert wird,
eine osteogenetischen Aktivität
hervorgerufen, aber es gibt ein weiteres Problem der antigenen Wirkung oder
Infektion in Verbindung mit diesen Matrizen.
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Um
die Nachteile zu überwinden,
die verknüpft
sind mit der Anwendung von isoliertem BMP oder imprägnierten
BMP Polymeren, entwickelten Suzuki et al. (J. Biomed. Mater. Res.
Vol. 50, No. 3, 405 (2000)) ein Trägersystem bestehend aus einem
BMP-2-abgeleiteten
synthetischen Oligopeptid, NSVNSKIPKACCVPTELSAI, kovalent an Alginat
ggekoppelt und welches eine ektopische Osteoinduktion in vivo gestattet.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Nach
einer tiefgreifenden Studie mit dem Ziel ein Peptid bereitzustellen
mit der osteogenen Aktivität mit
reduzierten Nebenwirkungen, wie oben beschrieben, haben die Erfinder
der vorliegenden Erfinder herausgefunden, dass ein Peptid-Variante,
die von BMP abgeleitet ist, eine osteogene Aktivität hat, und
zwar ähnlicher
jener der osteogenen Aktivität
von BMP, und somit wurde die Erfindung erfüllt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird das oben erwähnte
Ziel erreicht, durch ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, dargestellt durch
die SEQ-ID-NR. 4 bis SEQ-ID-NR. 7 in der Sequenzliste.
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Das
Ziel der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls durch einen osteogenen
Beschleuniger erreicht, der eine wirksame Menge der oben erwähnten Peptide
enthält.
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Dieses
und weitere Ziele der vorliegenden Erfindung werden einfacher ersichtlich
aus der hierin nachfolgenden detaillierten Beschreibung.
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Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
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In
der vorliegenden Erfindung kann der Ausdruck "die osteogene Aktivität haben" verstanden werden, als
die Wirkung der Beschleunigung der Aktivierung der alkalinen Phosphatase
in Osteoblast (Yamaguchi, A., Molecular Medicine, Vol. 30, No. 10,
1232 (1993)), damit neogenetischer Knochen gebildet wird oder das Wachstum
vom bestehenden Knochen induziert wird.
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Die
Peptide der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden, durch
ein Verfahren, welches üblicherweise
verwendet wird, zur Synthetisierung von Peptiden, beispielsweise
durch ein Festphasen-Synthese-Verfahren oder durch ein Flüssigphasen-Synthese-Verfahren.
Das Festphasen-Synthese-Verfahren ist einfacher in der Wirkung (siehe
beispielsweise "Sequel
to Biochemical Experiments 2, Chemistry about Protein (the second
volume)", Seiten
641-694, herausgegeben von Biochemical Society in Japan, veröffentlicht
am 20. Mai 1987 von Tokyo Kagaku Dojin, Japan und "Solid Phase Peptide
Synthesis – A
Practical Method",
Seiten 152-154 von Atherton, E. et al., veröffentlicht 1989 durch IRL Press,
Oxford). Die Festphasen-Synthese kann durchgeführt werden, indem üblicherweise
Aminogruppen mit geeigneten Schutzgruppen geschützt werden, beispielsweise
entweder Boc (tert-Butoxycarbonyl) oder Fmoc (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)
oder einer Kombination davon.
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Zur
Herstellung des Peptids der vorliegenden Erfindung durch das Festphasen-Synthese-Verfahren, beispielsweise
unter Anwendung eines in einem Reaktionsmedium unlöslichen
Polymers, wird 1) eine Aminosäure,
die dem C-terminalen Ende eines Ziel-Peptids entspricht, an das Polymer über eine α-COOH-Gruppe der
Aminosäure
gebunden; 2) nachfolgend wird in Richtung auf das N-terminale Ende des
Ziel-Peptids eine entsprechende Aminosäure oder ein Peptidfragment
gebunden, durch Kondensation an die Aminosäure nach dem Schutz anderer
funktioneller Gruppen, wie zum Beispiel einer α-Aminogruppe der entsprechenden
Aminosäure
oder des Peptidfragments, das nicht eine α-COOH-Gruppe ist; 3) eine Schutzgruppe
einer Aminogruppe, die eine Peptid-Bindung bildet, wie zum Beispiel
eine α-Aminogruppe,
wird von der gebundenen Aminosäure
ohne dem Peptidfragment entfernt; diese Schritte werden wiederholt,
um eine Peptidkette zu verlängern,
um eine Peptidkette zu bilden, die dem Ziel-Peptid entspricht.
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Diese
somit erzeugte Peptidkette wird von dem Polymer entfernt und die
Schutzgruppen werden von den funktionellen geschützten Gruppen entfernt, um
das Ziel-Peptid zu erhalten, welches danach geeigneterweise gereinigt
werden kann.
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Hier
können
als das Polymer Styrendivinylbenzen-Copolymere, Merrifield-Harze,
Chlormethyl-Harze, Wang-Harze, Sieber-Harze, Rink-Amid-Harze, Rink-Acid-Harze,
2-Chlortritylchlorid-Harze, HMBA-MBHA-Harze, MBHA-Harze, Oxim-Harze
und dergleichen verwendet werden. Unter diesen Harzen werden Styrendivinylbenzen-Copolymere bevorzugt.
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Von
dem Gesichtspunkt der Verhinderung von Nebenreaktionen wird bevorzugt,
dass die Ablösung der
Peptidkette von dem Polymer und die Entfernung der Schutzgruppe
simultan durchgeführt
werden, unter Verwendung von Trifluoressigsäure oder Wasserstofffluorid.
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Als
ein Lösungsmittel
und Kondensationsmittel bei der Peptid-Synthese können sämtliche,
im Fachgebiet bekannten, wie benötigt
angewendet werden. Beispielsweise können DMF (Dimethylformamid),
Trichlorethanol, N-Methylpyrrolidon und dergleichen als Lösungsmittel
erwähnt
werden und DCC, HATU (0(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat),
HOBt (1-Hydroxybenzotriazol), HBTU (0-Benzotriazol-1-yl-N,N, N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat),
PyBOP (Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidinophosphodiumhexafluorphosphat),
CF3-NO2-PyBOP und dergleichen
können
als Kondensationsmittel verwendet werden.
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Zur
Reinigung des erhaltenen Peptids ist es wirksam eine Reverse-Flüssigkeits-Chromatographie
zu verwendet.
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Entweder
ein oder beide der N terminalen Enden und C terminalen Enden des
oben erwähnten
Peptids der vorliegenden Erfindung kann gegebenenfalls chemisch
modifiziert werden. Beispielsweise kann das N terminale Ende acetyliert
werden und das C terminale Ende amidiert oder verestert.
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Das
Peptid der vorliegenden Erfindung kann durch herkömmli che
Salz-Bildungs-Reaktionen ein physiologisch verträgliches Salz bilden. Solche
Salze können
Salze mit Säuren
umfassen, wie zum Beispiel einer anorganischen Säure (z. B. Salzsäure, Schwefelsäure und
Phosphorsäure)
oder eine organische Säure
(z. B. Milchsäure,
Weinsäure,
Maleinsäure,
Fumarsäure,
Oxazsäure,
Apfelsäure,
Zitronensäure, Ölsäure und
Palmitinsäure);
Salze mit Hydroxiden und Carbonaten von Alkalimetallen und Alkalierdmetallen,
wie zum Beispiel Natrium, Kalium, Kalzium und Aluminium; und Salze
mit Aminen, wie zum Beispiel Triethylamin, Benzylamin, Diethanolamin,
t-Butylamin, Dicyclohexylamin und Arginin.
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Das
Peptid der vorliegenden Erfindung hat die osteogene Aktivität und zeigt
eine geringe Toxizität
bei Toxizitäts-Untersuchungen.
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Daher
kann das Peptid der vorliegenden Erfindung zum Zwecke der Knochenbildung
verwendet werden, als ein osteogener Beschleuniger und zwar unabhängig oder
als ein osteogener Beschleuniger, erhalten durch das Anheften des
Peptids an einen geeigneten Träger,
der gegebenenfalls pharmakologisch verträgliche Zusätze enthält, wie zum Beispiel einen
Stabilisator, einen Konservierungsstoff, einen Andicker, einen löslichkeitsvermittelnden
Stoff und dergleichen oder erhalten durch Lösen oder Suspendieren des Peptids
in einem wässerigen
Lösungsmittel.
Es ist besonders bevorzugt, dass der osteogene Beschleuniger der
vorliegenden Erfindung das Peptid, an einen Träger angeheftet, umfasst.
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Der
Träger
ist vorzugsweise biologisch abbaubar und biologisch absorbierbar
und es ist beispielsweise möglich,
einzeln oder in Kombination von zwei oder mehr verschiedenen Arten
von Keramik, Gelen oder Polysacchariden, wie zum Beispiel kovalent
quervernetzte Gele von Alginat (Suzuki, Y. et al., J. Biomed. Mater. Res.,
39, 317 (1998)) und Gele von Proteinen, wie zum Beispiel Kollagen,
zu verwenden.
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Unter
diesen Trägern
werden Gele von Polysacchariden bevorzugt, hinsichtlich ihrer nicht-inflammatorischen
und nicht-immunogenen Eigenschaften. Das Peptid kann an den Träger angeheftet
werden, mittels einer kovalenten Bindung, einer ionischen Bindung,
einer hydrophoben Bindung einer Wasserstoff-Bindung, einer SS-Bindung
und dergleichen, wobei diese Bindungen gebildet werden, durch Immersion,
Aufsprühen, Anwendung,
Tropfen oder dergleichen, unter Verwendung einer Lösung des
Peptids in Dimethylformamid oder dergleichen.
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Die
Anheftung des Peptids durch die kovalente Bindung wird hinsichtlich
der Stabilität
und Kontinuität des
Effektes bevorzugt. Eine solche Anheftung kann erhalten werden,
durch ein Verfahren, das üblicherweise verwendet
wird, zur Anheftung eines physiologisch aktiven Proteins, wie zum
Beispiel eines Enzyms, (siehe beispielsweise Scouten, W.H., Methods
in Enzymol., 135, Mosbach, K. Ed., 1987, Academic Press NY, Seiten 30-65).
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Der
so erhaltene feste osteogene Beschleuniger kann verwendet werden,
zur Implantation in einer Defektstelle im Knochen.
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Als
wässerige
Lösungsmittel,
die verwendet werden können
zur Herstellung eines flüssigen
osteogenen Beschleunigers, können
physiologische Kochsalzlösung
und physiologisch verträgliche
wässerige
Lösungen
von Mannitol, Sucrose, Laktose, Maltose, Glukose, Fruktose oder
dergleichen erwähnt
werden. Eine 5% wässerige
Lösung
von Glukose und eine physiologische Kochsalzlösung werden bevorzugt.
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Der
osteogene Beschleuniger, der erhalten wird durch Auflösen oder
Suspendieren des Peptids in dem wässerigen Lösungsmittel, kann verwendet
werden, durch intravenöse,
subkutane, intraperitoneale, intra-artikuläre oder dermale Anwendung oder
durch dessen Einfüllung
in eine Defektstelle im Knochen gemäß der Art seiner Formulierung.
Weiterhin bei Einkapselung oder Einbringung in Liposome durch das
herkömmliche
Verfahren kann der osteogene Beschleuniger oral verabreicht werden.
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Das
Peptid und der osteogene Beschleuniger der Erfindung kann die Behandlung
von Frakturen begünstigen,
indem es Patienten mit Frakturen verabreicht wird, die durch externe
Ursachen, rheumatoider Arthritis und Osteoporose oder durch Einfüllen oder
Implantation in einer Frakturstelle im Knochen.
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Sie
können
ebenfalls die Verminderung der Knochensubstanz auf Grund von Osteoporose
und Zahnwurzel-Erkrankungen unterdrücken und Frakturen vermeiden,
auf Grund von Osteoporose und rheumatoider Arthritis, indem sie
an Patienten mit Osteoporose, Zahnwurzel-Erkrankungen und rheumatoider
Arthritis verabreicht werden.
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Die
Dosis des Peptites der vorliegenden Erfindung kann variieren, abhängig von
den Bedürfnissen,
die abhängen
von dem Gewicht des Knochens, der gebildet werden soll, der Stelle
des verletzten Knochens, dem Zustand des Knochens und dem Alter,
Geschlecht und Gewicht eines Patienten und dergleichen. Allerdings exprimiert
das Peptid üblicherweise
seine osteogene Aktivität,
in dem es verabreicht oder implantiert wird, als ein aktiver Wirkstoff,
bei einer Dosis von 0,01 μg/kg
bis 2 g/kg (für
einen Erwachsenen), vorzugsweise 0,01 μg/kg bis 200 mg/kg (für einen
Erwachsenen).
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BEISPIELE
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Die
vorliegende Erfindung wird nun beschrieben mittels Beispielen, welche
nicht als einschränkend
für den
Schutzumfang der Erfindung angesehen werden sollten.
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Beispiel 1
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Ein
Peptid mit der Aminosäure-Sequenz
SEQ-ID-NR. 4, welches eine Aminogruppe am N terminalen Ende hat
und eine Carboxylgruppe am C terminalen Ende, wurde synthetisiert
mit dem Festphasen-Synthese-Verfahren, unter Verwendung eines automatischen
Peptide-Synthesizers.
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Genauer
wurde unter Verwendung von 0,1 mmol eines Partikelförmigen Harzes
(hergestellt von US Applied Biosystems, HMP leucine), bestehend
aus Styrendivinylbenzen-Copolymer (das molare Zusammensetzungsverhältnis von
Styren zu Divinylbenzen war 99:1), welches 4-(Nα-9-(Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-leucyl)-oxy-methyl-phenoxy-methyl-Gruppe
in einem Anteil von 0,74 mmol/g-Harz
erhalten, wobei sukzessiv Aminosäuren
gebunden wurden, entsprechend in der Richtung von dem Carboxyl terminalen
Ende zu dem Amino terminalen Ende des Ziel-Peptids. Bei der Bindungsreaktion
wurden als Aminosäuren
Nα-9-(Fluorenylmethoxycarbonyl)-Nβ-trityl-L-asparagin (Fmoc Asparagin),
Nα-9-(Fluorenyl-methoxycarbanyl)-0-t-butyl-L-serin
(Fmoc Serin), Nα-9-(Fluorenylmethoxycarbonyl)-valin
(Fmoc-Valin), Nα-9-(Fluorenylmethoxycarbonyl)-Nε-t-butyloxycarbonyl-L-lysin
(Fmoc Lysin), Nα-9-(Fluorenylme thoxycarbonyl)-L-isoleucin
(Fmoc Isoleucin), Nα-9-(Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-prolin
(Fmoc Prolin), Nα-9-(Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-alanin (Fmoc
Alanin), Nα-9-(Fluorenylmethoxycarbonyl)-S-trityl-L-cystein
(Fmoc Cystein), Nα-9-(Fluorenylmethoxycarbonyl)-0-t-butyl-L-threonin
(Fmoc Threonin), Nα-9-(Fluorenylmethoxy-carbonyl)-y-butyl-L-Glutaminsäure (Fmoc-Glutaminsäure), Nα-(Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-leucin
(Fmoc Leucin) und Nα-(Fluorenylmethoxycarbonyl)-0-t-butyl-L-thyrosin
(Fmoc Thyrosin) verwendet, wobei alle hergestellt werden von US
applied Biosystems, in einer Menge von 1 mmol bei jedem Bindungsschritt.
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HBTU
und HOBt wurden verwendet zur Bildung der Bindungen der Aminosäure.
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Das
entstehende Peptid-Harz wurde mit 10 ml Trifluoressigsäure, welches
2,5% Wasser und 2,5% Ethandithiol enthielt, für drei Stunden behandelt. Die
entstehende Lösung
wurde zu Diethylether dazu gesetzt. Der erzeugte Niederschlag wurde
weiter mit Diethylether mehrere Male gewaschen, um das Peptid zu
entschützen
und es von dem Harz abzulösen.
Das erzeugte rohe Produkt wurde durch vorbereitende Reverse-Phase-Hochleistungs-Flüssigkeit-Chromatographie
gereinigt (Säule:
Novapak HR C18 25 × 100
mm, RCM 25 × 10
mit einem Druckmodul, hergestellt von Nippon Waters Kabushiki Kaisha,
Japan).
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Das
entstehende gereinigte Peptid wurde einem AKTA-Explorer 10XT unterworfen,
hergestellt durch Pharmacio Biotech Kabushiki Kaisha, Japan (Säule: Novapak
C18 3,9 × 150
mm, hergestellt von Nippon Waters Kabushiki Kaisha, mobile Phase
: ein Mischungs-Lösungsmittel
aus Wasser und Acetonitril, welches 0,05 Vol% Trifluoressigsäure (mit
Variierung der Konzentration von Acetonitril von 5 Vol% bis 50 Vol%
in 30 Minten) enthielt, bei einer Flussrate von : 1 ml/Min.). Eine
einzige Spitze wurde bei 21,6 Minuten beobachtet. Das Molekulargewicht
des gereinigten Peptids betrug 2,637 durch FAB Massenspektrometrie
(theoretisches Molekulargewicht : 2,636.06).
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Beispiele 2 bis 5
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Die
Peptide (Beispiele 2 bis 4) mit den jeweiligen Aminosäure-Sequenzen
SEQ-ID-NR. 4, SEQ-ID-NR. 5 und SEQ-ID-NR. 6 und mit einer Aminogruppe
an dem N terminalen Ende und einer Aminogruppe an dem C terminalen
Ende und ein Peptid (Beispiel 5) mit der SEQ-ID-NR. 7 und einer
Aminogruppe an dem N terminalen Ende und einer Aminigruppe an dem
C terminalen Ende wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 synthetisiert,
außer
dass 0,1 mmol Partikel-förmiges
Harz (hergestellt von US Applied Biosystems, Fmoc Amid-Harz) verwendet
wurde, bestehend aus Styrendivinylbenzen-Copolymer (das molare Gewichtsverhältnis von
Styren zu Divinylbenzen war 99 : 1), das eine 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-fluorenylmethoxycarbonyl-aminoethyl)phenoxyacetoamidethyl-Gruppe
in einem Verhältnis
von 0,62 mmol/g Harz enthielt.
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Die
entstehenden Peptid-Harze wurden einer Entschützung und Ablösung von
der festen Phase unterworfen und die entstehenden rohen Produkte
wurden in der gleichen Art, wie in Beispiel 1, gereinigt.
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Die
gereinigten Peptide wurden jeweils untersucht, hinsichtlich der
Elutionszeit und dem Molekulargewicht, durch analytische HPLC und
durch FAB Massenspektroskopie. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1
gezeigt.
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Testbeispiel 1: Induktion
der Aktivität
von alkalischer Phosphatase in C3H10T1/2 Zell-Linie
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Die
undifferenzierte mesenchymale Maus-Zell-Linie C3H10Tl/2 (gekauft
von Dai-Nippon Seiyaku KK, Japan) wurde in Eagle's MEM Medium aufgelöst, welches 10% fetales Rinderserum
in einer Zell-Konzentration von
3,75 × 104 Zellen/ml enthält, und somit wurde eine Zell-Kultur-Flüssigkeit
vorbereitet. Die Zell-Kultur-Flüs sigkeit
wurde verteilt, in jeweils 100 μl
in jeder Kammer der 96-Loch-Platten, auf denen die Peptide der Beispiele
1 bis 5 jeweils in einer Menge von 200 μg durch Lufttrocknung verfestigt
wurden und bei 37°C
in Anwesenheit von 5% CO2 inkubiert wurden.
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Als
Kontrolle wurden die Zellen ebenfalls in gleicher Anzahl in Kammern
ohne verfestigtes Peptid verteilt und danach wurden 50 ng menschliches
rekombinantes BMP-2 (R&D
Systems, Inc.) zugesetzt. Ebenso wurden leere Zellen vorbereitet,
in welche wieder menschliches rekombinantes BMP-2 noch die verfestigten Peptide
zugesetzt wurden.
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Drei
Tage nach dem Beginn der Inkubation wurde der Kulturüberstand
entfernt und die Kammern wurden einmal mit Phosphatpuffer (PBS :
10 mM, 0,15 M normales Salz enthaltend, pH 7,4) gewaschen. Zu jeder Kammer
der 96-Loch-Platten wurden 100 μl
Tris-Puffer (20 mM, pH 8,5) mit 1% Tritin X-100 zugesetzt und 30 Minuten
stehen gelassen, um die Zellen aufzulösen. Hinsichtlich 100 μl der entstehenden
Zell-Lösung
wurden jeweils 100 μl
Tris-Puffer (1,5 M, 1 mM ZnCl2 und 1 mM
MgCl2 enthaltend, pH 8,5), die 7,5 mM p-Nitrophenylphosphat
enthielten (gekauft von Wako Junyaku Kogyo, Japan) zugesetzt. die
Erhöhung
der Absorbtion bei 405 nm wurde bestimmt, um die alkaline Phosphase-Aktivität in der
Zelle zu bestimmen. Die Konzentrat von Protein in der Zelle wurde
ebenfalls bestimmt, unter Verwendung eines BCA-Assay-Kits (hergestellt
von Pierce).
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Während der
Alkaline-Phosphatase-Aktivität
in den leeren Kammern 0,24 ± 0,11
nmol/Min.mg-Protein betrug, war die alkaline Phosphatase-Aktivität in den
Kammern mit den verfestigten Peptiden der Beispiel 1, 2, 3, 4 und
5 jeweils 1,3 ± 0,9
nmol/Min.mg-Protein, 1,5 ± 0,6
nmol/Min.mg-Protein, 1,5 ± 0,8
nmol/Min.mg-Protein, 1,7 ± 0,1
nmol/Min.mg-Protein bzw. 0,61 ± 0,07
nmol/Min.mg-Protein.
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Andererseits
betrug in den Kammern, in welche menschliches rekombinantes BMP-2
zugesetzt wurde, die alkaline Phosphatase-Aktivität 1,7 ± 0,4nmol/Min.mg-Protein.
Die Peptide der Beispiele 1 bis 4 bewirkten bemerkenswerte Erhöhungen der
alkalinen Phosphatase-Aktivität,
welche vergleichbar waren mit den menschlichen rekombinanten BMP-2.
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Durch
Vergleich mit bekannten Sequenzen aus der BMP-Familie wurde geschätzt aus
den Ergebnisse von Beispiel 5, dass das Peptid STLY eine günstige Wirkung
auf die alkaline Phosphatase-Aktivität besitzt.
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Beispiel 6
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Ethylendiamin
(EDA, hergestellt von Wako Junyaku Kogyo, Japan), 0,6 g (10 mmol)
aufgelöst
in 10 ml Methanol wurde in 150 ml Methanol eingetropft, in welches
2,3 g (20 mmol) von N-Hydroxysuccinimid
(HOSu, hergestellt von KK Peptide Kenkyusho, Japan) aufgelöst wurde,
während
bei Raumtemperatur gerührt
wurde. Nach dem Eintropfen wurde die Mischung eine weitere Stunde
gerührt.
Die niedergeschlagenen Kristalle wurden durch Filtration aufgenommen
und unter reduziertem Druck getrocknet, um 2,6 g (einen Ertrag von
circa 90%) Ethylendiamin 2N-Hydroxysuccinimidsalz
(EDA.2HOSu) zu erhalten.
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EDA.2HOSu,
66 mg und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (WSCD.HCl, hergestellt
von KK Peptide Kenkyusho), 0,48 g wurden aufgelöst in 30 ml 1 Gewichtsprozent
wässeriger
Lösung
von Natriumalginat (hergestellt von Funakoshi Kabushiki Kaisha,
Viskosität
: 550 cp, M/G-Verhältnis
: 1,0). Die entstehende Mischung wurde auf einer 10 cm × 10 cm
Teflon-beschichtetem
Aluminium-Ablage verteilt und bei 25°C für 48 Stunden stehen gelassen,
um ein kovalent quervernetztes Gel-Alginat zu erhalten.
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Das
Gel wurde ausreichend mit Wasser für Injektionen (hergestellt
von Otsuka Seiyaku) gewaschen, in welchem 2,5 mM CaCl2 und
143 mM NaCl aufgelöst
worden waren und dann nur mit Wasser für Injektionen gewaschen. Das
Alginat-Gel wurde nach dem Waschen gefriergetrocknet, um ein weißes schaumartiges
Gel zu erhalten.
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Das
entstehende schaumartige Gel, 0,2 g, wurde mit 4 ml Dimethylformamid
gedeckt, zu welchem 6 mg N-Hydroxysuccinimid und 10 mg WSCD.HCl
zugesetzt wurden und beim Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Das
schaumartige Gel wurde mit Methanol und Dimethylformamid gut gewaschen,
zu welchem 1 ml Dimethylformaid-Lösung mit
13 mg des Peptids aus Beispiel 2 und 0,86 μl Diisopropylethylamin zugesetzt
worden waren, und bei Raumtempe ratur über Nacht geschüttelt. Das
entstehende Gel wurde mit Methanol und Ethanol gut gewaschen, um
einen osteogenen Beschleuniger zu erhalten, in welchem das Peptid
aus Beispiel 2 an das Gel angeheftet war.
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Testbeispiel 2: Intramuskulärer Implantationstest
bei Ratten
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Der
osteogene Beschleuniger, der in Beispiel 6 erhalten wurde, 0,01
g, wurde in den cruralen Muskel von sechs Wochen alten männlichen
Wistar-Ratten (gekauft von Charles River Japan Inc.) implantiert.
Nach vier Wochen wurde peripheres Gewebe, einschließlich der
Implantationszellen entnommen und einer Gewebe-Färbung unterworfen.
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Als
ein Ergebnis zeigte eine von Kossa-Färbung, dass offensichtlich
an den Implantationsstellen Kalzium abgelagert war. Als eine Kontrolle
wurde ein Schwamm-artiges Gel, welches das angeheftete Peptid nicht besaß, an der
gegenüber
liegenden Seite der identischen Ratten implantiert, wo keine Ablagerung
von Kalzium bei der von Kossa-Färbung
beobachtet wurde.
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Testbeispiel 3: Mangelnder
tibialer Knochenstellen-Implantatstest bei Ratten
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Der
osteogene Beschleuniger, der in Beispiel 6 erhalten wurde, 0,01
g, wurde in kreisförmige
Mangelstellen von circa 3 mm Durchmesser implantiert, welche künstlich
gebildet wurden in den Tibiae von sechs Wochen alten männlichen
Wistar-Ratten (gekauft von Charles River Japan Inc).
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Vier
Wochen nach der Implantation wurde Gewebe, welches die Implantationsstellen
umfasste, herausgenommen und einer Gewebe-Färbung
unterworfen. Die Bildung von neogenetischen Knochen wurde offensichtlich
beobachtet. Als Kontrolle wurde ein Schaumartiges Gel, welches das
angeheftete Peptid nicht besaß,
an der gegenüber
liegenden Stelle der identischen Ratten implantiert, wo keine Spur
neogenetischen Knochen beobachtet wurde.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Peptid bereitgestellt mit der osteogenen Aktivität und ein osteogene
Beschleuniger, der das Peptid als einen aktiven Wirkstoff enthält.
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Da
das Peptid und der osteogene Beschleuniger eine niedrige Toxizität und eine
ausgezeichnete osteogene Aktivität
haben, sind sie zur Behandlung von Knochenbrüchen, zur Unterdrückung der
Verminderung der Knochensubstanz, die bei Osteoporose und Zahnwurzel-Erkrankungen
auftreten, und bei der Verhinderung von Frakturen nützlich,
die verknüpft
sind mit Osteoporose und rheumatoider Arthritis.
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