DE68924804T2

DE68924804T2 - Polypeptid mit sich wiederholenden zelladhäsiven Hauptsequenzen.

Info

Publication number: DE68924804T2
Application number: DE68924804T
Authority: DE
Inventors: Ichiro Azuma; Norio Nishi; Ikuo Saiki; Seiichi Tokura
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-06-24
Filing date: 1989-06-23
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2009-06-24
Also published as: ATE130312T1; JP2625156B2; GR3018096T3; DE68924804D1; US5183804A; EP0347931A3; JPH02174798A; ES2081817T3; EP0347931B1; EP0347931A2

Description

Die Erfindung betrifft ein Polypeptid, umfassend die Wiederholung einer bestimmten Aminosäuresequenz, die aus dem anhaftenden Kern von Zell-anhaftenden Proteinen besteht, wie auch die Verwendung des Polypeptids in verschiedenen Arzneimitteln einschließlich einem Antimetastasemittel für Krebs.
Einige Proteine, wie Fibronectin, Laminin und Vitronectin betreffen die Haftung zwischen Zellen und interstitiellen Verbindungsgeweben und üben verschiedene physiologische Aktivitäten hinsichtlich der zellulären Funktionen von tierischen Zellen aus. Diese Proteine werden im allgemeinen als Zell-haftende Proteine bezeichnet Z. B. ist Fibronectin ein Glycoprotein, das in der Leber synthetisiert wird und in einer Konzentration von ca. 0,3 mg/ml in humanem Plasma vorkommt.
Fibronectin umfaßt ein Dimer der Polypeptidkette A mit einem Molekulargewicht von ca. 250 K und Kette B mit einem Molekulargewicht von ca. 240 K, die in der Nachbarschaft ihrer beiden Carboxylenden über Disulfidbindungen verbunden sind. Kornblihtt A.R. et al. klärten die Primärstruktur des Fibronectin durch molekulare Klonierungstechniken auf [EMBO Journal, 4; 1755 (1985)]. Andererseits wurde die Primärstruktur von Laminin von Sasaki M. et al. aufgeklärt [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 935 (1987) und J. Biol. Chem., 262, 17111 (1987)] und die Primärstruktur von Vitronectin wurde aufgeklärt von Suzuki 5. et al. [EMBO Journal, 4, 2519 (1985)].
Es wurden weitere Untersuchungen über die Bindungsstellen betreffend die Zell-anhaftende Aktivität unternommen. Die Bindungsstellen von sowohl der A- als auch der B-Kette wurde durch teilweisen Verdau von Fibronectin mit Proteasen und anschließender Überprüfung der Bindung der so enthaltenden Fragmente an Heparin, Kollagen, Zellen und Bakterien aufgeklärt [Yamada KM., Ann. Rev. Biochem., 52, 761 (1983)]. Ferner wurde 1984 geklärt, daß die Kernsequenz der Zellbindungsstelle dieser Ketten Arg-Gly-Asp (RGD) war [Pierschbacher M.D. et al., Nature, 309, 30 (1984)]. Man weiß, daß diese RGD-Sequenz auch in anderen Haftproteinen, wie Vitronectin, vorkommt. Es wurde ebenfalls geklärt, daß die Kernsequenz der Zellbindungsstelle von Laminin Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg ist [Graf J. et al., Cell, 48, 989 (1987)].
Daher haften Fibronectin und Laminin an Rezeptoren von Zellen über die obige Kernsequenz und übertragen Information an die Zellen, an die sie anhaften. Man glaubt ferner, daß diese Substanzen zur Bindung von Biopolymeren, wie Heparin, Kollagen und Fibrin in der Lage sind, und daher die Haftung zwischen Zellen und Bindegeweben und die Differenzierung und Wachstum von Zellen betreffen [Yamada K.M., Ann. Rev. Biochem., 52, 761 (1983)].
Es wurden Versuche unternommen, diese Zell-haftenden Proteine mit den verschiedenen oben beschriebenen biologischen Aktivitäten für viele Zwecke einschließlich medizinischen einzusetzen. Z. B. würde eine Abnahme des Plasmafibronectinspiegels die retikuloendotheliale Funktion senken. Dieses Phänomen wird z. B. bei durch chirurgische Operation oder Trauma, intravaskuläre Koagulations-Disseminata, Verbrennungen, ernsthaften infektiösen Erkrankungen und chirurgischen Schock beobachtet. Es scheint daher, daß die Verabreichung von Fibronectin ein wirksamer Weg zur Verbesserung dieser Zustände ist. Ferner erwartet man, daß Fibronectin für die Behandlung von Wunden und zur Immunmodulation anwendbar ist, da es die Wanderung von Fibroblasten und Makrophagen aktiviert. Ein Versuch zur Anwendung von Fibronectin, welcher die Heilung von Wunden fördern würde, auf topische Behandlung von kornealen Fehlfunktionen wurde bereits unternommen [Fujikawa L.S. et al., Lab. Invest., 45, 120 (1981)].
Andererseits ist Laminin zur Bindung an Kollagen IV, Heparinsulfat, Proteoglycanen und Zellen in der Lage. Zusätzlich übt Laminin einen Effekt auf die Förderung der Verlängerung von Neuronaxonen aus. Daher sind seine in-vivo-Wirkungen äußerst interessant.
Ferner haben Zell-haftende Proteine Aufmerksamkeit erregt, da sie die Metastasen von Krebs betreffen. Während des Metastasestadiums eines Krebs kommen Krebszellen in Kontakt mit verschiedenen Zellen oder Biopolymeren. Wenn Zellhaftproteine, wie Fibronectin oder Laminin, während dieses Stadiums vorhanden sind, bilden die Krebszellen eine multizelluläre Masse, welche das Wachstum oder Überleben der Krebszellen erlaubt. In der Tat wurde beobachtet, daß die Verabreichung von Laminin zusammen mit Krebszellen an ein Tier die Metastase von Krebs beschleunigte.
Im Gegensatz zu diesen Phänomenen ist jedoch berichtet worden, daß ein Fragment, erhalten durch Verdau von Laminin mit Proteasen, als Inhibitor für die Krebsmetastase wirkt [Barsky S.H. et al., J. din. Invest., 24, 843 (1984)]. Es wurde in ähnlicher Weise bestätigt, daß ein Tripeptid Arg-Gly- Asp, entsprechend der anhaftenden Kernsequenz des Fibronectins (Humphries M.J. et al., Science, 233, 467 (1986)] und ein Pentapeptid Tyr-Ile-Gly-Ser- Arg, entsprechend dem des Laminins [Iwamoto Y. et al., Science, 238, 1132 (1987)] als Inhibitor für die Krebsmetastasen wirken.
Wie oben beschrieben, haben Zellhaftproteine, wie Fibronectin und Laminin, verschiedene biologische Aktivitäten. Es ist daher erforderlich, Techniken zur Anwendung der Substanzen hinsichtlich des Einsatzes als Arzneimittel zu entwickeln. Man nimmt an, daß die antimetastatischen Wirkungen der anhaftenden Kernsequenz von Fibronectin und Laminin hoch-geeignet als Arzneimittel sind. Jedoch sind die zellhaftenden Aktivitäten der Kemseguenzen für praktische Anwendungen von einem medizinischen Standpunkt immer noch ungenügend. Demnach war es erforderlich, eine Substanz zu entwickeln, die eine verbesserte Aktivität zeigt. Jedoch sind diese Zellhaftproteine natürliche Substanzen und stehen daher nur beschränkt zur Verfügung. Ferner ist es bemerkenswert schwierig, diese Glycoproteinen über chemische Synthesen oder gentechnische Verfahren effizient herzustellen.
Die Erfindung stellt daher neue Verbindungen zur Verfügung, die bei einem angemessenen Spiegel verschiedene biologische Aktivitäten, die bei Zell-anhaftenden Proteinen beobachtet werden, zeigen, und die leicht hergestellt werden können, und die keine ernsten Nebenwirkungen auflebende Organismen haben. Die erfindungsgemäße Verbindung ist eine Polypeptidverbindung mit einer hohen antimetastatischen Aktivität im Vergleich zu den oben erwähnten Kemsequenzen. Zusätzlich zu ihrer antimetastatischen Aktivität ist die erfindungsgemäße Verbindung ebenfalls wirksam bei der Immunmodulation, der Wundheilung, der Inhibierung der Plättchenagglutination und der Neuriatrie.
Demnach stellt die Erfindung eine neue Polypeptidverbindung mit einem relativ niedrigen Molekulargewicht zur Verfügung, die leicht hergestellt werden kann und die verschiedene Aktivitäten ähnlich zu denen der Zell-anhaftenden Proteine hat.
Ferner stellt die Erfindung eine neue Polypeptidverbindung mit einer hohen antimetastatischen Aktivität zur Verfügung.
Weiterhin stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die neue Polypeptidverbindung, zur Verfügung.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Wirkung von PBS (Kontrolle) auf Krebs-induzierte Plättchenaggregation;
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Wirkung von Poly(Arg, Gly, ASP) (Vergleichsverbindung) auf Krebs-induzierte Plättchenaggregation; und
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Wirkung von Poly(Arg-Gly- Asp) (erfindungsgemäße Verbindung) auf Krebs-induzierte Plättchenaggregation.
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist gekennzeichnet durch sich wiederholende anhaftende Kern Aminosäuresequenzen der Zell-anhaftenden Proteine, die dargestellt werden durch die Formeln:
(Arg-Gly-Asp) n und (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)n
worin n eine Zahl von 2 bis 20 darstellt.
Falls das erfindungsgemäße Polypeptid dargestellt wird durch die Formel:
(Arg-Gly-Asp)n
sind Verbindungen mit einem Molekulargewicht von ca. 1000 bis 10000, insbesondere ca. 1500 bis 5000, bevorzugt, da sie ausreichend hohe biologische Aktivitäten haben und in wäßrigen Lösungsmitteln hoch-löslich sind.
Falls die erfindungsgemäße Verbindung dargestellt wird durch die Formel:
(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)n
sind Verbindungen mit einem Molekulargewicht von ca. 5000 bis 15000, insbesondere ca. 10000, aus den gleichen Gründen wie oben beschrieben bevorzugt.

HERSTELLUNG

Die erfindungsgemäße Verbindung kann hergestellt werden durch Polymerisieren eines entsprechenden kurzkettigen Peptids, erhalten auf übliche Weise, z. B. Arg-Gly-Asp oder Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, durch kontinuierliche Polymerisationsverfahren unter Verwendung von Diphenylphosphorylazid (DPPA) Alternativ kann die erfindungsgemäße Verbindung über gentechnische Verfahren erhalten werden.
Die Polypeptidverbindung der Erfindung kann aus entweder L- oder D- Aminosäuren bestehen. Da die erfindungsgemäße Verbindung als Arzneimittel verwendet werden soll, kann sie in pharmazeutisch annehmbare Salze, z. B. Salze anorganischer Säuren, wie Hydrochloride oder Sulfate oder Salze organischer Säuren wie Acetat, Trifluoracetat, Lacatat oder Tartrat überführt werden. Die Umwandlung der Verbindungen in diese Salze kann nach üblichen Verfahren durchgeführt werden.

WIRKUNG

Die erfindungsgemäße Polypeptidverbindung mit den sich wiederholenden Zellhaftproteinkernsequenzen haftet an die Zellen über die Kernsequenzen nach demselben Mechanismus, der bei Zell-anhaftenden Proteinen beobachtet wird. Daher zeigt die erfindungsgemäße Verbindung verschiedene biologische Aktivitäten als Agonist oder als Antagonist von Zell-anhaftenden Proteinen. Es ist hier festzustellen, daß die erfindungsgemäße Verbindung einen antimetastatischen Effekt hat, der 6 bis 10mal so hoch ist wie der der Zell-anhaftenden Proteinkemsequenzen. Ferner hat die erfindungsgemäße Polypeptidverbindung einen weiten Bereich biologischer Aktivitäten. Sie ist nämlich wirksam bei der Immunmodulation, der Wundheilung, der Inhibierung von intravaskulärer Plättchenaggregation, verursacht durch Krebszellen, und Linderung von Neuro-Fehlfunktionen. Sie zeigte keine Toxizität bei der Überprüfung in Experimenten an Mäusen.
Demnach kann mindestens eine der erfindungsgemäßen Polypeptidverbindungen, wahlweise zusammen mit geeigneten üblichen Trägern oder pharmazeutischen Adjuvanzien, an einen Patienten als ein antimetastatisches Mittel für Krebs, ein Wundheilmittel, ein Immunmodulator, ein Plättchenaggregationsinhibitor oder als Linderungsmittel für Neuro-Fehlfunktionen verabreicht werden. Die Dosis kann je nach Zustand, Alter, Körpergewicht, usw. des Patienten innerhalb des Bereiches von 0,2 ug/kg bis 400 mg/kg festgelegt werden.
Das Verabreichungsverfahren für das erfindungsgemäße Polypeptid kann vorzugsweise aus solchen, die üblicherweise für Peptidarzneimittel verwendet werden, ausgewählt sein, z. B. parenterale Verabreichungsverfahren, wie die intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung. Die erfindungsgemäße Polypeptidverbindung kann in eine Injektion formuliert sein, die für die obigen Verabreichungsverfahren z. B. nach dem folgenden Verfahren geeignet ist. Sie wird in PBS oder physiologischer Kochsalzlösung, wie im folgenden gezeigt, unter Erhalt einer Injektion gelöst. Alternativ kann sie z. B. in 0,1 N wäßrige Lösung von Essigsäure gelöst und dann lyophilisiert werden. Diese Präparationen können ferner konventionelle Stabilisatoren, wie Glycin oder Albumin enthalten. Außerdem kann Kollagen oder ein Liposom als Träger verwendet werden, um die Halbwertszeit der erfindungsgemäßen Verbindung im Blut zu verlängern.
Wahlweise kann das erfindungsgemäße Polypeptid in Mikrokapseln für orale Verabreichung, z. B. durch Verkapselung in einem Liposom, formuliert werden. Ferner kann es über andere Schleimhäute als dem Verdauungstrakt durch Formulierung in z. B. Suppositorien, sublinguale Tabletten oder Nasensprays absorbiert werden.

BEWERTUNG DER BIOLOGISCHEN AKTIVITÄT

Nun werden die biologischen Aktivitäten der erfindungsgemäßen Verbindung, bezogen auf die Ergebnisse von pharmakologischen Tests, beschrieben.

(1) ANHAFTUNG AN ZIELZELLEN

Die Anhaftung an Zielzellen der erfindungsgemäßen Verbindung wurde nach dem von Saiki et al. berichteten Verfahren überprüft [Cancer Immunol., Immunother., 22, 125 (1986)]. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit einer Struktur von (Arg-Gly-Asp)n und einem Molekulargewicht von ca. 5000 im folgenden Synthesebeispiel 1 hergestellt, und ein Vergleichspolypeptid (Arg, Gly, Asp)n mit einer Zufallssequenz der entsprechenden Aminosäuren Arg, Gly und Asp und mit einem Molekulargewicht von ca. 5000, hergestellt im folgenden Synthesebeispiel 3, wurden verwendet. Die Haftung einer jeden Verbindung wurde unter Verwendung von Maus-B16-BL6-Melanomazellen als Ziele geprüft.
Zunächst wurden Mikrokulturwelis mit 20 ug/ml des zu überprüfenden Pclypeptids oder 5 ug/ml Maus-Fibronectin (erhalten von Seikagaku Kogyo, Japan), welches als positive Kontrolle verwendet wurde, vorbeschichtet. Anschließend wurden 0,05 ml/Well B16-BL6-Melanomazellen (2 x 10&sup4;) mit einem radioaktiven Jodid [¹²&sup5;J]JUDR hier zugegeben und die Zellen wurden bei 37ºC 20 Minuten kultiviert. Die Zahl der so von den Kulturwelis absorbierten Zellen wurde durch Messen der Radioaktivität bestimmt. 1 % Rinderserumalbumin (RSA) wurde als negative Kontrolle verwendet. Die B16-BL6-Melanomazellen wurden durch Kultur zu markierenden Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase für 24 Stunden in einem MEM-Medium, enthaltend 5 % FBS und 0,3 uCi/ml [¹²&sup5;J]JUdR (200 mCi/mmol; erhalten von New England Nudear, Boston, Mass., USA) markiert.
Die markierten Zellen wurden mit physiologischer Kochsalziösung zweimal gewaschen und in 0,05 % EDTA 1 Minute suspendiert. Anschließend wurden die Zellen gesammelt und in einem serumfreien MEM-Medium suspendiert. Die so erhaltene Zellsuspension wurde bei der obigen Prüfung eingesetzt. Die nicht-adsorbierten Zellen im Well wurden mit PBS 4mal weggewaschen. Die vom Well adsorbierten Zellen wurden in 0,1 ml 0,1 N NaOH gelöst. Die Zahl der adsorbierten Zellen wurde durch Messen der Radioaktivität der gelösten Zellen bestimmt.
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Wie Tabelle 1 angibt, beschleunigte das erfindungsgemäße Poly(Arg-Gly-Asp) und Fibronectin die Anhaftung der B16-BL6-Melanomazellen, wogegen Behandlung mit dem Poly(Arg, Gly, Asp) mit der Zufallssequenz und RSA kaum eine Adsorption der Zellen auslöste. Die Ergebnisse legen nahe, daß die Zell-anhaftende Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids vergleichbar zu der von Fibronectin ist. TABELLE 1 ANHAFTUNG VON B16-BL6-MELANOMAZELLEN AN MIT POLYPEPTID ODER FIBRONECTIN BESCHICHTETES SUBSTRAT Anhaftung Zahl angehafteter Zellen/Substrat (SD) Überzug Inkubiert mit Fibroneotin Poly (Acg-Oly-Asp) Poly(Arg, Gly, Asp) RSA Fibronectin + Arg-Gly-Asp + His-Gly-Gly + Poly(Arg-Gly-Asp)
Tabelle 1 zeigt auch die Ergebnisse der Überprufung der Zell-anhaftenden Spezifität von Poly(Arg-Gly-Asp) und Fibronectin. Es wurden hierzu 2 x 10&sup4; B16-BL6-Zellen zu den Kulturzellen gegeben, die auf die gleiche Weise wie oben beschrieben behandelt worden waren. Dann wurden diese Zellen darin 20 Minuten bei 37ºC in Degenwart von 100 oder 500 ug/ml eines synthetischen Peptids Arg-Gly-Asp, 100 oder 500 ug/ml oder des Poly(Arg-Gly-Asp) oder 500 mg/ml His-Gly-Gly kultiviert. Es wurde dann gefunden, daß die Haftung des Fibronectins an die Zellen inhibiert war, wenn sie in Gegenwart von Arg-Gly-Asp oder Poly(Arg-Gly-Asp) kultiviert wurden, wohingegen keine Inhibierung in Gegenwart von His-Gly-Gly (siehe Tabelle 1) beobachtet wurde.
Die Zellhaftung von Fibronectin wurde dosisabhängig unter Verwendung des synthetischen Tripeptids Arg-Gly-Asp inhibiert. Sie wurde ferner durch 5 mM EDTA inhibiert. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß der Zellhaftmechanismus von Poly(Arg-Gly-Asp) spezifisch abhängig von divalenten Metallionen wie Kalzium und Magnesiumionen und der Arg-Gly-Asp-sequenz wäre. Es wurde vorgeschlagen, daß das Poly(Arg-Gly-Asp) an Zellen über den gleichen Rezeptor anhaftet, der auch bei der Haftung von Fibronectin an die Zellen beteiligt ist.
Daher legten die Ergebnisse der obigen Überprüfung nahe, daß die erfindungsgemäße Polypeptidverbindung für Arzneimittel als Agonist oder Antagonist von Fibronectin einsetzbar ist.

(2) ANTIMETASTATISCHE WIRKUNG

(a) Anschließend wurde die antimetastatische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung mit sich wiederholenden Kemsequenzen als Arg-Gly- Asp auf Krebs geprüft. Ein 500-ug-Anteil eines jeden synthetischen Polypeptids Poly(Arg-Gly-Asp) mit einem Molekulargewicht von ca. 5000, einem Tripeptid Arg-Gly-Asp und einem Polypeptid Poly(Arg, Gly, Asp) mit einem Molekulargewicht von ca. 5000 wurde mit 5 x 10&sup4; B16-BL6-Melanomazellen vermischt, die sich in der oben erwähnten logarithmischen Wachstumsphase befanden, und eine extrem starke Metastase zeigten, in PBS. 0,2 ml einer jeder so erhaltenen Mischung wurde intravenös in eine Gruppe von männlichen C57BL/6-Mäusen injiziert. Jede Gruppe bestand aus 5 Tieren. 14 Tage nach Verabreichung wurden die Krebskolonien in den Lungen der Tiere gezählt und die erhaltenen Daten mit solchen einer Kontrollgruppe, die PBS allein erhielten, verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2-1 (Test 1) wiedergegeben. Wie die Ergebnisse anzeigen, war die Metastase in die Lungen deutlich durch Verabreichung von Poly(Arg-Gly-Asp) inhibiert. Im Gegensatz hierzu zeigte weder die Verabreichung von Arg-Gly-Asp noch Poly(Arg, Gly, Asp) einen solchen antimetastatischen Effekt. Tabelle 2-1 zeigt ferner, daß die Menge von Arg-Gly-Asp, wie sie zum Erreichen eines mit dem Poly(Arg- Gly-Asp) vergleichbaren antimetastatischen Effekt notwendig war, 3000 ug ist, d. h. ca. 6mal so viel wie bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid.
(b) Anschließend wurden die antimetastatischen Wirkungen von zwei Polypeptiden mit je sich wiederholenden Arg-Gly-Asp-Sequenzen, nämlich Poly(Arg-Gly-Asp)-1500 (Molekulargewicht ca. 1500) und Poly(Arg-Gly-Asp)- 5000 (Molekulargewicht ca. 5000) geprüft. 1000 ug einer jeden Verbindung wurde an Mäusen auf dieselbe Weise wie im obigen Test 1 verabreicht und die Wirkungen wurden beobachtet. Wie Tabelle 2-1 (Test 2) angibt, zeigten beide in Test 2 verwendeten Verbindungen einen deutlichen antimetastatischen Effekt im Vergleich zur Kontrollgruppe.
Ferner wurde Poly(Arg-Gly-Asp)-5000 nicht mit B16-BL6-Zellen vermischt, sondern intravenös an Mäusen verabreicht, denen 5 Minuten zuvor B16-BL6-Zellen verabreicht worden waren. In diesem Fall wurde auch ein hoher antimetastatischer Effekt beobachtet. Diese Tatsache weist darauf hin, daß die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindung in geeigneter Weise, wie intravenöser Injektion, einen antimetastatischen Effekt ergibt. TABELLE 2-1 WIRKUNG VON POLYPEPTIDEN AUF DIE EXPERIMENTELLE METASTASE VON KREBS, INDUZIERT DURCH INJEKTION BON B16-BL6-MELANOMAZELLEN Metastase in die Lunge Verbindung Verabreichung Dosis (ug) Mittelwert ± Standardabweichung (Bereich) Test 1 PBS (unbehandelt) Poly(Arg-Gly-Asp) Arg-Gly-Asp Poly(Arg, Gly, Asp) Test 2 (Molekulargewicht: 5000) (Molekulargewicht: 15000) gleichzeitig dito getrennt *: p < 0,001 im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle in der t-Kalibrierung der Studie
(c) Anschließend wurde ebenfalls der Antimetastaseeffekt einer Polypeptidverbindung Poly(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), erhalten in dem folgenden Synthesebeispiel 4, das ein Molekulargewicht von ca. 10000 und eine Zellanhaftende Kernsequenz von Laminin (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) hatte, geprüft. Es wurden 2, 20 und 100-ug-Portionen der obigen Verbindung jeweils mit 3 x 10&sup4; Lewis-Lungenkrebszellen (3LL) vermischt und an eine Gruppe von C57BL/6-Mäusen auf die gleiche Weise wie oben unter (b) beschrieben verabreicht. Auf diese Weise wurde die Antimetastasewirkung dieser Verbindung geprüft. Tabelle 2-2 zeigt die Ergebnisse. Wie aus Tabelle 2-2 hervorgeht, war die Metastase des Krebses in die Lungen deutlich durch Verabreichung von Poly(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) inhibiert. Im Gegensatz hierzu zeigte die Verabreichung von 100 ug eines Pentapeptids Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg kaum einen Antimetastaseeffekt. Obwohl dieses Ergebnis nicht in der obigen Tabelle gezeigt ist, war es erforderlich, mindestens 200 ug dieser Verbindung zu verabreichen, um einen signifikanten Effekt zu erreichen. Dieses Ergebnis zeigt, daß das erfindungsgemäße Polypeptid mit den sich wiederholenden Pentapeptidsequenzen eine Antimetastaseaktivität von beinahe 10-fach so hoch wie die des ursprünglichen Pentapeptids zeigt. TABELLE 2-2 WIRKUNG VON POLYPEPTIDEN AUF DIE EXPERIMENTELLE METASTASE, INDUZIERT DURCH INJEKTION VON METASTATSIERENDEN KREBSZELLEN Anzahl von Metastaseaufteten in die Lunge Krebs Verabreichte Verbindung Dosis (ug/Tier) Mittelwert ± Standardabweichung (Bereich) Unbehandelt (PBS) Poly(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg Poly(Arg-Gly-Asp) *: p < 0,01 im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle in der t-Kalibrierung der Studie. **: p < 0,02 im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle in der t-Kalibierung der Studie.

(3) INHIBITOREFFEKT AUF KREBSZELLRETENTION IN LUGEN

Eine Untersuchung ähnlich zu der oben beschriebenen belegte, daß die erfindungsgemäße Verbindung einen Inhibitoreffekt auf die Retention von Krebszellen in Lungen hat. B16-BL6-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden mit [¹²&sup5;J]JUdR markiert. 0,2-ml-Portionen einer Lösung, enthaltend 2 x 10&sup4;/Maus dieser markierten Zellen und 500 ug/Maus Poly(Arg- Gly-Asp) mit einem Molekulargewicht von 5000 wurden intravenös in den Schwanz von C57BL/6-Mäusen injiziert. Die Leber, Nieren, Milz und Lungen eines jeden Tiers wurden 30 Minuten oder 24 Stunden nach der Verabreichung entfernt und die Radioaktivität in diesen Organen gemessen. Mäuse, die PBS erhalten hatten, wurden als Kontrolltiere verwendet. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse. Die Radioaktivität der Lungen der mit Poly(Arg-Gly-Asp) verabreichten Gruppe war deutlich niedriger als die der Kontrollgruppe, obwohl kein signifikanter Unterschied in anderen Organen, einschließlich dem Blut beobachtet wurde. Diese Tatsache weißt darauf hin, daß die Retention von Krebszellen in den Lungen deutlich in der Testgruppe inhibiert war. TABELLE 3 VERTEILUNG UND RETENTION VON [¹²&sup5;J]JUdR-MARKIERTEN B16-BL6- MELANOMZELLEN, VERABREICHT ZUSAMMEN MIT POLY(Arg-Gly-Asp) AN C57BL/6-MÄUSEN Radioaktivität (cpm ± Standardabweichung)* Unbehandelt (PBS) Poly(Arg-Gly-Asp) Organ Lunge Leber Milz Niere Blut (1 ml) *: Mittel von 3 Tieren. **; Prozentsatz relativ zur verabreichten Radioaktivität (15308 ± 1605 cpm/2 x 10&sup4; Zellen) ist in Klammern angegeben. ***: p < 0,02 in der t-Kalibrierung der Studie im Vergleich zur unbehandelten (PBS)-Gruppe.

(4) ANTIMETASTASEEFFEKT AUF DAS SPONTANE METASTASEMODELL

Ferner wurde der Antimetastaseeffekt der erfindungsgemäßen Verbindung auf ein spontanes Metastasemodell geprüft. Es wurden B16-BL6-Zellen in die Fußpfoten von C57BL/Mäusen (jede Gruppe mit 5 Tieren) transplantiert. Dann wurden 100 ug oder 50 ug Poly(Arg-Gly-Asp) mit einem Molekulargewicht von ca. 5000 topisch direkt an die Stelle des transplantierten Krebses in jedem Tier in einer einzelnen oder aufgeteilten Dosis innerhalb eines bestimmten Zeitraums verabreicht. Der transplantierte Krebs wurde am 21. Tag entfernt und die Maus wurde zwei Wochen später seziert, um die Metastase des Krebs in die Lunge zu überprüfen. Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse. Es wurde gefunden, daß die Metastase von Krebs in die Lungen deutlich vermindert war, und das Wachstum des transplantierten Krebses an sich nicht unterdrückt werden konnte durch Verabreichung von 100 ug der Verbindung am ersten oder siebten Tag in einer einzelnen Dosis oder durch Verabreichung von 50-ug-Portionen desselben am 7., 10. 13. und 16. Tag.
Im Gegensatz hierzu hatte die Verabreichung von 100 ug Poly(Arg, Gly, Asp) mit einer zufälligen Aminosäuresequenz am 7. Tag überhaupt keine Suppressorwirkung auf die Metase des Krebs in die Lungen. TABELLE 4 INHIBITOREFFEKT VON POLYPEPTIDEN AUF SPONTANE METASTASE VON B16-BL6- MELANOMAZELLEN, VERABREICHT IN DIE FUßSOHLE Beobachtung am 21. Tag Verbindung Dosis (ug/Tier) Verabreichungstag Größe des transplantierten Krebs (mm 1 Standardabweichung) Anzahl von Metastaseauftreten in der Lunge (mm ± Standardabweichung Unbehandelt (PBS) Poly(Arg-Gly-Asp) *: p < 0,001 bei der t-Kalibration der Studie im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.

(5) SUPRESSIONSEFFEKT AUF DIE PLÄTTCHENAGGREGATION INDIZIERTER KREBSZELLEN

Die Wirkung von Poly(Arg-Gly-Asp) auf die durch Krebszellen induzierte Plättchenaggregation wurde geprüft. Das Blut einer C57BL/6-Maus wurde bei 160 x g 15 Minuten unter Erhalt eines Plättchen-reichen Plasmas (PRP) zentrifugiert. Als Kontrolle wurde Plättchen-armes Plasma (PPP), erhalten durch Zentrifugation von Blut bei 1000 x g für 10 Minuten, verwendet.
Poly(Arg-Gly-Asp) mit einem Molekulargewicht von 5000 wurde zu 250 ul des obigen PRP- oder PPP-Plasmas (5 x 10&sup5;/ul) zugegeben. Nach 5- bis 7-minütiger Präinkubation wurde die Mischung zu einer Suspension von B16-BL6-Zellen in physiologischer Kochsalziösung (ca. 10&sup6;/ml) gegeben und bei 37ºC bei 1000 Upm/min gerührt. Während dieses Zeitraums wurde die Aggregation der Plättchen mit einem dualen Aggregometer (Modell 440; Chrono-Log, USA) überprüft. Zum Vergleich wurde das obige Verfahren wiederholt, wobei das Poly(Arg-Gly-Asp) mit Poly(Arg, Gly, Asp) ersetzt wurde. Fig. 1 bis 3 zeigen zusammen die Ergebnisse. Fig. 1, 2 und 3 zeigen die beobachtete Plättchenaggregation bei Behandlung von heparinisiertem PRP mit PBS; mit 100 ug/ml Poly(Arg, Gly, Asp); und mit 100 pg/ml Poly(Arg-Gly-Asp); 7 Minuten vor Zugabe der B16-BL6-Melanomazellen (gezeigt durch einen Pfeil) in jedem Fall. Wie diese Figuren angeben, unterdrückte die erfindungsgemäße Verbindung Poly(Arg-Gly-Asp) die Plättchenaggregation (Fig. 3), wogegen der Vergleich Poly(Arg, Gly, Asp) kaum eine Suppressionsfähigkeit zeigte (Fig. 2).

(6) TOXIZITÄT

Die obigen Tests (1) bis (5) zeigten, daß Poly(Arg-Gly-Asp) mit einem Molekulargewicht von 5000 oder 1500 und Poly(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) mit einem Molekulargewicht von 10000 weder irgendeine Zytotoxizität auf Erythrocyten, Milz und Thymuszellen noch unerwünschten Aggregationseffekt auf Serumproteine zeigte.

FORMULIERUNG

Wie oben erwähnt, wird das erfindungsgemäße Polypeptid, wie andere pharmazeutische Peptide, vorzugsweise parenterale in Form einer Injektion für die intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung gegeben. Alternativ kann das Peptid oral in Form einer Mikrokapsel, enthaltend das Peptid in Liposom verabreicht werden, oder kann durch Adsorption durch andere Schleimhautmembranen als im Verdauungstrakt in Form eines Suppositonums, sublingualen Mittels oder Nasensprays verabreicht werden.
Die folgenden Formulierungen sind als nicht-beschränkende Beispiele für die Erfindung gegeben.

A) INJIZIERBARE LÖSUNG

Zusammensetzung
Erfindungsgemäßes Peptid 2 g
Natriumchlorid 8 g
Ascorbinsäure 2 g
Steriles Wasser 1 l
Das Peptid, Ascorbinsäure und Natriumchlorid wurden in sterilem Wasser gelöst, eine Ampulle wurde mit 5 ml Lösung gefüllt und dann unter Bereitstellung einer injizierbaren Lösung versiegelt.

B) LYOPHILISAT

Zusammensetzung
Erfindungsgemäßes Peptid 2 g
Sorbitol 20 g
Das Peptid und das Sorbitol wurden in 200 ml sterilem Wasser gelöst, eine Ampulle wurde mit 1 ml der Lösung gefüllt und lyophilisiert, anschließend wurde die Ampulle versiegelt. Diese Zusammensetzung kann in 5 ml sterilem Wasser vor der parenteralen Verabreichung gelöst werden.

SYNTHESEBEISPIEL

Im folgenden werden Beispiele für das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung beschrieben. Aminosäurederivate wurden von Peptide Institute, Inc. (Hinoh-shi, Osaka, 562 Japan) erworben, wogegen Peptide nach dem Flüssigphasenverfahren synthetisiert wurden. Die Bewertung der Reinheit der Polypeptide und die Identifikation einer jeden Verbindung erfolgte durch Dünnschichtchromatographie [Emtwicklungslösungsmittel: (A) obere Schicht einer Mischung von n-Butanol:Essigsäure:Wasser = 4:1:5; (B) n-Butanol:Pyridin:Essigsäure:Wasser = 15:10:3:12; (C) wäßriges Ammonium-gesättigtes n-Butanol, usw.], Elementaranalyse und Infrarotspektrometrie. Polypeptide mit regulären Sequenzen oder Zufallssequenzen wurden durch das Verfahren, beruhend auf die Verwendung von Diphenylphosphorylazid (DPPA) synthetisiert. Die Schutzgruppen (Mts- und Bzl-Gruppen) der funktionellen Gruppen auf den Seitenketten wurden durch Verwendung von Methansulfonsäure/Anisol oder Trifluormethansulfonsäure/Thioanisol entfernt. Schließlich wurde die Guanidgruppe der Argininseitenkette in ein Hydrochlorid mit einem Ionenaustauscherharz (Amberlite IRA-400) überführt. Die Entfernung der Schutzgruppen wurde durch Infrarotspektrometrie bestätigt. Das Molekulargewicht wurde grob durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Gelkonzentration: 15 oder 20 %) in Gegenwart von 1 % Natriumdodecylsulfat abgeschätzt.

SYNTHESEBEISPIEL 1: POLYPEPTID (Molekulargewicht: ca. 5000)

(1) t-Butoxycarbonylglycyl-β-benzyl-L-asparaginsäure [Boc-Gly- Asp(OBzl)-OH] (I)

5,3 g (30 mmol) t-Butoxycarbonylglycin wurden in 100 ml gereinigtem THF gelöst und es wurden 4,5 ml (33 mmol) Triethylamin und 4,33 ml (33 mmol) Isobutylchlorformiat bei -15ºC zugegeben. Die Mischung wurde bei dieser Temperatur 10 Minuten gerührt. Zur erhaltenen Mischung aus einem ge mischten Säureanhydrid wurde eine Lösung zugegeben, die durch Lösen von 8,0 g (36 mmol) β-Benzyl-L-asparaginsäure und 5,02 ml (36 mmol) Triethylamin in Wasser und Abkühlen auf 0ºC hergestellt wurde. Die Mischung wurde dann bei OCC 1 Stunde gerührt und ferner bei Raumtemperatur 15 Stunden. Nach Entfernen des THF durch Konzentration unter vermindertem Druck wurde kalte 10%ige Zitronensäure herzu zugegeben. Das so gebildete Präzipitat wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und 5mal mit 1/5 Volumen an 5 % Zitronensäure und dann 10mal mit Wasser (1/10 Volumen davon) gewaschen. Die Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und zur Trockne konzentriert. Dann wurde der Rückstand in Ether gelöst und mit n-Hexan präzipitiert. Nach 3maligem Wiederholen dieser Vorschrift wurde das erhaltene Produkt getrocknet, wodurch 6,9 g der Titelverbindung erhalten wurden.

(2) Glycyl-β-benzyl-L-aspartathydrochlorid [HCl H-Gly-Asp(OBzl)-OH] (II)

3,2 g der Verbindung (I), erhalten im obigen Schritt (1), wurden in 80 ml gereinigtem Dioxan gelöst. Nach Zugabe von 80 ml 4 N HCl/Dioxan wurde die Mischung bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Nach Konzentrieren zur Trockne wurde trockener Ether zugegeben, wodurch das Produkt kristallisierte, welches durch Zentrifugation gesammelt und mit trockenem Ether mehrere Male gewaschen wurde. Auf diese Weise wurden 2,4 g der Titelverbindung erhalten.

(3) Nα-t-Butoxycarbonyl-Nω-mesitylensulfonyl-L-arginylglycyl-β-benzyl- L-aspartat [Boc-Arg(Mts)-Gly-Asp(OBzl)-OH] (III)

3,4 g (7,4 mmol) Nα-t-Butoxycarbonyl-Nω-mesitylensulfonyl-L-arginin wurden in 70 ml gereinigtem THF gelöst und es wurden 1,13 ml (8,1 mmol) Triethylamin und 1,07 ml (8,1 mmol) Isobutylchlorformiat bei -15ºC zugegeben. Die erhaltene Mischung wurde bei dieser Temperatur 10 Minuten gerührt, und man ließ sich ein gemischtes Säureanhydrid bilden. 2,4 g (ca. 8,0 mmol) der Verbindung (II), wie im obigen Schritt (2) beschrieben, und 2,68 ml (19,2 mmol) Triethylamin wurden in einer Lösungsmittelmischung, enthaltend 70 ml THF, 50 ml DMF und 10 ml Wasser, gelöst und auf 5ºC gekühlt. Diese Lösung wurde zu der oben erwähnten gemischten Säureanhydridlösung zugegeben, und die Mischung wurde bei 5ºC 1 Stunde gerührt, wobei Rühren bei Raumtemperatur für 15 Stunden folgte. Nach Entfernen des THFs und Wassers durch Konzentration unter vermindertem Druck, wurde 5 % Zitronensäure zu der restlichen DMF-Lösung zugegeben. Das so gebildete Präzipitat wurde durch Abgießen abgetrennt, sorgfältig mit 5 % Zitronensäure und Wasser gewaschen und getrocknet. Nach zweimaligem Waschen mit Ether wurde der Rück stand aus Methanol/Ether umkristallisiert und durch Abgießen abgetrennt. Das Präzipitat wurde in einem pulver durch Behandeln mit Ether umgewandelt. Diese Pulver wurde dann zentrifugiert, mit Ether gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise wurden 3,9 g der Titelverbindung erhalten.

(4) Nω-Mesitylensulfonyl-L-arginylglycyl-β-benzyl-L-asparathydrochlorid [HCl H-Arg(Mts)-Gly-Asp(OBzl)-OH] (IV)

1,5 g (2,1 mmol) der Verbindung (III) wurden in 30 ml gereinigtem Dioxan gelöst und es wurden 30 ml 4 N HCl/Dioxan zugegeben. Die Mischung wurde 1 Stunde gerührt. Nach Konzentration zur Trockne wurde das Produkt durch Zugabe von trockenem Ether kristallisiert. Die Kristalle wurden zentrifugiert, mit trockenem Ether mehrere Male gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise wurden 1,3 g der Titelverbindung erhalten.

(5) L-Arginylglycylaspartathydrochlorid (2HCl H-Arg-Gly-Asp-OH) (V)

300 mg der Verbindung (III} wurden in einer Mischung von 4 ml Methansulfonsäure und 1 ml Anisol gelöst, und die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur 1,5 Stunden gerührt. Nach Zugabe von trockenem Ether wurde das so gebildete Präzipitat durch Dekantation abgetrennt, sorgfältig mit trockenem Ether gewaschen und getrocknet. Das Produkt wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst und durch eine mit Amberlite IRA-400 (Cl-Form) gepackten Säule geleitet. Dann wurde eine Fraktion, die die Zielverbindung enthielt, zur Trockne konzentriert, und der Rückstand wurde durch Behandeln mit Methanol/Ether kristallisiert. Nach Zentrifugation, Waschen mit Ether und Trocknen wurden 117 mg der Titelverbindung erhalten.

(6)Poly(Nω-mesitylensulfonyl-L-arginylglycyl-β-benzyl-L-aspartat) [Poly(Arg(Mts)-Gly-Asp(OBzl)] (VI)

400 mg (0,58 mmol) der Verbindung (IV) wurden in 1,2 ml gereinigtem DMSO gelöst und es wurden 0,19 ml (0,87 mmol) DPPA und 0,285 ml (2,03 mmol) Triethylamin hier zugegeben. Die erhaltene Mischung wurde bei 5ºC bis 8ºC 1 Stunde gerührt, worauf sich Rühren bei Raumtemperatur für 2 Tage anschloß. Anschließend wurden DPPA und Triethylamin wieder zugegeben, jeweils in derselben Menge. Die Polymerisation wurde weitere 2 Tage fortgesetzt. Das so gebildete Polymer wurde mit Wasser präzipitiert, zentrifugiert, sorgfältig mit Wasser und Methanol gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise wurden 295 mg der Titelverbindung erhalten.

(7) Poly(L-arginylglycyl-L-aspartathydrochlorid) [Poly(Arg-Gly- Asp)HCl] (VII)

100 mg der Verbindung (VI) wurden mit einer Mischung von 2 ml Methansulfonsäure und 0,4 ml Anisol unter Entfernung der Schutzgruppe in der Seitenkette behandelt. Dann wurde diese Position in das Hydrochlond durch Behandlung mit einem Anionenaustauscherharz umgewandelt. Das für die Synthese der Verbindung (V) verwendete Verfahren wurde wiederholt. Auf diese Weise wurden 60 mg der Titelverbindung mit einem Molekulargewicht von ca. 5000 erhalten.

SYNTHESEBEISPIEL 2: VERGLEICHSVERBINDUNG MIT ZUFALLSSEQUENZ

(1) Copoly(Nω-mesitylensulfonyl-L-arginin, Glycin, β-Benzyl-L-aspartat) [Copoly(Arg(Mts), Glyl, ASP(OBzl)] (VIII)

Eine Mischung, umfassend 356 mg (1,0 mmol) Nω-Mesitylensulfonyl-L-arginin, 75 mg (1,0 mmol) Glycin und 223 mg (1,0 mmol) β-Benzyl-L-aspartat wurde mit 0,97 ml (4,5 mmol) DPPA und 1,05 ml (7,5 mmol) Triethylamin in 2,0 ml gereinigtem DMSO polymerisiert. Das für die Synthese der Verbindung (VI) angewandte Verfahren wurde wiederholt.

(2) Copoly(L-argininhydrochlorid, Glycin, L-Asparaginsäure) [Copoly(Arg, Gly, Asp)HCl] (IX)

100 mg der Verbindung (VIII) wurden mit einer Mischung von 2 ml Methansulfonsäure und 0,4 ml Anisol unter Entfernung der Schutzgruppen in der Seitenkette behandelt. Dann wurden die Positionen in die Hydrochloride durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz umgewandelt. Das für die Synthese der Verbindung (V) angewandte Verfahren wurde wiederholt. Auf diese Weise wurden 50 ml der Titelverbindung mit einem Molekulargewicht von ca. 5000 erhalten.

SYNTHESEBEISPIEL 3: POLYPEPTID (Molekulargewicht: ca. 1500)

Poly(L-arginyl-glycyl-L-asparginsäure)hydrochlorid [Oligo(Arg-Gly- Asp) HCl] (X)

Die Polymerisation der Verbindung (VI) wurde 90 Minuten nach Einleitung abgebrochen. Das so erhaltene Oligopeptid mit einer geschützten Seitenkette wurde auf die gleiche Weise wie das, beschrieben bei der Synthese der Verbindung (VII), behandelt. Auf diese Weise wurde die Titelverbindung mit einem mittleren Molekulargewicht von ca. 1500 erhalten.

SYNTHESEBEISPIEL 4: POLYPEPTID (Molekulargewicht: ca. 10000)

(1) Nω-Mesitylensulfonyl-L-arginin-O-methylesterhydrochlorid [HCl- Arg(Mts)-OMe] (XI)

2,10 g Nω-t-Butoxycarbonyl-Nω-mesitylensulfonyl-L-arginin [Boc- Arg(Mts)-OH] wurden in 31 ml trockenem Dioxan gelöst, und es wurden 31 ml 4 N HCl-Dioxan hier zugegeben. Die erhaltene Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Die erhaltene Lösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert und dann durch Zugabe von trockenem Ether kristallisiert. Die Zielverbindung wurde durch Zentrifugation gsammelt, mit trockenem Ether mehrere Male gewaschen und in einem Desikator getrocknet.
Auf diese Weise wurden 1,1 g HCl H-Arg(Mts)-OH, aus dem die Boc-Gruppen entfernt worden waren, erhalten. Anschließend wurde dieses Produkt zu einer Lösung gegeben, die durch langsame Zugabe von 2,9 ml SOCl&sub2; zu 10,6 ml Methanol unter 10-minütigem Rühren bei -10ºC hergestellt worden war, und die erhaltene Mischung wurde 15 Stunden gerührt, zur Trockne Konzentriert, mit trockenem Ether kristallisiert, zentrifugiert, mit trockenem Ether mehrere Male gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise wurden 0,94 g HCl H- Arg(Mts)-OMe erhalten.

(2) Nω-t-Butoxycarbonyl-β-benzyl-L-seryl-Nω-mesitylensulfonyl-L-argininmethylester [Boc-Ser(Bzl)-Arg(Mts)-OME] (XII)

0,69 g (2,3 mmol) Boc-Ser(Bzl)-OH und 0,94 g (2,3 mmol) HCl-Arg(Mts)- OME wurden in einer Mischung von 16,3 ml gereinigtem DMF und 16,3 ml Dioxan gelöst, und die erhaltene Lösung wurde 10 Minuten bei 0ºC gerührt. Dann wurden 0,76 ml (2,76 mmol) DPPA und 0,74 ml /7,36 mmol) TEA zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Diese Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und das Dioxan wurde abdestilliert. Es wurde eine wäßrige Lösung von NaCl zum Rückstand zugegeben, und das so gebildete Präzipitat wurde durch Dekantation abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert, und der Extrakt wurde sorgfältig mit 5 % Zitronensäure, Wasser und Natriumbicarbonat gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat (Na&sub2;SO&sub4;) entwässert und zur Trockne eingedampft.

(3) Boc Gly-Ser(Bzl)-Arg(Mts)-OMe (XIII)

1,03 g der Verbindung (XII) wurden in 25,3 ml trockenem Dioxan gelöst, und es wurden 25,3 ml 4 N HCl/Dioxan zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt und dann zur Trockne eingedampft. Sie wurde dann durch Zugabe von trockenem Ether kristallisiert, und die Kristalle wurden zentrifugiert, mit trockenem Ether mehrere Male gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise wurden 0,68 g (1,2 mmol) HCl H-Ser(Bzl)- Arg(Mts)-OME erhalten. Diese Verbindung wurde in einer Lösungsmittelmischung von 9,4 ml gereinigtem DMF und 9,4 ml Dioxan zusammen mit 0,26 g (1,5 mmol) Boc-Gly-OH gemischt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 10 Minuten wurden 0,5 ml (1,8 mmol) DPPA und 0,49 ml (4,8 mmol) Triethylamin zugegeben, und die erhaltene Mischung wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Die so erhaltene Lösung wurde anschließend auf die gleiche Weise wie bei der Synthese der Verbindung (XII) behandelt, d. h. die Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und es wurde eine wäßrige Lösung von NaCl zugegeben. Das so gebildete Präzipitat wurde zur Entfernung der sauren und alkalischen Materialien gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise wurden 0,48g Boc-Gly-Ser(Bzl)-Arg(Mts)-OMe erhalten.

(4) Boc-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(Mts)-OMe (XIV)

Die Boc-Gruppe des Produkts (XIII) wurde auf die gleiche Weise wie bei Verbindung (XI) unter Erhalt von 0,40 g (0,63 mmol) HCl H-Gly-Ser(Bzl)- Arg(Mts)-OME entfernt. Sie wurde dann in einer Lösungsmittelmischung von 5,4 ml rektifiziertem DMF und 5,4 ml Dioxan zusammen mit der äquimolaren Menge (0,149) Boc-Ile-OH vermischt. Die erhaltene Lösung wurde 10 Minuten bei 0ºC gerührt, und dann wurden 0,21 ml DPPA und 0,20 ml Triethylamin zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Die so erhaltene Lösung wurde von sauren und alkalischen Materialien auf die Weise, wie bei den Verbindungen (XII) und (XIII) beschrieben, befreit. Nach Trocknen wurden 0,28 g Boc-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(Mts)-OMe erhalten.

(5) Boc-Tyr(Bzl)-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(Mts)-OMe (XV)

Die Boc-Gruppe des Produkts (XIV) wurde auf die gleiche Weise wie bei (1) entfernt, mit Ausnahme, daß ca. 2- oder 3mal so viel Lösungsmittel verwendet wurde, und die Reaktionszeit auf ca. 2- bis 3mal im Hinblick auf die Länge der Peptidkette und die sterische Hinderung der Ile-Seitenkette verlängert wurde. Es wurden 0,28 g des Produkts (XIV), 6,0 ml trockenes Dioxan und 6,0 ml 4 N HCl/Dioxan eingesetzt, wobei das Rühren für einen Zeitraum von 2 Stunden fortgesetzt wurde. Das erhaltene Peptid (HCl H-Ile-Gly- Ser(Bzl)-Arg(Mts)-OME, Ausbeute: 0,14 g (0,19 mmol)] wurde in einer Mischung von 2,8 ml rektifiertem DMF und 2,8 ml Dioxan zusammen mit 0,14 g (0,19 mmol) Boc-Tyr(Bzl)-OH gelöst. Die Lösung wurde 10 Minuten bei 0ºC gerührt. Anschließend wurden 0,12 ml DPPA und 0,72 ml Triethylamin zugegeben, und die Mischung bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Die so erhaltene Lösung wurde auf die gleiche Weise wie für Verbindung (XII) gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise wurden 0,12 g Boc-Tyr(Bzl)-Ile-Gly-Ser(Bzl)- Arg(Mts)-OMe erhalten.
(6) 0,14 g (0,13 mmcl) Produkt (XV) wurden in 1,95 ml trockenem Dioxan gelöst, und 0,68 ml 1 N NaOH wurde zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Nach Entfernen des Dioxans durch Konzentrieren unter vermindertem Druck wurden ca. 20 ml Wasser zugegeben und es wurde eine kleine Menge an unlöslichem Produkt abfiltriert. Das Filtrat wurde gekühlt und es wurden 10 % Zitronensäure bei 0ºC zugegeben. Das so gebildete Präzipitat wurde futriert, mit einer kleinen Menge Wasser zweimal gewaschen und dann getrocknet. Auf diese Weise wurden 0,10g Boc-Tyr(Bzl)-Ile- Gly-Ser(Bzl)-Arg(Mts)-OH erhalten. Dieses Produkt wurde in 6,0 ml trockenem Dioxan und 6,0 ml 4 N HCl/Dioxan 3 Stunden unter Entfernung der Boc-Gruppe gerührt. Auf diese Weise wurden 0,08 g HCl H-Tyr(Bzl)-Ile-Gly-Ser(Bzl)- Arg(Mts)-OH erhalten.

(7) Poly(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)HCl (XVII)

60 mg (0,061 mmol) HCl H-Tyr(Bzl)-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(Mts)-OH wurden in 0,2 ml rektifiziertem DMSO und 0,07 ml DPPA gelöst, und es wurden 0,06 ml Triethylamin zugegeben. Die Lösung wurde bei 0ºC 1 Stunde gerührt, worauf Rühren bei Raumtemperatur für 48 Stunden folgte. Nach 48 Stunden wurde eine zusätzliche Menge an DPPA und Triethylamin, jeweils in der gleichen Menge wie oben angegeben, zugegeben, und die Mischung wurde bei 0ºC 1 Stunde gerührt, worauf Rühren bei Raumtemperatur für 48 Stunden folgte. Zur so erhaltenen Lösung wurde Wasser zugegeben und die Mischung wurde mehrere Male unter Entfernung des DPPAs usw. zentrifugiert. Nach Zugabe einer kleinen Menge Methanol wurde die Zentrifugation vier weitere Male unter Entfernung von im Methanol gelösten niedrig-molekularen Peptiden wiederholt. Dann wurde der Rückstand noch einmal durch Dispersion in Ether zentrifugiert und dann getrocknet. Zur Entfernung der Schutzgruppen in den zweiten Ketten wurde ein 40-mg-Anteil des erhaltenen Poly(Tyr(Bzl)-Ile-Gly-Ser(Bzl)- Arg(Mts)) zu einer Lösungsmittelmischung, enthaltend 2 ml Trifluoressigsäure und 0,4 ml Trifluormethansulfonsäure zusammen mit 1 ml Thioanisol zugegeben, welches als Radikalfänger verwendet wurde. Die Mischung wurde bei 0ºC 2 Stunden gerührt. Die erhaltene Lösung wurde zur Trockne konzentriert und Ether wurde zugegeben. Das so gebildete Präzipitat wurde mit Ether 4mal gewaschen und getrocknet. Es wurde anschließend in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst und durch eine Säule eines Anionenaustauscherharzes (Amberlite IRA-400, Cl-Form) geleitet. Die das Zielprodukt enthaltende Fraktion wurde zur Trockne konzentriert, und der Rückstand wurde mit einer kleinen Menge Methanol präzipitiert. Nach mehrmaligem Waschen mit Ether und Trocknen wurden 22 mg Poly(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)HCl erhalten. Diese Polypeptid hat ein Molekulargewicht von ca. 10000.
Wie oben beschrieben, hat die neue erfindungsgemäße Polypeptidverbindung mit der sich wiederholenden Struktur eine höhere Zeilhaftung, verschiedene biologische Aktivitäten einschließlich einem Antimetastaseeffekt und ist kaum toxisch im Vergleich zu den Kemsequenzen von Zell-anhaftenden Proteinen. Ferner hat die erfindungsgemäße Polypeptidverbindung eine relativ einfache Struktur, was ihre Synthese einfach macht. Sie ist daher als Arzneimittel von hohem Wert.

Claims

1. Polypeptid umfassend sich wiederholende anhaftende Kemsequenzen eines Zell-anhaftenden Proteins oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz, dargestellt durch die Formel

(Arg-Gly-Asp)n

worin n eine Zahl im Bereich von 2 bis 20 ist.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, mit einem Molekulargewicht im Bereich von ca. 1500 bis ca. 5000.

3. Polypeptid umfassend sich wiederholende anhaftende Kemsequenzen eines Zell-anhaftenden Proteins oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz, dargestellt durch die folgende Formel

(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)n

worin n eine Zahl im Bereich von 2 bis 20 ist.

4. Polypeptid nach Anspruch 3 mit einem Molekulargewicht von ca. 10000.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Polypeptids nach einem der vorhergehenden Ansprüche oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon als Wirkstoff zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.