JP2000504676A

JP2000504676A - Ｖｉｐアナログの合成

Info

Publication number: JP2000504676A
Application number: JP9528106A
Authority: JP
Inventors: ボーリン，デービッド・ロバート; ダンホ，ウェーリード; フェリクス，アーサー・エム
Original assignee: エフ・ホフマン―ラロシュアーゲー
Priority date: 1996-02-09
Filing date: 1997-01-29
Publication date: 2000-04-18
Also published as: KR100493795B1; KR19990082403A; ATE328004T1; NO983626D0; BR9707409A; CN1186355C; NO983626L; CN1210543A; US6080837A; EP0879246B1; HUP9900961A2; AU1596397A; CZ294779B6; EP0879246A1; CZ251698A3; MX9806099A; HUP9900961A3; AU722895B2; DE69735991D1; US6316593B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、４つの保護ペプチド断片から、血管作動性腸管ペプチドアナログ、Ａｃ（１−３１）−ＮＨ₂を合成するための新規な方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ＶＩＰアナログの合成本発明は、４つの保護ぺプチド断片から、血管作動性腸管ペプチドアナログ、Ａｃ（１−３１）−ＮＨ₂を合成するための新規な方法に関する。血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）は、気道の粘液分泌を調節し、抗アレルギーおよび抗炎症特性を有する、平滑筋弛緩／気管支拡張物質である。最近の研究により、代謝安定性およびレセプター結合特性が増強されたＶＩＰのアナログが発見された。このＶＩＰアナログは、欧州特許出願第９２／１１７，１８５号の主題である。現在のところ、ＶＩＰアナログは、固相合成を用いて調製されている。固相合成には、例えば、クロロメチル化樹脂またはヒドロキシメチル樹脂に、エステル結合により、アルファーアミノ酸を結合させ、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護することが含まれる。樹脂に連続的にアミノ酸を追加してゆく。酸性条件下でアルファアミノ酸Ｂｏｃ保護を除去し、次の保護されたアミノ酸を順次縮合させ、中間体としての保護ペプチド一樹脂を得る。保護基を除去し、複数のフッ化水素による結合開裂反応により、ペプチドを樹脂から切断する。ペプチドの精製は、ａ）サイズ排除ゲルクロマトグラフィーおよびｂ）分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の２段階で行う。この多段階を要する方法には、多くの時間がかかり、標的ペプチドの回収率も不充分である。したがって、本発明の目的は、ＶＩＰアナログ合成のための、比較的単純でより効率的でより経済的な方法を提供することである。本発明は、保護ペプチド断片から、下記式を有するＶＩＰアナログ、ＡＣ（１−３１）−ＮＨ₂を合成するための新規な方法を提供する。好ましくは、反応は、Ｆｍｏｃ保護断片を結合させることを特徴とし、より好ましくは、以下の４つの断片：ペプチド断片Ｉ（配列番号２）、ペプチド断片II（配列番号３）、ペプチド断片III（配列番号４）およびペプチド断片IV（配列番号５）を結合させることを特徴とする。固相合成によりアナログを調製する場合には、ペプチド断片を予め分取ＨＰＬＣで精製することが必要であるが、新規な方法ではそれが不要であり、また、標的環状ＶＩＰアナログの合成の間に形成される中間体の精製も不要である。得られた生成物は、組立て後の最終段階で、分取ＨＰＬＣで１回通過させることにより、精製した。環状ＶＩＰアナログ、Ａｃ−（１−３１）−ＮＨ₂の合成のための本発明の方法には、２つまたはそれ以上の保護ぺプチド断片の結合が含まれる。好ましい保護断片は、以下の４つのＦｍｏｃ保護断片である。すなわち、断片Ｉ、Ｆｍｏｃ −（２６−３１）−ＮＨ₂（配列番号２）；断片II、Ｆｍｏｃ−（１９−２５） −ＯＨ（配列番号３）；断片III、Ｆｍｏｃ−（９−１８）−ＯＨ（配列番号４）；および断片IV、Ａｃ−（１−８）−ＯＨ（配列番号５）であり、これらはそれぞれ以下のように表される。４つのＦｍｏｃ保護ペプチド断片、ペプチド断片Ｉ（配列番号２）、ペプチド断片II（配列番号３）、ペプチド断片III（配列番号４）およびペプチド断片IV （配列番号５）を結合させることにより、化合物Ａｃ−（１−３１）−ＮＨ₂（配列番号１）を合成するための本発明の方法は、（ａ）ペプチド断片ＩのＦｍｏｃ保護基を脱保護し、脱保護ペプチド断片Ｉを保護ペプチド断片IIと結合させる工程；（ｂ）工程（ａ）で得られたぺプチドのＦｍｏｃ保護基を脱保護し、それを保護断片IIIと結合させる工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られたペプチドのＦｍｏｃ保護基を脱保護し、それを保護断片IVと結合させる工程；（ｄ）工程（ｃ）で得られた保護ペプチドを脱保護して、脱保護Ａｃ（１−３１）−ＮＨ₂を得る工程を含む。保護ペプチド断片Ｉ−IV は、各結合反応生成物の最大の結合効率および最小のラセミ化に基づき選択された。各結合反応には、当量の各断片を使用したため、標的ペプチドへの経済的な経路が提供された。各結合後に形成される中間体は、さらなる精製を行うことなく、次の結合反応に直接使用した。本明細書に記載されているように、固相合成後に生成した各断片の１回の精製工程の後の純度は、約８２％〜約９７％であることが分析用ＨＰＬＣにより決定され、各断片は、さらなる精製を行うことなく環状ＶＩＰアナログの合成のために使用した。より詳細には、式Ａｃ−（１−３１）−ＮＨ₂（配列番号１）の精製された化合物を合成するための方法は、（ａ）ペプチド断片I（配列番号２）のＦｍｏｃ保護基を脱保護し、脱保護ペプチド断片Ｉを保護ペプチド断片II（配列番号３）と結合させて、保護中間体ぺプチドＦｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂（配列番号６）を得る工程；（ｂ）中間体Ｆｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂のＦｍｏｃ保護基を脱保護し、脱保護中間体Ｆｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂を保護断片III（配列番号４）と結合させて、保護中間体ペプチドＦｍｏｃ（９−３１）−ＮＨ₂（配列番号７）を得る工程；（ｃ）中間体Ｆｍｏｃ（９−３１）−ＮＨ₂のＦｍｏｃ保護基を脱保護し、脱保護中間体Ｆｍｏｃ（９−３１）−ＮＨ₂を保護断片IV （配列番号５）と結合させて、保護中間体ペプチドＡｃ−（１−３１）−ＮＨ₂ を得る工程；（ｄ）保護ペプチドＡｃ（１−３１）−ＮＨ₂を脱保護する工程；および（ｅ）例えば分取ＨＰＬＣにより、脱保護ペプチドＡｃ（１−３１）−ＮＨ₂を精製する工程を含む。本明細書で用いられるように、ペプチドを定義するために用いる命名法は、当分野で典型的に用いられているものであり、Ｎ末端のアミノ基は左方に、Ｃ末端のカルボキシル基は右方に示される。天然のアミノ酸とは、タンパク質中に見出される天然に存在するアミノ酸、即ち、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、およびＨｉｓのうちの一つを意味する。アミノ酸が異性体の形で存在する場合には、特に示さない限り、Ｌ型アミノ酸が表されている。本明細書の他の箇所に記載されているものに加えて、アミノ酸、保護基、溶媒、試薬などを表すため、以下のような略語または記号を使用する。記号意味ＡｃアセチルＮｌｅノルロイシンＦｍ９−フルオレニルメチルＤＩＰＥＡＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンＤＭＦジメチルホルムアミド末尾に「−ＯＨ」および「−ＮＨ₂」が付された「ＶＩＰ」は、それぞれ、遊離酸型およびアミド型のポリペプチドを意味する。末尾が付されていない場合には、その表現は両方の型を含むものとする。本明細書で定義されるように、環状ペプチドとは、ペプチド中のあるアミノ酸の側鎖カルボキシル末端が、ペプチド鎖中の別のアミノ酸の側鎖アミノ末端と、アミド結合を形成することにより共有結合しているペプチドである。環状ペプチドを表すには、いくつかの命名法および記号が用いられる。例えば、以下のようなものである。ａ．シクロ（Ｌｙｓ²¹−Ａｓp²⁵）−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ¹⁹−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）²⁰ −Ｌｙｓ²¹−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）²²−Ｌｅｕ²³−Ａｓｎ²⁴−Ａｓｐ²⁵−ＯＨ；ｂ．Ｆｍｏｃ−（１９−２５）−ＯＨ；ｃ．Ｆｍｏｃ−〔Ａ１ａ¹⁹−Ａｓｐ²⁵〕−ＶＩＰシクロ（２１→２５）；ｄ．〔Ｆｍｏｃ−（配列番号３）−ＯＨ〕；ｅ．Ｆｍｏｃ−〔Ａｌａ¹⁹−Ａｓｐ²⁵〕−ＶＩＰシクロ（Ｌｙｓ²¹→Ａｓｐ²⁵）；ｆ．〔Ｆｍｏｃ−（配列番号３）−ＯＨ〕；ｇ．上記の構造（ａ−ｇ）および「（配列番号）」を用いた表記は、それぞれ、Ｎ末端の水素原子がＦｍｏｃ基に置換されたＶＩＰペプチド断片に相当するアミノ酸配列を有する同一ペプチドを表し、定義する。さらに、２１位のリシンの側鎖カルボキシルと２５位のアスパラギン酸の側鎖アミンとの間にアミド結合が形成され、したがって、環状ペプチド断片が形成されている。ペプチド構造の上記の表記は、等価であり交換可能であると考えられる。本発明の環状ペプチドにおいては、他に断らない限り、以下の配置が適合する。鎖中のアミノ酸環状ぺプチドを形成するために結合するアミノ酸の末端Ｌｙｓ εアミノ ε Ａｓｐ βカルボキシル（β＝ベータ）Ｇｌｕ γカルボキシル（γ＝ガンマ）本発明のＶＩＰアナログを含むペプチド断片は、アミノ酸間のペプチド結合を形成するための、いかなる公知の常法によっても容易に合成できる。そのような常法としては、例えば、カルボキシル基もしくは他の反応性基が保護されているアミノ酸またはその残基の遊離のアルファアミノ基と、アミノ基もしくは他の反応性基が保護されている別のアミノ酸またはその残基の遊離の第一カルボキシル基との結合を可能とするすべての液相法が挙げられる。ＶＩＰアナログを含むペプチド断片を合成するための方法は、目的の配列中の各アミノ酸を一つずつ別のアミノ酸もしくはその残基に連続的に付加していく方法により、または目的のアミノ酸配列を有するペプチド断片をまず常法により合成した後、それを結合させて目的のペプチドを得る方法により、実施される。そのようなペプチド断片を合成するための常法としては、例えば、すべての固相ペプチド合成法が挙げられる。そのような方法では、固相法の一般的な原理に従い、伸長中のペプチド鎖に、連続的に一つずつ目的のアミノ酸残基を組み込むことによって、ペプチド断片を合成できる〔Merrifield,R.B.,J.Amer.Chem.Soc. 85，2149-2154(1963)；Barany et al.，The Peptides，Analysis，Synthesis an d Biology，Vol.2，Gross，Ｅ．and Meienhofer，J.，Eds．Academic Press 1-2 84(1980)〕。ペプチドの化学合成に共通しているのは、適当な保護基による、様々なアミノ酸残基の反応性側鎖基の保護であり、それにより、最終的に保護基が除去されるまでその部位で化学反応が起こるのを防止する。また、アミノ酸または断片上のアルファアミノ基を、カルボキシル基における反応の間保護し、その後、アルファアミノ保護基を選択的に除去することによりその部位において以降の反応が起きることを可能とすることもよく知られている。固相合成法に関して、特定の保護基が開示されているが、各アミノ酸は、液相合成において各アミノ酸に対して通常用いられる保護基により保護することができることに注意されたい。アルファアミノ基は、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）および置換されたベンジルオキシカルボニル、例えばｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）などの芳香族ウレタン型保護基；ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、およびアリルオキシカルボニルなどの脂肪族ウレタン型保護基から選択される適当な保護基により保護できる。アルファアミノ保護には、Ｂｏｃが最も好ましい。カルボキシル基は、ベンジル（ＯＢｚｌ）、または低級アルキル、ハロ、ニトロ、チオ、もしくは置換されたチオ（すなわち低級アルキル（１〜７炭素原子）チオ）により置換されたベンジルのような芳香族エステル；低級アルキル、ｔ− ブチル（Ｏｔ−Ｂｕ）、シクロペンチル、シクロヘキシル（ＯｃＨｘ）、シクロヘプチル、および９−フルオレニルメチル（ＯＦｍ）のような脂肪族エステルから選択される適当な保護基により保護できる。グルタミン酸（Ｇｌｕ）には、ＯＢｚｌおよびＯＦｍが最も好ましく、アスパラギン酸（Ａｓｐ）には、ＯＣｈｘ、ＯＢｚｌおよびＯＦｍが最も好ましい。水酸基は、ベンジル（Ｂｚｌ）、または低級アルキル、ハロ（例えば２，６− ジクロロベンジル（ＤＣＢ））、ニトロ、もしくはメトキシで置換されたベンジルのようなエーテル；ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、テトラヒドロピラニル、およびトリフェニルメチル（トリチル）から選択される適当な保護基により保護できる。セリン（Ｓｅｒ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）には、Ｂｚｌが最も好ましい。チロシン（Ｔｙｒ）には、ＢｚｌおよびＤＣＢが最も好ましい。側鎖アミノ基は、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）および置換されたベンジルオキシカルボニル、例えばｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびｐ− メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）などの芳香族ウレタン型保護基；ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、およびアリルオキシカルボニルのような脂肪族ウレタン型保護基から選択される適当な保護基により保護できる。オルニチン（Ｏｒｎ）にはＺが最も好ましい。リシン（Ｌｙｓ）には２−Ｃｌ−ＺおよびＦｍｏｃが最も好ましい。グアニジノ基は、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、およびＢｏｃから選択される適当な保護基により保護できる。アルギニン（Ａｒｇ）には、Ｔｏｓが最も好ましい。側鎖アミド基は、キサンチル（Ｘａｎ）により保護できる。アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）は、保護しないことが好ましい。イミダゾール基は、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、トリフェニルメチル（トリチル）、２，４ −ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）、Ｂｏｃおよびベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）から選択される適当な保護基により保護できる。ヒスチジン（Ｈｉｓ）には、ＴｏｓおよびＢｏｍが最も好ましい。本発明の目的のためには、保護アミノ酸は、例えばＬｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、およびＴｙｒ（ｔＢｕ）のように表される。メタノール（ＭｅＯＨ）、塩化メチレン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）、アセトニトリル（ＣＨ₃ＣＮ）、エーテル、ヘキサンおよびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含むすべての溶媒は、フィッシャー（Fisher）またはブルディック（Burdick）およびジャクソン（Jackson）から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、ハロカーボン（Halocarbon）から購入し、さらなる精製を行うことなく使用した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）およびチオアニソールは、アルドリッチ・ケミカル社（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から購入した。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）は、シグマ・ケミカル社（ミシガン州、セントルイス）から、２−（１Ｈ−べンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびベンゾトリアゾール−１-イルオキシートリー（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）は、リチェリウ・バイオテクノロジース(RichelieuBi otechnologies)（カナダ、ケベックリ州、セントヒヤシンセ（St．Hyacinthe)）から購入した。２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコールコポリスチレン１％ジビニルベンゼン(サスリン樹脂(Sasrin-resin))は、ベーケム・バイオサイエンス（BachemBioscience）から入手した。Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ保護アミノ酸は、すべてＬ配置であり、ベーケム社（Bachem，Inc）（カリフォルニア州、トランス）から購入した。分析用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、グラジエント・マスター（Gradient Master）およびスペクトロモニターIII ＵＶ可変波長検出器（Spect romonitor III UV-Variable Wavelength Detector）を装備したＬＤＣコンストラメトリックIIG（LDC Constrametric IIG）を用い、リクロソルブ（Lichrosorb ）ＲＰ−８（５μ）カラム（４.６mm×２５cm）；溶離剤：（Ａ）０．１M ＮａＣｌＯ₄（pH２．５）−（Ｂ）ＣＨ₃ＣＮ、２０分間の直線勾配；流速１ml/分；検出２１４ｎｍで行った。保護中間体、Ｆｍｏｃ−（１９−３１）−ＮＨ₂およびＦｍｏｃ−（９−３1）−ＮＨ₂のＨＰＬＣは、リクロソルブＲＰ−８（５μ）カラム（４．６mm×２５cm）；溶離剤：（Ａ）ＮａＣｌＯ₄（pH２．５）−（Ｂ）ＣＨ₃ＣＮ；２０分間４０〜９０％（Ｂ）の直線勾配；流速１ml/分；検出２１４nmで行った。保護Ａｃ−（１−３１）−ＮＨ₂のＨＰＬＣは、（Ｂ）ＣＨ₃ＣＮ：ＩＰｒＯＨ（１：１）；２０分間６０〜９５％（Ｂ）の直線勾配を用いて、同カラムで行った。環状ＶＩＰアナログのＨＰＬＣは、（ｉ）ビダック（Vydac）Ｃ−１８カラム；溶離剤：（Ａ）Ｈ₂Ｏ（０．１％ＴＦＡ）−（Ｂ）ＣＨ₃ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；２０分間１５〜３０％（Ｂ）の直線勾配；流速１ml/分；検出２１４nm、（ii）ゾルバックス・プロテイン・プラス(Zorbax Protein Plus）カラム；溶離剤：（Ａ）Ｈ₂Ｏ（０．１％ＴＦＡ）−（Ｂ）ＣＨ₃ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；２０分間２０〜３５％（Ｂ）の直線勾配；流速２ml/分；検出２１０nm、（iii）リクロソルブＲＰ−８（５μ）カラム；溶離剤：（Ａ）ＮａＣｌＯ₄（pH２．５）−（Ｂ）ＣＨ₃ＣＮ；２０分間３０〜５０％（Ｂ）の直線勾配；流速１ml/分；検出２０６nmで行った。分取ＨＰＬＣは、デルタプレップ（D eltaPrep）３０００システムＹＭＣＯＤＳ−Ａ（１２０Å、１５μ）カラム（４．７×５０cm）；溶離剤：（Ａ）Ｈ₂Ｏ（０．１％ＴＦＡ）−（Ｂ）ＣＨ₃ＣＮ：ＭｅＯＨ（１：１）（０．１％ＴＦＡ）；３時間２０〜５０％（Ｂ）の直線勾配；流速８０ml/分；検出２１５nmで行った。高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）は、ベックマン（Beckman）ＶＧ２ＡＢ−１ＦまたはＶＧ７０Ｅ−ＨＦ質量分析計で記録した。アミノ酸解析は、ベックマンモデル１２１Ｍアミノ酸分析器で行った。保護ペプチド断片および遊離のペプチドは、密封された真空チューブ内で、６N ＨＣｌ（ピアース・ケミカル社（Pierce Chemical Co.））中で１１０℃で２４時間加水分解した。本発明では、４つのペプチド断片Ｉ−IVを、反復的固相合成により調製した。合成の間を通して、結合反応は、カイザー・ニンヒドリン試験（Kaiseretal.，A nal.Biochem.，34，595-598(1970)）によりモニターし、反応の進行および完了を決定した。樹脂の調製は、以下のようにしてＵＶ解析によりモニターした。合成過程中の各時点における、保護アミノ酸（ＡＡ）樹脂（Ｆｍｏｃ−ＡＡ− 樹脂）の置換には、Ｎ−（９−フルオレニルメチル）ピペリジンの３０１nm（ε ＝７８００）における吸光度を用いた。試験管内で４〜８mgの樹脂を正確に秤量し、２０％ピペリジンを含む０．５mlのＤＭＦで処理した。例えば、５．０５mg のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂を含む試験管に、２０％ピペリジンを含む０．５mlのＤＭＦを添加した。２０％ピペリジンを含む０．５mlのＤＭＦのみを含む空の試験管をブランクとして用いた。その後１５分にわたり、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂を含む試験管を２回または３回撹拌して、樹脂全体が確実にピペリジン溶液と接触するようにした。ＤＭＦを両方の試験管に添加して、量を５０mlとした。分光光度計を、ブランクを用いて３０１nmでゼロ点調整した。Ｆｍｏｃ置換の吸光度は以下のように計算した。概して、ペプチド樹脂断片からのＦｍｏｃ保護基の脱保護は、以下の手順に従い行った。実施例１〜８に記載されている、断片Ｉ、Ｆｍｏｃ−（２６−３１）−ＮＨ₂ の合成には、ＸＡＬリンカー樹脂を用いて、そして結合試薬としてベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）を用いて、Ｃ末端アミド断片を調製することが含まれていた。概して、最終純度を確実にするため各アミノ酸について、二重の結合を行った。典型的には、１回目の結合には４当量の試薬を用い、２回目の結合には２当量の試薬を用いた。実施例９〜１５に記載されている、断片II、Ｆｍｏｃ−（１９−２５）−ＯＨの合成には、保護ヘプタペプチドの段階的な固相組立てが含まれており、ＣＯＯＨ末端残基Ａｓｐを、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−サスリン）−ＯＢｚｌを経由してβ−ＣＯＯＨでサスリン樹脂と結合させた。出発樹脂に、ジペプチド、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＯＨを結合させた。Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＯＨは、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨおよびＨ−Ａｓｎ−ＯＨから（Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ− ＯＨからＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＳｕへの前活性化を介して）、７１．３％の収率で調製された（分析用ＨＰＬＣで純度は＞９５％であると推定された）。トリペプチド−樹脂を、それぞれ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ −Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを用いた２サイクルの固相合成に付した。得られたペンタペプチド−樹脂の一部を、次は、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを用いたさらに２サイクルの固相合成に付した。完全保護ヘプタペプチド−樹脂の一部を０．５％ＴＦＡ−ＣＨ₂Ｃｌ₂で切断し、ＨＰＬＣで１つのメジャーピーク（純度は＞８２％と推定された）を得た。Ｐｄ〔 (Ｃ₆Ｈ₅)₃Ｐ〕₂およびＢｕ₃ＳｎＨを用いて、Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）²¹−保護基を選択的に除去し、得られた部分保護ヘプタペプチド−樹脂を０．５％ＴＦＡ− ＣＨ₂Ｃｌ₂で切断した。完全に樹脂から切断するには、１０分間にわたる切断が合計５回必要であった。生成物、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ −Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）は、分析用ＨＰＬＣで純度が＞８０％であることが決定され、全収率は７５．７％（出発樹脂、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−サスリン）−ＯＢｚｌの負荷量に対して）であった。直鎖状ヘプタペプチドの側鎖−側鎖環化（Ｌｙｓ²¹−Ａｓｐ²⁵）は、ＢＯＰおよびＤＩＰＥＡを用いて、ＤＭＦを含む溶液中で行い、１．２５時間で完了した。この粗生成物を分析用ＨＰＬＣに付したところ、ほぼ完全に直鎖状ヘプタペプチドが変換されていることが示された。得られた環状ヘプタペプチドの一回の精製工程は、シリカゲルで行った。この精製工程で、ラクタム化の間に形成されたオリゴマーが除去された。この精製した生成物を分析用ＨＰＬＣに付したところ、環状ヘプタペプチドの純度は＞９８％であった。出発樹脂に対する、精製された環状ヘプタペプチドの全収率は３７％であった。Ｃ末端ベンジルエステルの最終的な脱保護は、ビブロミキサー（vibromixer）装置内で、１０％Ｐｄ担持炭素を用いて、約６時間にわたり水素化分解を行うことにより行った。反応は、分析用ＨＰＬＣにより追跡し、最終生成物、シクロ（Ｌｙｓ²¹−Ａｓｐ²⁵）−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ¹⁹−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）²⁰−Ｌｙｓ²¹ −Ｔｙｒ（ｔＢｕ）²²−Ｌｅｕ²³−Ａｓｎ²⁴−Ａｓｐ²⁵−ＯＨは、＞９７％の純度で、（出発樹脂に対して）３３．７％の全収率で得られた。最終生成物の構造および同定を、¹Ｈ−ＮＭＲ分光法により確認し、アミノ酸解析および質量分析により完全に特徴決定した。実施例１６〜２６に記載されている、断片III、Ｆｍｏｃ−（９−１８）−ＯＨ、および実施例２７〜３６に記載されている、断片IV、Ａｃ−（１−８）−ＯＨの反復的な固相合成は、結合試薬としてＢＯＰを用い、Ｆｍｏｃ保護基の脱保護にはピペリジンを用いて行った。断片上の側鎖保護基が保持されるように、酸に対して極めて不安定なサスリン・リンカーを用いた。概して、最終純度を確実にするために、各アミノ酸について、２回の結合反応を行った。第１回の結合には２当量の試薬を用い、２回目または３回目の結合には１当量の試薬を用いた。切断後に得られた平均純度は、ペプチド断片IIIについては９１％、ペプチド断片IVについては９５％であった。切断後に得られたこれらのペプチドの純度は、さらなる精製を行うことなく、ＶＩＰアナログのペプチド断片集合合成に直接使用するのに充分なものであった。本発明の新規な環状ＶＩＰアナログの合成は、以下に示すようにして、４つの断片Ｉ〜IVの結合により達成された。断片結合の各サイクルは、以下のような同一の手順に従い行った。（ｉ）１０％Ｅｔ₂ＮＨを含むＤＭＦにより、１つのペプチド断片のＦｍｏｃ保護基を脱保護し（２時間）；（ii）ヘキサン・エーテルを用いた洗浄によりフルオレンを除去し；（iii）０°／３０分〜１時間、ＨＢＴＵ（１．２当量）、ＨＯＢｔ（３．６当量）を含むＤＭＦ−ＣＨ₂Ｃｌ₂を用い、そして２５°／３時間、ＤＩＰＥＡ (４．８当量)を用いて、脱保護ペプチド断片と、１．０当量の別の保護断片１．０当量とを結合させ；そして、（iv）蒸発およびＣＨ₂Ｃｌ₂への溶解を行い、そして飽和ＮａＨＣＯ₃および１０％クエン酸を用いて抽出した。好ましい実施態様において、断片結合の各サイクルは、以下のようにして行った。（ｉ）１０％Ｅｔ₂ＮＨを含むＤＭＦにより、ペプチド断片ＩのＦｍｏｃ保護基を脱保護し（２時間）；（ii）ヘキサン・エーテルを用いた洗浄によりフルオレンを除去し；（iii）０°／３０分〜１時間、ＤＭＦ−ＣＨ₂Ｃｌ₂中、ＨＢＴＵ（１．２当量）、ＨＯＢｔ（３．６当量）を用い、そして２５°／３時間、ＤＩＰＥＡ（４．８当量）を用いて、脱保護ペプチド断片Ｉと、１．０当量の保護ペプチド断片IIとを結合させ；（iv）蒸発およびＣＨ₂Ｃｌ₂への溶解を行い、そして飽和ＮａＨＣＯ₃および１０％クエン酸を用いて抽出して、保護中間体Ｆｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂を得；（ｖ）１０％Ｅｔ₂ＮＨを含むＤＭＦにより、中間体Ｆｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂のＦｍｏｃ保護基を脱保護し（２時間）；（vi）ヘキサン・エーテルを用いた洗浄によりフルオレンを除去し；（vii ）０°／３０分〜１時間、ＤＭＦ−ＣＨ₂Ｃｌ₂中、ＨＢＴＵ（１．２当量）、ＨＯＢt（３．６当量）を用い、そして２５°／３時間、ＤＩＰＥＡ（４．８当量）を用いて、脱保護中間体Ｆｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂と、１．０当量の保護断片IIIとを結合させ；（viii）蒸発およびＣＨ₂Ｃｌ₂への溶解を行い、そして飽和ＮａＨＣＯ₃および１０％クエン酸を用いて抽出して、保護中間体Ｆｍｏｃ（９−３１）−ＮＨ₂を得；（ix）１０％Ｅｔ₂ＮＨを含むＤＭＦにより、中間体Ｆｍｏｃ（９−３１）−ＮＨ₂のＦｍｏｃ保護基を脱保護し（２時間）；（ｘ）ヘキサン・エーテルを用いた洗浄によりフルオレンを除去し；（xi）０°／３０分〜１時間、ＤＭＦ−ＣＨ₂Ｃｌ₂中、ＨＢＴＵ（１．２当量）、ＨＯＢｔ（３．６当量）を用い、そして２５°／３時間、ＤＩＰＥＡ（４．８当量）を用いて、脱保護中間体Ｆｍｏｃ（９−３１）−ＮＨ₂と、１．０当量の保護断片IVとを結合させ；そして（xii）蒸発およびＣＨ₂Ｃｌ₂への溶解を行い、そして飽和ＮａＨＣＯ₃および１０％クエン酸を用いて抽出して、保護中間体Ａｃ−（１−３１）−ＮＨ₂を得た。環状ＶＩＰアナログの断片集合合成は、実施例３７から４１に詳細に記載されている。保護中間体、Ｆｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂、Ｆｍｏｃ（９−３１） −ＮＨ₂、およびＡｃ（１−３１）−ＮＨ₂は、各反応混合物サイクルから主要生成物として得られた。これらの粗製の保護中間体は、さらに精製せずに、それぞれの以降の結合サイクルに粗生成物の形で使用した。分析用ＨＰＬＣにより、使用された条件下で、出発物質は完全に消費されていたことが確認された。２５°で２時間の、ＴＦＡ（９０％）、ＥＤＴ（３％）、チオアニソール（５％）およびアニソール（２％）を用いた反応により、完全に保護されたペプチドであるＡｃ（１−３１）−ＮＨ₂の最終的な脱保護を行った。分析用ＨＰＬＣにより、環状ＶＩＰアナログが合成の主要生成物（７２〜７５％）であることが確認された。粗生成物の精製は、ＹＭＣＯＤＳ−Ａ逆相カラム（４．７×５０cm）を用いた分取ＨＰＬＣにより一回通過させることにより、行った。このカラムを用いて、容易に、粗生成物４．０ｇまでスケールアップし、合計で８．４８ｇの精製された環状ＶＩＰアナログ、即ち、粗生成物中に合計で９．９５ｇ存在すると推定（ＨＰＬＣ解析より）された環状ＶＩＰアナログのうちの８５．２％が単離された。これは、結合反応、脱保護および精製の工程を含む全工程を通じての合成収２３．９％と対応する。この方法により調製された環状ＶＩＰアナログは、分析用ＨＰＬＣおよびキャピラリーゾーン電気泳動により均一（＞９９％）であることが示された。環状ＶＩＰアナログの同定は、ＦＡＢ質量分析およびアミノ酸解析により確認された。実施例実施例１〜８には、保護断片Ｉ、Ｆｍｏｃ−（２６−３１）−ＮＨ₂、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＮＨ₂の固相合成が記載されている。実施例９から１５には、断片I I、シクロ（Ｌｙｓ²¹−Ａｓｐ²⁵）−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ¹⁹−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）²⁰−Ｌｙｓ²¹−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）²²−Ｌｅｕ²³−Ａｓｎ²⁴−Ａｓｐ²⁵ −ＯＨの合成が記載されている。実施例１６から２６には、保護断片III、Ｆｍｏｃ−（９−１８）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−ＯＨの固相合成が記載されている。実施例２７から３６には、保護断片IV、Ａｃ−（１−８）−ＯＨ、Ａｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)− Ｇｌｕ(ＯｔＢｕ)−ＯＨの固相合成が記載されている。実施例３７から４１には、環状ＶＩＰアナログ、Ａｃ（１−３１）−ＮＨ₂の合成が記載されている。実施例１（３）−ＸＡＬ−樹脂の調製１５０ｇのベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂（負荷量：０．５４ミリ当量 /g、ロット番号１３９３３）を、１０％トリエチルアミンを含有する２×１５００mlのＮＭＰで中和し、１０００mlのＤＭＦ、１０００mlのＭｅＯＨ、１０００ mlのＣＨ₂Ｃｌ₂、１０００mlのＭｅＯＨおよび３×１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。９６．３ｇの（３）−ＸＡＬ−リンカー（０．１８mol、２．２当量）、７９．６ｇのＢＯＰ（０．１８mol）および２４．３ｇのＨＯＢｔ（０．１８m mol）を、２００mlのＮＭＰに溶解した。４７．０３mlのＤＩＰＥＡを添加し、溶液を、中和された樹脂を含有する反応器に一度に添加した。混合液を９０分間撹拌した。一部を取り出し、ＤＭＦおよびＭｅＯＨで洗浄した。ＸＡＬ−リンカーの負荷量は、ＵＶ解析により０．３６５mmol/gであると決定された。ＸＡＬ−樹脂を１０００mlのＤＭＦ、１０００mlのＭｅＯＨ、１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂および２× １０００mlのＭｅＯＨで洗浄した。結合していないＢＨＡ樹脂を、１０００mlの１０％無水酢酸および１０％ＤＩＰＥＡを含むＣＨ₂Ｃｌ₂で３０分間ブロックした。次に、樹脂を濾過し、１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂、１０００mlのＭｅＯＨ、２ ×１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂および２×１０００mlのＭｅＯＨで洗浄した。実施例２Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡの調製１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、１１９．２ｇのＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ（３００mmol）、１３２ｇのＢＯＰ（３００mmol）および４０．５ｇのＨＯＢｔ（３００mmol）を１０００mlのＮＭＰに溶解させた。７８．４mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、実施例１で調製されたＸＡＬ−樹脂に添加した。混合物を９０分間撹拌した。濾過後、樹脂を１０００mlのＤＭＦ（３分間）、１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）、１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、室温で撹拌しながら、５９.６ｇのＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ（１５０mmol）、６６．３ｇのＢＯＰ（１５０mmol）および２０．２ｇのＨＯＢｔ（１５０mmol）の混合物を１０００mlのＮＭＰに溶解させた。３９．２mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合液を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡ樹脂を１０００mlのＤＭＦ（３分間）、１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）、１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂ （３分間）および２×１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例３Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡの調製Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡのＦｍｏｃ保護基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨのＴｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡへの結合は、以下のようにして行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、８９．２ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ− ＯＨ（３００mmol）、１３２ｇのＢＯＰ（３００mmol）および４０．５ｇのＨＯＢｔ（３００mmol）の混合物を１０００mlのＮＭＰに溶解させた。７８．４mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡ樹脂に添加した。混合物を９０分間撹拌した。濾過後、樹脂を１０００mlのＤＭＦ（３分間）、１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）、１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、室温で撹拌しながら、４４．６ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ− ＯＨ（１５０mmol）、６６．３ｇのＢＯＰ（１５０mmol）および２０．２ｇのＨＯＢｔ（１５０mmol）の混合物を１０００mlのＮＭＰに溶解させた。３９．２ml のＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡ樹脂を１０００mlのＤＭＦ（３分間）、１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）、１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例４Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡの調製Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡのＦｍｏｃ保護基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨのＧｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡへの結合は、以下のようにして行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、８９．２ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ− ＯＨ（３００mmol）、１３２ｇのＢＯＰ（３００mmol）および４０．５ｇのＨＯＢｔ（３００mmol）の混合物を１０００mlのＮＭＰに溶解させた。７８．４mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡ樹脂に添加した。混合物を 90分間撹拌した。濾過後、樹脂を１０００mlのＤＭＦ（３分間）、１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）、１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、室温で撹拌しながら、４４．６ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ− ＯＨ（１５０mmol）、６６．３ｇのＢＯＰ（１５０mmol）および２０．２ｇのＨＯＢｔ（１５０mmol）の混合物を１０００mlのＮＭＰに溶解させた。３９．２ml のＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡ樹脂を１０００mlのＤＭＦ(３分間)、１０００mlのＭｅＯＨ(３分間)、１０００ml のＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例５Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ− ＢＨＡの調製Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡのＦｍｏｃ保護基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ −（Ｂｏｃ）−ＯＨのＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡへの結合は、以下のようにして行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、１４０．５ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ (Ｂｏｃ)−ＯＨ(３００mmol)、１３２ｇのＢＯＰ(３００mmol)および４０．５ｇのＨＯＢｔ（３００mmol）の混合物を１０００mlのＮＭＰに溶解させた。７８．４mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡ樹脂に添加した。混合物を９０分間撹拌した。濾過後、樹脂を１０００mlのＤＭＦ（３分間）、１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）、１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、室温で撹拌しながら、７０．３ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ( Ｂｏｃ)−ＯＨ(１５０mmol)、６６．３gのＢＯＰ(１５０mmol)および２０．２ｇのＨＯＢｔ（１５０mmol）の混合物を１０００mlのＮＭＰに溶解させた。３９．２mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬の一部を樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ） −ＸＡＬ−ＢＨＡ樹脂を１０００mlのＤＭＦ（３分間）、１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）、１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例６Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ −Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡの調製Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ −ＢＨＡのＦｍｏｃ保護基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−（Ｂｏｃ）−ＯＨのＬｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ− Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡへの結合は、以下のようにして行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、１４０．５ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ (Ｂｏｃ)−ＯＨ（３００mmol）、１３２ｇのＢＯＰ(３００mmol)および４０．５ｇのＨＯＢｔ（３００mmol）の混合物を１０００mlのＮＭＰに溶解させた。７８．４mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡ樹脂に添加した。混合物を９０分間撹拌した。濾過後、樹脂を１０００mlのＤＭＦ（３分間）、１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）、１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂(３分間)および２×１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、室温で撹拌しながら、７０．３ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ( Ｂｏｃ)−ＯＨ(１５０mmol)、６６.３ｇのＢＯＰ(１５０mmol)および２０.２ｇのＨＯＢｔ（１５０mmol）の混合物を１０００mlのＮＭＰに溶解させた。３９．２mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ− Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡ樹脂を１０００mlのＤＭＦ（３分間）、１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）、１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２× １０００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例７Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡの調製Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ( ｔ−Ｂｕ)−ＸＡＬ−ＢＨＡのＦｍｏｃ保護基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨのＬｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）-Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡへの結合は、以下のようにして行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、１０６ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（３００mmol）、１３２ｇのＢＯＰ（３００mmol）および４０．５ｇのＨＯＢｔ（３００mmol）の混合物を１０００mlのＮＭＰに溶解させた。７８．４mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡ樹脂に添加した。混合物を９０分間撹拌した。濾過後、樹脂を１０００mlのＤＭＦ（３分間）、１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）、１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、室温で撹拌しながら、５３ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１５０mmol）、６６．３ｇのＢＯＰ（１５０mmol）および２０．２ｇのＨＯＢｔ（１５０mmol）の混合物を１０００mlのＮＭＰに溶解させた。３９．２mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ− Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡ樹脂を１０００mlのＤＭＦ（３分間）、１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）、１０００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×１０００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。ペプチド樹脂断片、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ） −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＸＡＬ−ＢＨＡ、即ちＦｍｏｃ−（２６−３１）−ＸＡＬ−ＢＨＡの最終重量は、２６７ｇであった。実施例８Ｆｍｏｃ−（２６−３１）−ＸＡＬ−ＢＨＡの切断５００mlの丸底フラスコ内で、１０ｇの保護Ｆｍｏｃ−（２６−３１）−ＸＡＬ−ＢＨＡに、０．５％ＴＦＡを含む２００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂を添加した。スラリーを室温で０．５分間撹拌した後、濾過した。ピペリジンを添加することにより、濾液を直ちにpH７に調整した。濾液をロトバック（rotovac）で室温で蒸発させた。残渣を２００mlの蒸留水で磨砕し、２×２００mlのエーテルで洗浄した。得られた固体物質を真空下で乾燥させて、保護Ｆｍｏｃ−(２６−３１)−ＮＨ₂ を得た。次に、濾過されたペプチド樹脂をさらに５回２００mlの０．５％ＴＦＡ溶液で１５分間処理した後、ピリジンでpHを７に調整した。蒸発、磨砕および乾燥の後、各切断反応後の試料をＨＰＬＣで解析した。ＨＰＬＣ条件は、カラム：リクロソルブＲＰ−１８、５ｍ、２５ｃｍ；溶離剤：（ａ）０．１MＨＣｌＯ₄／Ｈ₂Ｏ（ｐＨ２．５）、（ｂ）ＭｅＣＮ；勾配：３４％から３９％ＭｅＣＮ／２０分間；流速：１ml／分；検出器：２１０nm Ｋｎａｕであった。９０％以上の純度のペプチド断片をすべて合わせたところ、合計で３．０１ｇが得られた。合わせた物質の純度は、９４．５％であった。実施例９Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−サスリン）−ＯＢｚｌの調製２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコールコポリスチレン１％ジビニルベンゼン架橋樹脂（サスリン樹脂、２５ｇ、０．９６ミリ当量/g、２４ミリ当量）を、ＤＭＦ（２×５００ml）およびＣＨ₂Ｃｌ₂（３×５００ml）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−α−Ｏ−ベンジルエステル（３５ｇ、７８．５６mmol、３．２７当量）を含むＣＨ₂Ｃｌ₂（４００ml）を添加し、機械的な振とう機を用いて振とうした。ＤＣＣ（１６．２ｇ、７８．５rnmol、３．２７当量）を含むＣＨ₂Ｃｌ₂溶液（１００ml）を添加した後、Ｎ−メチルモルホリン（３．３６ml、３０mmol、３．２７当量）および４−ジメチルアミノピリジン（０．２９３ｇ、２．４mmol、０．１当量）を添加し、５時間振とうした。一部を取り出し、メタノールで洗浄し、乾燥させた。負荷量は、ＵＶ解析により、１ｇの樹脂当たり０．６０mmolであると決定された。樹脂をＤＭＦ（２×５００ml）およびメタノール（５×５００ml）で洗浄し、真空下で乾燥させて、３２．８ｇのＦｍｏｃ− Ａｓｐ（Ｏ−サスリン樹脂）−ＯＢｚｌを得た。この樹脂の一部、１０ｇをＤＭＦ（１８０ml）に懸濁させ、安息香酸無水物（６．７８ｇ、３０mmol、５当量）のＤＭＦ溶液（４０ml）を添加した後、ＤＩＰＥＡ（５．２２ml、３０mmol）５当量）を添加し、懸濁液を３０分間振とうした。樹脂をＤＭＦ（５×２００ml）で洗浄し、置換は０．６０mmol/gであることを決定した。実施例１０Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アスパラギン（Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ −ＯＨ）の合成Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１０ｇ、２８．３２mmol）をＤＭＦ（１０ml） −ＣＨ₂Ｃｌ₂（７０ml）の混合物に溶解し、氷浴中で冷却した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．５８ｇ、３１．１４mmol、１．１当量）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（６．０６ｇ、３１．１４mmol、１．１当量）を添加し、混合物を０℃で１時間、そして２５℃で１４時間撹拌した。反応混合物を氷浴中で冷却し、濾過し、沈殿物をＣＨ₂Ｃｌ₂（４０ml）で洗浄した。濾過液を蒸発乾固させ、残渣をジオキサン（８０ml）−Ｈ₂Ｏ（１０ml）の混合物中に溶解して、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＳｕの溶液を作成した。無水Ｌ−アスパラギン（５．６０６ｇ、４２．４８mmol、１．５当量）を含む６０mlのＮａ₂ＣＯ₃（２．５０ｇ、４２．２８mmol、１．５当量）の溶液を、上記のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＳｕの溶液に添加した。さらに１０mlのジオキサンを添加し、反応混合物を２５℃で２時間撹拌した。酢酸エチル（２００ml）を反応混合物に添加し、撹拌しながら５％ＨＣｌ水溶液を添加することにより、pHを約２に調整した。ＥｔＯＡｃ層を分離し、水層を、各１００mlで４回抽出した。合わせたＥｔＯＡｃ抽出液を、飽和ＮａＣｌ（１００ml）、Ｈ₂Ｏ（３×１０ml）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させた。残渣を暖めながら（４０〜４５℃）ＤＭＦ（６０ml）に溶解し、曇点までＨ₂Ｏを加えた。生成物は、一晩の放置の後、結晶化した。それを濾過し、エーテルで洗浄し、ＤＭＦ−Ｈ₂Ｏから再結晶化させた。ジオキサンから凍結乾燥することにより、９．４５ｇ（７１．３％）の生成物が得られた。ＮＭＲおよびＦＡＢ質量分析により、分子式がＣ₂₅Ｈ₂₉Ｎ₃Ｏ₆であり、見かけの分子量(Ｍ＋Ｈ)⁺が４６８.３であることが確認された。生成物Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＯＨは、＞９５％の純度を有することが、分析用ＨＰＬＣにより示された（図４）。ＨＰＬＣ条件は、以下の通りであった。カラム：リクロソルブＲＰ−８（５μ）；溶離剤：（Ａ）０．１M ＮａＣｌＯ₄（pH２．５）−（Ｂ）ＣＨ₃ＣＮ；勾配：２０分間４０％〜８０％（Ｂ）；流速１ml/分；検出：２１０nm。実施例１１Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ（Ｏ−サスリン）−ＯＢｚｌの調製固相ペプチド合成を以下のように行った（樹脂１ｇ当たり２０mlの溶媒を用いた）。１）２０％ピペリジン／ＤＭＦ、１分間；２）２０％ピペリジン、ＤＭＦ、１０分間；３）ＤＭＦ、４×２分間；４）ＮＭＰ、１×２分間；５）本明細書に記載されたような保護アミノ酸の結合；および６）ＤＭＦ、３×２分間。Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ(Ｏ−サスリン)−ＯＢｚｌ１０ｇ、０．６０mmol/g、6．０mm olを出発原料として、上記のようにして固相ペプチド合成を行った。以下のようにして、ジペプチド、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＯＨを、Ｈ−Ａｓｐ（Ｏ−サスリン−樹脂）−ＯＢｚｌに結合させることにより、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ −Ａｓｐ（Ｏ−サスリン−樹脂）−ＯＢｚｌを調製した。４．２ｇ、９mmol、１．５当量のＦｍｏｃ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＨに、３.４１ｇ、９mmol、１．５当量のＨＢＴＵ；４．１３ｇ、２７mmol、４．５当量のＨＯＢＴ；３．１３５ｇ、１８mmol、３当量のＤＩＰＥＡ；および２２０mlのＮＭＰ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（１：１）を添加した。混合物を１．２５時間結合させた。この特定の結合では、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＯＨを、１６０mlのＮＭＰ−ＣＨ₂ Ｃｌ₂（１：１）に溶解させた。ＮＭＰとＣＨ₂Ｃｌ₂との混合は、発熱性であったため、ペプチドへ添加する前に溶媒を冷却してから、Ｈ−Ａｓｐ（Ｏ−サスリン−樹脂）−ＯＢｚｌに添加し、ＤＩＰＥＡおよびＨＯＢｔを添加し、反応管を２分間振とうした。その後、３０mlの冷ＣＨ₂Ｃｌ₂を添加し、最後に、ＨＢＴＵを溶解した２９mlのＮＭＰ−ＣＨ₂Ｃｌ₂（１：１）溶液および１０mlのＮＭＰを添加した。ＮＭＰ：ＣＨ₂Ｃｌ₂の比率は（１：１）に維持した。結合反応のpHは、５〜６に維持した。Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ(Ｏ−サスリン−樹脂) −ＯＢｚｌは、以下のように、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを樹脂へ結合させることにより調製した。５．４ｇ、１２mmol、２当量のＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨへ、３.４ｇ、１２mmol、２当量のＨＢＴＵ；１．８ｇ、１２mmo l、２当量のＨＯＢｔ;５.７５ml、３３mmol、５.５当量のＤＩＰＥＡ;および２２０mlのＮＭＰを添加した。この混合物を樹脂へ添加し、１時間結合させた。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ（Ｏ−サスリン−樹脂）−ＯＢｚｌは、以下のように、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを樹脂へ結合させることにより調製した。５.４g、１２mmol、２当量のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨへ、３．４ｇ、12mmol、２当量のＨＢＴＵ；１．８ｇ、１２mmol、２当量のＨＯＢｔ；５．７５ml、３３mmol、５．５当量のＤＩＰＥＡ；および２２０mlのＮＭＰを添加した。この混合物を樹脂へ添加し、１時間結合させた。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）²¹−ＯＨの添加後、樹脂をメタノールで洗浄し、乾燥させて、保護Ｆｍｏｃ−（２１−２５）−（Ｏ−サスリン−樹脂）−ＯＢｚｌ１３．３ｇ（０．４５mmol/g、５．９８mmol）を得た。このペプチド−樹脂の半量（６．６５ｇ、２．９９mmol）を、上記と同様のさらに２サイクルの固相合成に付し、以下のようにして、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨと結合させた。２．８ｇ、６mmol、２当量のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)−ＯＨに、２.６５ｇ、６mmol、２当量のＢＯＰ；０．９１８ｇ、６mmol、２当量のＨＯＢｔ；３．２５ml、１８．６５mmol、６．２当量のＤＩＰＥＡ；および１２０mlのＮＭＰを添加した。これを樹脂へ添加し、１時間結合させた。次に、以下のようにして、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨと結合させた。１．８６ｇ、６mmol、２当量のＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨに、２．２７ｇ、６mmol、２当量のＨＢＴＵ；０．９０ｇ、６ mmol、２当量のＨＯＢｔ；および１２０mlのＮＭＰを添加した。この混合液を樹脂へ添加し、１時間結合させた。樹脂を、ＤＭＦ（３×１２０ml）およびメタノール（４×１２０ml）で洗浄し、真空下で乾燥させて、７．３ｇ（０．３９mmol/g、２．８４mmol）の保護Ｆｍｏｃ（１９−２５）−（Ｏ−サスリン−樹脂）−ＯＢｚｌを得た。Ｆｍｏｃ（１９ −２５）−（Ｏ−サスリン−樹脂）−ＯＢｚｌの一部を、０．５％ＴＦＡ−ＣＨ₂ Ｃｌ₂で切断し、分析用ＨＰＬＣにより評価したところ、＞８２％の純度を有していた。実施例１２Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓ（Ｏ−サスリン）−ＯＢｚｌの脱保護によるＦｍｏｃ −Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ（Ｏ−サスリン）−ＯＢｚｌ保護ヘキサペプチド樹脂、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ（Ｏ−サスリン）−ＯＢｚｌ（７．２ｇ、０．３９mmol/g、２．８mmol）を、１３０mlのＣＨ₂Ｃｌ₂に懸濁させ、ヘリウムを送通した。酢酸（０．３３０ml、５．７５mmol）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウムジクロリド（０．１３８ｇ、０．１９６mm ol）および水素化トリブチルスズ（３．１６５ml、１１．９mmol）を加え、ペプチド樹脂に、１．５時間ヘリウムを送通し、反応管から液を取り出した。Ａｌｌｏｃ基が完全に脱保護されるよう、上記の反応を合計５回繰り返した。ペプチド −樹脂の一部を、０．５％ＴＦＡ−ＣＨ₂Ｃｌ₂で切断し、分析用ＨＰＬＣを行ったところ、Ａｌｌｏｃ基が完全に脱保護されていることが示された。樹脂をＣＨ₂ Ｃｌ₂（２×１２０ml）およびメタノール（４×１２０ml）で洗浄し、真空下で乾燥させて、７．１ｇ（０．４０mmol/g、２．８４mmol）の部分保護ペプチド− 樹脂であるＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）− Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ（Ｏ−サスリン）−ＯＢｚｌを得た。実施例１３Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ（Ｏ−サスリン）−ＯＢｚｌの切断：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−ＯＢｚｌの調製７．１ｇ（２．８４mmol）の部分保護Ｆｍｏｃ−（１９−２５）−サスリン− 樹脂−ＯＢｚｌを、０.５％ＴＦＡを含むＣＨ₂Ｃｌ₂（１４０ml）で室温で１０分間処理し、濾過し、ピリジンを添加して濾液を直ちにpH６〜７に調整した。ペプチド−樹脂をさらに４回、上記と同様に０．５％ＴＦＡを含むＣＨ₂Ｃｌ₂で処理し、濾液を合わせ、蒸発させた。ペプチドを水で磨砕し、濾過し、水で簡単に洗浄し、真空下で乾燥させた。粗製のペプチドを、無水エーテルで洗浄し、真空下で乾燥させて、３．２６ｇ（全収率７５．７％）の部分保護Ｆｍｏｃ−Ａｌａ −Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−ＯＢｚｌを得た。これは、分析用ＨＰＬＣにより、＞８０％の純度を有すると決定された。実施例１４直鎖状ヘプタペプチドの環化：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ− Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−ＯＢｚｌシクロ（ｌｙｓ２１→Ａｓｐ２５）の調製３．２６ｇ（２．２７１mmol）の、部分保護直鎖状ヘプタペプチド、Ｆｍｏｃ −Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−ＯＢｚｌを含む１００mlのＤＭＦ溶液を、２．０ｇ（４．５３mmol、２当量）のＢＯＰ試薬および３．１６ml（１８．１４mmol、８当量）のＤＩＰＥＡを含む５００mlのＤＭＦ溶液へ、磁石で撹拌しながら、２０分間をかけて徐々に添加した。室温で１．２５時間撹拌した後、一部を取り出し、分析用ＨＰＬＣにより、直鎖状ペプチドが完全に環化されていることが示された。反応混合物をさらに１時間撹拌し、酢酸で酸性化し、約２０mlになるまで蒸発させ、蒸留水（２００ml）を添加した。濾過により沈殿物を回収し、蒸留水で充分に洗浄し、真空下で乾燥させた。生成物を無水エーテルで洗浄し、乾燥させて、３．０ｇの保護環状ヘプタペプチドを得た。分析用ＨＰＬＣにより、直鎖状ペプチドがほぼ完全に環状ヘプタペプチドに変換されていることが示された。この物質を１０％メタノールを含む１００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させた。溶液をセライトで濾過することにより不溶物（オリゴマー）を除去し、濾液を蒸発させて２．８５ｇの粗製の保護環状ペプチドを得た。この物質を１００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させ、ウォーターズ・プレップ・パック・シリカゲルカラム（ Waters Prep Pack Silica Gel Column）（４．７×３０cm、１５〜２０μ）；流速：５０ml/分；検出：２８０nmへ負荷した。カラムを、順に、ＣＨ₂Ｃｌ₂（５００ml）、５％ＭｅＯＨを含むＣＨ₂Ｃｌ₂（２０００ml）で溶離し、最後に、８％ＭｅＯＨを含むＣＨ₂Ｃｌ₂で溶離した。純粋なペプチド（分析用ＨＰＬＣで決定）を含む画分をプールし、蒸発乾固させ、ジオキサンから凍結乾燥して、１．４４５ｇの精製された環状ヘプタペプチド（全収率、３７％）を得た。これは、分析用ＨＰＬＣにより＞９８％の純度を有することが示された。実施例１５Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−ＯＨシクロ（ｌｓ２１→Ａｓｐ２５）の調製実施例１４の完全保護環状ヘプタペプチド（１．４４５ｇ、１．１１１mmol）を、ヘリウム流下、ビブロミキサー・フラスコ中の６０mlのＭｅＯＨに溶解させた。これに、０．３１４ｇの１０％Ｐｄ担持炭素を添加し、ビブロミキサー装置中で、反応混合物を３．５時間水素化した。分析用ＨＰＬＣにより、約３０％のベンジルエステル完全保護環状ヘプタペプチドが残存していることが示された。さらに０．２ｇの１０％Ｐｄ担持炭素を添加し、水素化を２．７５時間続行した。分析用ＨＰＬＣにより、ベンジル基が完全に脱保護されたことが示された。反応混合液をセライトで濾過し、ＭｅＯＨで洗浄した。濾液および洗浄液を蒸発させ、ジオキサンから凍結乾燥して、１.２２５ｇ(９１.１％の収率:全収率３３．７％)の環状ヘプタペプチド酸を得た。分析用ＨＰＬＣにより、生成物は＞９７％の純度を有することが示された。生成物の同定は、アミノ酸解析、ＦＡＢ−ＭＳ、旋光度および¹Ｈ−ＮＭＲ分光法により、特徴決定し、確認した。実施例１６Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−サスリン樹脂の調製５０ｇの２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコールコポリスチレン１％ジビニルベンゼン架橋樹脂（サスリン樹脂）を、５００mlの塩化メチレンおよび２×５００mlのＤＭＦで洗浄した。７４．６ｇのＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（２４０mmol）を、６５０mlのＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＭＦ（２：１容量比）に溶解させた。溶液を氷浴中で冷却し、４９．５ｇのＤＣＣ（２４０mmol）を添加した後、１．４６ｇの４−ジメチルアミノピリジン（１２mmol）および６．２７mlのＮ−メチルモルホリン（６０mmol）を添加した。混合物をオービタルロータリー振とう器で９時間撹拌した。樹脂を濾過し、５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（3分間）および５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。一部を取り出し、乾燥させ、負荷量をＵＶ定性分析により決定したところ、０．５４mmol/gであった。次に、樹脂を２×５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および５００mlのＤＭＦ（３分間）で洗浄した。次に、樹脂を４００mlのＤＭＦに懸濁させ、５４．３ｇの安息香酸無水物（２４０mmol）を添加し、１００mlのＤＭＦ、および４１．７ml のジイソプロピルエチルアミン（２４０mmol）を添加した。懸濁液を３０分間振とうした。樹脂を濾過し、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、２×５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）、５００mlのＤＭＦ（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例１７Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａサスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−サスリン樹脂のＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨのＡｌａ−サスリンへの結合は、以下のようにして行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、１９．０８ｇのＦｍｏｃ−Ｎｌｅ −ＯＨ（５４mmol）、２３．９ｇのＢＯＰ（５４mmol）および７．３ｇのＨＯＢｔ（５４mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１４．１mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ａｌａ−サスリン樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、９．５４ｇのＦmoｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ（２７mmol）、１１．９ｇのＢＯＰ（２７mmol）および３．６５ｇのＨＯＢｔ（２７mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させ、室温で撹拌した。７．０５mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例１８Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリンのＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、１９．９ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ− ＯＨ（５４mmol）、２３．９ｇのＢＯＰ（５４mmol）および７．３ｇのＨＯＢｔ（５４mmol）を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１４．１mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、９.９ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ(２７mmol)、１１.９ｇのＢＯＰ（２７mmol）および３．６５gのＨＯＢｔ（２７mmol）を４００mlのＮＭＰに溶解させ、室温で撹拌した。７．０５mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合液を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例１９Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌ−サスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリンのＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、２５．３ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−ＯＨ（５４mmol）、２３．９ｇのＢＯＰ（５４mmol）および７．３ｇのＨＯＢｔ（５４mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１４．１mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、１２．７ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２７ mmol）、１１．９ｇのＢＯＰ（２７mmol）および３．６５ｇのＨＯＢｔ（２７mm ol）を４００mlのＮＭＰに溶解させ、室温で撹拌した。７．０５mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試を一度に樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例２０Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａサスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリンのＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、４０．１ｇのＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ（５４mmol）、２３．９ｇのＢＯＰ（５４mmol）および７．３ｇのＨＯＢｔ（５４mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１４．１ml のＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Lyｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、２０．１ｇのＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ（２７ mmol）、１１．９ｇのＢＯＰ（２７mmol）および３．６５ｇのＨＯＢｔ（２７mm ol）を４００mlのＮＭＰに溶解させ、室温で撹拌した。７．０５mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ− Ａｌａ−サスリン樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例２１Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ− サスリンのＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、１９．１ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ− ＯＨ（５４mmol）、２３．９ｇのＢＯＰ（５４mmol）および７．３ｇのＨＯＢｔ（５４mmol）を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１４．１mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、９.６ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ(２７mmol)、１１.９ｇのＢＯＰ(２７mmol)および３.６５ｇのＨＯＢｔ(２７mmo1)の混合物を４００ml のＮＭＰに溶解させ、室温で撹拌した。７．０５mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ− Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例２２Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）− Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ− Ａｌａ−サスリンのＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、２５．４ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（５４mmol）、２３．９ｇのＢＯＰ（５４mmol）および７．３ｇのＨＯＢｔ（５４mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１４．１ml のＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、１２．７ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２７ mmol）、１１．９ｇのＢＯＰ（２７mmol）および３．６５ｇのＨＯＢｔ（２７mm ol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させ、室温で撹拌した。７．０５mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例２３Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）− Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ） −Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリンのＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、２８．７ｇのＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（５４mmol）、２３．９ｇのＢＯＰ（５４mmol）および７．３ｇのＨＯＢｔ（５４mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１４．１ml のＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、１４．４ｇのＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（２７ mmol）、１１．９ｇのＢＯＰ（２７mmol）および３．６５ｇのＨＯＢｔ（２７mm ol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させ、室温で撹拌した。７．０５mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂を５００ mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂ （３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例２４Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ− Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ） −Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂のＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、２４．８ｇのＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（５４mmol）、２３．９ｇのＢＯＰ（５４mmol）および７．３ｇのＨＯＢｔ（５４mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１４．１ml のＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、１２．４ｇのＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（２７ mmol）、１１．９ｇのＢＯＰ（２７mmol）および３．６５ｇのＨＯＢｔ（２７mm ol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させ、室温で撹拌した。７．０５mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を２時間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ） −Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂のＦｍｏｃ基を、５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例２５Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）− Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂の調製対称無水物法(symmetric anhydride method)によるＦｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨの結合の前に、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ− サスリンのＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１９．４ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ（５４mmol）および７．３ｇのＨＯＢｔ（５４mmol）を、１３５mlのＣＨ₂Ｃｌ₂および２７０mlのＤＭＦの混合物に溶解させた。混合物を氷浴中で撹拌した後、１１．２ｇのＤＣＣ（５４mmol）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、濾過し、濾液を一度にＴｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂（（１０−１８）サスリン樹脂）に添加した。結合は９０分間で完了した。次に、得られた樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、１９．４ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ（５４mmol）および７．３ｇのＨＯＢｔ（５４mmol）を１３５mlのＣＨ₂Ｃｌ₂および２７０mlのＤＭＦの混合物に溶解させた。混合物を氷浴中で撹拌した後、１１．２ｇのＤＣＣ（５４mmol）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、濾過し、濾液を一度に（１０−１８）−サスリン樹脂に添加した。結合は９０分間で完了した。次に、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。結合完了後には脱保護は行わなかった。生成物、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−サスリン樹脂（Ｆｍｏｃ（９−１８）−サスリン樹脂）の最終重量は、１１２ｇであった。実施例２６Ｆｍｏｃ（９−１８）−サスリン樹脂からのＦｍｏｃ（９−１８）の切断２０ｇのＦｍｏｃ（９−１８）−サスリン樹脂を、０.２％ＴＦＡを含む４００ml のＣＨ₂Ｃｌ₂で室温で１分間処理した後、濾過した。ピリジン添加により、濾液のpHを直ちにpH７に調整した。濾液を蒸発させ、残渣を５０mlの蒸留水で磨砕し、５０mlのエーテルで洗浄した。得られた固体状の物質を、真空下で乾燥させた。濾過したペプチド−樹脂を、さらに６回、４００mlの０．２％ＴＦＡ溶液で１０分間処理した後、ピリジンでpHを７に調整した。蒸発、磨砕および乾燥の後、ＨＰＬＣ解析を行った。分析用ＨＰＬＣの条件は、以下の通りであった。カラム：リクロソルブＲＰ−１８、５ｍ、２５cm；溶離剤：（ａ）０．１MＨＣｌＯ₄／Ｈ₂Ｏ（pH２．５）、（ｂ）ＭｅＣＮ；勾配：３４％から３９％ＭｅＣＮ／２０分間；流速：１ml/分；検出器：２１０nm Ｋｎａｕ。純度が９０％以上のペプチド断片をすべて合わせると、全量は９．９ｇとなった。１１２ｇのペプチド樹脂の切断から得られた５２ｇの生成物は、９１％の平均純度を有していた。実施例２７Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂の調製５０ｇの２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコールコポリスチレン１％ジビニルベンゼン架橋樹脂（サスリン樹脂）を、５００mlの塩化メチレンおよび２×５００mlのＤＭＦで洗浄した。１０２ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（２４０mmol）を、５００ml のＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＭＦ（９：１容量比）に溶解させた。溶液を氷浴中で冷却し、４９．５ｇのＤＣＣ（２４０mmol）を１００mlのＣＨ₂Ｃ１₂／ＤＭＦ（９：1）に溶解させることにより調製したＤＣＣ溶液を添加した。混合物を３０分間撹拌した後、濾過によりＤＣＵを除去した。濾液を上記の洗浄されたサスリン樹脂に添加し、１．４６ｇの４−ジメチルアミノピリジン（１２mmol）および６．２７ mlのＮ−メチルモルホリン（６０mmol）を添加した。混合物を回転式振とう器（ orbital rotary）上で９時間撹拌した。樹脂を濾過し、５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。一部を取り出し、乾燥させ、負荷量をＵＶ分析により決定したところ、０．５９mmol/gであった。樹脂を２×５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および５００mlのＤＭＦ（３分間）で洗浄した。次に、樹脂を４００mlのＤＭＦに懸濁させ、５４．３ｇの安息香酸無水物（２４０mmol）を添加し、１００mlのＤＭＦ、および４１．７mlのジイソプロピルエチルアミン（２４０mmol）を添加した。懸濁液を３０分間振とうした。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂を濾過し、５００mlのＣＨ₂ Ｃｌ₂（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、２×５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂ （３分間）、５００mlのＤＭＦ（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例２８Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂のＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、２３．４ｇのＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（５９mmol）、２６．１ｇのＢＯＰ（５９mmol）および８．０ｇのＨＯＢｔ（５９mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１５．４ml のＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、室温で撹拌しながら、１１．７ｇのＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（２９．５mmol）、１３．１ｇのＢＯＰ（２９．５mmol）および４．０gのＨＯＢｔ（２９．５mmo1）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。７．７mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物液を９０分間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例２９Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂のＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、２２．８ｇのＦｍｏｃ−Ｐｈｅ− ＯＨ（５９mmol）、２６．１gのＢＯＰ（５９mmol）および８．０ｇのＨＯＢｔ（５９mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１５．４mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００ mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。ニンヒドリン試験で、結合反応が完了したことが示されたため、２回目の結合は不要であった。実施例３０Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂のＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、２０ｇのＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（５９mmol）、２６．１ｇのＢＯＰ（５９mmol）および８．０ｇのＨＯＢｔ（５９mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１５．４mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｐｈｅ −Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、室温で撹拌しながら、１０ｇのＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（２９．５mmol）、１３．１ｇのＢＯＰ（２９．5mmol）および４．０ｇのＨＯＢｔ（２９．５mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。７．７mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ） −サスリン樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例３１Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）− サスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂のＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、１８．４ｇのＦｍｏｃ−Ａｌａ− ＯＨ（５９mmol）、２６．１ｇのＢＯＰ（５９mmol）および８．０ｇのＨＯＢｔ（５９mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１５．４mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、室温で撹拌しながら、９．２ｇのＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（２９．５mmol）、１３．１ｇのＢＯＰ（２９．５mmol）および４．０ｇのＨＯＢｔ（２９．5mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。７．７mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｏｔＢｕ）−サスリン樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例３２Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）− Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ） −サスリン樹脂のＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、２４．３ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（５９mmol）、２６．１ｇのＢＯＰ（５９mmol）および８．０ｇのＨＯＢｔ（５９mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１５．４ mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）− サスリン樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、室温で撹拌しながら、１２．１ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（２９．５mmol）、１３．１ｇのＢＯＰ（２９．５mmol）および４．０ｇのＨＯＢｔ（２９．５mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。７．７mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢＵ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例３３Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ− Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ） −Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂のＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、２２．６ｇのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（５９mmol）、２６．１ｇのＢＯＰ（５９mmol）および８．０ｇのＨＯＢｔ（５９mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１５．４ml のＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、室温で撹拌しながら、１１．３ｇのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（２９．５mmol）、１３．１ｇのＢＯＰ（２９．５mmol）および４．０ｇのＨＯＢｔ（２９．５mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。７．７mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ −Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例３４Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ −Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂の調製Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ −Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂のＦｍｏｃ基の脱保護を、プロトコル１に記載の手順に従い行った。１回目の結合のため、室温で撹拌しながら、３６．６ｇのＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（５９mmol）、２６．１ｇのＢＯＰ（５９mmol）および８．０ｇのＨＯＢｔ（５９mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。１５．４ml のＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。２回目の結合のため、室温で撹拌しながら、１８．３ｇのＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（２９．５mmol）、１３．１ｇのＢＯＰ（２９．５mmol）および４．０ｇのＨＯＢｔ（２９．５mmol）の混合物を４００mlのＮＭＰに溶解させた。７．７mlのＤＩＰＥＡを上記の溶液に添加し、混合物を激しく撹拌した。得られた試薬を一度に樹脂に添加し、混合物を９０分間撹拌した。濾過後、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒt)−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ） −Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂を５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００ml のＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄した。実施例３５Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂のアセチル化保護ペプチド樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂を、２×２５％ピペリジンで処理し、プロトコル１に記載の脱保護工程のようにして洗浄した。Ｆｍｏｃ基を脱保護した後、Ｎ末端アミンのアセチル化を以下のようにして行った。１００mlのＡｃ₂Ｏおよび１００mlのＤＩＰＥＡを８００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂に含む溶液をペプチド樹脂に添加し、反応を９０分間進行させた。樹脂を濾過し、順に、５００mlのＤＭＦ（３分間）、５００mlのＭｅＯＨ（３分間）、５００mlのＣＨ₂Ｃｌ₂（３分間）および２×５００mlのＭｅＯＨ（３分間）で洗浄し、真空下で乾燥させて、１１０ｇの保護されたＡｃ（１−８）−サスリン樹脂、Ａｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ） −Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂を得た。実施例３６Ａｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−サスリン樹脂の切断２０ｇの保護Ａｃ（１−８）サスリン樹脂を、０．５％ＴＦＡを含む４００ml のＣＨ₂Ｃｌ₂で室温で１分間処理した後、濾過した。ピリジン添加により、濾液のpHを直ちにpH７に調整した。濾液を蒸発させ、残渣を５０mlの蒸留水で磨砕し、５０mlのエーテルで洗浄した。得られた固体状の物質を、真空下で乾燥させた。濾過したペプチド樹脂を、さらに３回、４００mlの０．５％ＴＦＡ溶液で１０分間処理した後、ピリジンでpHを７に調整した。蒸発、磨砕および乾燥の後、ＨＰＬＣ解析を行った。濾過したペプチド−樹脂を、さらに３回、４００mlの０．３％ＴＦＡ溶液で１０分間処理した後、ピリジンでpHを７に調整した。蒸発、磨砕および乾燥の後、ペプチド断片のＨＰＬＣ解析を行った。分析用ＨＰＬＣの条件は、以下の通りであった。カラム：リクロソルブＲＰ−１８、５ｍ、２５cm；溶離剤：（ａ）０．１M ＨＣｌＯ₄／Ｈ₂Ｏ（pH２．５）、（ｂ）ＭｅＣＮ；勾配：３４％から３９％ＭｅＣＮ／２０分間；流速：１ml/分；検出器：２１０nm Ｋｎａｕ。純度が９０％以上のペプチド断片をすべて合わせると、全量は１０．８ｇとなった。１１０ｇのペプチド樹脂の切断から得られた全収量は、４６ｇであり、純度は平均で９５％であった。実施例３７Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ −Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＮＨ₂（保護Ｆｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂）の合成断片Ｉ、Ｆｍｏｃ（２６−３１）−ＮＨ₂（配列番号２）（８．９１ｇ、８．２４mmol）を、１０％ジエチルアミンを含む９０mlのＤＭＦに溶解させ、室温で２時間撹拌した。アミンおよび溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をヘキサンおよびエーテルの混合物（４：１）で磨砕し、固体状の生成物をフィルター上に回収し、ヘキサンおよびエーテルの混合物（４：１）で洗浄して、７．０ｇのＨ−（２６−３１）−ＮＨ₂を無色の粉末として得た（収率９８．９％）。断片II、Ｆｍｏｃ（１９−２５）−ＯＨ(配列番号３)(９．８９ｇ、８．１５m mol)、Ｈ−（２６−３１）−ＮＨ₂（７．０ｇ、８．１５mmol）、ＨＯＢｔ（４．４９ｇ、２９．3mmol）およびＤＩＰＥＡ（６．８１ml、３９．１mmol）を、１２０mlのＤＭＦ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（１：１）に溶解させ、氷−水浴中で撹拌した。固体状のＨＢＴＵ（３．７１ｇ、９．７８mmol）を、１０分間かけて数回に分けて上記の溶液に添加した。撹拌を、０℃で３０分間、その後室温で３時間継続した。溶液を真空下で蒸発させて、溶媒を除去し、残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させた。この溶液を、順に、飽和ＮａＨＣＯ₃（３回）、１０％クエン酸水溶液（２回）、水およびブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥させた。溶液を濾過し、濾液を蒸発させて、粗製の保護中間体、Ｆｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂を１７．４ｇ、無色の固体として得た（収率１００％）。分析用ＨＰＬＣにより、純度は約７０％であると推定された。実施例３８Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）− Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ− Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−ＧｌｙＴｈｒ（ｔＢｕ）−ＮＨ₂（保護Ｆｍｏｃ（９−３１）−ＮＨ₂）の合成Ｆｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂（１７．４ｇ）を、１０％ジエチルアミンを含む９０mlのＤＭＦに溶解させ、室温で２時間撹拌した。アミンおよび溶媒を真空下で除去し、残渣をヘキサンおよびエーテルの混合物（３：１）で磨砕し、固体をフィルター上に回収し、ヘキサンおよびエーテルの混合物（３：１）で洗浄して、１６．６７ｇのＨ−（１９−３１）−ＮＨ₂を無色の固体として得た（収率１００％）。Ｆｍｏｃ（９−１８）−ＯＨ（配列番号４）（１６．５９ｇ、８．１５mmol）、Ｈ−（１９−３１）−ＮＨ₂（１６.６７ｇ）、ＨＯＢｔ（４．４９ｇ、２９. ３mmol）およびＤＩＰＥＡ（６．８１ml、３９．１mmol）を、１５０mlのＤＭＦ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（２：１）に溶解させ（溶液はわずかに濁っていた）、それから氷 −水浴中で撹拌した。ＨＢＴＵ（３．７０ｇ、９．７８mmol）を、１０分間かけて数回に分けて上記の溶液に添加した。溶液は透明になり、撹拌を、０℃で３０分間、その後室温で３時間継続した。溶液を真空下で蒸発させて、溶媒を除去し、残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させた。この溶液を、順に、飽和ＮａＨＣＯ₃（３回）、１０％クエン酸水溶液（２回）、水およびブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄ で乾燥させた。溶液を濾過し、濾液を真空下で蒸発させて、粗製の保護中間体、Ｆｍｏｃ（９−３１）−ＮＨ₂を２４．７７ｇ、約７９％の収率で、無色の固体として得た。分析用ＨＰＬＣにより、生成物の純度は約６９％であると決定された。実施例３９Ａｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＮＨ₂ （保護Ａｃ（１−３１）−ＮＨ₂）の合成Ｆｍｏｃ（９−３１）−ＮＨ₂（２４．７７ｇ）を、１０％ジエチルアミンを含む１００mlのＤＭＦに溶解させ、室温で２時間撹拌した。アミンおよび溶媒を真空下で除去し、残渣をヘキサンおよびエーテルの混合物（３：１）で磨砕し、固体をフィルター上に回収し、ヘキサンおよびエーテルの混合物（３：１）で洗浄して、２２．５６ｇのＨ−（９−３１）−ＮＨ₂を無色の固体として得た（収率９６．７％）。Ｈ−（９−３１）−ＮＨ₂（２２．５６ｇ、６．２２mmol）、Ａｃ（１−８） −ＯＨ（配列番号５）（８．７９ｇ、６．２２mmol）、ＨＯＢｔ(３．４３ｇ、２２.３８mmol)およびＤＩＰＥＡ(５．１９ml、２９．８４mmol)を含む、２００ mlのＤＭＦ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（１：１）の溶液を、氷−水浴中で撹拌しながら、ＨＢＴＵ（２．８３ｇ、７．４6mmol）を、１０分間かけて数回に分けて上記の溶液に添加した。０℃で３０分間、その後室温で３時間溶液を撹拌した。溶液を蒸発させ、残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させた。この溶液を、順に、飽和ＮａＨＣＯ₃（３回）、１０％クエン酸水溶液（２回）、水およびブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥させた。溶液を濾過し、濾液を蒸発させて、粗製の保護Ａｃ（１− ３１）−ＮＨ₂を２９．５４ｇ（約７２．２％の収率）、無色の固体として得た。分析用ＨＰＬＣにより、純度は約７８％であると推定された。実施例４０保護Ａｃ（１−３１）−ＮＨ₂の脱保護：環状ＶＩＰアナログの合成保護Ａｃ（１−３１）−ＮＨ₂（２９．５４ｇ）を、ＴＦＡ（１３５ml）、ＥＤＴ（４．５ml）、チオアニソール（７．５ml）、アニソール（３ml）の混合物１５０mlに溶解させ、室温で２時間撹拌した。この溶液を蒸発させて、ＴＦＡを除去し、５００mlの予冷されたエーテル中に添加して、沈殿物を形成させ、その沈殿物を回収し、エーテルで充分に洗浄した。生成物を真空下で乾燥させて、２５．５ｇのＡｃ（１−３１）−ＮＨ₂を無色の粉末として得た。この生成物は、ＨＰＬＣにより、約７２〜７５％の純度を有すると推定された。実施例４１環状ＶＩＰアナログの精製粗製のペプチド、Ａｃ（１−３１）−ＮＨ₂の精製は、デルタ・プレップ３０００システムを用いた分取ＨＰＬＣにより、複数回に分けて行った。粗生成物の一部を、ゾルバックス・プロテクション・プラス・カラム（環状ＶＩＰアナログ標品と比較）で定量的ＨＰＬＣ解析したところ、９．９５ｇのアナログが、２５．５ｇの粗生成物中に存在することが示された。典型的な回では、ペプチド（４ｇ）を２００mlの０．１％ＴＦＡ／Ｈ₂Ｏに溶解させ、ＹＭＣＯＤＳ−Ａ（１２０Å、１５μ）カラム（４．７×５０cm）に適用した。移動相は、（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ₂Ｏ−（Ｂ）０．１％ＴＦＡ）５０％ＭｅＯＨ−ＣＨ₃ＣＮであった。勾配溶離は、流速８０ml/分で、２０％（Ｂ）（１０分間）で出発し、次に２０％〜５０％（Ｂ）１８０分間で行った。ＵＶ検出を２１５nmで行った。主要なピークを含む画分を回収し、分析用ＨＰＬＣにより評価した。高純度であると判断した画分を集め、冷却したフィンガー・ロータリー・エバボレーターで濃縮し、凍結乾燥により１．２ｇの環状ＶＩＰアナログＡｃ（１−３１）−ＮＨ₂ を得た。残りの粗生成物を、同方法により処理して、合計で８．４８ｇ(８５．２％回収率)の精製された環状ＶＩＰアナログを得た。全収率は２３.９％であった。分析用ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動により、生成物は、＞９９％の純度を有することが確認された。生成物は、アミノ酸解析、ＦＡＢ−ＭＳ、旋光度、紫外線吸収および円二色性により特徴解析され、同定が確認された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/08 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７ＥＡ６１Ｋ 38/00 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フェリクス，アーサー・エムアメリカ合衆国、ニュージャージー 07006、ウェスト・コールドウェル、セントラル・アベニュー 257

Claims

【特許請求の範囲】１．化合物Ａｃ−（１−３１）−ＮＨ₂（配列番号１）を合成する方法であって、Ｆｍｏｃ保護ペプチド断片を結合させることを含む方法。２．Ｆｍｏｃ保護ペプチド断片が、ペプチド断片Ｉ（配列番号２）、ペプチド断片II（配列番号３）、ペプチド断片III（配列番号４）およびペプチド断片IV（配列番号５）である、請求項１記載の方法。３．（ａ）ペプチド断片ＩのＦｍｏｃ保護基を脱保護し、脱保護ペプチド断片Ｉを保護ペプチド断片IIと結合させる工程；（ｂ）工程（ａ）で得られたペプチドのＦｍｏｃ保護基を脱保護し、それを保護断片IIIと結合させる工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られたペプチドのＦｍｏｃ保護基を脱保護し、それを保護断片IVと結合させる工程；（ｄ）工程（ｃ）で得られた保護ぺプチドを脱保護して、脱保護Ａｃ（１−３１）−ＮＨ₂を得る工程を含む、請求項２記載の方法。４．脱保護ペプチドＡｃ（１−３１）−ＮＨ₂を精製することをさらに含む、請求項３記載の方法。５．精製が分取ＨＰＬＣにより行われる、請求項４記載の方法。６．４つのＦｍｏｃ保護ペプチド断片であるペプチド断片Ｉ（配列番号２）、ペプチド断片II（配列番号３）、ペプチド断片III（配列番号４）およびペプチド断片IV（配列番号５）を結合させることにより、精製された化合物Ａｃ−（１− ３１）−ＮＨ₂（配列番号１）を合成する方法であって、（ａ）ペプチド断片ＩのＦｍｏｃ保護基を脱保護する工程；（ｂ）脱保護ペプチド断片Ｉを保護ペプチド断片IIと結合させて、保護中間体Ｆｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂を得る工程；（ｃ）中間体Ｆｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂のＦｍｏｃ保護基を脱保護する工程；（ｄ）脱保護中間体Ｆｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂を保護断片IIIと結合させて、保護中間体Ｆｍｏｃ（９−３１）−ＮＨ₂を得る工程；（ｅ）中間体Ｆｍｏｃ（９−３１）−ＮＨ₂のＦｍｏｃ保護基を脱保護する工程；（ｆ）脱保護中間体Ｆｍｏｃ（９−３１）−ＮＨ₂を保護断片IVと結合させて、保護中間体Ａｃ−（１−３１）−ＮＨ₂を得る工程；（ｇ）保護ペプチドＡｃ−（１−３１）−ＮＨ₂を脱保護する工程；および（ｈ）脱保護ペプチドＡｃ−（１−３１）−ＮＨ₂を精製する工程を含む方法。７．工程（ｈ）における精製が分取ＨＰＬＣにより行われる、請求項６記載の方法。８．ペプチド断片および中間体のＦｍｏｃ保護基が、１０％Ｅｔ₂ＮＨを含むＤＭＦを用いて脱保護する、請求項６記載の方法。９．脱保護の後、ペプチド断片および中間体をヘキサン・エーテルで洗浄することにより、フルオレンを除去する、請求項６記載の方法。１０．脱保護ペプチド断片および中間体を、（ａ）ＤＭＦ−ＣＨ₂Ｃｌ₂中、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔを用い、ＤＩＰＥＡを用いて、１．０当量の保護ペプチド断片と結合させ；（ｂ）蒸発させ、ＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解させ；そして（ｃ）飽和ＮａＨＣＯ₃および１０％クエン酸で抽出する、請求項６記載の方法。１１．結合を、０°／３０分〜１時間および２５°／３時間、１．２当量のＨＢＴＵ、３．６当量のＨＯＢｔおよび４．８当量のＤＩＰＥＡを用いて行わせる、請求項１０記載の方法。１２．Ｆｍｏｃ（１９−３１）−ＮＨ₂（配列番号６）およびＦｍｏｃ（９−３１）−ＮＨ₂（配列番号７）からなる群より選択されるペプチド。１３．Ｆｍｏｃ−（２６−３１）−ＮＨ₂（配列番号２）；Ｆｍｏｃ−（１９− ２５）−ＯＨ（配列番号３）；Ｆｍｏｃ−（９−１８）−ＯＨ（配列番号４）；およびＡｃ−（１−８）−ＯＨ（配列番号５）からなる群より選択される保護ペプチド断片。１４．（配列番号２）；（配列番号３）および（配列番号４）を脱保護する、請求項１３記載のペプチド断片。１５．化合物Ａｃ−（1−３１）−ＮＨ₂（配列番号１）の製造のための、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の断片の使用。１６．上記の発明。