CZ251698A3 - Způsob přípravy analogu VIP a meziprodukty pro tuto přípravu - Google Patents
Způsob přípravy analogu VIP a meziprodukty pro tuto přípravu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ251698A3 CZ251698A3 CZ982516A CZ251698A CZ251698A3 CZ 251698 A3 CZ251698 A3 CZ 251698A3 CZ 982516 A CZ982516 A CZ 982516A CZ 251698 A CZ251698 A CZ 251698A CZ 251698 A3 CZ251698 A3 CZ 251698A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- fmoc
- minutes
- peptide
- mmol
- resin
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 59
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 title claims description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 327
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 293
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 121
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 89
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 83
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 83
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 72
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 71
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 68
- -1 1H-benzotriazol-1-yl Chemical group 0.000 claims description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 39
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 14
- NIHNNTQXNPWCJQ-UHFFFAOYSA-N fluorene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3C2=C1 NIHNNTQXNPWCJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 9
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical class [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 claims description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 102100033750 39S ribosomal protein L47, mitochondrial Human genes 0.000 claims 1
- 101000733895 Homo sapiens 39S ribosomal protein L47, mitochondrial Proteins 0.000 claims 1
- VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N invicorp Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N 0.000 abstract description 23
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 355
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 216
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 216
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 143
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 64
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 62
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 47
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 45
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 44
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 42
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 42
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 42
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 29
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 17
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 101100298295 Drosophila melanogaster flfl gene Proteins 0.000 description 13
- 108010003205 Vasoactive Intestinal Peptide Proteins 0.000 description 12
- 102400000015 Vasoactive intestinal peptide Human genes 0.000 description 12
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 12
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 10
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 10
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 230000027326 copulation Effects 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 8
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 8
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- CBPJQFCAFFNICX-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-methylpentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 CBPJQFCAFFNICX-IBGZPJMESA-N 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 7
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 6
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)butanedioic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N 0.000 description 5
- QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N 0.000 description 5
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N palladium Substances [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- SWZCTMTWRHEBIN-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=C(O)C=C1 SWZCTMTWRHEBIN-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 4
- LZOLWEQBVPVDPR-VLIAUNLRSA-N (2s,3r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]butanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H]([C@H](OC(C)(C)C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 LZOLWEQBVPVDPR-VLIAUNLRSA-N 0.000 description 4
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 4
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 4
- REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](COC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N 0.000 description 3
- UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 3
- VCFCFPNRQDANPN-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCC)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 VCFCFPNRQDANPN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 3
- NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 2,2,6,6-tetramethyloxan-4-one Chemical compound CC1(C)CC(=O)CC(C)(C)O1 NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YKNOJPJWNVHORX-UNQGMJICSA-N Val-Phe-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YKNOJPJWNVHORX-UNQGMJICSA-N 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 3
- MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N diphenylmethanamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(N)C1=CC=CC=C1 MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010265 fast atom bombardment Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 3
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 3
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 3
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000004149 thio group Chemical group *S* 0.000 description 3
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QOQFIQIYPSPWHZ-NRFANRHFSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-methylpentanoate Chemical compound O=C([C@@H](NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)CC(C)C)ON1C(=O)CCC1=O QOQFIQIYPSPWHZ-NRFANRHFSA-N 0.000 description 2
- JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]phenyl]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C)=CC=C1C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N 0.000 description 2
- UGNIYGNGCNXHTR-SFHVURJKSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-methylbutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UGNIYGNGCNXHTR-SFHVURJKSA-N 0.000 description 2
- YUGBZNJSGOBFOV-INIZCTEOSA-N (2s)-4-amino-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-oxobutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 YUGBZNJSGOBFOV-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- DVBUCBXGDWWXNY-SFHVURJKSA-N (2s)-5-(diaminomethylideneamino)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 DVBUCBXGDWWXNY-SFHVURJKSA-N 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- XEGZSHSPQNDNRH-JRQIVUDYSA-N Asn-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XEGZSHSPQNDNRH-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 2
- CJUKAWUWBZCTDQ-SRVKXCTJSA-N Asp-Leu-Lys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O CJUKAWUWBZCTDQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 101100455752 Caenorhabditis elegans lys-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N Gly-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 2
- STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N Lys-Gly-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- OVAOHZIOUBEQCJ-IHRRRGAJSA-N Lys-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O OVAOHZIOUBEQCJ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- MIMXMVDLMDMOJD-BZSNNMDCSA-N Lys-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MIMXMVDLMDMOJD-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- ATHHXGZTWNVVOU-UHFFFAOYSA-N N-methylformamide Chemical compound CNC=O ATHHXGZTWNVVOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- MVFQLSPDMMFCMW-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O MVFQLSPDMMFCMW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 2
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124630 bronchodilator Drugs 0.000 description 2
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 125000005928 isopropyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(OC(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000050 smooth muscle relaxant Substances 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- XXMYDXUIZKNHDT-QNGWXLTQSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-(1-tritylimidazol-4-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C(N=C1)=CN1C(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 XXMYDXUIZKNHDT-QNGWXLTQSA-N 0.000 description 1
- SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=CC=C1 SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- OTKXCALUHMPIGM-FQEVSTJZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 OTKXCALUHMPIGM-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 1
- VVQIIIAZJXTLRE-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCCC[C@H](N)C(O)=O VVQIIIAZJXTLRE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OIOAKXPMBIZAHL-LURJTMIESA-N (2s)-2-azaniumyl-5-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-5-oxopentanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O OIOAKXPMBIZAHL-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- IZKGGDFLLNVXNZ-KRWDZBQOSA-N (2s)-5-amino-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 IZKGGDFLLNVXNZ-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- FRLGFEJDRMTGHL-YFKPBYRVSA-N (2s)-6-amino-2-(carboxyamino)hexanoic acid Chemical group NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(O)=O FRLGFEJDRMTGHL-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- DAYKWVVEINTEQW-UHFFFAOYSA-N 1-(9h-fluoren-9-ylmethyl)piperidine Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1CN1CCCCC1 DAYKWVVEINTEQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001917 2,4-dinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C(=C1*)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- UGXVKHRDGLYFKR-CIUDSAMLSA-N Asn-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O UGXVKHRDGLYFKR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006847 BOC protecting group Chemical group 0.000 description 1
- VTHXZABQLOTBSV-UHFFFAOYSA-N C[I]C Chemical compound C[I]C VTHXZABQLOTBSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- IVHVNMLJNASKHW-UHFFFAOYSA-M Chlorphonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCC[P+](CCCC)(CCCC)CC1=CC=C(Cl)C=C1Cl IVHVNMLJNASKHW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- YUAXTFMFMOIMAM-QWRGUYRKSA-N Lys-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O YUAXTFMFMOIMAM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- URSRDDAXMAGFTC-KXXDLYTDSA-N [(2s,3s,4s,5r,6r)-5-hydroxy-2-methyl-6-[[(2r,3s,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-[2-(4-hydroxyphenyl)ethoxy]oxan-2-yl]methoxy]-4-[(2s,3r,4s,5r)-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxyoxan-3-yl] (e)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-enoate Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1\C=C\C(=O)O[C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO2)O)[C@@H](O)[C@H](OC[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](OCCC=3C=CC(O)=CC=3)O2)O)O[C@H]1C URSRDDAXMAGFTC-KXXDLYTDSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005515 capillary zone electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 125000000582 cycloheptyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- YNHIGQDRGKUECZ-UHFFFAOYSA-N dichloropalladium;triphenylphosphanium Chemical compound Cl[Pd]Cl.C1=CC=CC=C1[PH+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1[PH+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 YNHIGQDRGKUECZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007327 hydrogenolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010930 lactamization Methods 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- DBGVGMSCBYYSLD-UHFFFAOYSA-N tributylstannane Chemical compound CCCC[SnH](CCCC)CCCC DBGVGMSCBYYSLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 1
- VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N yttrium atom Chemical compound [Y] VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Respiratory Apparatuses And Protective Means (AREA)
- Regulating Braking Force (AREA)
- Hydrogen, Water And Hydrids (AREA)
- Catalysts (AREA)
- Networks Using Active Elements (AREA)
- Reduction Or Emphasis Of Bandwidth Of Signals (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu přípravy vasoaktivního intestinálního peptidového analogu Ac(1 -31)-NH2 ze čtyř chráněných peptidových segmentů.
Dosavadní stav techniky
Vasoaktivní intestinální peptid (VIP) je relaxant/bronchodilator hladkého svalstva, který reguluje sekreci hlenu v dýchacích cestách a má antialergické a antizánětlivé charakteristiky. Nejnovější studie vedly k objevů analogu VIP, který má zvýšenou metabolickou stabilitu a zvýšené receptorové vazné charakteristiky. Tento analog VIP je předmětem vynálezu, popsaného v evropské zveřejněné přihlášce vynálezu číslo 92/ 117, 185.
Aš dosud se tento analog VIP připravuje použitím pevné fáze. Tento způsob přípravy s pevnou fází zahrnuje vázání alfa-aminokyseliny, chráněné například terč.-butyloxykarbonylovou skupinou (BOC) , esterovou vazbou na chlormethylovanou pryskyřici nebo na hydroxymethylovou pryskyřici. Na pryskyřici se postupně váže několik aminokyselin. BOC chránící skupina se z alfa aminokyseliny odstraňuje za kyselých podmínek a následně se chráněné aminokyseliny kopulují postupně k získání meziproduktu, kterým je chráněná peptidová pryskyřice. Chránící skupiny se odstraní a peptid se oddělí od pryskyřice opakovanými fluorovodíkovými odštěpujícími reakcemi. Čištění peptidu je dvoustupňové a) gelovou chromatografii k exkluzí velikosti a b) preparátivní vysoce účinnou kapalinovou chromatografii (HPLC). Tento několikastupňový proces je časově náročný a vede * * · * ♦· • · · • · · ** k nedostatečnému výtěžku cílového peptidu.
Úkolem vynálezu je vyvinout poměrně jednoduchý, účinnější a ekonomičtější způsob syntézy analogu VIP.
Podstata vynálezu
Způsob přípravy analogu VIP Ac(l-3l)-NH2 íSEQ ID NOU) spočívá podle vynálezu v tom, ěe se kopulují Fmoc chráněné peptidové fragmenty.
Podle vynálezu se připravuje analog VIP Ac(1-311-NH2 vzorce
17;
Ac-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala 19 25 26 27 28 29 30 31
Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2
HN (SEQIDNOil) z chráněných peptidových fragmentů. S výhodou se při způsobu podle vynálezu kopulují Fmoc chráněné fragmenty, především se kopulují následující čtyři fragmenty: peptidový fragment I (SEQ ID N0:2), fragment II ťSEQ ID N0:3), fragment III íSEQ ID NO:4) a peptidový fragment IV íSEQ ID NO:5). Nový způsob nevyžaduje dosud nutné čištění peptidových fragmentů preparát ivní chromatografii HPLC, které bylo nutné, když se analog připravoval způsobem pevné fáze, ani nevyžaduje čištění meziproduktů, vytvořených v průběhu syntézy cílového cyklického VIP analogu. Výsledný produkt se čistí v konečné fázi po ukonční jednoho kroku preparát ivní chromatografii.
·· • •fc · 4 • · · «4 44
- 3 Způsob podle vynálezu pro přípravu cyklického VIP analogu AC(1-31)-NH2 zahrnuje kopulaci dvou nebo několika chráněných peptidovych fragmentů. Výhodnými peptidovými fragmenty jsou čtyři Fraoc chráněné fragmenty: peptidový fragment I (SEQ ID N0:2), fragment II (SEQ ID N0:3), fragment III (SEQ ID NO:4) a peptidový fragment IV (SEQ ID NO:5):
31'
Fmoc-Leu-^ys-Ljys-Gly-Gly-pir-NH2 Boc Boc tBu
CO
Fmoc-Asn-Tyr-Thr-Lys-íeu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-OH 1 1 I I I tBu tBu Boc PmcBoc
8 Ac-His-Ser-Asp-Ala-V al-Phe-Thr-Glu-OH
III II
Trt tBuOtBu tBuOtBu
Způsob podle vynálezu přípravy sloučeniny Ac(l-31)-NH2 (SEQ ID NO:1) kopulací Čtyř chráněných peptidouých fragmentů, kterými jsou peptidový fragment I (SEQ ID N0:2), fragment II (SEQ ID N0:3), fragment III (SEQ ID N0:4) a peptidový fragment IV (SEQ ID N0=51 zahrnující (a) odstraňování chránící skupiny Fmoc z peptidového fragmentu I a kopulaci chráněné ··* · · • ♦ · ·* ·» « · · · • · · · ·· ··
- 4 skupiny zbaveného peptidového fragmentu I s chráněným peptidovým fragmentem II; b)odstraňování chránící skupiny Fmoc z peptidu získaného ve stupni (a) a kopulaci s chráněným peptidovýffi fragmentem III; c) odstraňování chránící skupiny Fmoc z peptidu 2ískaného ve stupni (b) a kopulaci s chráněným peptidovým fragmentem IV; dl odstraňování chránící skupiny Fmoc 2 peptidu
J získaného ve stupni í cl k 2ískáni sloučeniny , ACÍ1-311-NH2, f prosté chránících skupin.
Chráněné peptidové fragmenty vzorce I až IV se volí se zřetelem na maximální kopulační účinnost a minimální racemizaci produktu v každé kopulační reakci. Používá se ekvivalentní množství každého fragmentu v každé kopulační reakci za vytvoření ekonomického způsobu získání cílového peptidu. Meziprodukty, vytvořené po každé kopulační reakci, se používají přímo pro následující kopulační reakci be2 dalšího čištění.
Čistota každého fragmentu, produktovaného způsobem s pevnou fází, jak se uvádí, je 82 až 97 % po jednotlivém čisticím stupni podle analytické chromatografie HPLC a každého fragmentu se používá pro přípravu cyklického analogu VIP bez dalšího Čištění.
Způsob podle vynálezu přípravy vyčištěné sloučeniny Ac(l-31)-NH2 (SEQ ID NO : 1) tedy zahrnuje: (a) odstraňování chránící skupiny Fmoc z peptidového fragmentu I (SEQ ID NO: 2) a kopulaci chráněné skupiny zbaveného peptidového fragmentu I s chráněným peptidovým fragmentem II (SEQ ID N0:3) za získání chráněného peptidu Fmocí19-31)-NH2 (SEQ ID N0:6) jakožto meziproduktu; íh) odstraňování chránící skupiny Fmoc z meziproduktu Fmoc(19-311 -NH2 a kopulaci meziproduktu Fmocí19-31)-NH2, zbaveného chránících skupin, s chráněným fragmentem III(SEQ ID N0:4) za získání jako meziproduktu chráněného peptidu Fmocí9311-NH2 (SEQ ID N0:7), ícl odstraňování chránící skupiny Fmoc z meziproduktu Fmocí9-311 -NH2 a kopulaci meziproduktu Fmoc(931Í-NH2, zbaveného chránících skupin s chráněným fragmentem IV fSEQ ID NO:5) 2a 2ískáni jako meziproduktu chráněného peptidu ňc<i-31)-NH2; odstraňování chránící skupiny 2 chráněného peptidu Ac(1-31)-NH2J a čištění peptidu Ací1 -311-NH2, žhaveného chránících skupin, například preparativní chromatografií HPLC.
Používaná nomenklatura k definování peptidů je v oboru běžně používanou nomenklaturou, přičemž aminoskupina na N-zakončení je vlevo a karboxylová skupina na C-zakončení je vpravo. Přírodními aminokyselinami se míní přírodně se vyskytující aminokyseliny v proteinech, například Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp a His. Pokud má aminokyselina izomerní formy, míní se aminokyselinou její L-forma, pokud není uvedeno jinak.
Pro presentaci aminokyselin se používají například následující zkratky, kromě shora uvedených, chránící skupiny, rozpouštědla a reakční činidla. Význam jednotlivých zkratrek je následuj fcí:
Symbol
Ac
Nle
Fm
DIPEA
DMF
Význam acetyl norleucin
9-fluorenylmethyl
N,N-di isopropylethyl amin di methyl formám id
Připojené označení -0H a -NH2 za VIP se týká forem volné kyseliny a amidu polypeptidu. Pokud toto označení není uvedeno, zahrnuje výraz obě formy.
Zde definovaným cyklickým peptidem je peptid, přičemž karboxyZakončení vedlejšího řetězce aminokyseliny v peptidu je vázáno kovalentně na vedlejší řetězec aminozakončerií jiné
- 6 • ·· aminokyseliny peptidového řetězce za vytvoření amidové va2by. Pro cyklické peptidy se používají různé nomenklatury a symboly. Příkladně se uvádějí
a. cyklo(Lys2i-Asp25)-Fmoc-Ala19-LysCBoc)20.LyS21.
Tyr(tBu)22-Leu23^Asn24-Asp25-OH;
b. Fmoc-(l9-25)-OH;
c. Fmoc-[AIal9-Asp25]-VIP cyído(21 ->25);
d. [Fmoc-(SEQ ID N0:3)-0H];
e. Fmoc-[Alal9-Asp25]-VIP cyklo (Lys21-»Asp25);
f. [Fmoc-(SEQ ID N0:3)-0H];
gBoc tBu
I I
Fmoc-Ala-Lys-Lys-Týr-Leu-Asn-Asp-OH hLShora uvedené struktury (a-g) a presentace za použití (SEQ ID NO·') representují vždy stejný peptid mající aminokyselinovou sekvenci odpovídající VIP peptidovému fragmentu, ve kterém je Fmoc skupina nahrazena vodíkem v N-zakončeni. Přídavně se vytváří amidová vazba mezi vedlejším řetězcem karboxylového lysinu v poloze 21 a vedlejším řetězcem aminu asparagové kyseliny v poloze 25 za vytvoření cyklického peptidového fragmentu. Shora uvedené presentace pro peptidovou strukturu se považují za rovnocenné a zaměnitelné,
V cyklických peptidech podle vynálezu se používají následující konfigurace, pokud není uvedeno jinak. Aminokyselina Zakončení aminokyseliny v řetězci vázané k vytvoření cyklického peptidu
Lys epsilon amino epsilon
Asp beta karboxyl
Glu gama karboxyl
Peptidové fragmenty, které obsahuje VIP analog podle
• to · · * • · * • to *· vynálezu se mohou snadno připravovat o sobě známými běžnými
Takové běžné způsoby zahrnují například všechny způsoby v roztokové fázi umožňující kondenzaci mezi volnou alfa aminoskupinou aminokyseliny nebo jejího zbytku majícího své karboxylové nebo jiné reaktivní aminoskupiny chráněné a volnou primární karboxylovou skupinou jiné aminoskupiny nebo jeího zbytku mající své aminoskupiny nebo jiné reaktivní skupiny chráněné,
Způsopb přípravy peptidových fragmentů, obsahujících VIP analog, se může provádět tak, že se přidávají aminokyseliny v žádoucím přadí jedna, aminokyselina ke druhé aminokyselině nebo k jejímu zbytku způsobem, při kterém se peptidové fragmenty s žádanou aminokselinovou sekvencí nejdříve obvyklým způsobem syntetizují a pak se kondenzují za získání žádaného pept i du.
Takový obvyklý způsob přípravy peptidových fragmentů zahrnuje například přípravu na jakékoliv pevné fázi Při takovém způsobu se příprava peptidovébo fragmentu může provádět postupným vnášením žádaných aminokyselinových zbytků do rostoucího peptídového řetězce o sobě známými principy přípravy s pevnou fází (R.B. Merrifield, J.Am.Chem. Soc. 85, str. 2149 až 2154, 1963; Barany a kol., The Peptides, Analysis, Synthesís and Biology, svazek 2, E. Gross a J. Meienhofer, vyd. Academie Press 1-284, 1980).
Při chemické přípravě peptidů je běžné chránění reaktivních skupin vedlejšího řetězce různých aminokyselinových podílů vhodnými chránícími skupinami, které brání průběhu chemických reakcí v místě až do chvíle odstranění takové chránící skupiny. Je také dobře známo chránit alfa aminoskupinu aminokyseliny nebo jejího fragmentu, když molekula reaguje na karboxylové skupině, naěež se selektivně odstraní skupina chránící alfa aminoskupinu a tím se na tomto místě umožní reakce.
τ : * ···· · ’ »«· *· ·* *· *· ’*
- 8 Jakkoliv byly vyvinuty specifické chránící skupiny pro způsob přípravy peptidu s pevnou fá2Í, připomíná se, že je mošno chránit každou aminokyselinu chránícími skupinami používanými pro přípravu v tekuté fází.
Alfa aminoskupiny se mohou chránit vhodnými chránícími skupinami se souboru zahrnujícího aromatické chránící skupiny urethanového typu, jako je skupina benzyΪoxykarbonylová (Z) a substituovaná skupina benzyloxykarbonylová, jako jsou například skupina p-chlorbenzyloxykarbonylová, p-nitrobenzyloxykarbonylová, p-brombenzyloxykarbonylová, p-b i fenyl isopropyl oxykarbonyl ová, p-fluorenylmethyloxykarbonylová (Fmoe) a p-methoxybenzyloxykarbonylová (M02) skupina! alifatické chránící skupiny urethanového typu, jako jsou například skupina terč.-butyl oxykarbonyl ová (Boc), diisopropylmethyloxykarbonylová, isopropyloxykarbonylová a al1yloxykarbonylová skupina. Jakožto nejvýhodnější skupina pro chránění alfa aminoskupiny se uvádí skupina Boc.
Karboxylové skupiny se mohou chránit vhodnými skupinami ze souboru zahrnujícího aromatické estery, napříkad skupinu benzylovou (OBzl) nebo skupinu benzylovou substituovanou nižší alkylovou skupinou, atomem halogenu, nitroskupinou, thioskupinou nebo substituovanou thioskupinou například nižší alkylovou skupinou (s 1 až 7 atomy uhlíku), thioskupina, alifatický ester jako nižší alkyl, t-butyl (Ot-Bu), cyklopentyi, cyklohexyl (OcHx), cykloheptyl a 9-f1uorenylmethyl (OFm). Obzvláště výhodnými chránícími skupinami pro glutamovou kyselinu (Glu) jsou skupina OBsl a OFm. Obzvláště výhodnými chránícími skupinami pro asparagovou kyselinu (Asp) jsou skupina OChx, OBzl a OFm.
Hydroxylové skupiny se mohou chránit vhodnými skupinami ze souboru zahrnujícího ethery, jako jsou napříkad skupina benzylová (Bzl) nebo skupina benzylová substituovaná nižší al-
- 9 • ·· · • · · »· · kýlovou skupinou, atomem halogenu, například 2,6-dichlorbenzy1 ová skupina (DCB), nitroskupinou nebo methoxyskupinou, dále skupina terč.-butylová (t-Bu), tetrahydropyranylová a trifenylmethylová (tritylová) skupina. Obzvláště výhodnou chránící skupinou pro serin (Ser) a threonin (Thr) je skupina Bzl . Obzvláště výhodnou chránící skupinou pro tyrosin (Tyr) je skupina DCB.
Aminoskupiny vedlejšího řetězce se mohou chránit vhodnými chránícími skupinami ze souboru zahrnujícího aromatické chránící skupiny urethanového typu, jako je skupina benzy1oxykarbonylová (Z) a substituovaná skupina benzy1oxykarbonylová, jako jsou například skupina p-chlorbenzyloxykarbonylová, 2chlorbenzyloxykarbonylová (2-C1-Z), p-nitrobenzyloxykarbonylová. p-brombenzyloxykarbony)ová, p-bifeny1 isopropyloxykarbonylová, 9-f1uoreny1methy1oxykarbonylová (Fmoc) a p-methoxybenzyl oxykarbonylová (Moz) skupina; alifatické chránící skupiny urethanového typu, jako jsou například skupina terč.-butyloxykarbonylová (Boc), di isopropylmethyloxykarbony1ová, isopropy1oxykarbonylová a allyloxykarbonylová skupina. Jakožto nejvýhodnější skupina pro chránění ornithinu (Orn) se uvádí skupina Z. Jakožto nejvýhodnější skupina pro chránění lysinu (Lys) se uvádí skupina 2-Cl-Z a Fmoc.
Guanidinoskupiny se mohou chránit vhodnou chránící skupinou ze souboru zahrnujícího nitroskupinu, p-toluensulfonylovou skupinu (Tos) , skupinu Z, adamantyloxykarbonylovou skupinu a skupinu Boc. Nejvýhodnějši skupinou pro chránění argininu (Arg) j e Tos.
Amidoskupiny vedlejšího řetězce se mohou chránit xanthylovou skupinou (Xan). Pro asparagin (Asn) á pro glutamin (Gin) neexistuje žádná výhodná chránící skupina.
Imidazolové skupiny se mohou chránit vhodnými chránícími
444 4 4 • 4 ·
44 * 4 44
4 · 4
4 4 * • 4 4« skupinami ze souboru zahrnujícího skupinu p-toluensulfonylovou ÍTos), 9-fluorenylmethyloxykarbonylovou (Fmoc) trifenylmethylovou (tri tylovou), 2,4-dinitrofenylovou (Dnp), Boc a benzyioxymethylovou ÍBom). Skupina Tos a Bom jsou nejvýhodnějši mi chránícími skupinami pro histídin (His).
Jakožto chráněné aminokyseliny pro účely vynálezu se uvádějí příkladně Lys(Boc), Glu(OtBu) a TyrítBu).
Všechna rozpouštědla pro účely vynálezu včetně methanolu, methylenchloridu, acetonitrilu (CH3CN), etheru, hexanu a dimet hylformamidu jsou obchodní produkty společnosti Fischer nebo Burdick a Jackson. Trifluoroctová kyselina (TFA) je ochodním produktem společnosti Halocarbon a používá se přímo bez dalšího čištění. Diisopropylethylamin ÍDIPEA) (EDT), dicyklohexylkarbodiimid ÍDCC),
1,2-ethandi thíol N-hydroxysukc i n i m i d (HOSu) a thioanisol jsou obchodní produkty společnosti Aldrich Chemical Co., Inc. (Mílvaukee, WI). 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) je ochodním produktem společnosti Sigma Chemical Co.
(St. Louis, MI), 2-(lH-bensotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát ÍHBT(J) a benzotriazol- i-yloxy-tri (di methylamino)fosfoniumhexafluorfosfát (BOP) jsou obchodní produkty společnosti Richelieu Biotechnologies (St. Hyacinthe, Quebec, Kanada). 2-Methoxy-4-alkoxyben2ylalkoholkopolystyren 1 % divinylbenzenu (pryskyřice Sasrin) je obchodní produkt společnosti Bachem Bioscience. Fmoc/tBu chráněné aminokyseliny jsou všechny v konfiguraci L a jsou obchodními produkty společnosti Bachem Inc. (Torrance, Ca).
Analytická vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) se provádí na jednotce LDC Constrametric IIG, vybavené jednotkami Gradient Master a spektromonitorem III UV-detektorem variabilních vlnových délek a na jednotce Lichrosorb RP-8 (5 um) sloupec (4,6 mm x 25 cm), za použití jako elučního činidla: (A) 0,1M NaCICU (hodnota pH 2,5) - ÍB) CH3CN, lineární gra· ·« · * · » t » ♦ ♦ ·· • * · · · ·» ·· ·♦· ·» · · • · · · » · ♦ ·»· ·· ·· ··' dlení 20 minut, průtok 1 ml/minuta, detekce 214 nm. HPLC chráněných meziproduktů, Fmoc-í19-31)-NH2 a Fmocí9-31)-NH2 se provádí na jednotce Lichrosorb RP-8 (5 um) sloupec (4,6 mm x 25 cm), za použití jako elučniho činidla; (A) 0, ÍM NaC104 (hodnota pH 2,5)-(B) CH3CN, lineární gradient 40 až 90% ( B) 20 minut, průtok 1 ml/minuta, detekce 214 nm. HPLC chráněného Ac(1-31)-NH2 se provádí na témže sloupci, za použití (B) CH3CN: IPrOH ( 1'· 1) ; lineární gradient 60 aš 95 % ÍB), 20 minut. HPLC cyklického VIP analogu se provádí na (i) Vydac C-18 sloupci, eluční činidlo: (A) H2O (0,1 % TFA) - (B) CH3CN (0,1 % TFA); lineární gradient 15 aě 30 % (B), 20 minut; průtok 1 ml/minuta; detekce 214 nm (i i) Zorbax Protein Plus sloupec; eluční činidlo (A) H20 (0,1 % TFA)-(B) CH3CN (0,1 % TFA); lineární gradient 20 až 35 % (B) 20 minut; průtoku 2 ml/minuta; detekce 210 nm (iii) Lichrosorb RP-8 (5 um) sloupec; eluční činidlo (A) NaC104 (hodnota pH 2,5)-ÍB) CH3CN, lineární gradient 30 až 50 % (B), 20 minut, průtok 1 ml/minuta, detekce 206 nm. Preparát ivni HPLC se provádí na sloupci Delta Prep 3000 systém YMC ODS-A (1,2 nm, 15 u.m) (4,7 x 50 cm); eluční činidlo H2O (0,1 % TFA)-(B) acetoni tri 1-methanol (1:1) (0,1 % TFA); lineární gradient 20 až 50 % (B) 3 hodiny; průtok 80 ml/minuta; detekce 2154 nm.
Hmotová spektra z bombardování rychlými atomy (FAB-MS) se zapisují na Beckmanově VG2AB-1F nebo VG70E-HF hmotovém spektrometru. Analáza aminokyselin se provádí na Beckmanově analyzátoru aminokyselin Model 121M. Chráněný peptidový fragment a volné peptidy se hydrolyžují v 6M kyselině chlorovodíkové (Pirce Chemical Co.) v utěsněné evakuované skumsvce při teplotě 110 C po dobu 24 hodin.
Podle vynálezu se čtyři peptidové fragmenty vzorce I aě IV připravují opakovanou syntézou na pevné fázi. Kopulační reakce se vědy monitorují Kaisrovým ninhydrinovým testem ke stanovení postupu reakce a ukončení reakce (Kaiser a kol.,
- 12 * · ·« · · · • · · · · • · · · • β ·<
··· · · · · · ··
Anal. Biochem. 34, str. 595 až 598, 1970). Příprava pryskyřic se monitoruje UV analýzou tímto způsobem:
Substituce chráněné aminokyseliny (AA) pryskyřice (FmocAA-pryskyřice) v každém bodě syntézní přípravy využívá absorbance N-(9-fluorenvlmethyl)piperidinu při 301 nm (epsilon 7800), Přesně se váží 4 až 8 mg pryskyřice ve zkušební zkumavce a zpracuje se 0,5 ml 20% roztoku piperídinu v dimethyl formám i du. Například do zkušební zkumavky, obsahující 5,05 mg Fmoc-Gly-pryskyřice se přidá 0,5 ml 20% roztoku piperídinu v dimethylformamidu. Jako slepého pokusu se použije 0,5 ml 20% roztoku piperídinu v dimethyl formám idu. V průběhu následujících 15 minut se zkumavka s Fmoc-Gly-pryskyřicí rozvíří dvakrát nebo třikrát k zajištění dokonalého styku pryskyřice s piperidinovým roztokem. Do obou zkumavek se vnese dimethylformamid k úpravě objemu na 50 ml. Spektrofotomer se vynuluje při 301 nm se slepou zkouškou, Absorbance Fmoc-Gly-pryskyřice se vypočte t i mto způsobem:
Ά301 x objíml)
526 x (50)
0,67 mmol/g
7800 x hmot. (g)
7800 x .0,00505 (g)
Obecně se chránící Fmoc skupina odstraňuje z peptidové pryskyřice způsobem uvedeným v tabulce:
| Protokol 1 | : Odstraňování chránící | skupiny Fmoc |
| Stupeň | Reakční činidlo | Doba |
| 1 | methylenchlorid | 2x3 |
| 2 | dimethylformamid | 3 minuty |
| 3 | 25% piperi din | 5 minut |
| 4 | 25% piperidin | 15 minut |
| 5 | dimethylformamid | 3 minuty |
| 6 | methanol | 3 minuty |
| 7 | methylenchlorid | 3 minuty |
flflfl fl · • fl * • fl flfl
- 13 • fl • fl • · • fl· fl fl » fl fl fl • v fl · · • · flfl
| 8 | methanol | 3 minuty |
| 9 | methylenchlori d | 3x3 minuty |
| 10 | dimethylformám id | 3 minuty |
| 11 | kopulace | 90 m i nut |
| 12 | d i methylformam i d | 3 minuty |
| 13 | methanol | 3 minuty |
| 14 | methylenchlorid | 3 minuty |
| 15 | methanol | 2x3 minuty |
Příprava fragmentu I, Fmoc-í26-31)-NH2, popsaná v příkladu 1 až 8. zahrnuje přípravu C koncového amidového fragmentu sa použití XAL-spojovníkove pryskyřice a za použití benzotria501 -1 -yloxytri s( d i methylamino) fosf on i umhexaf1 uorfosf átu ( BOP) jako kopulačního činidla. Obecně se provádí podvojná kopulace pro každou aminokysel inu k saj istění konečné čistoty. Zpravidla se používají čtyři ekvivalenty reakčního činidla pro první kopulací a dva ekvivalenty reakčního činidla pro druhou kopu1 aci .
Synthesa fragmentu II, Fmoc-(19-25)-OH, popsaná v příkladu 9 až 15, zahrnuje postupné vytváření v pevné fázi chráněného heptapeptidu, ve kterém koncová skupina COOH, Asp je vázán na pryskyřici Sasrin na beta-COOH přes Fmoc-Asp(0-Sasrin)-OBzl Výchozí pryskyřice se kopuluje s dipeptidem, Fmoc-Leu-Asn-OH, který byl připraven z Fmoc-Leu-OH a H-Asn-OH ípreaktivací Fmoc-Leu-OH na Fmoc-Leu-OSu) vě 71,3% výtěžku (stanovená čistota větší než 95% analytickou HPLC). Tripeptidová pryskyřice se podrobuje dvěma cyklům synthesy v pevné fázi s Fmoc-Tyr(tBu)-OH a s Fmoc-LysfAlloc)-OH. Část výsledné pentapeptidové pryskyřice se podrobí dvěma dalším cyklům synthesy v pevné fázi Fmoc-Lys( Boc)-OH a s Fmoc-Ala-OH. Podíl plně chráněné heptapept idové pryskyřice se odštěpí systémem 0,5 % trifluoroctová kyselina/metbylencblorid a vykazuje jeden hlavní pík (stanovená čistota větší než 82%) podle HPLC. Selektivní odstraňování chránící skupiny Lysí Al loc)21 se provádí Pd[ ( CřHs) 3Π2 a «·« · « • · · «* ·ν
- 14 • «I » · • · »»« ·· • » »» » · « • ♦ « ·« «·
BuaSnH a výsledná částečně chráněná pryskyřice se štěpí 0,5 % systémem 0:5 % triFluoroctová kyše1ina/methylenchlorid. K úplnému štěpení pryskyřice je potřeba 10 minut. Čistota produktu Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr( tBul-Leu-Asn-Asp( OBzl) je podle stanovení větší než 80% podle analytické HPLC a celkový výtěžek je 75,7% (ve srovnání s výchozí pryskyřicí, F®oe-Asp(0-Sasrin)-OBzl).
Cyklisace vedlejšího řetězce k vedlejšímu řetězci (Lys21 k Asp25) lineárního heptapeptidu se provádí v roztoku obsahujícím di methyl formámid sa použití BOP a DIPEA a je ukončena za 1,25 hodin. Analytická HPLC tohoto surového produktu dokládá téměř kompletní konverzi lineárního heptapeptidu. Provádí se jediný čisticí stupeň získaného cyklického heptapeptidu na silikagelu. Při tomto čištění se odstraňují jakékoliv oligomery, vytvořené při laktamisaci. Analytická HPLC čištěného heptapeptidu dokládá čistotu cyklického heptapeptidu větší něž 98%. Celkový výtěžek čištěného cyklického heptapeptidu, ve srovnání s výchozí pryskyřicí je 37%. Konečné odstraňování C-koncové benzylešterové skupiny se provádí hydrogenolýzou ve vibrómixerové aparatuře za použití 10% palladia na uhlí po dobu přibližně šesti hodin. Po reakci se provádí analytická HPLC a konečný produkt, cyklo(Lys21-Asp25)-Fmoc-Ala19-Lys(Boc)2°-Lys21Tyr(tBu22)-Leu23-Asn24-Asp25-OH se získá v celkovém výtěžku 33,7% (ve srovnání s výchozí pryskyřicí) při čistotě větší než 97%. Struktura a identita konečného produktu se potvrzuje íH-NMR spektroskopií a plně se charakterizuje aminokyselinovou analýzou a hmotovou spektroskopi í.
Opakovaná syntéza na pevné fází fragmentu III, Fmoc-(9-18)0H, popsaná v příkladu 16 až 26 a fragmentu IV, Ac(l-8)-0H, popsaná v příkladu 27 až 36, se provádí za použití BOP jakožto kopulačního činidla a piperidinu pro odstraňování chránící Fmoc skupiny. Vysoce kyselinově labilního linkeru Sasrin se používá k zadržování skupiny chránící vedlejší řetězec na * ♦ * *· • ·· • * · #· ·♦
- 15 fragmentu. Obecně se provádějí dvě kopulační reakce pro kaědou aminokyselinu k zajištění čistoty. Používají se dva ekvivalenty reakčního činidla pro první kopulaci a jednoho ekvivalentu reakčního činidla pro druhou kopulaci.
Střední čistota, lískaná po štěpení je 91% v případě peptidového fragmentu III a 95% v případě peptidového fragmentu IV. Tyto peptidové čistoty, lískané po štěpení jsou dostatečné pro přímé použití peptidového fragmentu pro syntézu VIP analogu bez dalšího čištění.
Příprava mocého cyklického VIP analogu podle vynálezu se provádí kopulací čtyř fragmentů I až IV podle následujícího schéma.
- 16 26 31
H-|-^νη2 (ΰ .19 21 25
Fmoc-)-1-1 - OH
HN
HBTU/HOBt (Π)
21
Fmoc—1 —— | —
HN l-NH,
Fmoc
-l-OH et2nh
HBTU/HOBt <m)
25
Fmoc -1
-NH,
Ac-|l-OH
ET2NH
HBTU/HOBt (IV)
Ac-I21
I —
HN
1-NH2
Ac-Isbavený chránící skupiny
1-NH2
- 17 Každý cyklus fragmenlové kopulace se provádí stejným následujícím zůsobem' (i) odstraňuje se chránící skupina Fmoc 2 peptidového fragmentu i 0% EtsNH v diméthy1formamidu ( dvě hodiny); (ii) odstraňuje se fluoren promytím systémem hexan/etheri (iii) kopuluje se peptidový fragment, zbavený chránící skupiny s 1,0 ekvivalentu jiného chráněného fragmentu sa použití HBTU (1,2 ekvivalenty), HOBt (3,6 ekvivalentů v systému dimethylformaid/ethylenchlorid při teplotě 0 C po o
dobu 30 minut až jedné hodiny a při teplotě 25 C po dobu tří hodin 2a použití DIPEA (4,8 ekvivalentů); a (iv) provádí se odpaření a rozpuštění v methylenchloridu a extrakce nasyceným ro2tokem hydrogenuhliči tanu sodného a 10% kyselinou citrónovou.
Podle výhodného provedení se každý cyklus kopulace fragmentů provádí následujícím způsobem: (i) odstraňuje se chránící skupina Fmoc 2 peptidového fragmentu 10% Et2NH v dimethyl formamidu (dvě hodiny); (ii) odstraňuje se fluoren promytím systémem hexan/ether; (iii) kopuluje se peptidový fragment I, zbavený chránící skupkny, s 1,0 ekvivalentu chráněného fragmentu II za použití HBTU (1,2 ekvivalenty), HOBt (3,6 ekvivalentů) v systému di methyl Forma id/ethylenchlorid při teplo& o tě 0 C po dobu 30 minut až jedné hodiny a při teplotě 25 C po dobu tří hodin za použiti DIPEA (4,8 ekvivalentů) 5 a ( iv) provádí se odpaření a rozpuštění v methylenchloridu a extrakce nasyceným roztokem hydrogenuhliči tanu sodného a 10% kyselinou citrónovou za získání chráněného meziproduktu Fmocí19-31)-NH2» (v) odstraňuje se chránící skupina Fmoc z meziproduktu Fmocí193D-NH2 za použití 10% Et2NH v dimethylformámidu (dvě hodiny);
(vi) odstraňuje se fluoren promytím systémem hexan/ether;
(vii) kopuluje se chránící skupiny zbavený meziprodukt Fmocí19-31)-NH2 s 1,0 ekvivalentu chráněného fragmentu III za použití HBTU (1,2 ekvivalenty). HOBt (3,6 ekvivalentů v systéo mu dimethylformaid/ethylenchlorid při teplotě 0 C po dobu 30 a
minut až jedné hodiny a při teplotě 25 C po dobu tří hodin za použití DIPEA (4,8 ekvivalentů); a (xii) provádí se odpaření ·· ··
- 18 a rozpuštění v methylenchloridu a extrakce nasyceným roztokem hydrogenuhli či tanu sodného a 10% kyselinou citrónovou za získání chráněného meziproduktu Fmocí9-31)-NH2; (ix) odstraňuje se chránící skupina Fmoc z meziproduktu Fmocí9-311 -NH2 10% EÍ.2NB v d i methyl formám i du (dvě hodiny); (x) odstraňuje se fluoren promytím systémem hexan/ether; (xi) kopuluje se peptidový fragment, zbavený chránící skupiny, s 1,0 ekvivalentu chráněného fragmentu IV za použití HBTU (1,2 ekvivalenty), HOBt (3,6 ekvivalentů) v systému dimethylformaiď/ethylenchlorid při teplotě 0 C po dobu 30 minut až jedné hodiny a při teplotě 25
C po dobu tří hodin za použití DIPEA (4,8 ekvivalentů); a (xii) provádí se odpaření a rozpuštění v methylenchloridu a extrakce nasyceným roztokem hydrogenuhliči tanu sodného a 10% kyselinou citrónovou za získání chráněného meziproduktu Fmoc(1-31)-MHa
Příprava cyklického VIP analogu z fragmentů je podrobně objasněna v příkladu 37 až 41. Chráněné meziprodukty, Fntoc(19-3U-NH2, Fmocí 9-31 )-NH3 a Ac(l-31)-NH2 se získají jako hlavní produkty z každého reakčního cyklu. Tyto surové, chráněné meziprodukty se dále nečistí a používají se v této surové formě pro každý následný kopulační cyklus. Analytická HPLC potvrzuje, že jsou výchozí materiály plně spotřebovány za použitých podm í nek.
Konečné odstranění chránící skupiny z plně chráněného peptidu Αα(1-31)-NH2 se provádí reakcí s TFA (90 %); s EDT (3 %);
β s thioanisolem (5 %); as anisolem (2 %) při teplotě 25 C po dobu dvou hodin. Analytická HPLC potvrzuje, že hlavním produktem syntézy (72 až 75 %) je cyklický VIP analog.
Čištění surového produktu se provádí jediným průchodem za použití preparativní HPLC za použití AMC ODS-A reverzního fázového sloupce (4,7 x 50 cm). Další čištění až do 4,0 g surového produktu se snadno dosahuje za použití sloupce a • •4 4444 44
444 ·· 44 44 44
- 19 isoluje se celkem 8,48 g čištěného cyklického VIP analogu nebo
85,2 % z celkem stanovených 9,95 g (podle analýzy HPLC) cyklického VIP analogu, obsaženého v surovém produktu. To odpovídá celkovému výtěžku syntézy 23,9 íí, která zahrnuje kopulační reakce, odstranění chránících skupin a čištění. Cyklický VIP analog, připravený tímto způsobem, je homogenní (více než z 99 %) podle analytické HPLC a kapilární zonové elektroforézy. Identita cyklického VIP analogu se potvrzuje hmotovou spektroskopií FAB a aminokyselinovou analýzou.
Vynález blíže objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.
Příklad 1 až 8 popisuje způsob přípravy v pevné fázi chráněného fragmentu T, Ftnoc-( 26-31)-NH2 , Fmoc-Leu-Lys(Boc)Lys(Roc)-GIy-Gly-Thr(t-Bu)-NH2. Příklad 9 až 15 popisuje způsob přípravy fragmentu II, cyklo(Lys2l-Asp25)-Fmoc-Ala19-Lys(Boc)20-Lys21 -Tyr(t-Bu)22-Leu33-Asn24-Asp25-OH. Příklad 16 až 26 popisuje způsob přípravy v pevné fázi fragmentu III, Fmoc(9-18)- OH, Fmoc-Asn-Tyr(tBu)-Thrí tBu)-Lys( Boc)-Leu-ArgíPmc) LysíRoc)-Gln-Nle-Ala-OH. Příklad 27 až 36 popisuje způsob v pevné fázi přípravy fragmentu IV, Ac(l-8)-0H, Ac-His(Trt)-Ser(t-Bu)-Aspí OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)OH. Příprava cyklického VIP analogu, Ac(1-31)-NH2, je popsána v příkladu 37 až 41 Ací1-31)-NH2.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava (3)-XAL-pryskyřice
Neutralizuje se 150 g benzhydrylamínové (BHA) pryskyřice (plnění- 0,54 mekv./g, podíl číslo 13933) dvakrát 1500 ml NMP obsahujícího 10 % triethylaminu, promývá se 1000 ml dimethylformamidu, 1000 ml methanolu, 1000 ml methylenchloridu, 1000 ·· φ φφ φφ
- 20 • Φ» φφ ml methanolu a 3 χ 1000 ml methylenchloridu. Rozpustí se
96,3 g (3)-XAL-1inkeru (0,18 mol), 2,2 ekv.), 79,6 g BOP (0,18 mol) a 24, 3 g HOHt (0,18 mmol) ve 200 ml NMP. Přidá se 47,03 ml DTPEA a roztok se přidá najednou do reaktoru obsahujícího neutralizovanou pryskyřici. Směs se míchá po dobu 90 m i nut.
Podíl se odstraní a. promývá se dimethyl formámidem a raethanolem. Plnění XOL-spojovníku určené UV analysou je 0,365 mmol/g. Pryskyřice XAL se promývá 1000 ml dimethylformamidu, 1000 ml methanolu, 1000 ml methylenchloridu a dvakrát 1000 ml methanolu. Nekopulovaná pryskyřice BHA se blokuje po dobu 30 minut 1000 ml 10% acetanhydridu a 10% DIPEA v methylenchloridu. Pryskyřice se odfiltruje promývá se 1000 ml methylenchloridu, 1000 ml methanolu, dvakrát 1O00 ml methylenchloridu a dvakrát 1000 methanolu.
Příklad 2
Příprava Fmoc-Thr(t-Bu)-XAL-BHA
K první kopulaci se rozpustí směs 119,2 g Fmoc-Thr(t-Bu)-OH (300 mmol), 132 g BOP (300 mmoí) a 40,5 g HOBt (300 mmol) v 1000 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Do roztoku s přidá 78,4 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se v jedné dávce přidá do XALpryskyřice připravené podle příkladu 1. Směs se míchá 90 minut
Po zfiltrování se pryskyřice promývá 1000 ml dimethylformamidu (3 minuty), 1000 ml methanolu (3 minuty), 1000 ml methylenchloridu (3 minuty) a dvakrát 1000 ml methanolu (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se za míchání při teplotě místnosti rozpustí směs 59,6 g Fmoc-Thr(t-Bu)-OH (150 mmol), 66,3 g BOP 150 mmol) a 20,2 g HOBt (150 mmol) v 10000 ml NMP. Přidá se • · fl flfl fl ·· • flfl ···· ·«· ··· «· flfl flfl fl* ··
- 21 39,2 ml DIPEA a směs se intensivně míchá. Výslené reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice a směs se míchá 90 minut.
Po sfiltrování se pryskyřice Fmoc-Thrít-Bul-XAL-BHA promývá 1000 ml dimethylformamidu (3 minuty), 1000 ml methanolu f 3 minuty), 1000 ml methylenchloridu (3 minuty) a dvakrát 1000 ml methanolu (3 minuty).
Přiklad 3
Příprava Fmoc-G1y-Thrí t-Bu)-XAL-BHA
Odstranění chrániči skupiny Fitoc s Fraoc-G1 y-Thrí t-Bu)-XALBHA se provede 2půsohem popsaným v protokolu 1. Kopulace Fmoc-GIy-0H na Thrí t-Βιι)-XAL-BHA se provede takto:
K první kopulaci se sa míchání při teplotě místnosti rozpusti směs 89,2 g Fmoc-Gly-0H (300 mmol), 132 g BOP (300 mmol) a 40.5 g HOBt (300 mmol) v 1000 ml NMP. Přidá se 78,4 ml DIPEA a směs se intensivně míchá. Výslené reakční Činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice Thrít-Bu)-XAL-BHA a směs se míchá 90 minut.
Po sfiltrování se pryskyřice promývá 1000 ml dimethylformamidu (3 minuty), 1000 ml methanolu (3 minuty), 1000 ml methylenchloridu (3 minuty) a dvakrát 1000 ml methanol (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se za míchání při teplotě místnosti rozpustí směs 44,6 g Fmoc-Gly-0H (150 mmol), 66,3 g BOP (150 mmol) a 20,2 g HOBt (150 mmol) v 1000 ml NMP. Přidá se 39,2 ml DIPEA a směs se intensivně míchá. Výslené reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice a směs se míchá 90 minut.
Po sfiltrování se pryskyřice Fmoc-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA • · * · · · • 4 ··
- 22 promývá 1000 ml dimethyl formámidu (3 minuty), 1000 ml methanolu (3 minuty), 1000 ml methylenchloridu Í3 minuty) a dvakrát 1000 ml methanolu (3 minuty).
Přiklad 4
Příprava Fmoc-Gly-Gly-Thrí t-Bu)-XAL-BHA
Odstranění chránící skupiny Fmoc 2 Fmoc-Gly-Thrít-Bu)-XALBHA se provede 2pusobem popsaným v protokolu 1. Kopulace Fmoc-Gly-OH na G1y-Thr(t-Bu)-XAL-BHA se provede následujícím způsobem:
K první kopulaci se 2a míchání při teplotě místnosti rozpustí směs 89,2 g Fmoc-Gly-OH (300 mmol), 132 g BOP (300 mmol) a 40,5 g HOBt (300 mmol) v 1000 ml NMP. Přidá se 78,4 ml DIPEA a směs se intensivně míchá. Výslené reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice G1y-Thr(t-Bu)-XAL-BHA a směs se míchá 90 minut.
Po zfiltrování se pryskyřice promývá 1000 ml dimethylformamidu (3 minuty), 1000 ml methanolu (3 minuty), 1000 ml methylenchloridu (3 minuty) a dvakrát 1000 ml methanol (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se 2a míchání při teplotě místnosti rozpustí směs 44,6 g Fmoc-Gly-OH (150 mmol), 66,3 g BOP (150 mmol) a 20,2 g HOBt (150 mmol) v 1000 ml NMP. Přidá se 39,2 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výslené reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice a směs se míchá 90 minut.
Po zfiltrování se pryskyřice Fmoc-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XALBHA promývá 1000 ml dimethyl formám i du (3 minuty), 1000 ml methanolu (3 minuty), 1000 ml methylenchloridu (3 minuty) a dvakrát 1000 ml methanol (3 minuty).
« · • ·· ♦ *
- 23 • · ·»··«· · ♦ · • »· ·· ·· ·· ··
Příklad 5
Příprava Fmoc-LysíBoc)-Gly-Gly-Thrít-Bu)-XAL-BHA
Odstranění chránící skupiny Fmoc z Fmoc-Gly-Gly-Thrít-Bu)XAL-BHA se provede způsobem popsaným v protokolu 1. Kopulace Fmoc-LysíBoc)-OH na Gly-Gly-Thrít-Bu)-XAL-BHA se provede následujícím způsobem
| K | prvn í | kopulaci | se | za míchání | při | teplotě místnosti |
| rozpust í | směs | 140,5 g | Fmoc | -Lysí Boc)-OH | í 300 | mmol), 132 g BOP |
| í300 mmol) a | 40,5 g HOBt | í300 mmol) v | 1000 | ml NMP. Přidá se | ||
| 78,4 ml | DIPEA | i a směs | se | intenzivně | míchá. | Výslené reakční |
| činidlo | se | přidá | v | jedné dávce | do pryskyřice |
Gly-Gly-Thrít-Bu)-XAL-BHA a směs se míchá 90 minut.
Po zfiltrování se pryskyřice promývá 1000 ml dimethylformamidu Í3 minuty), 1000 ml methanolu (3 minuty), 1000 ml methylenchloridu Í3 minuty) a dvakrát 1000 ml methanol (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se za míchání při teplotě místnosti rozpustí směs 70,3 g Fmoc-LysíBoc)-OH í 150 mmol), 66,3 g BOP í150 mmol) a 20, 2 g HOBt í150 mmol) v 1000 ml NMP. Přidá se
39,2 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výslené reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice a směs se míchá 90 minut.
Po zfiltrování se pryskyřice Fmoc-LysíBoc)-Gly-GlyThrí t-Eu) -XAL-BHA promývá 1000 ml dimethylformámidu Í3 minuty), 1000 rol methanolu Í3 minuty), 1000 ml methylenchloridu (3 minuty) a dvakrát 1000 rol methanolu Í3 minuty).
Přiklad 6
Příprava Fmoc-LysíBoc)-LysíBoc)-Gly-Gly-Thrí t-Bu)-XAL-BHA • · · *· ·· a · · ·· ··
- 24 *« ♦ » • · ·· *
K první kopulaci se za míchání při rozpustí směs 140,5 g Fmoc-LysíBoc)-OH (300 í300 mmol) a 40,5 g HOBt (300 mmol) v 1000 78,4 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá, činidlo se přidá v jedné dávce Lys(Boc)- G1 v-G1 v-Thr(t-Bu)-XAL-BHA a směs se
Odstranění chránící skupiny Fmoc z Fmoc-LysíBoc)-G1y-GlyThr(t-Bu)-XAL-BHA se provede způsobem popsaným v protokolu 1. Kopulace Fmoc-LvsíBoc)-OH na LysíBoc)-G1y-Gly-Thrít-Bu)-XALBHA se provede následujícím způsobem:
teplotě místnosti mmol), 132 g BOP ml NMP. Přidá se Výslené reakční do pryskyřice míchá 90 minut.
Po sfiltrování se pryskyřice promývá 1000 ml dimethylformamidu (3 minuty), 1000 ml methanolu Í3 minuty), 1000 ml methylenchloridu (3 minuty) a dvakrát 1000 ml methanol Í3 minuty).
Ke druhé kopulaci se za míchání při teplotě místnosti rozpustí směs 70,3 g Fmoc-LysíBoc)-OH (150 mmol), 66,3 g BOP (150 mmol) a 20,2 g HOBt (150 mmol) v 1000 ml NMP. Přidá se
39,2 ml DTPEA a směs se intenzivně míchá. Výslené reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice a směs se míchá 90 minut.
Po zfiltrování se pryskyřice Fmoc-LysíBoc)-Lys(Boc)-GlyGly-Thrí t -Bu) -XAL-BHA promývá 1000 ml dimethylformamidu (3 minuty), 1000 ml methanolu Í3 minuty), 1000 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x 1000 ml methanolu (3 minuty).
Příklad 7
Příprava Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Lysí Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA
Odstranění chránící skupiny Fmoc z Fmoc-LysíBoc)-LysíBoc)Gly-Gly-Thrít-Bu)-XAL-BHA se provede způsobem popsaným v protokolu 1. Kopulace Fmoc-Leu-0H na Lys( Boc)-LysíBoc)-Gly-Gly« ” ··· · * • 9 · »♦ »· * · ·· «
- 25 ΓΛ «
« ·»» • · · * • * · · • t *·
Thrít-Bu)-XAL-BHA se provede následujícím způsobem:
K první kopulaci se za míchání při teplotě místnosti rozpustí směs 106 g Fmoc-Leu-OH (300 mmol),. 132 g ROP (300 mmol) a 40,5 g HOBt (300 mmol) v 1000 ml NMP. Přidá se 78,4 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výslené reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice LysíBoc)-LysíBoc)-Gly-GlyThrít-Bu)-XAL-BHA a směs se míchá 90 minut.
Po sfiltrování se pryskyřice promývá 1000 ml dimethylformamidu Í3 minuty), 1000 ml methanolu (3 minuty), 1000 ml methylenchloridu Í3 minuty) a dvakrát 1000 ml methanol Í3 minuty).
Ke druhé kopulaci Se za míchání při teplotě místnosti rozpustí směs 53 g Fmoc-Leu-0H Í150 mmol), 66,3 g BOP (150 mmol) a 20,2 g HOBt C150 mmol) v 1000 ml NMP. Přidá se 39,2 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výslené reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice a směs se míchá 90 minut.
Po zfiltrování se pryskyřice Fmoc-Leu-LysíBoc)-Lys(Boc)Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA promývá 1000 ml dimethylformamidu (3 minuty), 1000 ml methanolu (3 minuty), 1000 ml methylenchlori du (3 minuty) a 2x 1000 ml methanolu (3 minuty).
Konečná hmotnost fragmentu Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-GlyGly-Thrít-Bu)-XAL-BHA peptidové pryskyřice, známého též jako Fmoc-(26-31)-XAL-BHA, je 267 g.
Příklad 8
Odštěpení chránící skupiny z Fmoc-(26-31)-XAL-BHA
Do 500 ml baňky s plochým dnem se vnese 10 g chráněného Fmoc-(26-31)-XAL-BHA spolu se 200 ml 0,5% trifluoroctové kyseliny v methylenchlorid. Suspense se míchá po dobu 0,5 minut při teplotě místnosti a zfiltruje se. Filtrát se okamžitě na0 0··
0 0 · • 0 0 * 0 0«
0 0 0
0 0 • 0 0
0 0
0*
0 0 0 0 staví na hodnotu pH 7 přidáním pyridinu. Filtrát se odpaří za teploty místnosti na rotační odparce. Zbytek se tri turuje 200 ml destilované vody, načež se promývá 2x 200 ml etheru. Výsledný pevný materiál se vysuší ve vakuu, čímž se získá chráněný Fmoc-(26-31)-NH2·
Zfiltrovaná peptidová pryskyřice se pak zpracuje 5x 200 ml 0,59! roztokem THF po 15 minutách, načež se nastaví hodnota pH 7 pyridinem. Po odpaření, trituraci a vysušení se vzorek každého odštěpení analyzuje HPLC. Podmínky HPLC: Lichrosorb RP-18, 5 tnm, 25 cm eluční činidla (A) 0, 1 M HCIO4/H2O (pH
2,5), ( B) MeCN; gradient: 34 % až 39 % MeCN/20 minuti průtočná rychlost: 1 ml/min a detektor 210 nm Knau.
Všechny peptidové fragmenty s čistotou nad 90 % se spojí na celkových 3,01 g. Čistota spojeného materiálu je 94,5%.
Příklad 9
Příprava Fmoc-Aspí 0-Sasrin)-OBzl
V dimethylformamidu (2 x 500 ml) a v methylenchloridu Í3 x 500 ml) se promývá 2-methoxy-4-alkoxybenzyla 1koholkopolystyren 1% divinylbenzenové zesítěné pryskyřice (pryskyřice Sasrin, 25 g, 0,96 etnkv/g, 24 mekv.). Přidá se ester Fmoc-Asp- -0-bensylu (35 g, 78,56 mmol, 3,27 ekv.) v methylenchloridu (400 ml) a v mechanickém šejkru se protřepe. Přidá se roztok DCC (16,2 g; 78,5 mmol, 3,27 ekv.) v methylenchloridu (100 ml), následně N-methylmorfolin (3,36 ml, 30 mmol, 3,27 ekv.) a 4-dimethylaminopyridinu (0,293 g, 2,4 mmol, 0,1 ekv.) a proptřepává se pět hodin. Podlí se vyjme, promývá se methanolem a vysuší se. UV-analysou se stanoví plnění 0,60 mmol/g pryskyřice. Pryskyřice se promývá dimethyl formamidem (2x500 ml) a methanolem (5x 500 ml) a vysuší se ve vakuu za získání 32,8 g Fmoc-Asp(0-Sasrin-pryskyřice)-OBzl. 10 g této pryskyřice se suspenduje v di* *· · · ·· • · · ι> ··· · · • · · · · · , ·* ·» *· methyl formamidu (180 ml) a přidá se roztok anhydridu benzoové kyseliny (6,78 g, 30 mmol, 5 ekv.) v dimethylformamidu (40 ml), následně DIPEA (5,22 ml, 30 mmol, 5 ekv.) a suspense se protřepává 30 minut. Pryskyřice se promývá dimethylformám idem (5x 200 ml) a podle stanoveni je substituce 0,60 mmol/g.
Příklad 10
Synthesa Na1fa-Fmoc·L-1eucy1 -L-asparaginí Fmoc-Leu-Asn-OH)
V systému dimethylformám id (10 ml)/methylenchlorid (70 ml) se rozpustí L-Leu-0H (10 g, 28,32 mmol) a ochladí se na ledové lázni. Přidá se N-hydroxysuccini mid (3,58 g, 31,14 mmol, 1,1 ekv.) a dicyklohexylkarbodiimid (6,06 g, 31,14 mmol, 1,1 ekv.)
O a směs se míchá při teplotě 0 Cl hodinu a při teplotě 25 C 14 hodin. Reakční směs se ochladí na ledové lázni, zfiltruje se a sraženina se promývá methylenchloridem (40 m1).Fi1trát se odpaří k suchu a zbytek se rozpustí ve směsi dioxanu (80 ml), vody (10 ml) za získání roztoku Fmoc-Leu-OSu. Přidá se roztok bezvodého L-asparaginu (5,606 g, 42,48 mmol, 1,5 ekv.) v 60 ml uhličitanu sodného (2,50 g, 42,28 mmol, 1,5 ekv.). Přidá se dalších 10 ml dioxanu a reakční směs se míchá 2 hodiny při teplotě 25 C. Do reakční směsi se přidá ethylacetát (200 ml) a hodnota pH se nastaví na přibližně 2 přísadou 5% vodné kyseliny chlorovodíkové za míchání. Ethylacetátová vrstva se oddělí a vodná vrstva se extrahuje 4x vády 100 ml éthylacetátu. Spojený ethylacetátový extrakt se promývá nasyceným roztokem chloridu sodného (100 ml), vodou (3x 100 ml), vysuší se bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří se k suchu. Zbytek se rozpustí v dimethylformamidu (60 ml) za ohřevu na tep0 lotu (40 až 45 C) a voda se přidá až do zakalení. Produkt vykrystaluje při stání přes noc. Zfiltruje se, promývá se etherem a překrystaluje se ze systému dimethylformám id/voda. Výsledkem lyofilizace z dioxanu je 9,45 g (71,3 % teorie) produktu. Spektroskopie NMR a FAB potvrzuje molekulární vz orec
- 28 • VI v II
C2sH29N30ď s pozorovanou hmotou pro (Μ + H)+, 468,3. Analytická HPLC potvrzuje čistotu produktu vyšší než 95% (obr.4). Podmínky HPLC: sloupec: Lichrosorb RP-8 (5 um): eluční činídlo; (A) O,1M KaC104 (pH 2,51-íB) CH3CN; gradient: 40%-80% (B) ve 20 minutách; průtok 1 ml/min a detekce:210 nm.
Příklad 11
Pří prava Fmoc-Ala-LysíBoc)-Lys(Al1oc)-Tyr(LBu)-Leu-Asn-Asp(0Sasrin)-OBzl
Provede se následující syntéza peptidu (za použití 20 ml systému roztok/g pryskyřice): 1) 20% piperidín/dimethylformaiňid, 1 minuta, 2) 20% piperidín/dimethylformamid, 10 minut, 3) dimethyiformamid, 4x2 minuty, 4) NMP, 1x2 minuty, 5) kopulace chráněných aminokyselin, jak dále popsáno a 6) dimethylformam i d; 3x2 ro i nuty.
Synthesa v pevné fázi se provede jak shora popsáno s 10 g (0,60 mmol/g, 6,0 mmol) Fmoo-Aspí0-Sasrin)-OBzl. Fmoc-Leu-AsnAspf0-Sasrin-pryskyřice)-OBzl se připraví kopulací dipeptidu Fmoc-Leu-Asn-OH na H-Aspí0-Sasrin-pryskyřice)-OBzl následujíc f m způsobem:
Do Fmoc-Asn-Leu-OH, (4,2 g, 9 mmol, 1,5 ekv.) se přidá HBTU, (3,41 g, 9 mmol, 1,5 ekv.), HOBT, (4,13 g, 27 mmol, 4,5 ekv.), DIPEA, (3,135 ml, 18 mmol, 3 ekv.) a systém NMP/methylenchlorid (1:1) 220 ml. Směs se kolupuje 1,25 hodiny. K této zvláštní kopulaci se rozpustí Fmoc-Leu-Asn-OH ve 160 ml NMPmethylenchlorid (1:1). Jelikož smísení NMP a methylenchloridu je exothermické, rozpouštědlo se před přidáním do peptidu chladí a přidá se do H-Asp(0-Sasrín-pryskyřice)-OBzl a následně se přidá DIPEA a HOBt a reakční nádoba se protřepává dvě minuty. Pak se přidá 30 ml studeného methylenchloridu a nakonec se přidá roztok HBTU ve 20 ml systému NMP/methylenchlorid • 4 4 4*44 444 44 44 44 44
- 29 (1:1) a 10 ml NMP. Poměr NMP: methylen-chlorid se udržuje (1:1). Hodnota pH kopulační reakce se udržuje na 5 až 6.
Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(0-Sasr i n-pryskyř i cg)-OBsl se připraví kopulací Fmoc-Tyr)tBu)- OH k pryskyřici následujícím způsobem: Do Fmoe-Tyr (tBu)-OH.. (5,4 g, 12 mmol, 2 ekv.) se přidá HRTU, (3,4 g, 12 mmol, 2 ekv.), HOBt, (1,8 g, 12 mmol, 2 ekv), DIPEA, (5,75 ml, 33 mmol, 5,5 ekv.) a NMP (220 ml). Směs se přidá do pryskyřice a kopuluje se jednu hodinu.
Fmoc-I,ys( Al loc) -Tyr( t.Bu) -Leu-Asn-Asp( O-Sasrin-pryskyřice) OBsl se připraví kopulací Fmoc-LysíAl1oc)- OH k pryskyřici. Do Fmoc-Lysíňlloc)-OH. (5,4 g. 12 mmol, 2 ekv.) se přidá HBTU, (3.4 g, 12 mmol, 2 ekv), HOBt, (1,8 g, 12 mmol, 2 ekv.), DIPEA, (5,75 ml, 33 mmol, 5,5 ekv.) a NMP (220 ml). Směs se přidá do pryskyřice a kopuluje se jednu hodinu.
Po přidání Fmoc-LysíAl1ocx)21 - OH se pryskyřice promývá methanolem a vysuší se za získání 13.3 g (0,45 mmol/g, 5,98 mmol) chráněného Fmoc-(21-25)-(0-Sasrín-pryskyřice)-OBsl. Polovina této peptidové pryskyřice (6,65 a, 2,99 mmol) se podrobí dvěma přídavným cyklům synthesy v pevné fázi, jak shora popsáno, a kopuluje se s Fmoc-Lys(Boc)- OH následujícím způsobem: k Fmoc-LysíBoc)-OH. (2,8 g, 6 mmol, 2 ekv.) se přidá BOP, (2,65 g, 6 mmol, 2 ekv.), HOBt, (0,918 g, 6 mmol, 2 ekv.); DIPEA, (3,25 ml, 18,65 mmol, 6,2 ekv.) a NMP í120 ml). Po přidání do pryskyřice se kopuluje jednu hodinu. K Fmoc-Ala-0H, (1,86 g, 6 mmol, 2 ekv.) se přidá HBTU (2,27 g, 6 mmol, 2 ekv.), HOBt, (0,90 g, 6 mmol, 2 ekv.) a NMP (120 ml) a směs se přidá do pryskyřice a kopuluje se jednu hodinu.
Pryskyřice se promývá dimethylformamidem (3x120 ml) a methanolem (4x120 ml) a vysuší se ve vakuu sa získání 7,3 g (0,39 mmol/g, 2,84 mmol) chráněního Fmoc-(19-25)-(0-Sasrinpryskyřice)-OBsl. Část Fmoc-( 19-25)-(0-Sasrin-pryskyřice)-OBzl se štěpí systémem 0,5% TFA/methylenchlorid a podle analytické fl flfl (A
HPLC má čistotu větší než 82%.
Příklad 12
Příprava Fmoc-Ala-Lys( Boc)-Lys-Tyrí tBu)-Leu-Asn-Asp(0-Sasrin)OB2I odstraněním chránící skupiny 3 Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys( Alloc)-TyrítBu)-Leu-Asn-Asp(0-Sasrin)-OBzl
Chráněná hexapeptidová pryskyřice Fmoc-Ala-Lys(Boc)Lys( Alloc)-TyrítBu)-Leu-Asn-Asp(0-Sasrin)-OBzl (7,2 g, 0,39 mmol/g, 2,8 mmol) se suspenduje ve 130 ml methylenchloridu a nechá se probůhlávat heliem. Přidá se kyselina octová (0,330 ml, 5,75 mmol), bísítrifenylfosfín)palladiumdichlorid (0,138 g, 0,196 mmol) a tributylcínhydrid (3,165 ml, 11,9 mmol) a peptidovou pryskyřicí se nechá probůhlávat helium 1,5 hodin a reakční nádoba se vypustí. Uvedená reakce se opakuje celkem pětkrát k zajištění úplného odstranění chránící skupiny Alloc Podíl peptidové pryskyřice se štěpí systémem 0,5 %
TFA/methylenchlorid a analytická HPLC vyka2uje úplné odstranění chránící skupiny Alloc. Pryskyřice se promyje methylenchloridem (2x120 ml) a methanolem (4x120 ml) a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 7,1 g (0,40 mmol/g, 2,84 mmol) Částečně chráních skupin 2bavené peptidové pryskyřice Fmoc-Ala-Lys(Boc)-LysTyrí tBu-Leu-Asn-Asp(0-Sasrin)OB2I.
Příklad 13
Štěpení Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyrí tBu)-Leu-Asn-Aspí0-Sasrin)OB2I: Příprava Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-TyrítBu)-Leu-Asn-Asp-OBzl
Při teplotě místnosti se 10 minut zpracovává 7,1 g (2,84 mmol) částečně chráněné Fmoc-Í19-25)-Sasrin-pryskyřice-OB21 systémem 0,5% TFA/ methylenchlorid (140 ml), zfiltruje se a filtrát se okamžitě nastaví na hodnotu pH 6 aě7 přísadou pyridinu. Peptidová pryskyřice se podrobí dalším 4 zpracováním 0,5 TFA v methylenchloridu, jak shora popsáno, a filtráty se spojí a odpaří. Peptid se tri turuje vodou, zfiltrije se, promývá se libovolně vodou a vysuší se ve vakuu. Surový peptid se promývá bezvodým etheren a vysuší se ve vakuu za získání 3,26 g (celkový výtěžek 75,7 % teorie) částečně chráněného Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-OBzl,který podle analytické HPLC vykazuje čistotu větší než 80%.
Příklad 14
Cyklizace lineárního heptapeptidu: příprava Fmoc-Ala-Lys(Boc)Lys-TyrítBu)-Leu-Asn-Asp-OBzl cykloíLys 21 >Asp25)
Roztok částečně chráněného heptapeptidu Fmoc-Ala-Lys(Boc)Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-OBzl (3,26 g, 2,271 mmol) ve 100 ml dimethylformamidu se přidá pomalu během 20 minut do magneticky míchaného roztoku reakčního činidla BOP (2,0 g, 4,53 mmol, 2 ekv. ) a DIPEA (3,16 ml, 18,14 mmol, 8 ekv. ) v 50Ó ml dimethylformamidu. Po míchání při teplotě místnosti po dobu 1,25 hodin se podíl odstraní a analytická HPLC indikuje, še lineární peptid byl úplně cyklizován. Reakční směs se míchá další hodinu, okyselí se octovou kyselinou a odpaří se na přibližně 20 ml a přidá se destilovaná voda (200 ml). Sraženina se odfiltruje, promývá se důkladně destilovanou vodou a vysuší se ve vakuu. Produkt se promývá bezvodým etherem a vysuší se za získání 3,0 g chráněného cyklického heptapeptidu. Analytická HPLC indikuje téměř úplnou přeměnu 1 ineárního peptidu na cyklický heptapeptid. Tento materiál se rozpustí ve 100 ml 10% methanolu v methylenchloridu. Nerozpustné Části (oligomery) se odstraní filtrací roztoku cel i tem a filtrát se odpaří za získání 2,85 surového chráněného cyklického peptidu. Tento materiál se rozpustí ve 100 ml methylenchloridu a vpraví se na silikagelový sloupecWaters Prep Pack (4,7 x 30 cm, 15 aš 20 um); průtočná rychlost: 50 ml/min; detekce: 280 nm. Sloupec se eluuje methylenchloridem (500 ml), 5% methanolem v methylenchloridu (2000 ml) a nakonec se eluuje 8% methanolem v methylenchlori • ·· »· »
- 32 du. Frakce, obsahující čistý peptid (podle analytické HPLC), se smísí, odpaří se k suchu a lyofilizací se odstraňuje dioxan za získání 1,445 g vyčištěného heptapeptidu (celkový výtěžek, 37 % teorie), který podle analytické HPLC vykazuje čistotu větší než 98%.
Příklad 15
Příprava Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)- Leu-Asn-Asp-OH cyklo(Lys 21 >Asp25)
Plně chráněný cyklický heptapeptid podle příkladu 14 (1,445 g, 1,111 mmol) se rozpustí v 60 ml methanolu ve vibromísičové baňce v proudu helia. Přidá se 0,314 g 10% Pd na uhlí a reakční směs se hydrogenuje 3,5 hodiny ve vibromixeru. Analytická HPLC indikuje, že zbylo přibližně 30 % cyklického heptapeptidu chráněného benzylesterem. Přidá se dalších 0,2 g 10% Pd na uhlí a v hydrogenací se pokračuje po dobu 2,75 hodin. Analytická HPLC indikuje, še došlo k úplnému zbavení ochrany benzylovou skupinou. Reakční směs se zfiltruje celitem a promývá se methanol em. Filtrát a promývací voda se odpaří a lyofilizací se odstraňuje dioxan za získání 1,225 g (91,1% výtěžek, celkový výtěžek 33,7%) cyklické heptapeptidové kyseliny. Podle analytické HPLC jě čistota produktu vyšší než 97 %. Identita produktu se charakterizuje a potvrzuje analysou aminokyseliny, FAB-MS, optickým stáčením a spektroskopií 1H-NMR.
Příklad 16
Příprava pryskyřice Fmoc-Ala-Sasrin
Promyje se 50 g 2-methoxy-4-alkoxybenzylalkoholové kopolystyrenové, 1 % divinylbenzenu zesítěné pryskyřice (Sasrinové pryskyřice) 500 ml methylenchloridu a 2x500 ml dimethylformani i du.
• · «·
- 33 V 650 ml systému methylenchlorid/dimethylformamid ( ob j . 2:1) se rozpustí 74,6 g Fmoc-Ala-OH (240 mmol). Roztok se ochladí na ledové lázni a přidá se 49,5 g DCC (240 mmol), následně 1,46 g 4-dimethylaminopyridinu (12 mmol) a 6,27 ml N-methylmorfolinu (60 mmol). Směs se míchá 9 hodin v oběhovém rotačním šejkru.
Pryskyřice se zfiltruje a promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 500 ml methanolu (3 minuty).
Podíl se odstraní, vysuší se a náplň se určí UV kvalitativní analysou 0,54 mmol/g.
Pryskyřice se pak promývá 2x 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 500 ml dimethylformamidu (3 minuty). Pryskyřice se suspenduje ve 400 ml dimethylformamidu a přidá se 54,3 g anhydridu benzoové kyseliny (240 mmol), následně 100 ml dimethyl formamidu a 41,7 ml diisopropylethyl aminu (240 mmol). Suspense se protřepává 30 minut. Pryskyřice se odfiltruje a promyje 500 ml methylenchloridu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 2x500 ml methylenchloridu (3 minuty), 500 ml dimethylformamidu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Příklad 17
Příprava pryskyřice Fmoc-Nle-Ala-Sasrin
Odstranění chránící skupiny Fmoc z pryskyřice Fmoc-AlaSasrin se provede postupem popsaným v protokolu 1. Kopulace Fmoc-Nle-OH na Ala-Sasrin se provede následujícím způsobem:
K první kopulaci se rozpustí směs 19,08 g Fmoc-Nle-OH (54 mmol), 23,9 g BOP (54 mmol) a 7,3 g HOBt (54 mmol) ve 400 ml φφφ φφφ· φ φφφ «φφφ φφφφφ φφ φφ φ ·
- 34 NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 14, í ml DIPEA a směs se intensivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou k pryskyřici Ala-Sasrín a směs se míchá dvě hodiny.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethylformami du (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml. methylen chloridu C3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty),
K druhé kopulaci se rozpustí směs 9,54 g Fmoc-Nle-0H (27 mmol), 11,9 g BOP (27 mmol) a 3,65 g HOBt (27 mmol) ve 400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7,05 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice a směs se míchá dvě hodiny.
Po filtraci se pryskyřice Fmoc-Nle-Ala-Sasrin promývá 500 ml dimethyl formám idu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty) .
Příklad 18
Příprava pryskyřice Fmoc-Gln-NIe-Ala-Sasrin
Odstranění chránící skupiny Fmoc z pryskyřice Fmoc-Nle-AlaSasr i n se provede postupem popsaným protokolu 1 .
K první kopulaci se rozpustí směs 19,9 g Fmoc-Gin-OH (54 mmol), 23,9 g BOP (54 mmol) a 7,3 g HOBt (54 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 14,1 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou k pryskyřici Nle-Ala-Sasrin a směs se míchá dvě hodiny.
φ φφ
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylen • ·· * »»
- 35 chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
K druhé kopulaci se rozpustí směs 9,9 g Fmoc-Gln-0H (27 mmol), 11,9 g BOP (27 mmol) a 3,65 g HOBt (27 mmol) ve 400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7,05 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice a směs se míchá dvě hodiny.
Po filtraci se pryskyřice Fmoc-Gln-Nle-Ala-Sasrin proraývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Příklad 19
Příprava pryskyřice Fmoc-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin
Odstraňování chránící skupiny Fmoc z pryskyřice Fmoc-GlnNle-Ala-Sasrin se provede postupem popsaným protokolu 1.
K první kopulaci se rozpustí směs 25,3 g Fmoc-LysíBoc)Gln-OH (54 mmol), 23,9 g BOP (54 mmol) a 7,3 g HOBt (54 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 14, 1 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice Gln-Nle-Ala-Sasrin a směs se míchá dvě hodiny.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se rozpustí směs 12,7 g Fmoc-LysíBoc)Gln-OH (27 mmol), 11,9 g BOP (27 mmol) a 3,65 g HOBt (27 mmol) ve 400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7,05 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice a směs se míchá • ·· • · « t » « · * · · ··« »· ·· ·· *· ··
- 36 dvě hodiny.
Po filtraci se pryskyřice Fmoe-Lys( Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin promývá 500 ml dimethyl formámidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu Í3 minuty).
Přiklad 20
Příprava pryskyřice Fmoc-ArgíPmc)-LysíBoc)^Gln-NIe-Ala-Sasrin
Odstranění chránící skupiny Fmoc pryskyřice Fmoc-LysíBoc)G1n-NIe-A1 a-Sasri π se provede postupem popsaným protokolu 1.
K první kopulaci se rozpustí směs 40,1 g Fmoc-ArgíPmc)-OH (54 mmol), 23,9 g BOP (54 mmol) a 7,3 g HOBt (54 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 14,1 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice LysíBoc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin a směs se míchá dvě hodiny.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethy1 Formami du (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se rozpustí směs 20,1 g Fmoc-ArgíPmc)OH (27 mmol), 11,9 g BOP (27 mmol) a 3,65 g HOBt (27 mmol) ve 400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7,05 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakčnl činidlo se přidá najednou do pryskyřice a směs se míchá dvě hodiny.
Po filtraci se pryskyřice Fmoc-Arg( Pmc)-Lys(Boc)-G1n-NleAla-Sasrin promývá 500 ml dimethyl formámidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x 500 ml methanolu (3 minuty).
- 37 φφφ φφφ φφ • · φφ • »Φ φ
φ φ φ φ · · • Φ φφ φφ φφ
Příklad 21
Příprava pryskyřice Fmoc-Leu-ArgíPmc)-LysíBoc)-Gin-Nle-AlaSasrin
Odstraňování chránící skupiny Fmoc z pryskyřice FmocArg(Pmc)-Lys(Boc)-G1n-Nle-Ala-Sasrin se provede postupem popsaným v protokolu 1.
K první kopulaci se rozpustí směs 19,1 g Fmoc-Leu-OH (54 mmol), 23,9 g BOP (54 mmol)a 7,3 g HOBt (54 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 14,1 ml DIPEA a směs se intenzívně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice ArgíPmc)-LysíBoc)-G1n-NIe-Ala-Sasrin a směs se míchá dvě hodiny.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethy1formami du (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se rozpustí směs 9,6 g Fmoc-Leu-OH (27 mmol), 11,9 g BOP (27 mmol) a 3,65 g HOBt (27 mmol) ve 400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7,05 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice a směs se míchá dvě hodiny. .
Po filtraci se pryskyřice Fmoc-Leu-ArgíPmc)-LysíBoc)-GlnNle-Ala-Sasrin promývá 500 ml dimethylformám idu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Příklad 22
Příprava pryskyřice Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys( Boc)-G1nNle-Ala-Sasrin • · ·· fl » »» • flflfl · • fl fl ·· ··
- 38 flflfl • · · fl · · • flfl' flfl • · · flfl fl flfl · flfl fl*
Odstraněni chránící skupiny Fmoc z pryskyřice Fmoc-LeuArg(Pmc)-LysíBoc)-G1n-NIeΆ1a-Sasrin se provede postupem popsaným protokolu 1.
K první kopulaci se ro2pustí směs 25,4 g Fmoc-LysíBoc)Leu-OH (54 mmol), 23,9 g BOP (54 mmol) a 7,3 g HOBt (54 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 14,1 ml DIPEA a směs se intensivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice Leu-ArgíPmc)-LysíBoc)-G1n-NIeAla-Sasrin a směs se míchá dvě hodiny.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se ro2pustí směs 12,7 g Fmoc-LysíBoc)-OH (27 mmol), 11,9 g BOP (27 mmol) a 3,65 g HOBt (27 mmol) ve 400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7,05 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice a směs se míchá dvě hodiny.
Po filtraci se pryskyřice Fmoc-Lys(Roc)-Leu-ArgíPmc)LysíBoc)-G1n-NIe-Ala-Sasrin promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu Í3 minuty).
Příklad 23
Příprava pryskyřice Fmoc-ThrítBu)-LysíBoc)- Leu-ArgíPmc)Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin
Odstraňování chránící skupiny Fmoc 2 pryskyřice FmocLysíBoc)-Leu-ArgíPmc)-LysíBoc)- Gin-Nle-AIa-Sasrin se provede postupem popsaným protokolu 1.
• ft ftftft· • ftft · · · · ftftft • ftft ftft ·· ftft ·· ·
- 39 K první kopulaci se rozpustí směs 28,7 g Fmoc-Thr(tBu)OH (54 mmol), 23,9 g BOP (54 mmol) a 7,3 g HOBt (54 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 14,1 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou k pryskyřici LysíBoc)-Leu-ArgíPmc)-Lys-(Boc)GlnN1e-Ala-Sasrin a směs se míchá dvě hodiny.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethylformami du (3 minuty), 500 rol methanolu (3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se rozpustí směs 14,4 g Fmoc-ThrítBu)-OH (27 mmol), 11,9 g BOP (27 mmol) a 3,65 g HOBt (27 mmol) ve 400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7,05 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice a směs se míchá dvě hodiny.
Po filtraci se pryskyřice Fmoc-Thr(tBu)-LysíBoc)-Leu-Arg(Pmc)- LysíBoc)-Gin-Nle-Ala-Sasrin promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Příklad 24
Příprava pryskyřice Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-LysíBoc)-LeuArgí Pmc)-Lysí Boc)-G1n-Nle-Ala-Sasrin
Odstranění chránící skupiny Fmoc z pryskyřice Fmoc-ThríbBu)LysíBoc)-Leu-ArgíPmc)-LysíBoc)-Gin-Nle-Ala-Sasrin se provede postupem popsaným protokolu 1.
K první kopulaci se rozpustí směs 24,8 g Fmoc-Tyr(tBu)OH (54 mmol), 23,9 g BOP (54 mmol) a 7, 3 g HOBt (54 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 14,1 ml • *· · ♦ ♦ · · · · ·*· ·· · »· >· ·«
- 40 DIPEA a směs se intensivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice Thr(tBu)-LysíBoc)-Leu-Arg( Pmc)Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin a směs se míchá dvě hodiny.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethylformami du (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se rozpustí směs 12,4 σ Fmoc-TyríLBu)-OH (27 mmol), 11,9 g BOP (27 mmol) a 3,65 g HOBt (27 mmol) ve 400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7,05 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice a směs se míchá dvě hodiny.
Po Filtraci se pryskyřice Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)Leu-Arg-(Pmc)-LysíBoc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin promývá 500 ml dimethyl formám i du (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Příklad 25
Příprava pryskyřice Fmoc-Asn-Tyr( tBu)-ThrftBu)-LysíBoc)-LeuArg(Pmc)-Lys(Boc)-Glπ-NIe-Ala-Sasrin
Odstranění chránící skupiny Fmoc z pryskyřice Fmoc-TyrítBu)Thr( tBu) -Lysí Boc) -Leu-Arg( Pmc) -Lys( Boc) -Gln-Nle-Ala-Sasr in se provede postupem popsaným protokolu 1 před kopulací Fmoc-Asn-0H způsobem symetrického anhydridu.
Rozpustí se 19,4 g Fmoc-Asn-0H (54 mmol) a 7,3 g HOBt (54 mmol) ve směsi 135 ml methylenchloridu a 270 ml dimethyl formami du. Směs se míchá v ledové lázni před přidáním 11,2 g DCC (54 mmol). Směs se míchá 30 minut, 2filtrujě se a filtrát se přidá najednou k pryskyřici TyrítBu)-Thr(tBu)-LysíBoc)-Leu·» « · • · • · ft · · · » · ·· ·»· « 4 » · · • β «4 • · · · · » · ·♦
ArgíPmc)-LysíBoc)-G1n-Nle-A1a-Sasrin (pryskyřice (10-18) Sasrinové pryskyřice). Kopulace se ukončí v 90 minutách.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethylformami du (3 minuty), 500 ml methanolu Í3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se rozpustí směs 19,4 g Fmoc-Asn-0H (54 mmol) a 7,3 g HOBt (54 mmol) ve 135 ml methylenchloridu a 270 ml dimethyl formamidu. Směs se míchá v ledové lázni před přidáním 11,2 g DCC (54 mmol). Směs Se míchá 30 minut, zflitru je se a filtrát se přidá v jedné dávce do Sasrinové pryskyřice (10-18). Kopulace se ukončí v 90 minutách.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethylformami du Í3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Po ukončené kopulaci se pryskyřice nezbavuje chráničích skupin. Konečný výtěžek Fmoc-Asn-TyrítBu)-Thr(tBu)-LysíBoc)Leu-Argí Pmc)-Lysí Boc)-Gln-Nle-Al a-Sasri nu (Fmoc(9-18)Sasr inpryskyřice jakožto produktu je 112 g.
Příklad 26
Štěpení Fmoc(9-18) z pryskyřice Fmocí9-18)-Sasrin
Při teplotě místnosti se zpracovává 1 minutu 20 g pryskyřice Fmocí9-18)-Sasrin se 400 ml 0,2% TFA v methylenchloridu a zfiltruje se. Hodnota pH filtrátu se okamžitě nastaví na pH 7 přidáním pyridinu. Filtrát se odpaří a zbytek se tri turuje 50 ml destilované vody a promývá se pak 50 ml etheru. Výsledný pevný materiál še vysuší ve vakuu.
Odfiltrovaná peptidová pryskyřice se zpracovává 6x 400 ml
- 42 Φ· · · • φ * • φ φ •φ · · φφφ «β > · φ «φφφ φ φφ φ φ φφ φφ φφ φφφφ φ φφφφ φφφ
ΦΦ ΦΦ φφ *0
0,2% roztoku TFA po dobu 10 minut s následným nastavením hodnoty pH na 7 pyridinem. Po odpaření, trituraci a sušení se provede analysa HPLC. Podmínky HPLC: sloupec Lichrosorb RP-18, 5m, 25 cm, eluční činidla (a) 0, 1 M HCIO4/H2O ( pH 2,5), fb) MeCM, gradient 34% až 39% MeCN/20 minut, průtočná rychlost í/ml/min a detektor 210 nm Knau. Všechny peptidové fragmenty o čistotě větší než 90% se spojí na celkem 9.9 g. 52 g produktu získaného štěpením 112 g peptidové pryskyřice má průměrnou Čistotu 91%.
Příklad 27
Příprava pryskyřice Fmoc-GluíOtBu)-Sasrin
Promývý se renové, 1 %
Sasrin) 500 ml g 2-methoxy-4-alkoxybenzylalkoholkopolystydivinylbenzenu zesítěné pryskyřice (pryskyřice methylenchloridu a 2x500 ml dimethy1 formám idu.
V 500 ml systému methylenchlorid/dimethylformamid (objemový poměr 9:1) se rozpustí 102 g Fmoc-Glu(OtBu)-OH (240 mmol) Roztok se ochladí v ledové lázni a přidá se roztok DCC, připravený rozpuštěním 49,5 σ DCC (240 mmol) v 100 ml systému methylenchlorid/dimethylformamid (9:1), Směs se míchá 30 minut, pak se zfiltruje k odstranění DCU. Filtrát se přidá do promyté pryskyřice Sasrin, načež se přidá 1,46 g 4-dimethylaminopyridinu (12 mmol) a 6,27 ml N-methylmorfolinu (60 mmol). Směs se míchá 9 hodin na oběhovém rotačním mísí či.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty). Podíl se vyjme, vysuší se a násada stanovená UV analysou je 0,59 mmolZg.
Pryskyřice se promývá 2x500 ml methylenchloridu (3 minuty)
4 < 4
4 44
444 4 4
4 4
99 • · · · • 4 44 • 4 4 4 9 4
4· ·
94
- 43 44 4 4
4 4
4 · • 4 · ·«· 44 a 500 ml dimethylformamidu (3 minuty). Pryskyřice se pak suspenduje ve 400 ml dimethylformamidu a přidá se 54.3 g anhydridu kyseliny benzoové (240 mmol), následně 100 ml dimethylformamidu a 41,7 ml diisopropylethylaminu (240 mmol). Suspense se protřepe 30 minut. Pryskyřice Fmoc-Glu(OtBu)-Sasrin se odfiltruje a promývá se 500 ml methylenchloridu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 2x500 ml methylenchloridu (3 minuty), 500 ml dimethylformamidu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Přiklad 28
Příprava pryskyřice Fmoc-Thr(tBu)-G1u(OtBu)-Sasrin
Odstraněni chránící skupiny Fmoc z pryskyřice Fmoc-Glu(OtBu)-Sasrin se provede postupem popsaným protokolu 1.
K první kopulaci se rozpustí směs 23,4 g Fmoc-Thr(tBulOH (59 mmol), 26,1 BOP (59 mmol) a 8,0 g HOBt (59 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 15,4 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice GluíOtBu)-Sasrin a směs se míchá 90 minut.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se rozpustí směs 11,7 g Fmoc-Thr(tBu)-OH (29,5 mmol), 13,1 g BOP (29,5 mmol) a 4,0 g HOBt (29,5 mmol) ve 400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7,7 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice a směs se míchá 90 minut.
| • · · | • · * · | • · · · |
| • · · | • · · * | • « |
| « · · · · | £ · · · | « * · · |
Po filtraci se pryskyřice Fmoc-Thr(tBu)-GluíOtBu)-Sasrin promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Příklad 29
Příprava pryskyřice Fmoc-Phe-ThrítBu)-G1u( OtBu)-Sasrin
Odstranění chránící skupiny Fmoc z pryskyřice FmocThríLBn)-G1u-(OtBu)-Sasrin se provede postupem popsaným protokolu 1 .
K první kopulaci se rozpustí směs 22,8 g Fmoc-Phe-OH í 59 mmol), 26,1 g BOP Í59 mmol) a 8,0 g HOBt (59 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 15,4 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční Činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice Thr(tBu)-G1u(OtBu)-Sasrin a směs se míchá 90 minut.
Po filtraci se pryskyřice Fmoc-Phe-Thr(tBu)-GluíOtBu) Sasrin promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x 500 ml methanol (3 minuty).
Ninhydrinový test ukazuje, še kopulační reakce je úplná, takže druhá kopulace není nutná.
Příklad 30
Příprava pryskyřice Fmoc-Val-Phe-ThrítBu)-GluíOtBu)-Sasrin
Odstranění chránící skupiny Fmoc z pryskyřice Fmoc-PheThrítBu)-GluíOtBu)-Sasrin se provede postupem popsaným protokolu 1 .
K první kopulaci se rozpustí směs 20 g Fmoc-Val-OH (59 mmol), 26,1 g BOP (59 mmol) a 8,0 g HOBt (59 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 15,4 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice Phe-ThrítBu)-GluíOtBu)-Sasrin a směs se míchá 90 minut.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethyl formami du (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se rozpustí směs 10 g Fmoc-Val-OH (29,5 mmol), 13,1 g BOP (29,5 mmol) a 4,0 g HOBt (29,5 mmol) ve 400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7,7 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice a směs se míchá 90 minut.
Po filtraci se pryskyřice Fmoc-Val-Phe-ThrítBu)-GluíOtBu)Sasrin promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x 500 ml methanolu (3 minuty).
Příklad 31
Příprava pryskyřice Fmoc-Al a r.Val-Phe-Thrí tBu) -Glu(OtBu)-Sasrin
Odstranění chránící skupiny Fmoc z pryskyřice Fmoc-ValPhe-Thr(tBu)-GluíOtBu)-Sasrin se provede postupem popsaným v protokolu 1 ,
K první kopulaci se rozpustí směs 18,4 g Fmoc-Ala-0H (59 mmol), 26,1 g BOP (59 mmol) a 8,0 g HOBt (59 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při. teplotě místnosti. Přidá se 15,4 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční Činidlo se přidá najednou do pryskyřice Val-Phe-ThrítBu)-GluíOtBu)-Sasrin a
- 46 • 4 4 · « * · ·
4 4 4 ·
4 « · 4« směs se míchá 90 minut.
Po Filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethyl formám i du (3 minuty), 500 ml methanolu Í3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se rozpustí směs 9.2 g Fmoc-Ala-0H (29,5 mmol), 13,1 g BOP (29,5 mmol) a 4,0 g HOBt (29,5 mmol) ve 400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7.7 ml DIPFA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá v jedné děvce do pryskyřice a směs se míchá 90 minut.
Po filtraci se pryskyřice Fmoc-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)G1u(OtBu)-Sasrin promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Příklad 32
Příprava pryskyřice Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr( tBu)G1uí OtBu)-Sasr i n
Odstranění chránící skupiny Fmoc z pryskyřice Fmoc-Ala-ValPhe-Thrí tBu) - G1 u.í OtBu)-Sasr i n se provede postupem popsaným v protokolu 1,
K první kopulaci se rozpustí směs 24,3 g Fmoc-AspíOtBu)OH (59 mmol), 26,i g BOP (59 mmol) a 8,0 g HOBt (59 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 15,4 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin a směs se míchá 90 minut.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethyl formami -
» * * ► · 1
4« · * • 4 * 4
- 47 du (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu í3 minuty).
Ke druhé kopulaci se rozpustí směs 12,1 g Fmoc-AspíOtBu)- OH (29,5 mmol), 13,1 g BOP (29,5 mmol) a 4, 0 g HOBt (29,5 mmol) ve 400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7,7 ml DIPFA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá najednou do pryskyřice a směs se míchá 90 m i nut.
Po filtraci se pryskyřice Fmoc-Asp(0tBu)-Ala-Val-PheThr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methy1enchloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Příklad 33
Příprava pryskyřice Fmoc-Ser( tBu)-AspíOtBu)-Ala-Val-PheThrí tBu)-G1u(OtBu)-Sasrin
Odstranění chránící skupiny Fmoc z pryskyřice Fmoc-Asp(PtBu)-Ala-Val-Phe-ThrítBu)-G1u(OtBu)-Sasrin se provede postupem popsaným v protokolu 1.
K první kopulaci se rozpustí směs 22,6 g Fmoc-Ser(tBu)OH (59 mmol), 26,1 g BOP (59 mmol) a 8,0 g HOBt (59 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 15,4 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice Asp(0tEu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-G1u(OtBu)-Sasrin a směs se míchá 90 minut.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethylformami du (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se rozpustí směs 11,3 g Fmoc-Ser(tBu)-OH
- 48 «λ · · ·· * ··* • * ··· · · · · ···· v · » v · · * · · • · » ·« ·· · *· ·* (29,5 mmol), 13,1 g BOP (29,5 mmol) a 4,0 g HOBt (29,5 mmol) ve 400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7,7 ml DIPEft a směs se intensivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice a směs se míchá 90 minut.
Po filtraci se pryskyřice Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-ValPhe-Thr(tBu)-GluíOtBu)-Sasrin promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Příklad 34
Příprava pryskyřice Fmoc-HisíTrt)-Ser(tBu)-ftspíOtBu)-Ala-ValPhe-Thr(tBu)-Gluí OtBu)-Sasrin
Odstranění chránící skupiny Fmoc z pryskyřice Fmoc-Ser(tBu)Asp( PtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(.tBu)-Gluí OtBu)-Sasr in se provede postupem popsaným v protokolu 1.
K první kopulaci se rozpustí směs 36,6 g Fmoc-HisíTrt)OH (59 mmol), 26,1 g BOP (59 mmol) a 8,0 g HOBt (59 mmol) ve 400 ml NMP za míchání při teplotě místnosti. Přidá se 15,4 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reakční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice Ser(Tbu)-Asp(0tBu)-Ala-ValPhe-Thr(tBu)-GluíOtBu)-Sasrin a směs se míchá 90 minut.
Po filtraci se pryskyřice promývá 500 ml dimethylformamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 500 ml methylen chloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty).
Ke druhé kopulaci se rozpustí směs 18,3 g Fmoc-His(Trt)-OH (29,5 mmol), 13,1 g BOP (29,5 mmol) a 4,0 g HOBt (29,5 mmol) ve .400 ml NMP a míchá se při teplotě místnosti. Do roztoku se přidá 7,7 ml DIPEA a směs se intenzivně míchá. Výsledné reak- 49 -
« 9 ční činidlo se přidá v jedné dávce do pryskyřice a směs se míchá 90 minut.
Po filtraci se pryskyřice Fmoc-HisíTrt)-SerítBu)-AspíOtBu)Ala-Val-Phe-ThrítBu)-GluíOtBu)-Sasrin promývá 500 ml dimethylformamid (3 minuty), 500 ml methanol (3 minuty), 500 ml methylenchlorid (3 minuty) a 2x500 ml methanol (3 minuty).
Příklad 35
Acetylace pryskyřice His(Trt)^SerítBu)-AspíOtBu)-A1a-Val-PheThrítBu)-GluíOtBu)-Sasrin
Chráněná peptidová pryskyřice Fmoc-Hisí Trt)-Serí tBu)· AspfOtBu)-Ala-Val-Phe-ThrítBu)-GluíOtBu)-Sasrin se zpracuje 2x 25% piperi dinem a promývá se jak popsáno při odstraňování chránící skupiny v protokolu 1. Po odstranění chránící skupiny Fmoc se provede acetylace N-koncového aminu následujícím způsobem:
Roztok 100 ml Ac20 a 100 ml DIPEA v 800 ml methylenchloridu se přidá do peptidové pryskyřice a reakce se nechá probíhat 90 minut.
Pryskyřice se odfiltruje a promývá se postupně 500 ml dimethyl formamidu (3 minuty), 500 ml methanolu (3 minuty), 50Q ml methylenchloridu (3 minuty) a 2x500 ml methanolu (3 minuty) a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 110 g chráněné prysykřice Ací1-8)-Sasrin, Ac-His(Trt)-SerítBu)-AspíOtBu)-Ala-Va1 - Phe Thrí tBu)-Gluí OtBu)-Sasrin.
Příklad 36
Štěpení pryskyřice Ac-HisíTrt)-SerítBu)-AspíOtBu)-Ala-Val-FheThrí tBu)-Gluí OtBu)-Sasrin
Při teplotě místnosti se zpracovává jednu minutu 20 g pryskyřice Ací1-8)-Sasrin se 400 ml 0,5% TFA v methylenchloridu a odfiltruje se. Hodnota pH filtrátu se okamžitě nastaví na 7 přidáním pyridinu. Filtrát se odpaří a zbytek se trituruje 50 ml destilované vody a promývá se pak 50 ml etheru. Výsledný pevný materiál se vysuší ve vakuu. Zfiltrovaná peptidová pryskyřice se zpracovává 3x 400 ml 0,5% roztoku TFA po dobu 10 minut s následným nastavením hodnoty pH na 7 pyridinem. Po odpaření, trituraci a sušení se provede analysa HPLC.
Zfiltrovaná peptidová pryskyřice se zpracovává 3x 400 ml 0,3% roztoku TFA po dobu 10 minut s následným nastavením hodnoty pH na 7 pyridinem. Po odpaření, trituraci a sušení se provede analysa HPLC. Podmínky HPLC: sloupec Lichrosorb RP-18,5 m, 25 cm, eluční činidla (a) 0,1 M HCIO4/H3O (pH 2,5), íb) MeCN, gradient 34 % až 39 % MeCN/20 minut, průtočná rychlost 1/ml/min a detektor 210 nm Knau.
Všechny peptidové fragmenty o čistotě větší než 90% se spojí a tak se získá celkem 10,8 g. Celkový výtěžek získaný štěpením VIP g peptidové pryskyřice je 46 g s průměrnou čistotou 95% .
Příklad 37
Synthesa Fmoc-Ala-LysíBoc)-Lys-TyrítBu)-Leu-Asn-Asp-Leu-Lysí Boc) -Lysí Boc) -G.l y-Gl y-Thrí tBu) - NH2 : íchráněný Fmocí19- 31)-NH2)
V 90 ml 10% diethylaminu v dimethylformamidu se rozpustí fragment I, Fmocí26-31)-NH2 (SEQ ID No:2) (8,91 g, 8,24 mmol) a míchá se dvě hodiny při teplotě místnosti. Amin a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a zbytek se trituruje se směsí hexanu a etheru (4:1), pevný produkt se oddělí a promývá se směsí hexanu a etheru (4=1), čímž se získá 7,0 g H-(26-31)-NH2 v po• · • · · » · ·· · « a · • fl · * a · · · a fla· fl« a· ·«· · • fl· a fl a · ·· fl···· «fl ·· ··
- 51 době bezbarvého prášku (výtěžek 98,9 % teorie).
Fragment II, Fmocí19-25)-OH (SEQ ID N0:3) (9,89 g , 8,15 mmol), H-(26-31-NH2 (7,0 g, 8,15 mmol), HOBt (4,49 g, 29,3 mmol) a DIPEA (6,81 ml, 39,1 mmol) se rozpustí ve 120 ml systému dimethylformamid/methylenchlorid (1:1) a míchá se na ledové lázni. Během 10 minut se do uvedeného roztoku přidá po částech pevný HBTU (3,71 g, 9,78 mmol), V míchání se pokračuje o
minut při teplotě 0 Ca pak 3 hodiny při teplotě místnosti. Roztok se odpaří ve vakuu k odstranění rozpouštědel a zbytek se rozpustí v methylenchloridu. Tento roztok se promývá nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (3x), 10% citrónovou kyselinou (2x), vodou a solankou a vysuší se bezvodým síranem hořečnatým. Roztok se zfiltruje a filtrát se odpaří, čímž se získá surový chráněný meziprodukt Fmocí19-31)-NH2 v podobě bezbarvé pevné látky 17,4 g (výtěžek 100 %) , Analytickou HPLC je určena čistota přibližně 70%.
Příklad 38
Synthesa Fmoc-Asn-Tyrí tBu)-ThrítBu)-Lysí Boc)-Leu-Arg- ( Pmc)-Lysí Boc)-(G1n-Nle-Ala-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyrí tBu)-Leu-Asn-AspLeu-Lysí Boc)-Lysí Boc)-G1 y-Gly-Thr( tBu) - NH2'· (chráněný Fmoc(9-31)-NH3)
V 90 ml 10% diethylaminu v dimethylformamidu se rozpustí Fmocí 19-31) -NH2 (17,4 g) a míchá se dvě hodiny při teplotě místnosti. Amin a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a zbytek se trituruje se směsí hexanů a etheru (3:1), pevný produkt se oddělí a promývá se směsí hexanu a etheru (3:1), čímž se ziská 16,67 g H-(19-31)-NH2 v podobě bezbarvého pevné- 1átky (výtěžek 100 % teorie).
Fmoc(9-18)-OH (SEQ ID N0:4) (16,59 g , 8,15 mmol), H-Í1931)-NH2 (16,67 g), HOBt (4,49 g, 29,3 mmol) a DIPEA (6,81 ml, *··* » · ♦ · • · · « ♦ ·· ♦ · ·· «· ··« · · · * ··· 9 · « » » «I»·· * * *
999 f 99 99 99 99
39,1 mmol) se rozpustí ve 150 ml systému dimethylformamid/methylenchlorid (2:1) (roztok je velmi kalný) a míchá se na ledové lázni. Během 10 minut se do uvedeného roztoku přidá po částech pevný HBTU (3,70 g, 9,78 mmol). Roztok se vyčeří a v míO cháni se pokračuje 30 minut při teplotě 0 Ca pak tři hodiny při teplottě místnosti. Roztok se odpaří ve vakuu k odstranění rozpouštědel a zbytek se rozpustí v methylenchloridu. Tento roztok se promývá nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (3x), 10% citrónovou kyselinou (2x), vodou a solankou a vysuší se bezvodým síranem hořečnatým. Roztok se zfiltruje a filtrát se odpaří, čímž se získá 24,77 g surového chráněného meziproduktu Fmoc (9-31. )-ΝΗξ v podobě bezbarvé pevné látky (výtěžek přibližně 79 %), který podle analytické HPLC vykazuje čistotu 69%.
Příklad 39
Synthesa Ac-His(Trt)SerítBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val -Phe-ThrítBu)Glu(OtBu)-Asn-Tyr( tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Argí Pmc)-Lysí Boc)-ÍGln-Nle-Ala-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-AspLeu-Lys(Boc)-Lysí Roc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-NH2: (chráněný Ac( 1-31)-ΝΗΞ)
Ve 10O ml 10% diethylaminu v dimethylformamidu se rozpustí Fmocí9-31)-NH2 (24,77 g) a míchá se dvě hodiny při teplotě místnosti. Amin a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a zbytek se trituruie se směsí hexanu a etheru (3:1), pevný produkt se odfiltruje a promývá se směsí hexanu a etheru (3:1), čímž se získá 22,56 g H-Í9-3D-NH2 v podobě bezbarvé pevné látky (výtěžek 96,7 % teorie).
Roztok H-(9-31)-NH2 (22,56 g , 6,22 mmol), Ac(l-8)-0H (SEQ ID N0:5) (8,79 g, 6,22 mmol), HOBt (3,43 g, 22,38 mmol) a DIPEA (5,19 ml, 29,84 mmol) ve 200 ml systému dimethylformamíd/methylenehlorid (1:1) se míchá na ledové lázni. Během 10 « ♦ »”♦/’· φ”φ *”φ φφφ «φ»· φ φ φφ φ · φ * φ φφ φφ φφφ φ φ φφφ · φ φ φφφ φφφ, φφ φφ φφ φφ φφ minut se do uvedeného roztoku přidá po částech pevný HBTU (2,83 g, 7,46 mmol). Roztok se míchá 30 minut při teplotě O C a pak tři hodiny při teplottě místnosti. Roztok se odpaří ve vakuu k odstranění rozpouštědel a zbytek se rozpustí v methylenchloridu. Tento roztok se promývá nasyceným roztokem hydrogenuhliČi tanu sodného ( 3x) , 10% vodnou citrónovou kyselinou (2x), vodou a solankou a vysuší se bezvodým síranem horečnatým Roztok se zfiltruje a filtrát se odpaří, čímž se získá 29,54 g surového chráněného meziproduktu Ac(1-31)-NH2 v podobě bezbarvé pevné látky (výtěžek 72,2 % teorie), která podle analytické HPLC vykazuje čistotu přibližně 78%,
Příklad 40
Odstranění chránící skupiny z chráněného Ací1 -31)-NH2:
Syntesa cyklického analogu VIP
Chráněný Ac( 1-31 )-11¾ (29,54 g) se rozpustí ve 150 ml směsí TFA (135 ml), EDT (4,5 ml), thioanisolu (7,5 ml), anisolu (3 ml) a míchá se dvě hodiny při teplotě místnosti. Tento roztok se odpaří k odstranění TFA a vlije se do 500 ml předchlazeného etheru, čímž vznikne sraženina, která se odfiltruje a promývá se opatrně etherem. Produkt se vysuší ve vakuu a získá se 25.5 g Ac(l-31)-NH2 v podobě bezbarvého prášku s čistotou přibližně 72 až 75% podle zjištění HPLC.
Příklad 41
Čištění cyklického VIP analogu
Surový peptid Ae( 1-31 )-11¾ se čistí několikanásobnou preparativní HPLC ná systému Delta Prep 3000. Kvantitativní analysy HPLC podílu surového produktu na sloupci Zorbac Protection Plus (standard cyklického VIP analogu) vykazuje obsah 9,95 g analogu v surovém produktu o hmotnosti 25,5 g. Při typické operaci se peptid (4 g) rozpustí ve 200 ml systému 1 % » « * · • · ί·
• · φ
TFA/H2O a aplikuje se na sloupec YMC ODS-A (12,0 nm, 15 um) (4,7 x 50 cm). Mobilní fáze je (A) 0,1 % TFA/H3O , (B) 0,1% TFA/50 % methanol/aceton itri 1. Gradient od 20 % (B) (10 minut) a pak 20 % až 50 % (B) ve 180 minutách při průtočné rychlosti 80 ml/min. Detekce UV při 215 nm. Frakce obsahující hlavní vrchol se spojí a vyhodnotí se analytickou HPLC, Frakce posouzené jako vysoce čisté se spojí, zkoncentrují se na rotační odparce a lyofilizují se k získání 1,2 g cyklického analogu VIP Ac(2-3)-NH2. Zbytek surového produktu se zpracuje stejným způsobem a poskytne celkem 8,48 g (výtěžek 85,2 % teorie) vyčištěného cyklického analogu VIP, celkový výtěžek 23,9 %. Analytická HPLC a kapilární elektroforéza potvrzují, že čistota produktu je větší než 99%. Produkt se charakterizuje a indentita se potvrdí analysou aminokyselin, FAB-MS, optickým stáčením, ultrafialovou absorpcí a cirkulárním dichroismem.
Průmyslová využitelnost
Způsob poměrně jednoduché, účinné a ekonomické přípravy peptidového analogu Ac(1-31)-NH2, vasoaktivního intestinálního peptidu (VIP), který je re1axant/bronchodi Iator hladkého svalstva, reguluje sekreci hlenu v dýchacích cestách a má antialergické a anti zánět 1 ivé charakter istiky, ·- 4 » * 4 · 44 *· · *4 4
44 • 44 • · 4 4 « ♦
4 ·
4«
444 44
4
4
Seznam sekvencí (1) Obecné informace íi) Přihlašovatel
ÍA) Jméno: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG (B) Ulice: Grenzacherstrasse 124 ( C) Město: Basle
CD) Stát: BS
ÍE) Země: Švýcarsko (F) Poštovní kod ZIP: CH-4010 (G) Telefon: 061-6885108 (H) Telefax: 061-6881395
Cl) Telex: 962292/965542 hlr ch (ii) Název vynálezu: Způsob přípravy analogu VIP a meziprodukty pro tento způsob f i i i) Počet sekvencí: 7 í iv) Forma pro počítač
ÍA) Typ média: Floppy disk
ÍB) Počítač: Apple Macintosh íC) Operační systém: Apple Macintosh ÍD) Software: Word 5.1 ťvi) Platné přihlašovací údaje
Číslo přihlášky: EP (2) Informace pro SEQ ID NO:1:
íi) Charakteristiky sekvence:
ÍA) délka: 31 aminokyselin ÍB) typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden řetězec ÍD) topologie: lineární iii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: modifikované místo (B) lokace: 21..25 • · · ·
- 56 ·· * · • · * • · ft ··· ftft • · · © • ft ·· • ftft · • ftftft ft·· ft · ftft · • ft ·· (C) jiné informace: (poznámka = cyklizace vedlejšího řetězce v Lys2i na ASP25 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NQ:1:
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin 15 10 15
Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 (2) Informace pro SEQ ID N0:2:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) délka: 6 aminokyselin <B) typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (i i) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
Leu Lys Lys Gly Gly Thr 1 5 (2) Informace pro SEQ ID N0:3; (i) Charakteristiky sekvence:
(A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická'· ne ( ix) Charakteristiky (A) jméno/klič: modifikované místo (B) lokace: 3..7 (C) jiné informace: (poznámka = vedlejší řetězce Lys3 a Asp 7 jsou cyklizovány
| « W’ ·· 4 | • | 4 | 4 | ||
| * 4 | 4 | 4 t ·· | • 4 | 44 | 4 |
| • « | 4 | 4 4 4 4 | 4 | 4 | 4 |
| • 44 44 | 4· | 4 4 | 44 |
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3:
Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp 1 5 (2) Informace pro SEQ ID NO:4:
(i)· Charakteristiky sekvence:
(A) délka: 10 aminokyselin (B) typ’- aminokyselina
ÍC) řetězcovitost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (i i) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:4:
Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin Xaa Ala 1 5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO:5:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) délka: 8 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (i i) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:5:
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu 1 5 (2) Informace pro SEQ ID NO:6:
(i) Charakteristiky sekvence'· (A) délka: 13 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden řetězec (D) topologie: lineární
| 94 4 | ·”· | 4~4 | 4 | 4 | • | |
| 4 9 9 | • 4 | 44 | 4 | 4 | 44 | |
| 4 | 4 | |||||
| 4 4 4 | 4 · | 4 | • | 4 | 4 | |
| 44 4 »« | 9· | 44 | »4 | 44 |
(ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: modifikované místo (Β) 1okace: 3..7 (C) jiné informace: (poznámka = vedlejší řetězce Lys3 a Asp7 jsou cyklizovány (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6:
Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 1 5 10 (2) Informace pro SEQ ID N0:7:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) délka: 23 aminokyselin (B) typ: aminokyse1 i na (C) řetězcovitost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (i i) Typ molekuly’· peptid (iii) Hypotetická: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:7:
Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn 1 5 '10 . 15
Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20
| • i ♦ ”· | fl’ | • · fl | ·”· | fl | « |
| • · · | • | • flfl | • · | v « | fl |
| fl · · | • | • » · | • | • | • |
| flflfl flfl | flfl | flfl | flfl | * fl |
yv KI6-1S
Claims (15)
1. Způsob přípravy analogu VIP Ac(l-31)-NH2 (SEQ ID NO: 1) vyznačující se tím, Se se kopulují Fmoc chráněné peptidové fragmenty.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, še se jako chráněné peptidové fragmenty kopulují peptidový fragment I (Seq ID NO:2), péptidový fragment II (Seq ID N0'-3), péptidový fragment III (Seq ID N0:4) a péptidový fragment IV (Seq ID NO:5).
3. Způsob podle nároku 2, vyznačuj ící se tím, še se
a) odstraňuje chránící skupina Fmoc z peptidového fragmentu I a kopuluje se chráněné skupiny zbavený péptidový fragment I s chráněným peptidovým fragmentem II;
b) odstraňuje se chránící skupina Fmoc z peptidu získaného ve stupni (a) a kopuluje se chráněné skupiny zbavený peptidový fragment s chráněným peptidovým fragmentem III;
c) odstraňuje se chránící skupina Fmoc z peptidu získaného ve stupni (b) a kopuluje se chráněné skupiny zbavený peptidový fragment s chráněným peptidovým fragmentem IV;
d) odstraňuje se chránící skupina Fmoc z peptidu získaného ve stupni (c) sa získání sloučeniny ACÍ1-31)-NH2
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se chráněné skupiny zbavený peptid Ac(l-3Í)-NH2 čistí.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se peptid Ac(l-31)-NH2 čistí preparativní chromatograf i í HPLC.
6. Způsob přípravy Čištěného Ac(l-31)-NH2 (SEQ ID NCMl) kopulací čtyř skupinou Fmoc chráněných peptidových fragmentů, peptidového fragmentu I (Seq ID N0:2), peptidového fragmentu ·«·* · «* · • 4 44 4 « 44
4 44 44 *444 4
4 4 4 4 * 4 t
4· 44 44 44
ID NO:4) a ě u j ící fragmentu I fragment I «* 4 4 • « 4
4 4 4 4
4 · · • 44 44
- 60 II (Seq ID NO =3), peptidového fragmentu III (Seq peptidového fragmentu IV (Seq ID NO:5), vyzná se tím, še se
a) odstraňuje chránící skupina Fmoc z peptidového
b) kopuluje se chráněné skupiny zbavený peptidový s chráněným peptidovým fragmentem II za získání chráněného
1 meziproduktu Fmocí19-31)-NH2,
c) odstraňuje se chránící skupina Fmoc z meziproduktu ť Fmocí19-31)-NH2,
d) kopuluje se chráněné skupiny zbavený meziprodukt Fmocí1931)-NH2 s chráněným peptidovým fragmentem III za získání chráněného meziproduktu Fmocí9-31)-NH2 ,
e) odstraňuje se chránící skupina Fmoc z meziproduktu Fmoc(9-31)-NH2,
f) kopuluje se chráněné skupiny zbavený meziprodukt Fmoc(931)-NH2 s chráněným peptidovým fragmentem IV za získání chráněného meziproduktu Ací 1 - 31) - NH2 ,
g) odstraňuje se chránící skupina z chráněného peptidů Ací1-31)-NH2 a
h) chránící skupiny zbavený peptid Acíl-31)-NH2 se čistí.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m, že se čištění podle stupně h) provádí preparativní chromatograf i í HPLC.
8. Způsob podle nároku 6, vyznačuj ící se tím, še se chránící skupina z peptidových fragmentů a meziproduktů odstraňuje 10% Et2NH v dimethylformaroidu.
9. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, ěe se po odstranění chránící skupiny odstraňuje fluoren promýváním peptidových fragmentů a meziproduktů systémem hexan/ ether.
10.
Způsob podle nároku 6, vyznačuj ící • 0 0 ·
0 0 0«
0 000 0 0
0 « 0
00 00
0 · ·
0 0 0«
0 0 0 t
0 0 0 0
00 00
00 0 0
0 0 0
0 0 ··
0 0 0
000 00
Lim, že se chránící skupiny zbavené peptidové fragmenty a mezi produkty
a) kopulují s 1,0 ekvivalentem chráněných peptidových fragmentu 2a použití 2-(lH-benzotriazol-1-yl)-1, 1,3,3-tetramethylr uroniumhexafluorfosfátu, 1-hydroxybenzotriazolu v systému dimethylformamid/methylenchloríd za použití diisopropylethyl am inu,
b) reakční směs se odpaří a zbytek se rozpustí v methylenchloridu a cl reakční směs se extrahuje nasyceným roztokem hydrogenuhli čítánu sodného a 10% kyselinou citrónovou.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačuj ící se a
t í m, že se kopulace provádí za teploty 0 C po dobu 30 minut
Q až jedné hodiny a 25 C po dobu tří hodin s 1,2 ekv. 2-(lHbenzotr i azol-1-yl)-1,1,3, 3-tetramethyluroň iumhexafluorfosfátu,
3,6 ekv. 1-hydroxybenzotriazolu a 4,8 ekv. diísopropylethylaminu.
12. Peptidy ze souboru zahrnujícího Fmocí19-31)-NH2 (SEQ ID N0;6) a Fmocí9-31)-NHs (SEQ ID N0:7) jakožto meziprodukty pro provádění způsobu podle nároku 1.
13. Chráněné peptidové fragmenty ze souboru zahrnujícího Fmocí26-31)-NH2 (SEQ ID N0=2), Fmocí19-25)-OH (SEQ ID N0:3), Fmocí9-18)-OH (SEQ ID NO:4) a Ac(l-8)-0H (SEQ ID N0:5) jakožto meziprodukty pro provádění způsobu podle nároku 1.
14. Peptidové fragmenty podle nároku 13 ze souboru zahrnujícího (SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3) a (SEQ ID NO:4) zbavenmé chránícíh skupin jakožto meziprodukty pro provádění způsobu podle nároku 1 .
15. Použití peptidových fragmentů podle nároku 12 až 13 pro přípravu Ac-( 1-31) -NH2 (Seq ID N0:l).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1142596P | 1996-02-09 | 1996-02-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ251698A3 true CZ251698A3 (cs) | 1998-11-11 |
| CZ294779B6 CZ294779B6 (cs) | 2005-03-16 |
Family
ID=21750320
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19982516A CZ294779B6 (cs) | 1996-02-09 | 1997-01-29 | Způsob přípravy Ac(1-31)-NH2 (SEQ ID NO:1) kopulací čtyř Fmoc chráněných peptidových VIP fragmentů a meziprodukty pro tento způsob |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6080837A (cs) |
| EP (1) | EP0879246B1 (cs) |
| JP (1) | JP2000504676A (cs) |
| KR (1) | KR100493795B1 (cs) |
| CN (1) | CN1186355C (cs) |
| AT (1) | ATE328004T1 (cs) |
| AU (1) | AU722895B2 (cs) |
| BR (1) | BR9707409A (cs) |
| CZ (1) | CZ294779B6 (cs) |
| DE (1) | DE69735991D1 (cs) |
| HU (1) | HUP9900961A3 (cs) |
| MX (1) | MX9806099A (cs) |
| NO (1) | NO983626D0 (cs) |
| NZ (1) | NZ330885A (cs) |
| WO (1) | WO1997029126A1 (cs) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE328004T1 (de) * | 1996-02-09 | 2006-06-15 | Hoffmann La Roche | Herstellung eines vip-analogen |
| FR2775902B1 (fr) * | 1998-03-13 | 2001-05-11 | Assist Publ Hopitaux De Paris | Utilisation d'analogues du vip dans la prevention et le traitement des lesions cerebrales du nouveau-ne humain |
| ES2245505T3 (es) * | 1998-03-23 | 2006-01-01 | Trimeris Inc. | Metodos y composiciones para la sintesis de peptidos (t-20). |
| US6281331B1 (en) * | 1998-03-23 | 2001-08-28 | Trimeris, Inc. | Methods and compositions for peptide synthesis |
| CN101229363A (zh) | 2000-11-28 | 2008-07-30 | 蒙多生物技术许可股份公司 | 具有血管活性肠肽的生物学活性的用于治疗肺动脉和小动脉高压的化合物 |
| US20060241028A1 (en) | 2002-06-10 | 2006-10-26 | Dorian Bevec | Use of compounds having the biological activity of vasoactive intestinal peptide for the treatment of sarcoidosis |
| KR100451432B1 (ko) * | 2002-07-12 | 2004-10-06 | 강충경 | Ｔ-20 펩타이드의 생물학적 제조방법 |
| WO2006023358A1 (en) * | 2004-08-18 | 2006-03-02 | Eli Lilly And Company | Selective vpac2 receptor peptide agonists |
| US20080085860A1 (en) * | 2004-08-18 | 2008-04-10 | Eli Lilly And Company | Selective Vpac2 Receptor Peptide Agonists |
| KR20090027239A (ko) * | 2006-07-06 | 2009-03-16 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 혈관작용성 장 펩티드의 유사체 |
| ES2870914T3 (es) | 2009-08-14 | 2021-10-28 | Phasebio Pharmaceuticals Inc | Péptidos intestinales vasoactivos modificados |
| CA2873553C (en) | 2011-06-06 | 2020-01-28 | Phasebio Pharmaceuticals, Inc. | Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension |
| ES2822598T3 (es) | 2015-02-09 | 2021-05-04 | Phasebio Pharmaceuticals Inc | Métodos y composiciones para tratar enfermedades y trastornos musculares |
| CN110317257B (zh) * | 2019-06-03 | 2023-10-31 | 吉尔生化（上海）有限公司 | 一种辛卡利特的固液相合成法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237046A (en) * | 1979-04-27 | 1980-12-02 | Miklos Bodanszky | Polypeptides and methods of preparation |
| WO1991004041A1 (en) * | 1989-09-15 | 1991-04-04 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Process for inducing analgesia, peptides and therapeutic compositions |
| AU656230B2 (en) * | 1991-10-11 | 1995-01-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Cyclic vasoactive peptides |
| JPH0616694A (ja) * | 1992-07-01 | 1994-01-25 | Sato Seiyaku Kk | カルシトニンの製造法 |
| ES2051647B1 (es) * | 1992-12-10 | 1995-01-16 | Lipotec Sa | Procedimiento para la preparacion de calcitonina de salmon. |
| ATE328004T1 (de) * | 1996-02-09 | 2006-06-15 | Hoffmann La Roche | Herstellung eines vip-analogen |
-
1997
- 1997-01-29 AT AT97902251T patent/ATE328004T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-01-29 EP EP97902251A patent/EP0879246B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-29 CZ CZ19982516A patent/CZ294779B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-01-29 BR BR9707409A patent/BR9707409A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-01-29 AU AU15963/97A patent/AU722895B2/en not_active Ceased
- 1997-01-29 CN CNB971920729A patent/CN1186355C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-01-29 KR KR10-1998-0706135A patent/KR100493795B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-01-29 DE DE69735991T patent/DE69735991D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-29 JP JP9528106A patent/JP2000504676A/ja not_active Ceased
- 1997-01-29 WO PCT/EP1997/000380 patent/WO1997029126A1/en active IP Right Grant
- 1997-01-29 NZ NZ330885A patent/NZ330885A/en unknown
- 1997-01-29 HU HU9900961A patent/HUP9900961A3/hu not_active Application Discontinuation
- 1997-02-07 US US08/798,394 patent/US6080837A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-07-29 MX MX9806099A patent/MX9806099A/es not_active IP Right Cessation
- 1998-08-07 NO NO983626A patent/NO983626D0/no not_active Application Discontinuation
- 1998-12-18 US US09/215,775 patent/US6316593B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO983626L (no) | 1998-08-07 |
| EP0879246A1 (en) | 1998-11-25 |
| CZ294779B6 (cs) | 2005-03-16 |
| EP0879246B1 (en) | 2006-05-31 |
| KR19990082403A (ko) | 1999-11-25 |
| MX9806099A (es) | 1998-10-31 |
| DE69735991D1 (de) | 2006-07-06 |
| BR9707409A (pt) | 1999-04-13 |
| US6316593B1 (en) | 2001-11-13 |
| KR100493795B1 (ko) | 2005-09-09 |
| WO1997029126A1 (en) | 1997-08-14 |
| NZ330885A (en) | 2000-02-28 |
| CN1210543A (zh) | 1999-03-10 |
| AU722895B2 (en) | 2000-08-10 |
| JP2000504676A (ja) | 2000-04-18 |
| CN1186355C (zh) | 2005-01-26 |
| ATE328004T1 (de) | 2006-06-15 |
| US6080837A (en) | 2000-06-27 |
| HUP9900961A2 (hu) | 1999-07-28 |
| HUP9900961A3 (en) | 2001-06-28 |
| AU1596397A (en) | 1997-08-28 |
| NO983626D0 (no) | 1998-08-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Andreu et al. | Solid‐phase synthesis of PYLa and isolation of its natural counterpart, PGLa [PYLa‐(4–24)] from skin secretion of Xenopus laevis | |
| EP3505533A1 (en) | Synthesis method for low-racemization impurity liraglutide | |
| US4607023A (en) | Natriuretic | |
| Nakagawa et al. | The use of polymer-bound oximes for the synthesis of large peptides usable in segment condensation: Synthesis of a 44 amino acid amphiphilic peptide model of apolipoprotein A-1 | |
| AU4199397A (en) | Improved solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis | |
| CN106892968B (zh) | 一种利那洛肽的合成方法 | |
| JP2008534628A (ja) | ペプチド誘導体の製造のための方法 | |
| JPH0532696A (ja) | 副甲状腺ホルモン誘導体 | |
| CZ20003798A3 (cs) | Způsob výroby cyklických peptidů vázaných k polymernímu nosiči | |
| CZ251698A3 (cs) | Způsob přípravy analogu VIP a meziprodukty pro tuto přípravu | |
| CA2071538C (en) | Hpth (1-37) fragment, its production, drug containing it and its use | |
| CA2024855C (en) | Process and intermediates for producing glucagon | |
| EP1179537B1 (en) | Solid phase peptide synthesis method | |
| AU2420392A (en) | Lanthionine bridged peptides | |
| US4473555A (en) | Nona- and dodecapeptides for augmenting natural killer cell activity | |
| US5744444A (en) | HPTH-fragment-(1-37), the preparation thereof, medicaments containing same and the use thereof | |
| US6673769B2 (en) | Lanthionine bridged peptides | |
| US5512656A (en) | Thymosin alpha-1 derivatives | |
| Mihara et al. | Synthesis of the 60 amino acid homeo domain and smaller fragments of the Drosophila gene regulatory protein Antennapedia by a segment synthesis-condensation approach | |
| THOMPSON et al. | Synthesis of peptide amides using Fmoc‐based solid‐phase procedures on 4‐methylbenzhydrylamine resins | |
| SAKAMOTO et al. | Chemical synthesis of phosphorylated peptides of the carboxy‐terminal domain of human p53 by a segment condensation method | |
| Bahyrycz et al. | Plant peptide hormone phytosulfokine (PSK‐α): synthesis of new analogues and their biological evaluation | |
| EP1008656A1 (en) | Process for producing lh-rh derivatives | |
| Kitagawa et al. | Facile solid-phase synthesis of sulfated tyrosine-containing peptides: Part II. Total synthesis of human big gastrin-II and its C-terminal glycine-extended peptide (G34-Gly sulfate) by the solid-phase segment condensation approach | |
| CN114736289B (zh) | 一种带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20070129 |