CZ20003798A3

CZ20003798A3 - Způsob výroby cyklických peptidů vázaných k polymernímu nosiči

Info

Publication number: CZ20003798A3
Application number: CZ20003798A
Authority: CZ
Inventors: Adam W. Sledeski; James J. Mencel
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Products, Inc.
Priority date: 1998-04-15
Filing date: 1999-04-15
Publication date: 2001-08-15
Also published as: HUP0101629A2; EP1093458A1; JP2002511483A; AP2000001972A0; CA2325572A1; WO1999052933A1; IL138338A0; CN1163504C; CN1323313A; OA11501A; EP1093458A4; SK15352000A3; KR20010085236A; UA72460C2; CN1552737A; NO20005165D0; AU744812B2; BG104903A; AU3567999A; NO20005165L

Description

Způsob výroby cyklických peptidů vázaných k polymernímu nosiči

Oblast techniky

Předmětný vynález se týká způsobu výroby cyklických peptidových analogů hormonů příštítné žlázy vázaných k polymernímu nosiči a analogů proteinů souvisejících s hormony příštítné žlázy, přičemž tyto analogy obsahují alespoň jeden můstek mezi postranními řetězci dvou nesousedících zbytků aminokyselin, přičemž uvedený způsob je založen na přípravě jednotlivých fragmentů těchto analogů. Konkrétně se předmětný vynález týká způsobu syntézy uvedených cyklických peptidových analogů v pevné fázi a peptidových fragmentů používaných při této syntéze.

Dosavadní stav techniky

Cyklické peptidové podjednotky jsou přítomny v širokém spektru biologicky aktivních peptidů, jejichž skupina zahrnuje analogy hormonů příštítné žlázy a analogy proteinů souvisejících s hormony příštítné žlázy, analogy vasoaktivních peptidů, analogy cholecystokininu, peptidy odvozené od nádorového nekrózového faktoru (TNF), analogy kalcitoninu, analogy somatostatinu, modulátory buněčné přilnavosti, analogy faktorů uvolňující růstový hormon (GRF), antagonisty bradykininu, analogy stimulátorů aktivace tyrosinu (TAM Mimics) a agonisty amylinu. Zvlášť významné jsou cyklické peptidové analogy hormonů příštítné žlázy (hPTH) a analogy proteinů souvisejících s hormony příštítné žlázy (hPThrP).

Lidský hormon příštítné žlázy (v dalším popisu označovaný zkratkou hPTH) je protein obsahující 84 aminokyselin, který je • · · · • · ť? · • · • · · t * · · « « · · · · • · · · ·· ·· hlavním regulátorem vápníkové homeostáze. Protein související s hormonem příštítné žlázy (v dalším popisu označovaný zkratkou hPTHrP) je protein obsahující od 139 do 171 aminokyselin, jehož N-konec je homologem hPTH. N-koncové fragmenty hPTH a hPTHrP, zejména ty, které se skládají z aminokyselin 1-34, si zachovávají plnou biologickou aktivitu základního hormonu.

Fragment hPTH(1-34) má následující aminokyselinovou * sekvenci:

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-GLy-Lys-His-LeuAsn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-AspVal-His-Asn-Phe.

Fragment hPTHrP(1-34) má následující aminokyselinovou sekvenci:

Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-IleGln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-GluIle-His-Thr-Ala.

Biologická aktivita hPTH se odráží v aktivaci dvou sekundárních přenášecích systémů: v aktivitě G-proteinu spojeného s adenylcyklasou (AC) a v aktivitě G-proteinů spojeného nebo nespojeného s proteinovou kinasou C(PKC). Bylo prokázáno, že N-koncové fragmenty hPTH(1-34)OH a hPTH(1-31)NH₂mají anabolické účinky na tvorbu kostí u lidí, respektive u krys, kterým byly vyoperovány vaječníky. Bylo prokázáno, že toto zvýšení růstu kostí souvisí se stimulací aktivity adenylcyklasy. Analogy těchto N-koncových fragmentů mají významný terapeutický potenciál pro léčbu fyziologických stavů souvisejících s regulací obsahu vápníku v kostních buňkách, jejichž skupina zahrnuje hypokalcemii; osteoporózu; osteopenii; a poruchy spojené s osteoporózou a osteopenií, jako je hyperparathyroidismus, hypoparathyroidismus a syndrom

9999 99

9

9 9 9 · ······ • · · · 9 9 9 9 9 9

99 999 999 99 99

Cushings; osteopenii vyvolanou glukokortikoidy a látkami snižujícími imunitu; a hojení zlomenin kostí nebo opakovaných zlomenin kostí.

Bylo rovněž zjištěno, že odstranění až šesti aminokyselinových zbytků z uvedeného N-konce hPTH (1-34) vede ke značnému snížení schopnosti vzniklého analogu stimulovat adenylcyklasu, zatímco dopad tohoto odstranění na vázání k receptoru je malý. Tak analogy hPTH(l-34) zkrácené až o šest aminokyselinových zbytků na jejich N-konci inhibují účinek PTH a jsou užitečné pro léčbu poruch charakteristických nadbytkem PTH, jako je hyperparathyroidísmus a hyperkalcemická krize související s hyperparathyroídismem, škodlivá hyperkalcemie, selhání ledvin a vysoký tlak.

Acyklické analogy hPTH(1-27) až (1-34) byly popsány v patentu Spojených států amerických číslo US 4 086 196. Acyklické analogy hPTH(l-34) a hPTHrP (1-34) byly popsány v patentu Spojených států amerických číslo US 5 589 452.

[Nle⁸, Nle¹⁸, Tyr³⁴, nebo Phe³⁴] hPTH (1-34) byly popsány v patentu Spojených států amerických číslo US 4 656 250.

[Nle⁸, Nle¹⁸, Tyr³⁴] hPTH (1-34) a jejich deriváty zkrácené na N-koncích byly popsány v patentech Spojených států amerických číslo US 4 771 124 a US 4 423 037. Další acyklické analogy PTH(1-34) byly popsány v patentech Spojených států amerických číslo US 5 723 577 a US 5 434 246, ve zveřejněné mezinárodní přihlášce číslo WO 97/02834, ve zveřejněných přihláškách evropských patentů číslo EP 561 412-Al, EP 747 817-A2, ve zveřejněných mezinárodních přihláškách číslo WO 94/02510,

WO 96/03437 a WO 95/11988-Al. Analogy hPTH(1-28)NH₂ až hPTH (1-31) NH₂ a [Leu²⁷] hPTH (1-28 ) NH2 až [Leu²⁷] hPTH (1-33 ) NH2 byly popsány v patentu Spojených států amerických číslo

US 5 556 940. Acykličtí antagonisté receptoru PTH včetně • · · · φ φ φ φ φ » φ φ • φ φ • φ · φ φ · φ φ •» φφ φ analogů ΡΤΗ zkrácených na N-koncích byly popsány v patentech Spojených států amerických číslo US 5 446 130, US 5 229 489,

US 4 771 124 a US 4 423 037.

Byly rovněž popsány cyklické a bicyklické analogy hPTH a hPTHrP. Cyklo (Lys²⁶-Asp³⁰) [Leu²⁷] hPTH (1-34 ) NH₂ a cyklo (Lys²⁷-Asp³⁰) hPTH (1-34 ) NH₂ byly popsány v patentu Spojených států amerických číslo US 5 556 940.

Cyklo (Lys²⁶-Asp³⁰) [Leu²⁷] hPTH (1-31) NH2, cyklo (Glu²²-Lys²⁶) [Leu²⁷] hPTH (1-31) NH2 a cyklo (Lys²⁷-Asp³⁰) hPTH (1-31) NH2 byly popsány v publikaci Barbier a spolupracovníci: J. Med. Chem. 1997, 40, 1373. Monocyklické a bicyklické deriváty hPTH(l-34) nebo hPTHrP(1-34) jsou popsány v patentových dokumentech číslo WO 96/40193 a DE 19508672-A1 a v publikaci A. Bisello a spolupracovníci Biochemistry 1997, 36, 3293. Cyklo (Lys¹³-Asp¹⁷) hPTHrP (7-34 ) NH2, což je účinný antagonista receptoru PTH, byl popsán v publikaci M. Chorev a spolupracovníci Biochemistry 1991, 30, 5698. Kanmera a spolupracovníci v publikaci Peptide Chemístry 1993: Okada, Y., ed.; Protein Research Foundation, Osaka,

1994, 321-324 rovněž popsali sérii analogů hPTHrP obsahujících amidy.

Ve zveřejněné mezinárodní přihlášce číslo WO 98/51324 je popsán cyklický peptid obecného vzorce (I)

X-A.io-Aii-Ai2-Al3-Ai4-Ai5-Ai6-Ai7-Aie-Ai9-A20-A21-A22-A23-A24-A₂5- A26-A27- Y (I) a jeho z farmaceutického hlediska přijatelné soli a prekurzory léčiva, kde substituent X je vybrán ze skupiny zahrnující (a) Ri_a-Ao^-Ai-A2-A3-A4-A5-A6-A-7-A8-A9-, (b) Ri_a-A2^-A3-A4-A5-A6-A-7-Ag-A9- , (c) Rlb~A3~A4-A5-A6-A7-A8-A9-, (d) Ri_a-A4^_A5^_Ag-A7^—A8^-A9^_ , (e) Ria-As-Ag—A7—As^-A9-, (f) Ri_a—Αδ^-A7^— Ag—Ag^—, (*?) Rla-^-Ag-Ag-, (h) Ria-Ag-Ag-, (í) Rla“ A9-, a (j) Ri_a;

substituent Y je vybrán ze skupiny zahrnující (a) ^—R3/ (b) - A28^-R3, (C) -A28-A29“R3z (d) -A28^-A29-Á30-R3/ (e) - A28-A29-A30-A31-R3, (f) -A28^-A29“A30-A3i-A32-R3z (g) -A28-A29-A30-A31-A32-A33-R3, a (h) -A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-R3;

R_la je atom vodíku, alkylová skupina aralkylová skupina nebo skupina -COR₂;

R_lb je skupina R_ia nebo skupina obecného vzorce

H nebo

9 9 9

9 9 9 • 9 9 «

9 9 9 • 9 9 9 r₂ je alkylová skupina, alkenylová skupina, alkinylová skupina, arylová skupina nebo aralkylová skupina;

R₃ je skupina obecného vzorce

A35-OR4 nebo A35-NR4R5 kde

R₄ a R₅ jsou nezávisle na sobě atomy vodíku nebo nižší alkylové skupiny;

Rg a R_g jsou nezávisle na sobě atomy vodíku nebo alkylové skupiny;

R₇ je alkylová skupina;

R_g je atom vodíku, alkylová skupina nebo skupina obecného vzorce COR₂;

R₁₀ je atom vodíku nebo atom halogenu;

R_u je alkylová skupina nebo aralkylová skupina;

m je 1, 2 nebo 3;

n je 3 nebo 4;

A_o není přítomen nebo je peptid složený z jednoho až šesti aminokyselinových zbytků;

• ·

Αι

A₂ a₃ a₄

As

A₆ a₇

A_e

A₉

Aio je Ser, Ala, Gly nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

je Ala, Val nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina;

je Ala, Ser, Gly nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

je Glu, Ala nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina ;

je Ile, His, Ala nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina ;

je Ala, Gin, Gly nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

je Ala, Leu, Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina;

je Leu, Nle, Gly nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

je His, Ala, D-Pro nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina ;

je Ala, Asn, Asp, Cys, homo-Cys, Glu, Gly, Lys, Orn, Ser, Thr, D-Pro, skupina -NHCH(CH₂) _m (NH₂)COnebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

Q 444 44 44 4444 o · · · ·····>

···· 4 444444

444· · · 4444 ·· 49 444 444 44 44

Au je Ala, Gly, Leu nebo Lys, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₁₂ je Ala nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina

Au je Ala, Asn, Asp, Cys, homo-Cys, Glu, Gly, Lys,

Orn, Ser, Thr, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

Ai₄ je Ala, Asn, Asp, Cys, homo-Cys, Glu, Gly, His,

Lys, Orn, Ser, Thr, D-Pro, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

Au je Ala, Gly, Ile, D-Pro nebo Leu, nebo ekvivalentní aminokyselina;

Ais je Asn, Ala, Gly, D-Pro nebo Gin, nebo ekvivalentní aminokyselina;

Au je Ala, Asn, Asp, Cys, homo-Cys, Glu, Gly, Lys,

Orn, Ser, Thr, D-Pro, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) C0nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

Au je Asp, Cys, homo-Cys, Glu, His, Leu, Lys, Orn,

Nle, Ser, Thr, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

Au je Arg nebo Glu, nebo ekvivalentní aminokyselina

A₂₀ je Arg, nebo ekvivalentní aminokyselina;

• · · · • ·· · ·· ·«

A₂i je Arg, Asp, Cys, homo-Cys, Glu, Lys, Orn, Ser,

Thr, Val, skupina -NHCH (CH₂) _ra (NH₂) CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

A₂₂ je Asp, Cys, homo-Cys, Glu, His, Lys, Orn, Phe,

Ser, Thr, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO- ;

A₂₃ je Leu, Phe nebo Trp, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₂₄ je Leu, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₂₅ je Arg, Asp, Cys, homo-Cys, Glu, His, Lys, Orn,

D-Pro, Ser, Thr, skupina -NHCH(CH₂) _m (NH₂)CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

A_2S je Asp, Cys, homo-Cys, Glu, His, Lys, Orn, Ser,

Thr, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

A₂7	je	Leu	nebo	Lys,	nebo	ekvivalentní	aminokyselina;
A₂8	je	Ile	nebo	Leu,	nebo	ekvivalentní	aminokyselina;
A₂9	je	Ala,	Asp,	Cys,	homo	-Cys, Glu, Gin, Lys, Orn,

Ser, Thr, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) CO- nebo skupina -NHCH[ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

• · · · · *

Α₃ο 3θ Asp, Cys, homo-Cys, Glu, Gly, Lys, Orn, Ser,

Thr, skupina -NHCH(CH₂) _m (NH₂)CO- nebo skupina -NHCH [(CH₂) _nCO₂H ] CO- ;

A₃i je Ile, Leu nebo Val, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₃₂ je His, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₃₃ je Asn nebo Thr, nebo ekvivalentní aminokyselina

A₃₄ je Ala nebo Phe, nebo ekvivalentní aminokyselina

A35 není přítomen nebo je peptid složený z jedné až čtyř aminokyselin;

postranní řetězce alespoň jednoho z dále uvedených párů aminokyselinových zbytků, tj . A₂o a A_i4, A₂₃ a An, A₂₄ a An a A₂i, A₁₈ a A₂₂, A₂i a A₂₅, A₂₅ a A₂₉ a A₂₆ a A₃₀, jsou vzájemně spojeny amidovou, esterovou disulfidovou nebo lanthioninovou vazbu a tvoří tak můstek, přičemž postranní řetězce všech dále uvedených aminokyselinových zbytků, tj . A₁₀, A_i3, A₄₄, An, A₁₈, A21, A₂₂, A₂₅, A₂6, A29 a A₃₀ maximálně přispívají k vytváření jediného můstku; přičemž pokud postranní řetězce párů aminokyselinových zbytků A₂₃ a A₁₇ nebo A₂₆ a A₃₀ jsou vzájemně spojeny amidovou, disulfidovou nebo lanthioninovou vazbou za tvorby můstku, potom postranní řetězce alespoň jednoho páru aminokyselinových zbytků A_i0 a A_i4, Ai₄ a A₁₈, An a A₂₂, A_i8 a A₂₂A₂i a A₂₅ a A₂₅ a A₂₉ jsou rovněž spojeny amidovou, esterovou, disulfidovou nebo lanthioninovou vazbou za tvorby můstku.

9999 ·· • 9 9 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

Skupina výhodných sloučenin obecného vzorce (I) zahrnuje peptidové sloučeniny kde substituent X je vybrán ze skupiny zahrnující (a) Ri_a-Ao-Ai-A2^-A3-A4-A5-A6-A7-Ag-A9-_/ (b ) Ria^-A2 ^—A3-A4-A 5-Ag-A7-Ag-Ag- , (c) Rib^-A3—A4—A5—Ag—A7—As^-A9—, (d) Rla^-A4—A5 —Ag^-A₇ ^—Αθ —Ag^-, (e) R_la-A₅-Ag-A₇-A8-A9-, (f) R_la-As-A₇~A8-A9-, (g) Rla~A₇-Ag-Ag-, (h) R_la-A₈-A₉~, (i) Rla^—Ag^—, a (j) Ria;

substituent Y je vybrán ze skupiny zahrnující (a) ^_R3ř (b) ~A₂₈ —R3, (c) - A₂8~ A₂9^_ R3 r (d) - A₂8^_A29^_A30^-R3 z (e) - A₂8^_ A₂g^_ A30-A31 - R3, (f) - A28 - A29-A30 - A31-Ά32 - R3 , (g) - A₂8^_ A₂₉-A30 ^- A31^- A32 - A33 - R3, a (h) - A₂8^_ A₂g^_ A30-A31- A32- A33- A34- R3 ;

R_la je atom vodíku, alkylová skupina, aralkylová skupina nebo skupina -COR₂;

·· · ·· ·· · ·· · • · · · · ···· • « * · · « · · ·· · • · · · · · · · · · ·· ♦· ··· «·· ·· ··

R_lb je skupina R_ia nebo skupina obecného vzorce

R₂ je alkylové skupina, alkenylová skupina, alkínylová skupina, arylová skupina nebo aralkylová skupina;

R₃ je skupina obecného vzorce

A35-OR4 nebo A35-NR4R5 kde

R₄ a R5 jsou nezávisle na sobě atomy vodíku nebo nižší alkylové skupiny;

r₆ a Rg jsou nezávisle na sobě atomy vodíku nebo alkylové skupiny;

R₇ je alkylová skupina;

R₈ je atom vodíku, alkylová skupina nebo skupina obecného vzorce COR2;

R₁₀ je atom vodíku nebo atom halogenu;

R_u je alkylová skupina nebo aralkylová skupina;

···* ·· • · 9

9 9 • 9 9 9

9 9 9

9 9

Α_ο není přítomen nebo je peptid složený z jednoho až šesti aminokyselinových zbytků;

Αχ je Ser, Ala, Gly nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₂ je Ala, Val nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₃ je Ala, Ser, Gly nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₄ je Glu, Ala nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₅ je Ile, His, Ala nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₆ je Ala, Gin, Gly nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₇ je Ala, Leu nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₈ je Leu, Nle, Gly nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

Ag je His, Ala, Gly nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

Αχό je Ala, Asn, Gly, Lys, Asp nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

···· ·· • · · • · · • · · φ • · · · ·· ·· ·· ·· • · · · • · · φ • · · · · • · · · • · · · ·

	An	je Ala, Gly,
		aminokyselin
	Al2	je Ala nebo '
	Al3	je Ala, Gly :
		aminokyselin
	Al4	je Ala, Gly,
*·		ekvivalentní
	Ais	je Ala, Gly,
		ekvivalentní
	Al6	je Asn, Ala,
		ekvivalentní
	Al?	je Ala, Asp,
		ekvivalentní
	Al8	je Lys, nebo
	Al9	je Arg nebo '
-	A20	je Arg, nebo
*»	A21	je Arg, Lys,

je Ala nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina je Arg nebo Glu, nebo ekvivalentní aminokyselina aminokyselina;

A22 je Asp, Lys, Orn nebo Glu, nebo ekvivalentní aminokyselina;

• 4

444

444· 44

4 4 4 • · 4 • · 4 4

4 4 ·

44 4

Α₂₃ je Leu, Phe nebo Trp, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₂4 je Leu, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₂₅ je Arg, His, Asp, Lys nebo Glu, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₂6	je	Lys	nebo	His,	nebo	ekvivalentní	aminokyselina;
A₂7	je	Leu	nebo	Lys,	nebo	ekvivalentní	aminokyselina;
A28	je	Ile	nebo	Leu,	nebo	ekvivalentní	aminokyselina;
A₂9	je	Ala,	Asp,	Glu	nebo	Gin, nebo ekvivalentní

aminokyselina;

A30 je Asp, Lys nebo Glu, nebo ekvivalentní aminokyselina ;

A₃₁ je Ile, Leu nebo Val, nebo ekvivalentní aminokyselina ;

A₃₂ je His, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A33 je Asn nebo Thr, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A34 je Ala nebo Phe, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A35 není přítomen nebo je peptid složený z jedné až čtyř aminokyselin.

• Λ · ·· ·· £ · · φ ••9 · · ···!* « · · β · ······ • · · · · · · · « • · · * · · · · · · « φ · φ

Výše uvedené peptidové sloučeniny byly popsány ve zveřejněné mezinárodní přihlášce číslo WO 98/51324 jako sloučeniny mající užitečné vlastnosti, konkrétně vlastnosti využitelné ve farmacii. Tyto sloučeniny jsou užitečné pro léčbu chorobných stavů, které je možné zmírňovat sloučeninami, které se vážou k receptorům hormonu příštítné žlázy, přičemž současně dochází nebo nedochází ke stimulaci aktivity adenylcyklasy. Předmětný vynález se týká způsobu zlepšení postupu syntézy těchto peptidových sloučenin.

Syntéza cyklických peptidů na pevné fázi obvykle zahrnuje postupné přidávání aminokyselin k polymernímu nosiči pro syntézu peptidů, čímž jsou získávány peptidy vázané k polymernímu nosiči, které mají úplnou nebo částečnou aminokyselinovou sekvenci požadovaného cyklického peptidu. Po tomto stupni dochází k odchránění postranních řetězců aminokyselin, které mají být cyklizovány, a následné cyklizaci. Pokud dochází k cyklizaci před vytvořením úplné aminokyselinové sekvence, přidávají se k produktu zbývající aminokyseliny a výsledný peptid je následně uvolněn z polymerního nosiče a přečištěn.

Nicméně lineární přístup k přípravě peptidů, a k cyklickým peptidům obecně, je velmi často neúčinný a může být proto neefektivní z hlediska výrobních nákladů při přípravě velkého množství peptidu. V případě, že k syntéze peptidu dochází lineárním způsobem, snadnost čištění tohoto peptidu klesá s rostoucím počtem aminokyselinových zbytků obsažených ve struktuře daného peptidu. Navíc v případě cyklických peptidů se díky přípravě můstku(ů) mezi postranními řetězci, ke které dochází téměř na konci syntézy, přenášejí problémy související s přípravou uvedeného můstku mezi postranními řetězci na ·· *· • · · · * · · ···· • · · · · ···· ···« · ······ $ · · · · · ····

9 ·· 99 9 9 99 99 9 9 přípravu celého peptidu, přičemž tyto problémy zahrnují nízký výtěžek, vedlejší reakce a odstranění nečistot. Důsledkem této skutečnosti je, že zabudováním cyklické jednotky do struktury peptidu s dlouhým řetězcem dochází k nárůstu obtíží, ke kterým dochází při syntéze lineárních peptidů. Komerčně využitelný způsob syntézy cyklických analogů hPTH, jako je způsob popsaný ve zveřejněné mezinárodní přihlášce číslo WO 98/51324 a výše uvedených dokumentech, vyžaduje takový syntetický přístup, který překonává potíže spojené jak s délkou jednotlivých složek, tak s tím, že tyto složky jsou cyklické, a který by umožnil výrobu komerčně využitelných množství při výrobě léčiv. Předmětný vynález se týká účinnějšího způsobu výroby cyklických analogů hPTH a hPTHrP, přičemž tento způsob zahrnuje použití přemostěných a nepřemostěných strukturních fragmentů.

Podstata vynálezu

Předmětný vynález se týká způsobu výroby cyklických analogů hPTH a hTPHrP obecného vzorce (II)

kde

J, L, a M jsou lineární peptidové fragmenty,

Ki není přítomna nebo je cyklický peptidový fragment, a

K₂ je cyklický peptidový fragment;

přičemž tento způsob zahrnuje stupeň:

• · · · · · • · « • · 1 · · « tu · ·

Μ—( R ) (1) přípravy ^v/ postupným připojováním vhodně chráněných aminokyselinových zbytků k polymernímu nosiči za vzniku struktury (III) kde je polymer vhodný pro syntézu peptidů a je polypeptidový fragment (2) oddělené přípravy cyklického peptidového fragmentu (IV), jehož N-konec je chráněný a jehož příprava zahrnuje běžně používaný způsob syntézy peptidů

PHN^ ^CO„H K₂ ² (IV) kde

P je skupina vhodná pro chránění aminokyseliny, (3) spojení fragmentů (III) a (IV) za vzniku peptidu obecného vzorce (V)

PHN

• · 4 · • · 4 · · 4 4 4 4 4 9 • •4 4 4 9 9 9 9

9 44 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 99 9 99 44 44 (4) pokud skupina K₂ není přítomna, potom (a) uvedený způsob zahrnuje přípravu polypeptidových fragmentů J a L ve formě jediného polypeptidu obecného vzorce (VI)

PHfKy/L

CO₂H (VI) a spojení polypeptidu obecného vzorce (VI) s peptidem obecného vzorce (V) za vzniku peptidu obecného vzorce (VII)

(VII) nebo případně (b) postupné přidávání ochráněných jednotlivých aminokyselinových prvků polypeptidů J a L k peptidovému fragmentu obecného vzorce (V) , nebo případně (c) oddělenou přípravu jedné nebo obou skupin J a L ve formě peptidových fragmentů a jejich spojení s rostoucím peptidem, jehož řetězec začíná fragmentem obecného vzorce (V), (5) pokud skupina Ki je přítomna, potom (a) uvedený způsob zahrnuje oddělenou přípravu polypeptidového fragmentu obecného vzorce (VIII)

PHN^ ^CO,H Kf ² (VIII) ·· · · kde

P je skupina vhodná pro chránění aminoskupiny, přičemž tato příprava probíhá běžně používaným způsobem syntézy peptidů;

(b) přípravu peptidového fragmentu obecného vzorce (IX)

PHN. ^CO.H

L ² (IX) a jeho spojování s peptidovým fragmentem obecného vzorce (V) za vzniku peptidového fragmentu obecného vzorce (X) ^PHN·^^ a (c) spojení cyklického peptidového fragmentu (VIII) s peptidovým fragmentem obecného vzorce (X) za vzniku peptidového fragmentu obecného vzorce (XI)

PHN

(XI) (d) přípravu fragmentu obecného vzorce (XII)

PHN. _ZCO,H (XII) který je následně spojován s fragmentem obecného vzorce (XI) a • · · · • · » « • · ·

9 99 9

9 9 9 9 • 9 9 9 9 9

9 9 9 9

999 99 99 (6) odštěpení polymerního nosiče a chránících skupin.

Při způsobu podle předmětného vynálezu jsou cyklické peptidové fragmenty připravovány odděleně a následně spojovány s polymerním nosičem nebo peptidem vázaným k polymernímu nosiči. Oddělená příprava cyklického peptidového fragmentu umožňuje konvergentní syntézu peptidů vázaných k polymernímu nosiči, což vede ke zvýšení výtěžku a vyrobeného množství výsledného cyklického peptidu. Problémy spojené s přípravou přemostěných fragmentů jsou v tomto případě omezeny na menší peptidové podjednotky, které je možné přečistit před jejich spojováním s nosičem vhodným pro syntézu na pevné fázi. Uskutečňování tohoto způsobu při přípravě některých výhodných analogů hPTH a hPTHrP vyžaduje syntézu nových peptidových fragmentů a novou sekvenci jednotlivých stupňů.

Pokud není uvedeno jinak, mají následující pojmy použité výše i v následujícím textu níže uvedený význam.

Pojmem „alkylová skupina se rozumí uhlovodíková skupina, která může být lineární nebo větvená, a která může obsahovat ve svém řetězci od přibližně 1 do přibližně 20 atomů uhlíku. Pojmem větvená se rozumí, že k lineárnímu alkylovému řetězci je připojena jedna nebo více nižších alkylovýcn skupin. Pojmem „nižší alkylová skupina se rozumí alkylová skupina obsahující od přibližně 1 do 4 atomů uhlíku, která může být lineární nebo větvená. Jako příklad alkylové skupiny je možné uvést methylovou skupinu, ethylovou skupinu, n-propylovou skupinu, isopropylovou skupinu, n-butylovou skupinu, sek. butylovou skupinu, isobutylovou skupinu a terč. butylovou skupinu apod.

·· • · · • · · • · · • ·

Pojmem „alkenylová skupina se rozumí alifatická uhlovodíková skupina obsahující dvojnou vazbu mezi atomy uhlíku, která může být lineární nebo větvená, a která může obsahovat ve svém řetězci od přibližně 2 do přibližně 20 atomů uhlíku. Pojmem „nižší alkenylová skupina se rozumí alkenylová skupina obsahující od přibližně 2 do 4 atomů uhlíku, která může být lineární nebo větvená. Jako příklad alkenylové skupiny je možné uvést ethenylovou skupinu, propenylovou skupinu, n-butenylovou skupinu, isobutenylovou skupinu,

3-methylbut-2-enylovou skupinu, n-pentenylovou skupinu, heptenylovou skupinu, oktenylovou skupinu, cyklohexylbutenylovou skupinu a decenylovou skupinu.

Pojmem „alkinylová skupina se rozumí uhlovodíková skupina obsahující trojnou vazbu mezi atomy uhlíku, která může být lineární nebo větvená, a která může obsahovat ve svém řetězci od přibližně 2 do přibližně 20 atomů uhlíku. Pojmem „nižší alkinylová skupina se rozumí alkinylová skupina obsahující od přibližně 2 do 4 atomů uhlíku, která může být lineární nebo větvená. Jako příklad alkinylové skupiny je možné uvést ethinylovou skupinu, propinylovou skupinu, n-butinylovou skupinu, 3-methylbut-2-inylovou skupinu, n-pentínylovou skupinu, heptinylovou skupinu, oktinylovou skupinu a decinylovou skupinu.

Pojmem „alkylenová skupina se rozumí dvojvazná skupina odvozená od lineárního nebo větveného řetězce nasyceného uhlovodíku tak, že jsou z tohoto řetězce odštěpeny dva atomy vodíku. Jako konkrétní příklad je možné uvést methylenovou skupinu, 1,2-ethylenovou, 1,1-ethylenovou skupinu,

1,3-propylenovou skupinu, 2,2-dimethylpropylenovou skupinu apod.

• · • · • ·

Pojmem „fenylalkylová skupina se rozumí fenylová skupina, která je vázána k základnímu řetězci molekuly přes alkylenovou skupinu. Uvedená alkylenová skupina výhodně obsahuje od přibližně 1 do přibližně 7 atomů uhlíku. Jako konkrétní příklad takovéto skupiny je možné uvést benzylovou skupinu,

2-fenylethylovou skupinu, 2-propylfenylovou skupinu apod.

Pojmem „skupina chránící aminoskupinu se rozumí snadno odštěpítelná skupina, která se v dané oblasti techniky používá pro ochránění aminoskupiny proti nežádoucí reakci během syntetických postupů, a kterou je možné selektivně odštěpit.

V dané oblasti techniky je dobře známé použití N-chránících skupin pro chránění skupin proti nežádoucím reakcím během syntézního postupu a mnoho těchto chránících skupin je popsáno například v publikaci T. H. Greene a P. G. M. Wuts: Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydání, John Wiley & Sons, New York (1991), která je zde zahrnuta jako odkazový materiál. Skupina výhodně používaných N-chránících skupin zahrnuje acylové skupiny, jako je formylová skupina, acetylová skupina, chloracetylová skupina, trichloracetylová skupina, o-nitrofenylacetylová skupina, o-nítrofenoxyacetylová skupina, trifluoracetylová skupina, acetoacetylová skupina,

4-chlorbutyrylová skupina, isobutyrylová skupina, o-nitrocinnamoylová skupina, pikolinoylová skupina, acylisothiokyanátová skupina, aminokaproylová skupina, benzoylová skupina apod.; acyloxyskupiny, jako je methoxykarbonylová skupina, 9-fluorenylmethoxykarbonylová skupina, 2,2,2-trifluorethoxykarbonylová skupina, 2-trimethylsilylethoxykarbonylová skupina, vinyloxykarbonylová skupina, allyloxykarbonylová skupina, terč. butyloxykarboriylová skupina (BOC), • · • · » · · fl • · « ·

1,1-dimethylpropinyloxykarbonylová skupina, benzyloxykarbonylová skupina (CBZ), p-nitrofenylsulfinylová skupina, p-nitrobenzyloxykarbonylová skupina,

2,4-dichlorbenzyloxykarbonylová skupina, allyloxykarbonylová skupina (Alloc) apod.

Pojmem „aminokyselina se v tomto popisu rozumí aminokyselina vybraná ze skupiny zahrnující přírodní a syntetické aminokyseliny definované v tomto textu. Uvedené aminokyseliny mohou podle substituentů obsažených v postranním řetězci být neutrální nebo mohou nést kladný nebo záporný náboj. Pojmem „neutrální aminokyselina se rozumí aminokyselina obsahující v postranním řetězci nenabité substituenty. Jako konkrétní příklad neutrální aminokyseliny je možné uvést alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, tryptofan, methionin, glycin, serin, threonin a cystein. Pojmem „kladně nabitá aminokyselina se rozumí aminokyselina obsahující v postranním řetězci substituenty, které jsou při fyziologické hodnotě pH kladně nabity. Jako konkrétní příklad kladně nabité aminokyseliny je možné uvést lysin, arginin a histidin. Pojmem „záporně nabitá aminokyselina se rozumí aminokyselina obsahující v postranním řetězci substituenty, které jsou při fyziologické hodnotě pH záporně nabity. Konkrétními příklady záporně nabité aminokyseliny jsou kyselina aspartová a kyselina glutamová. Výhodnými aminokyselinami jsou α-aminokyseliny. Ještě výhodnějšími aminokyselinami jsou a-amínokyseliny s konfigurací L na α-atomu uhlíku.

Pojmem „aminokyselinový zbytek se rozumí jednotlivá aminokyselinová jednotka zabudovaná do struktury peptidu nebo peptidového fragmentu.

Pojmem „přírodní aminokyselina se' rozumí a-aminokyselina vybraná ze skupiny zahrnující alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, tryptofan, methionin, glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin, glutamin, lysin, arginin, histidin, kyselinu aspartovou a kyselinu glutamovou.

Pojmem „syntetická aminokyseliny se rozumí aminokyselina, pro kterou neexistuje kodon nukleové kyseliny. Jako příklad syntetické kyseliny je možné uvést D-izomery přírodních α-aminokyselin uvedených výše; Aib (kyselinu aminomáselnou), bAib (kyselinu 3-aminoisomáselnou), Nva (norvalin), β-Ala, Aad (kyselinu 2-aminoadipovou), bAad (kyselinu 3-aminoadipovou), Abu (kyselinu 2-aminomáselnou), Gaba (kyselinu γ-aminomáselnou), Acp (kyselinu 6-aminokapronovou), Dbu (kyselinu 2,4-diaminomáselnou), kyselinu a-aminopimelovou,

TMSA (trimethylsilyl-Ala), alle (allo-isoleucín),

Nle (norleucin) , terč. Leu, Cit (citrulin), Orn, Dpm (kyselinu 2,2'-diaminopimelovou), Dpr (kyselinu 2,3-diaminopropionovou), a- nebo β-Nal, Cha (cyklohexyl-Ala), hydroxyprolin,

Sar (sarkosin) apod.; cyklické aminokyseliny; N“-alkylované aminokyseliny, jako je MeGly (N“-methylglycin),

EtGly (N^a-ethylglycin) a EtAsn (N“-ethylasparagin); a aminokyseliny, ve kterých α-atom uhlíku nese dva substituenty tvořící postranní řetězce.

Pojmem „ekvivalentní aminokyselina se rozumí aminokyselina, kterou může být nahrazena jiná aminokyselina v peptidech podle předmětného vynálezu, přičemž touto záměnou nedojde ke znatelné ztrátě funkce tohoto peptidu. Při provádění takovýchto změn se záměna podobných aminokyselin provádí na základě vzájemné podobnosti substituentů obsažených v postranním řetězci spočívající například v jejich velikosti, náboji, hydrofilícitě, hydropaticitě a hydrofobicitě, jak je popsáno v tomto textu.

·· ··

Jak bylo podrobně popsáno v patentu Spojených států amerických číslo US 4 554 101, který je zahrnutý v tomto textu jako odkazový materiál, byly různým aminokyselinovým zbytkům přiřazeny následující hodnoty hydrofilicity: Arg (+3,0);

Lys (+3,0); Asp (+3,0); Glu (+3,0); Ser (+0,3); Asn (+0,2);

Gin (+0,2); Gly (0); Pro (-0,5); Thr (-0,4); Ala (-0,5);

His (-0,5); Cys (-1,0); Met (-1,3); Val (-1,5); Leu (-1,8);

Ile (-1,8); Tyr (-2,3); Phe (-2,5); a Trp (-3,4). Rozumí se, že aminokyselinový zbytek je možné zaměnit jiným aminokyselinovým zbytkem s podobnou hodnotou hydrofilicity (jejíž hodnota se neliší například o ± 2,0), přičemž je stále získáván biologicky ekvivalentní polypeptid.

Podobným způsobem je možné provádět tyto záměny na základě podobností hydropatíckých indexů. Každému aminokyselinovému zbytku byl přiřazen hydropatický index na základě hydrofobicity daného aminokyselinového zbytku a jeho náboje. Konkrétně mají jednotlivé aminokyselinové zbytky následující hodnoty hydropatíckých indexů: Ile (+4,5); Val (+4,2);

Leu (+3,8); Phe (+2,8); Cys (+2,5); Met (+1,9); Ala (+1,8);

Gly (-0,4); Thr (-0,7); Ser (-0,8); Trp (-0,9); Tyr (-1,3);

Pro (-1,6); His (-3,2); Glu (-3,5); Gin (-3,5); Asp (-3,5);

Asn (-3,5); Lys (-3,9) a Arg (-4,5). Při provádění záměn na základě podobnosti hydropatíckých indexů je výhodné, aby se tyto indexy lišily v rozmezí ± 2,0.

Pojmem „peptid a „polypeptid se rozumí polymer, ve kterém jsou monomerními jednotkami aminokyselinové zbytky vzájemně spolu spojené amidovými vazbami. Výhodnými peptidy podle předmětného vynálezu jsou takové peptidy, jejichž struktura zahrnuje cť-aminokyseliny. Ještě výhodnější peptidy podle předmětného vynálezu zahrnují ve své struktuře «-aminokyseliny se stereochemickou konfigurací L na a-atomu • · · · • · 9 9 · ······ • · · · 9 * · · · φ ·· ·9· ··· 99 ·· uhlíku.

Pojmem „cyklický peptid se rozumí peptid obsahující jeden nebo více cyklických peptidových fragmentů definovaných v tomto textu.

Pojmem „peptidový fragment se rozumí peptidová podjednotka základního peptidu. Pojem „peptidový fragment může zahrnovat lineární, větvenou nebo cyklickou podjednotku cílového peptidu.

Pojmem „lineární peptid se rozumí peptid nebo polypeptid, ve kterém jsou aminokyseliny vzájemně pospojovány amidovými vazbami mezi N-koncem jedné a C-koncem druhé aminokyseliny.

Pojmem „rozvětvený peptid se rozumí peptid nebo polypeptid, ve kterém je jeden nebo více stavebních prvků tvořen aminokyselinou nesoucí v postranním řetězci karboxylovou skupinu nebo aminoskupinu, přičemž takováto aminokyselina je vázána k dalšímu peptidovému substituentu přes tyto postranní řetězce.

Pojmem „cyklický peptidový fragment se rozumí peptidový fragment definovaný v tomto textu, ve kterém je substituent jednoho aminokyselinového zbytku spojen se substituentem jiného aminokyselinového zbytku obsaženého v uvedeném peptidovém fragmentu. K vazbě dochází výhodně mezi postranními řetězci dvou aminokyselinových zbytků obsažených v uvedeném peptidovém fragmentu, výhodně je touto vazbou esterová, amidová, disulfidová nebo lanthioninová vazba. Vazba mezi dvěma aminokyselinovými řetězci je v tomto textu označována značkou l I

Uvedená esterová, amidová, disulfídová nebo lanthioninová vazba spojující dva aminokyselinové zbytky uvedeného

9· cyklického peptidu je tvořena mezi funkčními skupinami obsaženými v jednotlivých postranních řetězcích. Takto tedy dochází k tvorbě amidové vazby mezi karboxylovou skupinou obsaženou v postranním řetězci kyselého aminokyselinového zbytku a aminoskupinou obsaženou v postranním řetězci bazického aminokyselinového zbytku; k tvorbě esterové vazby dochází mezi karboxylovou skupinou obsaženou v postranním řetězci kyselého aminokyselinového zbytku a hydroxyskupinou obsaženou v postranním aminokyselinového zbytku; k tvorbě disulfidů dochází mezi aminokyselinovými zbytky obsahujícími v postranním řetězci sulfhydrylové skupiny; a k tvorbě lanthioninových můstků dochází desulfurací odpovídajícího disulfidu.

Počet atomů obsažených v můstku vzniklém při shora popsané tvorbě amidové, esterové, disulfidové nebo lanthioninové vazby se mění podle délky postranního řetězce a typu vazby (tj. podle toho, zda se jedná o amidovou, esterovou, disulfidovou nebo lanthioninovou vazbu). Uvedený můstek tak výhodně obsahuje od 2 do 12 atomů, výhodněji od 6 do 10 atomů. Nej výhodněji obsahuje můstek 7 atomů, přičemž takovýto můstek výhodně obsahuje amidovou vazbu mezi funkčními skupinami obsaženými v postranních řetězcích zbytků Lys a Asp.

Pojmem „polymerní nosič se rozumí pevný nosič modifikovaný reaktivními skupinami tak, že tento pevný nosič může reagovat s karboxylovým koncem nebo N-koncem aminokyseliny, peptidu nebo cyklického peptidového fragmentu. Jako konkrétní příklad polymerního nosiče je možné uvést polymerní nosič Merrifield (což je chiormethylovaný polystyren), hydroxymethylový polymerní nosič,

2-chlortritylchloridový polymerní nosič, tritylchloridový polymerní nosič, kyselinový polymerní nosič Rink ···· • 4 44

4 4 4

4 4 4 • 4 44 4 444 44 4 •444 4 4 4444 • 4 44 444 ··· 44 44 (což je 4-benzyloxy-2',4'-dimethoxybenzhydrolový polymerní nosič), tritylalkoholový polymerní nosič, polymerní nosič PAM (což je 4-hydroxymethyl-fenylacetamidomethylový polymerní nosič), polymerní nosič Wang (což je p-benzyloxybenzylalkoholová pryskyřice), MBHA polymerní nosič (což je p-methylbenzhydrylaminový polymerní nosič) , BHA polymerní nosič (což je benzhydrylaminový polymerní nosič), amidový polymerní nosič Rink (což je 4- (2',4'-dimethoxyfenyl-Fmoc-aminomethyl)fenoxylový polymerní nosič) a polymerní nosič PAL (což je kombinace kyseliny 5-(4-Fmoc-aminomethyl-3,5-dimethoxyfenoxy)valerové-MBHA polymerního nosiče). -Skupina výhodných polymerních nosičů zahrnuje chlortritylový polymerní nosič, kyselinový polymerní nosič Rink a amidový polymerní nosič Rink.

Pojmem „pevný nosič se rozumí podkladový materiál, který je inertní k reakčním činidlům a reakčním podmínkám popsaným v tomto textu, který je zároveň v podstatě nerozpustný v použitém médiu. Jako příklad pevného nosiče je možné uvést anorganické podkladové materiály, jako je křemelina, silikagel a porézní sklo s regulovanou velikostí pórů; organické polymery, jejichž skupina zahrnuje polystyren, včetně 1 až 2 procentního ko-polystyrendivinylbenzenu (gelové formy) a 20 až 40 procentního kopolystyrendivinylbenzenu (makroporézní formy), polypropylen, polyethylenglykol, polyakrylamid, celulosu apod.; a směsné anorganicko-polymerní kompozice, jako je polyakrylamid nanesený do matrice tvořené částicemi křemeliny. Podrobnější informace je možné nalézt v publikaci J. M. Steward a J. D. Young: Solid Phase Peptide Synthesis,

2. vydání, Pierce Chemical Co. (Chicago, IL, 1984).

Dále pojem „pevný nosič zahrnuje shora popsaný pevný nosič, který je připojen k druhému inertnímu nosiči, jako jsou φφ φ φφ φφ φ φφ · φφ φ φ φφφφ φφφφ φ φφφφφφ φφφφ φ φ φφφφ φφ φφ φφφ φφφ φφ φφ částice popsané v publikaci: Technical Manual, Multipin® SPOC, Chiron Technologies (1995) a v odkazových materiálech uvedených v této publikaci, který je tvořen oddělitelnými svrchními vrstvami na bázi polyethylenu nebo polypropylenu roubovaného methakrylátovým kopolymerem funkcionalizovaným aminoskupinami a inertním jádrem.

Dále pojem „pevný nosič zahrnuje polymerní nosiče, jako jsou polyethylenglykolové nosiče popsané v publikaci: Janda a spolupracovníci, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 6419-6423 (1995) a ve zveřejněné mezinárodní přihlášce číslo WO 95/16918 (S. Brenner), které jsou rozpustné v mnoha rozpouštědlech, ale které je možné vysrážet z roztoku přidáním srážecího rozpouštědla.

Názvy přírodních a syntetických aminokyselin a jejich zbytků používané v tomto popisu dodržují pravidla stanovená Názvoslovnou komisí pro organickou chemii IUPAC (IUPAC Commision on the Nomenclature of Organic Chemistry) a Komisí pro biochemické názvosloví IUPAC-IUB (IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature), která byla publikována v publikaci „Nomenclature of α-Amino Acids (Recommedations, 1974) Biochemistry, 14(2), (1975). V rozsahu, ve kterém se názvy a zkratky aminokyselin a jejich zbytků použité v tomto popisu a připojených patentových nárocích liší od těchto názvů, budou tyto odlišné názvy a zkratky vysvětleny.

Jeden z peptidů podle tohoto vynálezu je označován například jako cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Ala¹, Nle⁸, Lys¹⁸, Asp²²,

Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂, přičemž aminokyselinové zbytky v závorce následující za slovem „cyklo jsou spojené a aminokyseliny z přírodní sekvence uvedené v závorce jsou substituované.

Zkratkou hPTH jsou označovány lidské hormony příštítné žlázy (PTH) a zkratkou PTHrP jsou označovány proteiny související • ·· · ·· • · · • · · • · · · • · · · • · · · ·· ·· • · · · • · · · • · · · · • 9 · · ·· ·· ve druhé závorce se obsažených ve začíná od N-konce

^E JE) s lidskými hormony příštítné žlázy. Čísla vztahují k počtu aminokyselinových zbytků struktuře peptidu, přičemž toto číslování (tj. v tomto případě označuje prvních 31 aminokyselin hPTH).

Jak je znázorněno na schématu 1, příprava cyklického peptidu vázaného k polymernímu nosiči zahrnuje připojení cyklického a necyklického peptidového fragmentu k polymernímu nosiči, k aminokyselině vázané k polymernímu nosiči nebo k peptidu vázanému k polymernímu nosiči.

Schéma 1

Standardní způsob adice Odchránění N-konce p_HN-Q-HN^

PHN^/CChH '^E Ί® ’ PHN-Q-CO₂H kde je polymerní nosič vhodný pro syntézu peptidu,

T je skupina H2N a aminokyselina, nebo cyklický nebo acyklický peptid,

E a Q jsou nezávisle na sobě aminokyseliny chráněné na N-koncích, nebo cyklické nebo acyklické peptidové fragmenty chráněné na N-koncích.

K adici výhodně dochází mezi karboxylovým koncem uvedeného peptidového fragmentu a polymerním nosičem, aminokyselinou vázanou k polymernímu nosiči nebo peptidem vázaným k polymernímu nosiči. Pokud je peptidový fragment adován k aminokyselině vázané k polymernímu nosiči nebo k peptidu, dochází k adici výhodně prostřednictvím amidové vazby mezi ······ « « ·· »· • » · ·· ·· Λ « * · • · 9 · t · · · · • · · ♦ * ····«· ···· · t ···· ·· «· ··· ·*4 ·· ·· karboxylovým koncem uvedeného cyklického peptidového fragmentu a N-koncem aminokyseliny vázané k polymernímu nosiči nebo peptidu.

Aby došlo k uvedené adiční reakci, musí být karboxylové skupina uvedeného peptidového fragmentu aktivována. Při prováděni předmětného vynálezu je možné používat mnoho způsobů aktivace, jejichž skupina zahrnuje například použití předem připravených symetrických anhydridů (PSA), předem připravených směsných anhydridů (PMA), chloridů kyselin, aktivních esterů a in šitu aktivace karboxylové kyseliny, jak popsali Fields a Noble v roce 1990 v publikaci „Solid phase peptide synthesís utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids, Int. J.

Pept. Protein Res. 35:161-214.

Skupina konkrétních aktivačních činidel zahrnuje isopropylchlorformiát, diisopropylkarbodiimid (DIC), diisopropylkarbodiimid (DIC) smíchaný s 1-hydroxybenzotriazolem (HOBT), 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid (EDC), bis (2-oxo-3-oxazolidinyl)fosfonylchlorid (BOP-C1), benzotriazol-l-yloxy-tris((dimethylamino)fosfonium)hexafluorfosfát (BOP), benzotriazol-l-yloxy-trispyrrolidinfosfoniumhexafluorfosfát (PyBOP), brom-tris-pyrrolidinfosfoniumhexafluorfosfát (PyBROP), 0-(7-azabenzotriazol-lyl)-N,N, N ', N '-tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HATU),

2-(lH-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborát (TBTU), 2-(ΙΗ-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HBTU),

2-[2-oxo-l-(2H)-pyridyl]-1,1,3,3-bispentamethylenuroniumtetrafluorborát (TOPPipU), N,N'-dicyklohexylkarbodiimid (DCC), N,N'-dicyklo-hexylkarbodiimid (DCC) smíchaný s 1-hydroxybenzotriazolem (HOBT) apod. Skupina rozpouštědel vhodných pro uvedenou adiční reakci zahrnuje dichlormethan, « · · · · · * · · · ·· © · ·· · ··· »» · »

N,N-dimethylformamid (DMF), dimethylsulfoxid (DMSO), toluen, tetrahydrofuran (THF) apod. Doba trvání adiční reakce se pohybuje od přibližně 1 hodiny do 48 hodin v závislosti na druhu polymerního nosiče a derivátu karboxylové kyseliny, které mají být vzájemně spojeny, aktivačního činidla, rozpouštědla a teplotě. Adiční reakce probíhá při teplotě od přibližně -10 °C do přibližně 50 °C, výhodně při teplotě místnosti.

Aby se předešlo rušení průběhu shora popsané adiční reakce, N-konec uvedeného cyklického peptidového fragmentu je chráněn skupinou citlivou na kyselinu nebo zásadu. Takovéto chránící skupiny by měly být stabilní za podmínek vytváření amidové vazby, přičemž by měly být snadno odštěpitelné bez toho, že by došlo ke zničení rostoucího peptidového řetězce nebo racemizaci kteréhokoli chirálního centra obsaženého v tomto řetězci. Skupina vhodných chránících skupin zahrnuje 9-fluorenylmethyloxykarbonylovou skupinu (Fmoc), terč. butyloxykarbonylovou skupinu (Boc), benzyloxykarbonylovou skupinu (Cbz), bifenylisopropyloxykarbonylovou skupinu, terč. amyloxykarbonylovou skupinu, isobornyloxykarbonylovou skupinu, (a,a)dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxykarbonylovou skupinu, o-nitrofenylsulfenylovou skupinu,

2-kyano-terc. butyloxykarbonylovou skupinu apod. Výhodnou chránící skupinou je 9-fluorenylmethyloxykarbonylová skupina (Fmoc) .

Podobně může být nezbytné ochránit jakoukoli reaktivní funkční skupinu obsaženou v postranním řetězci uvedeného cyklického peptidového fragmentu. Skupina zvlášť výhodných chránících skupin používaných pro chránění aminoskupin obsažených v postranním řetězci lysinu a argininu zahrnuje

9 • 9 ·· · ·

9 9 · · 9

9« 9* • · • 9 9 9 9 «

2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonylovou skupinu (pmc), nitroskupinu, p-toluensulfonylovou skupinu,

4-methoxybenzensulfonylovou skupinu, benzyloxykarbonylovou skupinu (Cbz), terč. butyloxykarbonylovou skupinu (Boc), allyloxykarbonylovou skupinu (Alloc) a adamantyloxykarbonylovou skupinu; skupina chránících skupin používaných pro chránění funkčních skupin obsažených v postranním řetězci tyrosinu zahrnuje benzylovou skupinu, o-brombenzyloxykarbonylovou skupinu, 2,6-dichlorbenzylovou skupinu, isopropylovou skupinu, terč. butylovou skupinu (tBu), cyklohexylovou skupinu, cyklopentylovou skupinu a acetylovou skupinu (Ac); skupina chránících skupin používaných pro chránění funkčních skupin obsažených v postranním řetězci šeřinu zahrnuje terč. butylovou skupinu, benzylovou skupinu a tetrahydropyranylovou skupinu; skupina chránících skupin používaných pro chránění funkčních skupin obsažených v postranním řetězci histidinu zahrnuje tritylovou skupinu, benzylovou skupinu, benzyloxykarbonylovou skupinu (Cbz), p-toluensulfonylovou skupinu a 2,4-dinítrofenylovou skupinu; skupina chránících skupin používaných pro chránění funkčních skupin obsažených v postranním řetězci tryptofanu zahrnuje formylovou skupinu a terč. butyloxykarbonylovou skupinu (Boc); skupina chránících skupin používaných pro chránění funkčních skupin obsažených v postranním řetězci asparaginu a glutaminu zahrnuje tritylovou skupinu (Trt); skupina chránících skupin používaných pro chránění funkčních skupin obsažených v postranním řetězci kyseliny aspartové a kyseliny glutamové zahrnuje O-terc. butylovou skupinu (OtBu) a O-allylovou skupinu a O-benzylovou skupinu.

K adici uvedených fragmentů k polymernímu nosiči nebo k peptidu vázanému k polymernímu nosiči dochází výhodně při

teplotě místnosti v přítomnosti 2 molárních ekvivalentů (vzhledem k polymernímu nosiči) peptidového fragmentu ochráněného 9-fluorenylmethyloxykarbonylovou skupinou (Fmoc), který je aktivovaný přibližně ekvimolárním množstvím benzotriazolyloxy-tris[pyrrolidino]-fosfoniumhexafluoracetátu (PyBOP) a hydrátu hydroxybenzotriazolu v přítomnosti přibližně 4 ekvivalentů diisopropylethylaminu v dimethylformamidu během 16 až 48 hodin.

Dokončení adiční reakce by mělo být spolehlivě stanoveno. Odborníkovi v dané oblasti jsou dostatečně známé monitorovací testovací metody, při kterých se používají různá činidla, jejichž skupina zahrnuje ninhydrin (tzv. Kaiserův test), kyselinu pikrovou, kyselinu 2,4,6-trinitrobenzensulfonovou (TNBS), fluorescamin a chloranil, přičemž metody využívající tato činidla jsou založené na reakci daného činidla s volnou aminoskupinou za vzniku chromoforní sloučeniny. Pokud se používají iminokyseliny (např. Pro nebo Hyp) je výhodně pro monitorování využívána metoda používající isatin. Podrobněji tyto metody popsali Fields a Noble ve shora uvedené publikaci. Kvantifikaci dokončení reakce je možné monitorovat během probíhající reakce např. způsobem popsaným ve zveřejněné mezinárodní přihlášce číslo WO 91/03485 (Salisbury a spolupracovníci).

Při syntéze, při které se používají sloučeniny ochráněné 9-fluorenylmethyloxykarbonylovou skupinou (Fmoc), se výhodně používá Kaiserův test a metoda založená na použití kyseliny 2,4,6-trínítrobenzensulfonové (TNBS). Při Kaiserově testu je možné vzorek peptidu vázaného k polymernímu nosiči testovat ninhydrinovým činidlem dodávaným firmou Píerce Chemical, způsobem popsaným v publikaci: Sarin a spolupracovnicí, 1981, Anal. Biochem. 117:147-157, Podobně je možné vzorek peptidu • 9

9 9

9 9 9 • ·9

9 φυ vázaného k polymernímu nosiči testovat pomocí kyseliny trinitrobenzensulfonové (TNBS) dostupné od firmy Fluka, způsobem popsaným v publikaci: Takajashi, 1984, Chem. Lett. 1:127.

Pokud ze stanovení provedeného některým z uvedených testů vyplývá, že adiční reakce není dokončena, je možné reakci posunout směrem k dokončení několika způsoby, které jsou oborníkovi v dané oblasti dostatečně známé, a jejichž skupina zahrnuje (a) opakovanou adici v přítomnosti jedno- až pětinásobného přebytku chráněné aminokyseliny, (b) opakovanou adici v přítomnosti jiného rozpouštědla nebo v přítomnosti dalšího rozpouštědla (např. trifluorethanu) nebo (c) přidávání chaotropní soli, např. chloristanu sodného (NaC10₄) nebo bromidu lithného (LiBr), a které byly popsány v publikaci:

Klis a Steward, 1990, „Peptides: Chemistry, Structure and Biology, editoři Rivier a Marshall, ESCOM Publ., str. 904906.

Při výhodném provedení předmětného vynálezu je možné cyklický peptidový fragment vázaný k polymernímu nosiči znázornit obecným vzorcem (II)

P A Α,_χ A,₉ AŤg-ATj-AjŤ-B—C—D— (II) kde je polymerní nosič;

P je skupina chránící aminoskupinu;

· • · t

9· « 9 9

9 · * « · 9 9 tt 99 I · · » · ·

I · · >> · 9

9 to · buď není přítomna nebo je jí skupina obecného vzorce —Αη-Α—A—Aj^-A— ;

je skupina obecného vzorce -A₂₃-A₂4-A₂5-;

je skupina obecného vzorce -A₂6-A27-A_2g-A29-A₃₀-; a je skupina -A_3i-, skupina -A₃i-A₃₂-, skupina -A₃i-A₃₂-A33- nebo skupina -A31-A32-A33-A34-;

kde je laktamový, esterový, disulfidový nebo lanthioninový můstek;

A13, An, Ais, A₂₂ jsou aminokyselinové zbytky;

A14 je His (Trt) nebo Ser(tBu);

A15 a A₂₈ jsou nezávisle na sobě Ile nebo Leu; Ser(tBu) nebo Leu;

A15	je	Asn	(Trt)	nebo	Gin (	Trt) ;
A19	je	Arg	(Pmc)	nebo	Glu (	OtBu);
A₂o	je	Arg	(Pmc)	Λ
A21	je	Arg(Pmc)	nebo	Val;

«φφφ φ φ φ φ φ φφφ • φ · φ • · · · « φ · φ φφφ φ

A-23	je Phe nebo Trp(Boc);
A24	je Leu;
A25	je Arg(Pmc) nebo His (Trt);
A26 a A30	jsou aminokyselinové zbytky, ve

kterých jsou postranní řetězce k₂e a A30 spolu případně spojeny amidovou, disulfidovou nebo lanthionínovou vazbou;

A27	je	Leu	nebo	Lys(Boc);
A29	je	Ala	nebo	Gin(Trt);
A31	je	Ile	nebo	Val;
A32	je	His	(Trt);
A33	je	Asn (Trt)	nebo Thr(
A34	je	Ala	nebo	Phe.

V dalším výhodném provedení předmětného vynálezu je možné cyklický peptidový fragment vázaný k polymernímu nosiči znázornit obecným vzorcem (II),

• 9 ΦΦ Φ Φ Φ

Φ Φ ΦΦΦ • φ Φ Φ Φ Φ

Φ * ΦΦΦ • · · ΦΦΦ ΦΦ Φ· kde je laktamový můstek a postranní řetězce

A₂6 a A30 jsou spolu případně spojeny amidovou vazbou.

V dalším výhodném provedení předmětného vynálezu je možné cyklický peptidový fragment vázaný k polymernímu nosiči znázornit obecným vzorcem (II), kde je laktamový můstek;

A13 a Ais

Aj7 a A22

A26

A30

A26 a A30 jsou Lys;

jsou Asp;

je Lys(Boc); a je Asp(OtBu); nebo postranní řetězce jsou spolu případně spojeny amidovou vazbou.

V dalším výhodném provedení předmětného vynálezu je možné cyklický peptidový fragment vázaný k polymernímu nosiči znázornit obecným vzorcem (III),

Fmoc A|_g Ajp A2Q A2] A22 A22 A24 A_2J A^^ A^^ A2g A^g Α^θ Ajj (iT) (III)

9999 99

φ 99 99 »9 9999 • ♦ 9 · «

9 9 9 9 »

9 9 9 9 · 9 ·9 9· kde

	je laktamový můstek;
Aig	je Lys;
Ai9	je Glu(OtBu);
A20	j e Arg(Pmc);
A21	je Val;
A₂₂	je Asp;
A23	je Trp(Boc);
A24	je Leu;
a₂₅	je Arg(Pmc);
A₂6	je Lys(Boc);
A₂₇	je Leu;
A₂8	j e Leu;
A₂9	je Gln(Trt);
A30	je Asp(OtBu);
A₃i	je Val.

• · · « • · · • · · · • 9 9 9

9 · · · · ·· « · · 9

9 9 9 o 9 9 9 9

9 9 9

Peptid vázaný k pevnému nosiči podle předmětného vynálezu připravený shora popsaným postupem může být dále zpracováván, například spojením s jedním nebo více dalšími cyklickými peptidovými fragmenty, spojením s jedním nebo více peptidovými fragmenty, postupným přidáváním jednotlivých aminokyselin, nebo kombinací těchto postupů.

Dokončený cyklický peptid je následně uvolněn z polymerního nosiče. Chránící skupiny je možné odstranit před, po nebo souběžně při uvolňování peptidu z polymerního nosiče. Zcela odchráněný peptid je možné přečistit, ať již samostatně nebo ve směsi, acidobazickou extrakcí, rekrystalizací, lyofilizací, sekvencí chromatografíckých stupňů při nichž se používají všechny nebo kterýkoli z následujících druhů chromatografie: výměna iontů na slabě zásaditém polymeru v acetátové formě; hydrofobní adsorpční chromatografie na nederivatizovaném polystyren-divinylbenzenu (např. na produktu dodávaném pod obchodním názvem AMBERLITE® XAD); adsorpční chromatografie na silikagelu; iontově výměnná chromatografie na karboxymethylcelulose; rozdělovači chromatografie, jako je např. chromatografie na produktu dodávaném pod obchodním názvem SEPHADEX® G-25, LH-20 nebo protiproudé rozdělení; vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC), zejména vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) s reverzními fázemi na koloně naplněné oktyl- nebo oktadecylsilylovaným oxidem křemičitým.

Příprava peptidového fragmentu

Peptidový fragment podle předmětného vynálezu je připravován syntézou základního peptidového řetězce, která

4*4444 4 · 44 ·· ·· 4 4 · ·· 4 4 4 * • « 4 4 ♦ ♦··♦ • « 4 · 4 ·44·4* *444 4 4 * 4 4 4

44 4·4 4 4 4 4« *· vyžaduje seřazení aminokyselin tvořících uvedený fragment ve správném pořadí. Základní peptidový řetězec fragmentu podle předmětného vynálezu je možné syntetizovat jakýmkoli běžně používaným způsobem, který je odborníkovi v dané oblasti techniky znám. Souhrn mnoha způsobů používaných při syntéze peptidů na pevné fázi je možné nalézt v publikaci J. M.

Steward a J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 a v publikaci J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, str. 46, Academie Press (New York), 1973. Přehled způsobů používaných při klasické syntéze v roztoku je uveden v publikaci G. Schroder a

K. Lupke, The Peptides, vol. 1, Academie Press (New York),

1965 .

Jak je odborníkům v dané oblasti techniky známo, postup syntézy peptidů na pevném nosiči obecně zahrnuje výstavbu peptidu od karboxylového konce, který se označuje rovněž jako C-konec, přičemž tento C-konec aminokyseliny, ve které je vhodnou skupinou ochráněna α-aminoskupina, je navázán k polymeru tvořícímu pevnou fázi. N-chránící skupina je následně odštěpena a poté dochází k adici další aminokyseliny, ve které je opět ochráněna aminoskupina, přičemž dochází k tvorbě peptidové vazby mezi touto aminokyselinou a α-aminoskupinou aminokyseliny navázané k pevnému nosiči shora popsaným způsobem. Uvedený cyklus odchránění první aminokyseliny a adice následující aminokyseliny je opakován dokud není zcela vytvořen požadovaný peptid. Jakékoli reaktivní skupiny obsažené v postranních řetězcích jsou během syntézy peptidu ochráněny vhodnými chránícími skupinami, které jsou stabilní za podmínek adice a odchránění N^a-chránící skupiny, které je ale možné snadno odstranit na konci syntézy celého peptidu. Pokud je peptidový fragment připravován způsobem používajícím syntézu na pevné fázi, je tento fragment získáván pro použití při adici k jiným fragmentům tak, že je odštěpen z uvedeného pevného nosiče.

Cyklický fragment je získáván podobným způsobem. Avšak při získávání cyklického fragmentu následuje po vytvoření základního peptidového řetězce (1) selektivní odchránění těch funkčních skupin obsažených v postranních řetězcích, které mají být cyklizovány, (2) cyklizace a (3) případně odstranění všech zbylých chránících skupin.

Použití aminokyselin chráněných 9-fluorenylmethyloxykarbonylovou skupinou (Fmoc) je ale pouze jedním z možných přístupů při syntéze peptidů. Při přípravě peptidu vázaného k pevnému nosiči je rovněž možné použít i aminokyseliny s aminoskupinami ochráněnými terč. butyloxykarbonylovou skupinou (Boc) (uvedený postup byl popsán například v publikaci Geysen a spolupracovníci, 1987, J. Immunol.

Methods 102:259-274).

Aminokyselinami používanými pro syntézu peptidů mohou být standardní Boc(N^a-amino chráněné N“-terc. butyloxykarbonyl)aminokyseliny popsané v publikaci: Merrifield,

1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, nebo N“-amino chráněné 9-fluorenylmethoxykarbonyl (Fmoc) aminokyseliny, které byly poprvé popsány v publikaci Carpino a Han, 1972, J. Org. Chem. 37:3403-3409, které jsou nestálé v zásaditém prostředí. Jak Fmoc, tak Boc N°-amino chráněné aminokyseliny je možné získat od firmy Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem nebo Peninsula Labs nebo jiných chemických společností, které jsou odborníkovi v dané oblasti známé. Dále je při způsobu podle předmětného vynálezu možné ««φφφφ · · · · · · • · φ φφ ·· φ φφ φ φφφ φ φ ·ΦΦΦ φφφφ φ φφφ φφφ φφφφ φ · φφφφ φφ φφ φφφ φ · · φφ ·· použít ostatní N“-chránicí skupiny, které jsou odborníkovi v této oblasti rovněž známé. Syntézu peptidů na pevné fázi je možné provádět způsoby, které jsou odborníkovi dostatečně známé, a které byly popsány například v publikaci: Steward a Young, 1984, Solid Phase Synthesis, druhé vydání, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; v publikací: Fields a Noble, 1990, Int. J. Pept. Protein Pes. 35:161-214, nebo pomocí automatických syntezátorů, jako je automatický syntezátor prodávaný firmou ABS.

Ačkoli způsob syntézy peptidu směrem od C-konce k N-konci je v této oblastí používaným standardem, je pro odborníka zřejmé, že peptidový fragment podle předmětného vynálezu je rovněž možné syntetizovat směrem od N-konce k C-konci.

Příprava laktamového můstku

Cyklické peptidové fragmenty obsahující laktamový můstek jsou připravovány vytvořením amidové vazby mezi karboxylovou skupinou obsaženou v postranním řetězci kyselého aminokyselinového zbytku a aminoskupinou obsaženou v postranním řetězci bazického aminokyselinového zbytku v přítomnosti shora uvedeného aktivačního činidla. Skupina výhodných kyselých aminokyselinových zbytků zahrnuje Asp, Glu, -NHCH [ (CH₂) ₃CO₂H] CO- a -NHCH [ (CH₂) ₄CO₂H] CO-, přičemž nejvýhodnějším zbytkem je Asp. Skupina výhodných bazických aminokyselinových zbytků zahrnuje His, Lys, Orn,

-NHCH (CH₂NH₂) CO- a -NHCH [ (CH₂) 2NH2] CO-, přičemž ne j výhodněj ším zbytkem je Lys.

V případech, kdy peptidový prekurzor cyklického peptidového fragmentu obsahuje více než jeden kyselý nebo bazický aminokyselinový zbytek, jsou chrániči skupiny pro

9 9 4 4	44 9	4 ··	94	4
9	4	9	9	4	4		4	4	4
4	4	4 4	4	9	• 4		4	4	4
• 4	4	4	4	4	4		9	4	9
4 ·		• 4	9 9 9	4 4 4		4·		• 4

ostatní kyselé nebo bazické aminokyseliny přítomné v cyklickém peptidovém fragmentu vybrány tak, aby bylo možné selektivně odchránit aminokyseliny, které mají být cyklizovány. Výhodně jsou požadované kyselé a bazické aminokyselinové zbytky odchraňovány současně. Chránící skupiny použité pro ochránění zbývajících aminokyselinových zbytků jsou vybrány tak, aby byly stabilní nejen vůči činidlům, která se používají pro selektivní odchránění vybraného bazického a kyselého aminokyselinového zbytku, ale i za podmínek, za kterých dochází ke shora popsané cyklizaci.

Pojmem „orthogonalita používaným v souvislosti s chránícími skupinami postranních řetězců se rozumí zde popisovaná situace, kdy molekula obsahuje dva nebo více druhů chránících skupin, přičemž každý z těchto druhů chránících skupin je nejlépe odstraněn za specifických podmínek, zatímco zůstává stabilní za podmínek používaných pro odstranění chránících skupin ostatních druhů. Takto je tedy možné odstranit všechny chránící skupiny stejného druhu, zatímco ostatní chránící skupiny zůstanou nedotčeny.

Skupina výhodných chránících skupin s požadovanou orthogonalitou zahrnuje: pro kyselé aminokyselinové zbytky, které mají být cyklizovány: allylovou skupinu; pro bazické aminokyselinové zbytky, které mají být cyklizovány: allyloxykarbonylovou skupinu (alloc); pro ostatní kyselé aminokyselinové zbytky: terč. butylovou skupinu (tBu); a pro ostatní bazické aminokyselinové zbytky:

terč. butyloxykarbonylovou skupinu (Boc).

Po dokončení syntézy základního peptidového řetězce cyklického peptidového fragmentu podle předmětného vynálezu na pevné fázi nebo v roztoku dochází k simultánnímu odstranění allylové a allyloxykarbonylové chránící skupiny reakcí se ·· • 4 ···· 44 • 4

4 «

4« ··

sloučeninou palladia, výhodně reakcí s tetrakis(trifenylfosfin)palladiem v přítomnosti

N-methylanilínu. Ke vzniku laktamového můstku dochází způsobem, uvedeným v tomto textu při popisu vzniku amidové vazby.

Skupina výhodných cyklických peptidových fragmentů pro přípravu cyklických peptidů vázaných k pevnému nosiči podle předmětného vynálezu zahrnuje fragmenty obecných vzorců (XV) , (XVI) a (XVII)

P Áj3 A_|S A,₆ A₁₇ OH (XV)

P Ájg Ajg A,_o A,, OH (XVI)

P ^26 ^27 ^28 ^29 Α^θ OH (XVII) kde je laktamový, disulfidový nebo lanthioninový můstek;

je skupina chránící aminoskupinu;

An, Ai7, Ais, A_22z A₂₆ a A₃₀ jsou aminokyselinové zbytky;

···· ·· ··

A14	je	His	(Trt)	nebo	Ser(tBu);
AlS	je	Ser	(tBu)	nebo	Leu;
Al6	je	Asn	(Trt)	nebo	Gin(Trt) ;
A19	je	Arg(Pmc)	nebo	Glu(OtBu);
A₂0	je	Arg(Pmc)	i
A₂i	je	Arg	(Pmc)	nebo	Val;
A₂7	je	Leu	nebo	Lys(Boc);
A₂8	Je	Ile	nebo	Leu;	a
A₂9	je	Ala	nebo	Gin(Trt).

Skupina ještě výhodnějších cyklických peptidových fragmentů zahrnuje fragmenty obecných vzorců (IV), (V) a (VI), kde | je laktamový můstek;

P je 9-fluorenylmethoxykarbonylová skupina (Fmoc);

Ai₃, Ais a A₂₆ jsou Lys;

Ai?, A₂₂ a A₃₀ jsou Asp;

φφφφ φφ • φ φ ·· · • · · φ • · · ♦ φ φφφφ φ »9 · Φ «««φ

ΦΦ Φ·

Φ Φ Φ ·

Φ Φ Φ Φ

ΦΦ Φ»

Al4	je	His	(Trt)	nebo	Ser (	(tBu) ;
Al5	je	Ser	(tBu)	nebo	Leu;
Al6	je	Asn	(Trt)	nebo	Gin (	Trt) ;
Al9	je	Arg	(Pmc)	nebo	Glu (	OtBu);
A₂o	je	Arg(Pmc)	f

Α₂ι Arg(Pmc) nebo Val;

Α₂7 je Leu nebo Lys(Boc);

A₂g je Ile nebo Leu; a

A₂9 je Ala nebo Gin (Trt) .

Ještě výhodnějším cyklickým peptidovým fragmentem pro přípravu cyklických peptidů vázaných k pevnému nosiči podle předmětného vynálezu je

Fmoc-cyklo(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH.

Analogy cyklického peptidu hormonu příštítné žlázy a analogy proteinu souvisejícího s hormonem příštítné žlázy, které se vhodně připravují způsobem podle předmětného vynálezu, byly popsány v následujících dokumentech:

1.

v přihlášce patentu Spojených států amerických číslo US 60/046 472, podané dne 14. května 1997 (Condon a spolupracovníci);

»··· ·· • · · • · « • · fl • · · « ·· ··

2. v patentu Spojených států amerických číslo US 5 556 940 ze

17. září 1997 (Willick a spolupracovníci);

3. v patentu Spojených států amerických číslo US 5 717 062 z

10. února 1998 (Chorev a spolupracovníci);

4. ve zveřejněné mezinárodní přihlášce číslo WO 96/40775 zveřejněné dne 19. prosince 1996 (Vickery a spolupracovníci).

Výhodným cyklickým peptidem, který se vhodně připravuje způsobem podle předmětného vynálezu, je peptid obecného vzorce (I)

X-A7-Ag-A9-Ai0-Aii-Ai2^_Ai3-Ai4-Ai5-Ai6-Ai7-Aig-Ai9-A20A21^_A22 A₂₃ A₂₄ A₂5 Α₂₆-Α₂7-Α₂₈-Α29-Α30-Α₃₁-Υ (I) kde substituent X je vybrán ze skupiny zahrnující (a) Ri_a-Ai-A₂-A₃-A₄-A5-A6-, (b) Ri_b-A₂-A₃-A₄-A5-A6-, (c) Rib-A₃-A₄-A₅-A₆-, (d) R_lb-A₄-A₅-A₆-, (e) Ri_b-A₃-A6-, (f) Rlb~Ag^—, (g) Rw-/ kde

R_la je vybrána ze skupiny zahrnující • 999 • · · • 9 9

9 9

9 9 · • 9 «9

(1) atom vodíku, (2) peptid obsahující od 1 do 6 aminokyselin, (3) alkylovou skupinu, (4) fenylalkylovou skupinu, (5) skupinu -COR₂, kde R₂ je vybrána ze skupiny zahrnující alkylovou skupinu, alkenylovou skupinu, alkinylovou skupinu, fenylovou skupinu, naftylovou skupinu a fenylalkylovou skupinu,

R_lb je vybrána ze skupiny zahrnující (1) atom vodíku, (2) alkylovou skupinu (3) fenylalkylovou skupinu, (4) skupinu -COR₂, kde R₂ je vybrána ze skupiny zahrnující alkylovou skupinu, alkenylovou skupinu, alkinylovou skupinu, fenylovou skupinu, naftylovou skupinu a fenylalkylovou skupinu,

Ai je vybrána ze skupiny zahrnující Ser a Ala nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek,

A₂, A₃, A₄ a A₆ jsou aminokyselinové zbytky a

A₅ je vybrána ze skupiny zahrnující Ile nebo His nebo ekvivalentní aminokyselinové zbytky;

A₇, A_9z An a A12 jsou aminokyselinové zbytky;

Ag je Leu nebo Nle nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

φφφφ ·· • · · • · · • φ φ · φφ φ ·

Αιο je Asp nebo Asn nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

A13 a A17 jsou aminokyselinové zbytky, ve kterých postranní řetězce aminokyselin A_i3 a Ai₇ jsou spolu spojeny amidovou vazbou;

A14 je His nebo Ser nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

A15 a A₂8 jsou nezávisle na sobě Ile nebo Leu nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

Ai6 je Asn nebo Gin, nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

Ais a A₂₂ jsou aminokyselinové zbytky, ve kterých postranní řetězce aminokyselin A₁₈ a A₂₂ jsou spolu spojené amidovou vazbou;

Aig je Arg nebo Glu, nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

A₂₀ je Arg nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

A₂i je Arg nebo Val nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

A₂3 je Phe nebo Trp nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

9 9 · • 9· ·

9 9 9 · 9 9 ·9 ·

A₂₄ je Leu nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

A₂5 je Arg nebo His nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

A₂₆ a A₃₀ jsou aminokyselinové zbytky, ve kterých postranní řetězce aminokyselin A₂₆ a A30 jsou spolu spojeny amidovou vazbou ;

A₂₇ je Leu nebo Lys nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

A₂₉ je Ala nebo Gin nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

A31 je Ile nebo Val zbytek;

nebo ekvivalentní aminokyselinový substituent Y je vybrán ze skupiny zahrnující (a) -R3, (b) -A₃₂-R₃, (c) ~A₃2^-A33-R₃, (d) -A32-A33-A34-R3, kde

R₃ je hydroxylová skupina nebo skupina obecného vzorce

-NR4R5

kde

A₃₂ je His nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

A33 je Asn nebo Thr nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek;

A34 je Ala nebo Phe nebo ekvivalentní aminokyselinový zbytek.

Peptidy obecného vzorce (I) mají užitečné farmaceutické vlastnosti. Tyto sloučeniny jsou zvlášť užitečné pro léčbu chorobných stavů, které je možné tlumit sloučeninami, které se vážou k receptorům hormonu příštítné žlázy, přičemž zároveň dochází nebo nedochází ke stimulaci aktivity cAMPasy.

Podrobněji byl tento problém popsán v přihlášce patentu Spojených států amerických číslo US 60/046 472.

Jako konkrétní příklady výhodných peptidů, které se vhodně připravují způsobem podle předmětného vynálezu, je možné uvést

cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹,	Nle³,	Lys¹⁸,	Asp²²,	Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala^1,2,	Nle⁸,	Lys¹⁸	, Asp²²,	Leu²⁷)	lh'PTH(l-3i;	1 NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala^1,3,	Nle⁸,	Lys¹⁸	, Asp²²,	Leu²⁷)	]hPTH(1-31)	1 NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala^1,4,	Nle⁸,	Lys¹⁸	, Asp²²,	Leu²⁷;	\|hPTH(1-31;	1 nh₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala^1,5,	Nle⁸,	Lys¹⁸	, Asp²²,	Leu²⁷;	\|hPTH(1-31)	nh₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala^1,6,	Nle⁸,	Lys¹⁸	, Asp²²,	Leu²⁷;	\|hPTH(l-31)	i NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'⁷,	Nle⁸,	Lys¹⁸	, Asp²²,	Leu²⁷]	hPTH(1-31)NH₂

cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'⁸, [Ala¹'¹⁰,	Lys¹⁸, Nle⁸,	Asp²², Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'¹¹,	Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'¹²,	Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
cyklo (Lys^ls-Asp²²)	[Ala¹'¹³,	Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'¹⁴,	Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'¹⁵,	Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'¹⁶,	Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
bicyklo (Lys¹³-Asp	¹⁷, Lys¹⁸-	-Asp²²)	[Ala¹, Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp¹⁷'²²,
Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
bicyklo (Lys¹⁸-Asp'	²², Lys²⁶-	-Asp³⁰)	[Ala¹, Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,

Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂ cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Ala¹, Nle⁸, Lys¹⁸, Asp²², Leu²⁷] hPTH (1-34 ) NH2 bicyklo (Lys¹³-Asp¹⁷, Lys¹⁸-Asp²²) [Ala¹, Nle⁸, Lys¹⁸, Asp¹⁷'²², Leu²⁷] hPTH (1-34 ) NH2 bicyklo (Lys¹⁸-Asp²², Lys²⁶-Asp³⁰) [Ala¹, Nle⁸, Lys¹⁸, Asp²²,

Leu²⁷] hPTH (1-34) NH₂ cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Lys¹⁸, Asp²²] hPTHrP (1-34 ) NH₂ cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Lys¹⁸'²⁶'³⁰, Asp²², Leu²³'²⁸'³¹, Glu²⁵'²⁹] hPTHrP (1-34)NH₂ cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Nle⁸, Lys¹⁸, Asp²², Leu²⁷] hPTH (7-34 ) NH2 cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Lys¹⁸, Asp²²] hPTHrP (7-34 ) NH2 bicyklo (Lys¹³-Asp¹⁷, Lys¹⁸-Asp²²) [Nle⁸, Lys¹⁸, Asp²², Leu²⁷] hPTH (7-34)NH₂ a bicyklo (Lys¹⁸-Asp²², Lys²⁶-Asp³⁰) [Nle⁸, Lys¹⁸, Asp²², Leu²⁷] hPTH (7-34)NH₂, bez jakéhokoli omezení na uvedené příklady.

Další skupina výhodných cyklických peptidů, které se vhodně připravují způsobem podle předmětného vynálezu, zahrnuje sloučeniny obecného vzorce (I) ···· ·· ·· ·· kde ♦ · · • 9 9 • * · • · · 9

99

9

9 9

9 9 9

9 9 substituent X je vybrán ze skupiny zahrnující (a) Ri_a-A]_-A2^-A3^-A₄-A5-Ag-, kde

Rla	je atom vodíku nebo Pro,
Al	je Ser nebo Ala,
a₂	je Val,
a₃	je Ser,
a₄	je Glu,
a₅	je Ile nebo His,
Ag	je Gin,

(b) R_lb-A2^-A₃-A4-A5-A6-, kde

A₂, A_3z A₄, A₅ a A₆ mají shora definovaný význam a

R_lb je atom vodíku,
(c)	Rib^-A3^— A4^— Ας^-Ag-, kde Rib, A₃, A₄, A₅ a A₆ mají shora definovaný význam
(d)	Rib^-A₄-Ά5—Αβ^-, kde Rib, A₄, A₅ a A₆ mají shora definovaný význam,
(e)	Rib^-A5^-, kde Rib, A₅ a A₆ mají shora definovaný význam,
(f)	Rib-Ag^-, kde Rib a A₆ mají shora definovaný význam,
(g)	Rib^-/ kde Rib má shora definovaný význam;
a₇	je Leu;

4 4 •9«< 99 • 4 • 4 4

4 4 4 > 4 4 · • 4 44 «4 <4 .»·

Λ

Ag	je	Leu	nebo
a₉	je	His;
A10	je	Asp	nebo
An	je	Leu;
A12	je	Gly;

Ai3, A17, Ais, A₂₂ a A30 jsou nezávisle na sobě vybrané ze skupiny zahrnující Ser, Thr, Lys, Cys, homo-Cys, Orn, Asp, Glu, -NHCH (CH₂NH₂) C0-,

-NHCH [ (CH₂) ₂NH₂] C0-, -NHCH [ (CH₂) ₃CO₂H] CO- a -NHCH [ (CH₂) ₄CO₂H] C0-;

A14	je	His	nebo	Ser;
Ai₅	je	Ser	nebo	Leu;
Al6	je	Asn	nebo	Gin;
A19	je	Arg	nebo	Glu;
A₂o	je	Arg;
A21	je	Arg	nebo	Val;
A₂3	je	Phe	nebo	Trp;
A24	je	Leu;

• · · · · ·· · ·· 9 • · 9 9 · · 9 · ·

4·· · ······ · » · « · 9 9 9 9 9

V 9 9 9 ··· 9 9 9 · · 9 ♦

A₂₅ je Arg nebo His;

A₂₅ je His nebo je nezávisle vybrána ze skupiny zahrnující Ser, Thr, Lys, Cys, homo-Cys, Orn, Asp, Glu, -NHCH (CH₂NH₂) CO-,

-NHCH [ (CH₂) ₂NH₂] CO-, -NHCH [ (CH₂) ₃CO₂H] CO- a -NHCH [ (CH₂) ₄CO₂H] CO-;

a₂₃	je	Leu	nebo	Lys ;
A₂8	je	Ile	nebo	Leu;
A₂g	je	Ala	nebo	Gin;
A₃1	je	Ile	nebo	Val;

a substituent Y je vybrán ze skupiny zahrnující (a) -R₃, kde

R₃ je hydroxylová skupina nebo skupina obecného vzorce —NR4R5 kde

R₄ a R5 jsou nezávisle na sobě atomy vodíku nebo alkylové skupiny obsahující 1 až atomy uhlíku, (b) -A₃₂-R₃, kde

R₃ má shora definovaný význam,

A₃₂ je His, (c) -A₃2-A₃3-R₃, kde • ·· · ·· « · · • · · · • · * · • · $ · · ·

R₃ a Ά₃2 mají shora definovaný význam, A₃₃ je Asn nebo Thr a (d) -A32-A33-A34, kde

A34 je Ala nebo Phe.

Další skupina výhodných cyklických peptidů, které se vhodně připravují způsobem podle předmětného vynálezu, zahrnuje sloučeniny obecného vzorce (I)

kde
(i)	postranní vazbou,	řetězce	Al8	a
(ii)	postranní vazbou a	řetězce	A13	a
	postranní vazbou,	řetězce	Ais	a
(iii)	postranní vazbou a	řetězce	Al8	a
	postranní řetězce vazbou nebo	A26	a
(iv)	postranní vazbou,	řetězce	A13	a
	postranní vazbou a	řetězce	Al8	a
	postranní	řetězce	A26	a

vazbou.

A22	j sou	spolu	spoj eny	amidovou
Al7	j sou	spolu	spoj eny	amidovou
A22	j sou	spolu	spoj eny	amidovou
A22	jsou	spolu	spoj eny	amidovou
A30	j sou	spolu	spojeny	amidovou
An	j sou	spolu	spoj eny	amidovou
A22	j sou	spolu	spoj eny	amidovou
A30	j sou	spolu	spoj eny	amidovou

cyklických peptidů, které se vynálezu,

Další skupina výhodných vhodně připravují způsobem podle předmětného zahrnuje sloučeniny obecného vzorce (I) ····*· · · · · · · • · * «· · ♦ · · · • · · · · 1 ♦ · · ···* · ··<»** • · · t · · » ♦ · «

4* *· ··· ··» * · ·· kde

Al3	je vybrána	ze skupiny zahrnující	Lys a Ala,
A17	je vybrána	ze skupiny zahrnující	Ser a Asp,
Al8	je Lys,
A₂2	je Asp,
A26	Lys a
A30	je Asp.
Dalším	výhodným cyklickým peptidem, který	se vhodně

připravuje způsobem podle předmětného vynálezu, je sloučenina obecného vzorce (I) kde

X je skupina Ri_a-A₁-A₂-A3-A₄-A5-A6-.

Dalším výhodným cyklickým peptidem, který se vhodně připravuje způsobem podle předmětného vynálezu, je sloučenina obecného vzorce (I) kde

Ai je Ala,

A₈ je Nle a

4··

4

A₂₇ je Leu.

R_Xa je atom vodíku,

Y je —A32^—A33^—A34—NH₂.

Další skupina výhodných cyklických peptidů, které se vhodně připravují způsobem podle předmětného vynálezu, zahrnuje sloučeniny obecného vzorce (I) kde

X je vybrána ze skupiny zahrnující

	(a)	Rlb^-A₂-A3-A4-A5-A6
	(b)	Rifa-TU^-/¼^-As^-Ας^- ,
	(c)	Κΐϋ-Α-ι-Αβ-Αδ^-,
*	(d)	Rib^-As-A₆-,
v	(e)	Rlb^_Ů6~,
	(f)	Rlb~ >

Dalším výhodným cyklickým peptidem, který se vhodně • « · · · · « · · • 9 « · » » · * • 9 9 9 připravuje způsobem podle předmětného vynálezu, obecného vzorce (I)

9

je sloučenina kde

Ag je Nle a

A₂7 je· Leu.

X je atom vodíku a

Y j e-A3₂-A33-A34-NH₂.

Ještě výhodnější cyklické peptidy, které se vhodně připravují způsobem podle předmětného vynálezu, jsou vybrané ze skupiny zahrnující:

cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Ala¹, :	Nle⁸,	Lys¹⁸,	Asp²², :	Leu²⁷] hPTH(1-31)NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Ala^1,2,	Nle⁸,	Lys¹⁸	, Asp²²,	Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Ala^1,3,	Nle⁸,	Lys¹⁸	, Asp²²,	Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Ala^1,4,	Nle⁸,	Lys¹⁸	, Asp²²,	Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Ala^1,5,	Nle⁸,	Lys¹⁸	, Asp²²,	Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Ala^1,6,	Nle⁸,	Lys¹⁸	, Asp²²,	Leu²⁷]hPTH (1-31)NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Ala^1,7,	Nle⁸,	Lys¹⁸	, Asp²²,	Leu²⁷]hPTH (1-31)NH₂

		62	• · 9 · 9 • 9 9 9 9 ·	9 9 • 9 9 9 9 9 9 • * 9 9	• 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9	9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9	9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'⁸,	Lys¹⁸,	Asp²², Leu²⁷] hPTH (	L-31)NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'¹⁰,	Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷	] hPTH	1-31)	nh₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'¹¹,	Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷	] hPTH	1-31) NH₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'¹²,	Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷	] hPTH	1-31)	nh₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'¹³,	Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷	]hPTH(	1-31)	nh₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'¹⁴,	Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷	]hPTH(	1-31)	nh₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'¹⁵,	Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷	]hPTH(1-31)	nh₂
cyklo (Lys¹⁸-Asp²²)	[Ala¹'¹⁶,	Nle⁸,	Lys¹⁸, Asp²²,	Leu²⁷	]hPTH(	1-31)	nh₂

,17,22 bicyklo (Lys¹³-Asp , Lys -Asp ) [Ala¹, Nle⁸, Lys¹⁸, Asp Leu²⁷] hPTH (1-31) NH2 bicyklo (Lys¹⁹-Asp²², Lys²⁶-Asp^3Cj Leu²⁷] hPTH (1-31) NH2 .

[Ala¹, Nle⁸, Lys¹⁸, Asp²²,

cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Ala¹, Nle⁸, Lys¹⁸, Asp²², Leu²⁷] hPTH (1-31) NH2 bicyklo (Lys¹³-Asp¹⁷, Lys¹⁸-Asp²²) [Ala¹, Nle⁸, Lys¹⁸, Asp¹⁷'²², Leu²⁷] hPTH (1-31) NH2 bicyklo (Lys¹⁸-Asp²², Lys²⁶-Asp^3Cj [Ala¹, Nle⁸, Lys¹⁸, Asp²²,

Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂.

Ještě výhodnějším cyklickým, který se vhodně připravuje způsobem podle předmětného vynálezu, je cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Ala¹, Nle⁸, Lys¹⁸, Asp²², Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou zde uvedeny pro lepší ilustraci předešlého popisu aniž by jakkoli omezovaly rozsah předmětného vynálezu.

• · · · · • · · · · ·

Příklad 1

Cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Ala¹, Nle⁸, Lys¹⁸, Asp²², Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂

Ala-Val-Ser-Glu-IIe-Gln-Leu-Nle-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-AsnSer-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Val-NH ₂

Stupeň 1

Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)Asp(OtBu)-Val-NH-polymerní nosič gramů Rinkamidového MBHA polymerního nosiče o koncentraci 0,64 milimolu/gram (3,2 milimolu) (o titru 0,5-0,7 milimolu/gram, Nova Biochem, LaJolla, CA, USA) bylo nabotnáno třepáním v 60 mililitrech dimethylformamidu, zbaveno rozpouštědla a promyto dvakrát 60 mililitry dimethylformamidu. Poté byla odštěpena 9-fluorenylmethoxykarbonylová skupina (Fmoc), přičemž tento postup zahrnoval působení 60 mililitrů směsi obsahující 20 procent piperidinu v dimethylformamidu na polymerní nosič po dobu 20 minut a následné promytí polymerního nosiče 4 x 60 mililitry dimethylformamidu (test TNBS: pozitivní). Směs 2,17 gramu (6,4 milimolu) Fmoc-Val-OH a 2,43 gramu (6,4 milimolu) O-benzotriazol-l-yl-N,N,N',N'-tetramethyluronimhexafluorofosfátu (HBTU) ve 150 mililitrech dimethylformamidu byla ponechána reagovat s 32 mililitry (12,8 milimolu) N-methylmorfolinu při teplotě 0 °C po dobu 10 minut, přidána k výše popsanému peptidu vázanému k polymernímu nosiči a vzniklá směs byla míchána třepáním při teplotě místnosti po dobu přibližně 80 minut. Polymerní nosič • · · · · · • · · '· · · · · · ···· · ··«··· • · · · · * · ··· <* «· ··· ··· ·« ·* byl oddělen od rozpouštědla, promyt 3 x 150 mililitry dimethylformamidu (test TBNS: negativní), promyt dvakrát diethyletherem a sušen přes noc. Bylo získáno 0,88 gramu produktu, z čehož bylo možné odvodit, že došlo k adici 2,75 milimolu Val. Syntéza dále pokračovala postupným odštěpováním 9-fluorenylmethoxykarbonylové skupiny (Fmoc), které bylo prováděno shora popsaným způsobem, a adicí, opět shora popsaným způsobem, 5,6 milimolu Fmoc-Asp(OtBu),

Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Leu, Fmoc-Leu, Fmoc-Lys(Boc), FmocArg(Pmc), Fmoc-Leu a Fmoc-Trp(Boc), přičemž bylo vždy použito

5,6 molárního ekvivalentu O-benzotriazol-l-yl-N,N,N', N'-tetramethyluronimhexafluorofosfátu (HBTU), 11,2 milimolu N-methylmorfolinu a 50 mililitrů dimethylformamidu. Hmotnost výsledného produktu byla 5,8 gramu. Z tohoto množství byl odebrán alikvotní podíl, ve kterém byly odštěpeny chránící skupiny, takže byl získán v názvu uvedený peptid, který obsahoval 9-fluorenylmethoxykarbonylovou skupinu (Fmoc), přičemž postranní řetězce neobsahovaly žádné chránící skupiny a jehož čistota byla 86 A procent. LC-MS: stanoveno 1390,9, vypočteno 1390,8.

Stupeň 2

Fmoc-cyklo(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp

Fmoc—Lys—GIu(OtBu) Arg(Pmc)—Val-Asp-OH

Způsob A: Syntéza na pevné fázi

a. Vytvoření sekvence: Syntéza Fmoc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-chlortritylovaný polymerní nosič

Adice Fmoc-Asp(OAllyl)-OH k 15 gramům 1 procentně síťovaného chlortritylovaného polymerního nosiče obsahujícího 1,05 milimolu chlotritylových skupin/gram polymeru (celkem 15,75 milimolu) byla provedena pomocí 7,89 gramu (18,9 milimolu) Fmoc-Asp(OAllyl)-OH, 82 gramů (39,9 milimolu) benzotriazolyloxy-tris[pyrrolidino]-fosfoniumhexafluoracetátu (PyBOP) a 10,2 gramu (78,8 milimolu) diisopropylethylaminu ve 150 mililitrech dichlormethanu. Směs byla míchána třepáním, oddělena od rozpouštědla a polymerní nosič byl postupně promyt 3 x 150 mililitry směsí dichlormethan/methanol/diisopropylethylamin (17:2:1) a x 150 mililitry dichlormethanu. Z polymerního nosiče byl odebrán vzorek pro TNBS test, jehož výsledek byl negativní. N-koncová 9-fluorenylmethoxykarbonylová skupina (Fmoc) byla odstraněna reakcí 9-fluorenylmethoxykarbonylovou skupinou (Fmoc) ochráněné aminokyseliny vázané k polymernímu nosiči se 150 mililitry 5 procentního roztoku piperidinu ve směsi dichlormethan/dimethylformamid (1:1) po dobu 10 minut a následnou reakcí se 150 mililitry 20 procentního roztoku piperidinu v dimethylformamidu po dobu 30 minut. Aminokyselina vázaná k polymernímu nosiči byla promyta shora popsaným způsobem. Adice Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH (po tomto stupni byl odebrán 10 procentní alikvot), Fmoc-Glu(OtBu)-OH a FmocLys (ε-Alloc)-OH byly provedeny stejným způsobem se stejnou posloupností jednotlivých stupňů, přičemž k promývání před TNBS testováním bylo místo tří podílů dichlormethanu použito

9 9 · · ··»· • · 9 · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99 999 999 99 99 tří až pěti podílů dimethylformamidu. V žádném případě nebylo třeba provádět dvojitou adici. Výsledný peptid vázaný k polymernímu nosiči byl promyt 150 mililitry tetrahydrofuranu a 150 mililitry diethyletheru, usušen ve vakuu a bylo získáno 27,23 gramu.

b. Odstranění allylové a allyloxykarbonylové (alloc) skupiny z Lys¹⁸ a Asp²²: syntéza Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Aspchlortritylovaný polymerní nosič gramů shora připraveného peptidu Fmoc-Lys(Alloc)Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-chlortritylovaný polymerní nosič bylo nabotnáno mícháním v třepačce obsahující

100 mililitrů směsi dimethylsulfoxid/dimethylformamiddichlormethan (1:1:0,2 objemových dílů) po dobu 20 minut, jemně oddělen od rozpouštědla a bylo k němu postupně přidáno 2,9 gramu tetrakistrifenylfosfinpalladia částečně rozpuštěného ve 240 mililitrech směsi dimethylsulfoxid/dimethylformamid (1:1 objemových dílů), 60 mililitrů dichlormethanu a

16,2 gramu (150 milimolů) N-methylanilinu a výsledná směs byla 2 hodiny míchána třepáním. Polymerní nosič byl oddělen od rozpouštědla a promyt 3 x 100 mililitry dichlormethanu. Takto upravený polymerní nosič byl nabotnán ve 100 mililitrech směsi dimethylsulfoxid/dimethylformamid (1:1 objemových dílů), jemně oddělen od rozpouštědla a použit přímo při cyklizaci Lys¹⁸-Asp²³.

····

9 9 · 9 · • 9 99 9 999

9 · 9 9 9 · 9 *99 9 9· o 18 99

c. Vytvoření laktamoveho můstků Lys -Asp : syntéza Fmoccyklo(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-chlortritylovaný polymerní nosič

K peptidu vázanému k polymernímu nosiči, který byl připraven v předcházejícím stupni, bylo přidáno 5,2 gramu (10 milimolů) benzotríazolyloxy-tris[pyrrolidino]fosfoniumhexafluoracetátu (PyBOP) a 2,6 gramu (20 milimolů) diisopropylethylaminu ve 100 mililitrech směsi dimethylsulfoxid/dimethylformamid (1:1 objemových dílů) a směs byla ponechána míchat 4 hodiny. Polymerní nosič byl oddělen od rozpouštědla a promyt 3 x 100 mililitry dimethylformamidu.

Z polymerního nosiče odděleného od rozpouštědla byl odebrán alikvotní podíl pro provedení TNBS testu, jehož výsledek byl negativní. Zbytek polymerního nosiče byl promyt 100 mililitry tetrahydrofuranu a 100 mililitry diethyletheru a vysušen ve vakuu.

d. Odštěpení polymerního nosiče a izolace Fmoc-cyklo(LysAsp) Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp

Peptid vázaný k polymernímu nosiči, jehož příprava byla popsána v předcházejícím odstavci byl 20 minut třepán ve 130 mililitrech směsi kyseliny octové/dichlormethanu/

2,2,2,-trifluorethanolu (1:8:1). Kapalný podíl byl oddělen od polymeru a bylo k němu přidáno 500 mililitrů methyl terč. butyletheru a 100 mililitrů diethyletheru a směs byla odstředěna. Kapalina nad sraženinou byla odstraněna, ke zbytku byl přidán diethylether a vzniklá směs byla opět odstředěna. Kapalina nad sraženinou byla odstraněna a sušením zbytku ve vakuu přes noc bylo získáno 2,77 gramu pevné žluté látky ···· ·· · · «« ·· • · · ·· · · « · · · z-Q · · · · · ····

ΌΟ ····· ·»···» • · · · · · · · · · ·· ·· ··· ··· ·· ·· (MS: 1172; 41 procent stechiometrického výtěžku surového produktu). Surový produkt byl přečištěn mžikovou chromatografií s elucí směsí dichlormethan/methanol (85:15 až 60:40) a byl získán 1 gram Fmoc-cyklo(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)Arg(Pmc)-Val-Asp-OH (15 procentní výtěžek vztažený na hmotnost polymerního nosiče), jehož čistota byla 85 A procent.

Způsob B: Syntéza v roztoku

a. Vytvoření sekvence

Syntéza Boc-Asp(OAllyl)-OBzl

Do tříhrdlé baňky o objemu 3 litry bylo přidáno 50 gramů (154,5 milimolu) benzylesteru kyseliny 1,1-dimethylethoxykarbonyl-(L)-aspartové, 96 mililitrů dichlormethanu,

9,43 gramu (162,3 milimolu)allylalkoholu a 10 miligramů 4-N,N-dimethylaminopyridinu. Reakční směs byla ochlazena na teplotu 8 °C a byl k ní při teplotě 8 až 11 °C během 90 minut přidán roztok 32 gramů (154,5 milimolu) dicyklohexylkarbodiimidu ve 100 mililitrech dichlormethanu. Během přidávání roztoku dicyklohexylkarbodiimidu docházelo ke srážení dicyklohexylmočoviny. Reakční směs byla míchána dvě hodiny při teplotě 11 až 12 °C, přičemž po uplynutí této doby bylo vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) prokázáno, že směs neobsahovala žádný výchozí materiál.

Vzniklá dicyklohexylmočovina byla odfiltrována a filtrát byl zahuštěn. Olejovitý zbytek byl rozpuštěn v 250 mililitrech methyl terč. butyletheru a ze vzniklého roztoku byly filtrací odstraněny zbytky dicyklohexylmočoviny. Filtrát byl postupně promyt 30 mililitry 0,2 N kyseliny chlorovodíkové, ··«· • · <Q « · · © · ····

Ό 27 ····· ······

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 999 9 99 99 99 mililitry vody, 20 mililitry nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, 30 mililitry vody a dvakrát 50 mililitry solanky, vysušen nad bezvodým síranem hořečnatým, přefiltrován a zahuštěn, čímž bylo získáno 55,88 gramu Boc(L) Asp (OAllyl) -OBzl ve formě oleje. (M_vyp. 363,4; M+l_změř. 364).

Syntéza HCl-Asp(OAllyl)-OBzl

Do tříhrdlé baňky o objemu 3 litry byl přidán roztok

110,5 gramu (302,7 milimolu) Boc-Asp(OAllyl)-OBzl v 500 mililitrech ethylacetátu. Baňka byla opatřena mechanickým míchadlem, roztok byl ochlazen na teplotu 5 °C a byl jím ponechán po dobu 2,5 hodiny probublávat chlorovodík, přičemž během této doby vzrostla teplota směsi na přibližně 22 °C. Analýzou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) bylo zjištěno, že směs neobsahovala žádnou výchozí látku. Směsí byl přes noc ponechán probublávat dusík, přičemž došlo ke vzniku bílé sraženiny, která byla izolována filtrací a promyta 100 mililitry ethylacetátu. Zbytek byl usušen ve vakuu a bylo získáno 84 gramů HC1.Asp(OAllyl)+OBzl ve formě bílých krystalů pozorovatelných mikroskopem. (M_vyp. 263; M+l_změř. 264).

Syntéza Boc-Val-Asp(OAllyl)-OBzl

K roztoku 25,4 gramu (116,7 milimolu) Boc-Val-OH v 85 mililitrech ethylacetátu bylo přidáno 16,55 gramu (122,5 milimolu) hydrátu hydroxybenzotriazolu ve 122,3 mililitru dimethylformamidu. Směs byla ochlazena na teplotu 5 °C a byl k ní během 1 hodiny přidán roztok

25,2 gramu (122,5 milimolu) dicyklohexylkarbodiimidu v 58,7 mililitru ethylacetátu. Během přidávání uvedeného roztoku • · vzrostla teplota na přibližně 18 °C a došlo k vysrážení dícyklohexylmočoviny. Chlazení bylo přerušeno, směs byla míchána 2 hodiny a následně k ní bylo během 25 minut přidáno 35 gramů (116,7 milimolu) HC1. H₂N-Asp(OAllyl)-OBzl ve 189 mililitrech dimethylformamidu. Ke směsi bylo pomalu během 30 minut přidáno 12,8 mililitru N-methyl-morfolinu, čímž bylo pH upraveno na hodnotu 7 a vzniklá směs byla míchána 36 hodin při teplotě místnosti. Z reakční směsi byla filtrací odstraněna dicyklohexylmočovina, filtrát byl zředěn methyl terč. butyletherem, míchán 2 hodiny a znovu přefiltrován. Získaný filtrát byl postupně promyt 100 mililitry vody,

100 mililitry 0,5 molárního vodného roztoku kyseliny citrónové, 100 mililitry vody, 100 mililitry nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, 100 mililitry solanky, vysušen nad bezvodým síranem hořečnatým, přefiltrován a zahuštěn, čímž bylo získáno 41,3 gramu Boc-Val-Asp(OAllyl)OBzl ve formě oleje. (M_vyp. 462; M+l_změř. 463).

Syntéza HC1.Val-Asp(OAllyl)-OBzl

K roztoku 31,7 gramu (68,5 milimolu) Boc-Val-Asp(OAllyl)OBzl ve 300 mililitrech ethylacetátu ochlazenému na teplotu 2 až 4 °C byl 2 hodiny přidáván plynný chlorovodík. Chlazení bylo přerušeno a směs byla míchána 48 hodin. Poté byl roztokem 1 hodinu prudce probubláván dusík. Reakční směs byla zahuštěna na rotační odparce a bylo získáno 38,3 gramu pevné bílé látky, která byla krystalizována z ethylacetátu, čímž bylo získáno

24,2 gramu HC1. Val-Asp (OAllyl)-OBzl. (M_vyp. 362 M+l_změř. 363).

···· 44 ·

4 4 4 4 · • · · 4 ♦ 4 · · 4 • · · · 4 4 · · 4 · *4 44 444 4*4 *· ··

Syntéza Fmoc-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl

Do tříhrdlé baňky o objemu 3 litry opatřené mechanickým míchadlem bylo přidáno 17,25 gramu (26 milimolů) Fmoc-Arg(Pmc) a 300 mililitrů acetonitrilu a tato směs byla míchána při teplotě místnosti dokud nedošlo ke vzniku čirého roztoku.

K roztoku byl přidán benzotriazol-l-yloxy-trispyrrolidinfosfoniumhexafluorfosfát (PyBOP), roztok byl ochlazen na teplotu 2 °C a bylo k němu přidáno 2,6 gramu (26 milimolů) N-methylmorfolinu za vzniku bílé husté kaše. Ke směsi bylo pomalu až do úplného rozpuštění uvedené kaše přidáno 52 mililitrů dimethylformamidu a vzniklý roztok byl míchán 30 minut při teplotě 3 °C. Následně byl k roztoku během 20 minut přidán při teplotě 2 až 3 °C roztok 10,4 gramu (26 milimolů) HC1.Val-Asp(OAllyl)-OBzl ve 39 mililitrech dimethylformamidu a 7,5 mililitru N-methylmorfolinu, čímž bylo pH směsi upraveno na hodnotu 7. Chlazení bylo přerušeno a směs byla míchána 2,5 hodiny. Výsledná směs byla naředěna

250 mililitry vody a 250 mililitry ethylacetátu.

Ethylacetátová vrstva byla oddělena a promyta x 100 mililitry vody a 2 x 100 mililitry solanky a zahuštěna za vzniku pevné bílé látky, jejíž krystalizací ze 175 mililitrů ethylacetátu bylo získáno 18,5 gramu Fmoc-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl (jehož čistota byla 95 A procent). Ethylacetátový filtrát byl zahuštěn a kaučukovitý zbytek byl triturován ethylacetátem, čímž bylo získáno dalších 3,12 gramu požadovaného produktu. (M_vypM+l_změř. 1008).

1007;

• 4 • ·4 ·

4

Syntéza Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl

K roztoku 16 gramů (15,9 milimolu) Fmoc-Arg(Pmc)-ValAsp (OAllyl ) -OBzl v 267 mililitrech dichlormethanu bylo při teplotě místnosti přidáno 23 gramů (26,7 mililitru, milimolů) piperidinu. Reakční směs byla míchána 2,5 hodiny a dále byla promyta 2 x 60 mililitry vody a 2 x 60 mililitry solanky, vysušena nad bezvodým síranem hořečnatým, přefiltrována a zahuštěna za vzniku polopevné látky. Tato polopevná látka byla rozpuštěna ve 400 mililitrech ethylacetátu a vzniklý roztok byl ponechán stát tři dny a přefiltrován. Filtrát byl promyt 2 x 60 mililitry vody, vysušen nad bezvodým síranem hořečnatým, přefiltrován a zahuštěn, čímž bylo získáno 23,5 gramu produktu znečištěného piperidin-benzofulvenovým aduktem, jehož přítomnost byla prokázána analýzou hmotnostní spektroskopií. Získaná pevná látka byla rozpuštěna ve 400 mililitrech ethylacetátu,roztok byl přefiltrován, promyt 2 x 60 mililitry vody, vysušen nad bezvodým síranem hořečnatým, zahuštěn a získaná pevná látka byla sušena ve vakuu, čímž bylo získáno 12,55 gramu Arg-(Pmc)Val-Asp (OAllyl)-OBzl formě pevné bílé látky. (M_vyp. 784 M+l_Změř. 785) .

Syntéza Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl

K roztoku 6,73 gramu (15,8 milimolu) Fmoc-Glu(tBu) a 8,18 gramu (15,8 milimolu) benzotriazol-l-yloxy-trispyrrolídinfosfoniumhexafluorfosfátu (PyBOP) ve 105 mililitrech acetonitrilu bylo při teplotě 2 °C přidáno 1,58 gramu (15,8 milimolu) N-methylmorfolinu a reakční směs byla míchána 30 minut při teplotě 2 až 4 °C. Poté byl ke směsi během ··*· ·· · « ·· ·· ·· · 99 9 9 9 · · · ··· · · ···· ···· · · 9 · · · ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 999 999 9· 99 minut při teplotě 2 °C přidán roztok 12,4 gramu (15,8 milimolu) (L)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl v mililitrech acetonitrilu. Přidáním N-methylmorfolinu bylo pH směsi upraveno na hodnotu 7. Chlazení bylo přerušeno, směs byla ponechána ohřát na teplotu místnosti a míchána další 3 hodiny. Mléčně zakalená reakční směs byla pomalu přefiltrována a bílý zbytek byl přes noc usušen na filtru, čímž bylo získáno 10,8 gramu Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-ValAsp (Allyl ) -OBzl . Získaný filtrát byl zahuštěn za vzniku kaučukovité látky, která byla rozpuštěna ve 30 mililitrech acetonitrilu a ponechána stát 48 hodin, čímž bylo získáno dalších 3,45 gramu požadovaného produktu. Celkový výtěžek Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(Allyl)-OBzl tedy činil

14,3 gramu. (M_vyp. 1192; M+l_změř. 1192,4)

Syntéza Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(Allyl)-OBzl

K roztoku 12,3 gramu (10,3 milimolu) Fmoc-Glu(OtBu)Arg(Pmc)-Val-Asp(Allyl)-OBzl ve 105 mililitrech dichlormethanu bylo při teplotě místnosti přidáno 3,5 gramu (41,3 milimolu) piperidinu. Směs byla míchána 2 hodiny, naředěna heptanem, zahuštěna na polovinu svého původního objemu a ponechána stát přes noc v mrazáku. Matečný louh nad olejovitým zbytkem byl dekantován a olejovitý zbytek byl rozpuštěn v dichlormethanu. Vzniklý roztok byl postupně promyt 0,5 molární kyselinou citrónovou, vodou, solankou, vysušen nad bezvodým síranem hořečnatým, přefiltrován a zahuštěn. Surový pevný produkt byl dvakrát tríturován heptanem a přefiltrován, čímž bylo získáno 9,0 gramů Glu(OtBu)-(L)Arg(Pmc)-Val-Asp(Allyl)-OBzl ve formě bílého prášku. (M_vyp. 970,2; M+l_změř. 971).

···· Φ· • ·

Syntéza Fmoc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)OBzl

K suspenzí 4,2 gramu (9,3 milimolu) Fmoc-Lys(Alloc) a 4,8 gramu (9,3 milimolu) benzotriazol-l-yloxy-trispyrrolidinfosfoniumhexafluorfosfátu (PyBOP) v 69 mililitrech acetonitrilu bylo při teplotě 5 °C přidáno 0,94 gramu (9,3 milimolu) N-methylmorfolinu a vzniklý roztok byl míchán 30 minut při teplotě 5 °C. K roztoku byla přidána suspenze 9 gramů (9,3 milimolu) Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(Allyl)-OBzl v 52 mililitrech acetonitrilu, takže výsledná reakční směs byla bíle zakalená. Ke směsi byl přidáván N-methylmorfolin dokud její pH nedosáhlo hodnoty 7 a následně byla směs ponechána ohřát na teplotu místnosti a míchána 1,33 hodiny. Reakční směs byla přefiltrována a pevný zbytek byl promyt 2 x 40 mililitry acetonitrilu a sušen přes noc ve vakuu v proudu dusíku, čímž bylo získáno 12,8 gramu bíle zabarvené pevné krustovité látky, která byla triturována 200 mililitry methyl terč. butyletheru, izolována filtrací a usušena, čímž bylo získáno 9,7 gramu Fmoc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-ValAsp (OAllyl ) -OBzl . (M_vyp. 1404,7; M+l_změř. 1406).

b. Odstranění allylové a allyloxykarbonylové (alloc) skupiny z Lys¹⁸ a Asp²²: syntéza Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-AspOBzl

Do tříhrdlé baňky o objemu 1 litr opatřené mechanickým míchadlem, kterou proudil dusík, bylo při teplotě místnosti přidáno 167 mililitrů dichlormethanu a 1,37 gramu (1,18 milimolu, 0,2 ekvivalentu) Pd(PPh₃)₄. Oranžovým roztokem byl 2 minuty probubláván dusík a následně byl do směsi

0000 »0 0 0 00 00 0 0 · ·· · · · * · 0

0 0 0 0 »000 0 0 0 0 · 0 0 0 0 ·» ···· · 0 · · 0 · • 0 00 «00 ·0· ·0 00 postupně přidán roztok 8,3 gramu (5,91 milimolu,

1,0 ekvivalent) Fmoc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-ValAsp(OAllyl)-OBzl v 66,4 mililitrech dimethylformamidu a

13,3 gramu (124 milimolu, 21 ekvivalentů) methylanilinu. Vzniklý roztok byl míchán při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a směs byla naředěna 700 mililitry methyl terč. butyletheru, který způsobil vytvoření pevné látky. Vzniklá suspenze byla míchána 1 hodinu a přefiltrována. Pevný zbytek byl triturován 200 mililitry methyl terč. butyletheru, přefiltrován a usušen, čímž bylo získáno 5,0 gramů světle žluté pevné látky. Z filtrátu byl dále izolován druhý podíl produktu o hmotnosti 1,1 gramu ve formě světle žluté pevné látky, takže celkem bylo získáno 6,1 gramu Fmoc-Lys-Glu(OtBu) Arg (Pmc)-Val-Asp-OBzl. (M_vyp. 1280, 6; M+l_změř. 1281).

c. Vytvoření laktamového můstku Lys¹⁸-Asp²²: syntéza

Fmoc-cyklo(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OBzl

Ve tříhrdlé baňce o objemu 1 litr bylo při teplotě místnosti rozpuštěno 6,0 gramů (4,69 milimolu)

Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OBzl ve 300 mililitrech dimethylformamidu a do roztoku bylo postupně přidáno 3,44 gramu (6,61 milimolu, 1,41 ekvivalentu) benzotriazol-1yloxy-tris-pyrrolidinfosfoniumhexafluorfosfátu (PyBOP),

0,89 gramu (6,57 milimolu, 1,40 ekvivalentu) hydrátu hydroxybenzotriazolu a 1,73 gramu (13,4 milimolu;

2,85 ekvivalentu) diisopropylethylaminu. Výsledný oranžový roztok byl 1 hodinu míchán při teplotě místnosti a následně zředěn 300 mililitry vody, což vedlo ke vzniku olejovitého zbytku. Zakalený matečný louh, který obsahoval většinou nečistoty, byl dekantován, olejovitý zbytek byl míchán přes ·«·· ·« • · · • · # • · · · • · · · • i a >

• a * · <· ·· noc ve 100 mililitrech vody, čímž vznikla krustovitá pevná látka, která byla izolována filtrací a bylo získáno 4,2 gramu světle žluté pevné látky. Z filtrátu byl dále izolován 1,0 gram druhého podílu produktu ve formě žluté pevné látky, takže celkově bylo získáno 5,2 gramu Fmoc-cyklo(Lys-Asp)LysGlu (OtBu)-Arg ( Pmc)-Val-Asp-OBzl. (M_vyp. 1262; M+l_zraěř. 1262,5).

d. Odštěpení benzylesterové skupiny: syntéza

Fmoc-cyklo(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH

K roztoku 5,9 gramu (4,7 milimolu) Fmoc-cyklo(Lys-Asp)Lys Glu-Arg-Val-Asp-OBzl v 25 mililitrech dimethylformamidu bylo přidáno 5,9 gramu aktivního uhlí, směs byla přefiltrována a k filtrátu bylo přidáno 0,59 gramu 10 procentního palladia na uhlí a směs byla převedena do vodíkové atmosféry o tlaku 344,7 kilopascalu (50 psig) v aparatuře Parr. Po uplynutí

1,5 hodiny byla směs přefiltrována, bylo k ní znovu přidáno aktivní uhlí, byla opět přefiltrována a bylo k ní znovu přidáno 0,59 gramu 10 procentního palladia na uhlí a směs byla opět vystavena po dobu 2 hodin vodíkové atmosféře o tlaku 344,7 kilopascalu (50 psig). Směs byla přefiltrována a filtrát byl zředěn 50 mililitry vody a extrahován třikrát

200 mililitry methylenchloridu. Spojené methylenchloridové extrakty byly zahuštěny a bylo získáno 1,2 gramu Fmoc-cyklo(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH ve formě oleje. (M_vyp. 1171; M+l_zraěř. 1172,3).

3. Čištění

400 miligramů vzorku Fmoc-cyklo(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)Arg(Pmc)-Val-Asp-OH bylo rozpuštěno v 10 mililitrech směsi

999 9 • * • 9 • 9 * · · • ΰ ·

• 9

9

trifluorethan/isopropylalkohol (1:1). Tento vzorek byl nastříknut do dvou 5 mililitrových pístů na koloně pro preparativní vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) (jejíž náplň tvořil Microsorb MV C18, 300Ang, 8u a jejíž rozměry byly 41,4 x 250 milimetrů) ekvilibrované 55 procenty soustavy B (přičemž soustava A byla tvořena vodným roztokem kyseliny trifluoroctové o koncentraci 0,1 objemového procenta; a soustava B byla tvořena směsí acetonitril/isopropylalkohol (75 objemových procent:25 objemových procent) obsahující 0,1 procenta kyseliny trifluoroctové). Nástřik byl vymýván rychlostí 70 mililitrů/minutu s postupným zvýšením koncentrace fáze B z 55 procent na 65 procent během 30 minut, z 65 procent na 95 procent fáze B během 1 minuty a následně byla kolona vymývána 10 minut 95 procenty fáze B. Roztok vycházející z kolony byl monitorován ultrafialovým detektorem pracujícím při vlnové délce 210 nanometrů. Frakce, jejichž koncentrace byla 93,5 A procenta a vyšší byly spojeny a zahuštěny na vakuové odparce. Lyofilizací zbytku bylo získáno 200 miligramů Fmoc-cyklo(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH.

(M_vyp. 1171; M+lzměř. 1172,6).

Stupeň 3

Fmoc-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-resin gram (0,185 milimolů) Fmoc-[Trp²³ (Boc) , Arg²⁵ (Pmc), Lys²⁶(Boc), Leu²⁷, Gin²⁹ (Trt) HPTH (23-31)-chlortritylovaného polymerního nosiče byl nabotnán třepáním v 10 mililitrech dimethylformamidu po dobu 30 minut, zbaven rozpouštědla, a • · · · · · • · « r · * · · ·· * • β · · · · · · • 9 « » ♦ ·«· ·· · • 9 · · · 9··® ·· «9 ··· ··· Η ** minut třepán v 10 mililitrech směsi obsahující objemových procent piperidinu v dimethylformamidu.

Polymerní nosič byl zbaven kapaliny a promyt 3 x 20 mililitry dimethylformamidu. Poté k němu byl přidán roztok 240 miligramů (0,205 milimolu, 1,1 ekvivalentu) Fmoc-cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) LysGlu (OtBu)-Arg (Pmc)-Val-Asp-OH, 312 miligramů (0,6 milimolu, ekvivalenty) benzotriazol-l-yloxy-tris-pyrrolidinfosfoniumhexafluorfosfátu (PyBOP) a 156 miligramů (1,2 milimolu, 6 ekvivalentu) diisopropylethylaminu v mililitrech dimethylformamidu a výsledná směs byla míchána po dobu 16 hodin. Polymerní nosič byl zbaven rozpouštědel a promyt 3 x 20 mililitry dimethylformamidu (výsledek TNBS testu byl pozitivní) a byla k němu znovu přidána směs

Fmoc-cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) Lys-Glu (OtBu) -Arg (Pmc) -Val-Asp-OH, benzotriazol-l-yloxy-tris-pyrrolidinfosfoniumhexafluorfosfátu (PyBOP) a diisopropylethylaminu a vzniklá směs byla opět míchána dalších 16 hodin. Následně byl polymerní nosič zbaven rozpouštědel a promyt 3 x 10 mililitry dimethylformamidu (TNBS test: negativní). Alikvotní podíl výsledného, shora uvedeného peptidu, byl odštěpen z polymerního nosiče postupem popsaným ve stupni 2, způsobu A pomocí reakčního činidla K za vzniku peptidového fragmentu obsahující postranní řetězce s nechráněnými skupinami. (LC-MS: M_vyp. 2001; M_změř. 2000,5). Zbývající peptid byl použit ve stupni 4.

Stupeň 4

Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(OtBu)-Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Vaí-Asp^lrP(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-resin

Požadovaný peptid vázaný k polymernímu nosiči byl připraven odstraněním 9-fluorenylmethyloxykarbonylové skupiny • •09 · · !»

(Fmoc) z 1,38 gramu (0,244 milimolu podle titru Trp²³) peptidu vázaného k polymernímu nosiči, jehož příprava byla popsána ve stupních 1 až 3, a následným postupným střídáním stupně odstraňování 9-fluorenylmethyloxykarbonylové skupiny (Fmoc) a adice 0,5 milimolu každé z následujících složek:

Fmoc-Ser(OtBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH,

Fmoc-His(Trt)-OH a Fmoc(Boc)-OH způsobem popsaným ve stupni 1, přičemž bylo použito 190 miligramů (0,5 milimolu)

O-benzotriazol-l-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroníumhexafluorfosfátu (HBTU) a 2 milimoly N-methylmorfolinu v 25 mililitrech dimethylformamidu. Adice probíhaly při teplotě místnosti po dobu přibližně 1 hodiny. Výsledný peptid vázaný k polymernímu nosiči byl promyt 25 mililitrovýmí dávkami dimethylformamidu, tetrahydrofuranu a diethyletheru a jeho usušením ve vakuu bylo získáno 1,93 gramu produktu. Alikvotní podíl výsledného, shora uvedeného peptidu byl odštěpen z polymerního nosiče dále popsaným postupem (činidlo K) za vzniku peptidového fragmentu obsahující postranní řetězce s nechráněnými skupinami. (LC-MS: M_vyp. 2579, 4; M_změř. 2580,7), jehož čistota byla 52 A procent.

Stupeň 5

Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-lle-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-OH FMOC-[Ala', Ser^OtBu), Glu⁴(OtBu), Gln⁶(Trt), His⁹(Trt), Asn'°(Trt)Nle*]hPTH(l-12)

Shora uvedený peptid byl připraven adicí 2,65 gramu (5 milimolů) Fmoc-Leu-OH k 5 gramům (3 milimolům) 1 procentně síťovaného Gly-2-chlortritylovaného polymerního nosiče obsahujícího 0,6 milimolu Gly-2-chlotritylových skupin/gram polymeru, která byla prováděna třepáním po dobu 30 minut v přítomnosti 3,9 gramu (7,5 milimolu) benzotriazol-l-yloxy80 • •44 « ·

44 ·· · · · · · 4 · · · • · · 4 4 *444 *··· 4 444 44 4 **·· 4 · 4 4 4 4 • 4 4 4 444 · 4 4 44 44 tris-pyrrolidinfosfoniumhexafluorfosfátu (PyBOP), 1,94 gramu (15 milimolů) diisopropylethylaminu v 50 mililitrech směsi dimethylformamid/tetrahydrofuran. Polymerní nosič byl poté zbaven rozpouštědel, promyt pěti podíly směsi dimethylformamíd/tetrahydrofuran a jedním podílem methanolu (ninhydrinový test: negativní). Uvedený polymerní nosič byl jednou promyt dimethylformamidem a byl dvakrát rozmíchán v 60 mililitrech směsi obsahující 20 procent piperidinu v dimethylformamidu, vždy na dobu 15 minut, přičemž mezi jednotlivými přídavky byl polymerní nosič promyt x 60 mililitry dimethylformamidu a 60 mililitry methanolu. Výsledek ninhydrinového testu po druhém rozmíchání polymerního nosiče v uvedené směsi byl vysoce pozitivní. Uvedený cyklus byl opakován, přičemž v každém následujícím stupni trvalo míchání ve směsi piperidin/dimethylformamid 30 minut a bylo použito vždy 2,5 molárního ekvivalentu následujících složek: Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Nle, Fmoc-Leu,

Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ser(OtBu), Fmoc-Val a Fmoc-Ala spolu s 2,5 molárního ekvivalentu benzotriazol-l-yloxy-tris-pyrrolidinfosfoniumhexafluorfosfátu (PyBOP) a s 2,5 molárního ekvivalentu diisopropylethylaminu. Výsledný peptid byl odštěpen od polymerního nosiče třepáním ve 100 mililitrech směsi kyseliny octové/trifluorethylenu/ dichlormethanu (1:1:8) po dobu 1 hodiny. Z kapaliny byl izolován polymerní nosič, který byl promyt 200 mililitry dichlormethanu a promývací roztok byl spojen s hlavním podílem kapaliny. Takto spojené kapalné podíly byly odpařeny postupně z hexanu, ethylacetátu a isopropylalkoholu. Zbytek byl triturován s diethyletherem, usušen přes noc ve vakuu a bylo získáno 2,24 gramu požadovaného peptidu (jehož čistota podle analýzy vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) byla

A procent). Polymerní nosič byl znovu vystaven podmínkám, za kterých docházelo k odštěpení peptidu a kapalina byla zpracována shora popsaným postupem, čímž byl získán druhý podíl požadovaného peptidu, jehož hmotnost byla 2,75 gramu (a jehož čistota podle analýzy vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) byla 00 A procent), takže celkový výtěžek peptidu byl 4,95 gramu (2,1 milimolů, výtěžek 70 procent vztaženo na polymerní nosič). (LC-MS: M_vyp. 1514,8; M_změř. 1514,7). Takto získaný materiál byl přímo použit ve stupni 6.

Stupeň 6

Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-GlyI i

Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(OtBu)-Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Vai-AspTrp(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-resin

900 miligramů (0,144 milimolů) peptidu připraveného ve stupni 5 bylo nabotnáváno třepáním v 15 mililitrech dimethylformamidu po dobu 40 minut, polymerní nosič byl zbaven rozpouštědla a vystaven působení 15 mililitrů směsi obsahující 20 objemových procent piperidinu v dimethylformamidu po dobu 45 minut. Polymerní nosič byl zbaven rozpouštědel a promyt 3 x 30 mililitry dimethylformamidu (výsledek testu TNBS polymerního nosiče byl negativní). K takto promytému polymernímu nosiči bylo přidáno 15 mililitrů dimethylformamidu, 775 miligramů (0,33 milimolů, 2,7 molárního ekvivalentu na základě titru aminokyseliny na pozici 23) Fmoc[Ala¹, Ser³ (OtBu),Glu⁴(OtBu),Gin⁶(Trt),His⁹(Trt),

Asn¹⁰(Trt),Nle⁸) hPTH(1-12) připraveného ve stupni 4, • · · ·

151 miligramů (0,29 milimolu, 0,21 molárního ekvivalentu) benzotriazol-l-yloxy-tris-pyrrolidinfosfoniumhexafluorfosfátu (PyBOP), 39 miligramů (0,25 molu) hydrátu hydroxybenzotriazolu a 75 miligramů (0,58 milimolu) diisopropylethylaminu a výsledná směs byla míchána třepáním po dobu 3 dnů. Polymerní nosič byl zbaven rozpouštědel, promyt třikrát 30 mililitry dimethylformamidu (byla prokázána přítomnost částic reagujících při testu TNBS mírně pozitivně i mírně negativně), vystaven působení 15 mililitrů směsi obsahující 20 objemových procent piperidinu v dimethylformamidu, zbaven rozpouštědel a postupně promyt třikrát 15 mililitry dimethylformamidu, mililitry tetrahydrofuranu a 15 mililitry diethyletheru a vysušen. Z peptidu byly odštěpeny chránící skupiny přítomné v postranních řetězcích a peptid byl odštěpen z polymerního nosiče způsobem popsaným ve stupni 7.

Stupeň 7

Aia-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Nle-His-Asn-Leu-Giy-Lys-His-Leu-AsnSer-Lys-GIu-Arg-Val-Asp-Trp-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Val-NH ₂

Z peptidu vázaného k polymernímu nosiči, který byl připraven ve stupni 6, byla postupem popsaným ve stupni 1, způsob A, odštěpena 9-fluorenylmethyloxykarbonylová skupina (Fmoc) vázaná k Ala¹. Poté byly z peptidu vázaného k polymernímu nosiči působením směsi kyseliny trifluoroctové/fenolu/thioanisolu/ethandithiolu a vody (33:2:2:1:2) (označované také jako reakční činidlo K z celkovým zředěním 10 mililitrů činidla/gram peptidu vázaného k polymernímu nosiči) po dobu 3 hodin odštěpeny • · · · «· · · · ·· · • · · · · · • ·»···* • · · · · · • · · · · · * · · * chránící skupiny přítomné v postranních řetězcích, přičemž zároveň došlo k odštěpení peptidu z polymerního nosiče. Polymerní nosič byl zbaven rozpouštědel a produkt byl vysrážen z filtrátu přidáním reakční směsi do vychlazeného methyl terč butyletheru, jehož množství bylo 50 mililitrů/gram peptidu vázaného k polymernímu nosiči. Uvedená směs byla ponechána stát po dobu 15 minut a odstředěna (5 minut při 2000 otáčkách za minutu). Kapalina nad usazenou sraženinou byla dekantována a pevný zbytek byl promyt diethyletherem.

Směs byla rozdělena odstředěním a supernatant byl odstraněn. Zbylá pevná látka byla pro zajištění úplného odstranění skupin citlivých na přítomnost kyseliny míchána 1 hodinu v 0,1 procentní vodné kyselině trifluoroctové (jejíž množství bylo 6 mililitrů/gram peptidu vázaného k polymernímu nosiči). Vzniklý roztok byl lyofilizován za vzniku 414 miligramů peptidu shora uvedené struktury ve formě pevné bílé látky (o čistotě 37 procent, jehož čistota vyjádřená hmotnostním procentem byla 26,3 procenta a jehož výtěžek stanovený na Trp²³byl 26,3 procenta). (LC-MS: M_vyp. 3632,0; M+l_změř. 3633,4).

Stupeň 8: Čištění

Jeden gram materiálu, jehož příprava byla popsána výše, byl rozpuštěn v 10 mililitrech vody a tento roztok byl nastříknut na kolonu pro preparativní vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) o rozměrech

5,08 x 25 centimetrů (2' x 25 centimetrů) (která byla naplněna částicemi o velikosti 10 mikrometrů, 1,2 χ 10’⁸ metru (120 angstrómu) nebo 3,0 x 10‘⁸ metru (300 angstrómu)), která byla předem ekvilibrována směsí tvořenou 0,1 procentní vodnou kyselinou trifluoroctovou (složkou A)/ 0,1 procentní kyselinou trifluoroctovou v acetonitrilu (složkou B)/isopropylalkoholem (složkou C) v poměru 75:5:20. Kolona byla grandientově vymývána rychlostí 115 mililitrů/minutu směsí jejíž složení se během 30 minut změnilo z 75 procent složky A : 5 procentům složky B : 20 procentům složky C na 60 procent složky A :

procentům složky B : 20 procentům složky C, propláchnuta směsí obsahující 30 procent složky A, 60 procent složky B, procent složky C a následně byla kolona znovu ekvilibrována směsí obsahující 75 procent složky A, 5 procent složky B a 20 procent složky C. Roztok vytékající z kolony byl monitorován ultrafialovým detektorem pracujícím při vlnové délce 280 nanometrů. Frakce obsahující požadovaný peptid o čistotě přibližně 75 procent byly spojeny a zahuštěny na rotační odparce při teplotě přibližně 35 °C. Zahuštěný vodný roztok byl nanesen na stejnou preparativní kolonu a vymýván za stejných podmínek jako ve shora popsaném případě. Frakce obsahující peptid o čistotě 90A procent a vyšší byly spojeny a zahuštěny na rotační odparce při teplotě přibližně 35 °C. Zahuštěný roztok byl nanesen na stejnou preparativní kolonu, která byla předem ekvilibrována směsí tvořenou 75 procenty 0,1 molárního vodného roztoku octanu amonného (jehož pH bylo kyselinou octovou upraveno na hodnotu 6)(složky D), procenty acetonitrilu (složky E) a 10 procenty isopropylalkoholu (složky C) . Kolona byla grandientově vymývána rychlostí 115 mililitrů/minutu směsí jejíž složení se během 30 minut změnilo ze 75 procent složky D : 15 procentům složky E : 10 procentům složky C na 60 procent složky D :

procentům složky E : 10 procentům složky C a propláchnuta směsí obsahující 30 procent složky D, 60 procent složky E, procent složky C. Frakce obsahující požadovaný peptid o čistotě 95A procent nebo vyšší byly spojeny a lyofilizovány a φ · φ φ • φ · 4 φ φ φ 4 φ Φ Φ Φ 4

Φ Φ Φ 4

Φ · Φ Φ byl získán přečištěný produkt ve formě pevné acetátové soli (z 1 gramu surového produktu bylo získáno 100 až 200 miligramů produktu o čistotě přibližně 95A procent). Ve všech stupních byly obsah a čistota frakcí analyzovány analytickou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na koloně naplněné C18 (jejíž rozměry byly 4,6 milimetru x 25 centimetru, přičemž velikost částic tvořících náplň byla 5 mikrometrů, 1,2 x 10’⁸ metru (120 angstómů) nebo

3,0 x 10'⁸ metru (300 angstdmů)) s gradientovou elucí rychlostí 1 mililitr/minutu směsí jejíž složení se během 30 minut změnilo z 25 procent složky B na 40 procent složky B, přičemž složkou A byla 0,1 procentní kyselina trifluoroctová a složkou B byl 0,1 procentní roztok kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu. Detekce byla prováděna ultrafialovým zářením o vlnové délce 220 nanometrů.

» · · · ·

WO 99/52933 ~Í“

SEKVENČNÍ VÝPIS

VČT7ÚŠ99/08435'

<110>	Sledeski, Adam	i W.
	Mencel, James	J.
<120>	ZPŮSOB VÝROBY	CYKLICKÝCH PEPTIDŮ
	NOSIČI
<130>	A3113A-WO
<140>
<141>
<150>	60/081,897
<151>	1998-04-15
<160>	47
<170>	Patentln Ver.	2.0
<210>	1
<211>	31
<212>	PRT
<213>	Neznámý
<220>
<221>	PEPTID
<222>	(18)..(22)
<223>	„Postranní řetězce Lys v pozici
	jsou spojeny	amidovou vazbou
<220>
<221>	MOD RES
<222>	(8)
<223>	Nle
<220>
<221>	PEPTID
<222>	(31)
<223>	„Touto C-koncovou aminokyselinou
	conh₂
<400>	1
Ala Val Ser Glu Ile	Gin Leu Xaa His Asn
1	5	10
Ser Lys Glu Arg Val	Asp Trp Leu Arg Lys
	20	25
<210>	2
<211>	31
<212>	PRT
<213>	Neznámý
<220>	t
<221>	ťlOD_RES
<222>	(8).

-4.Í »

1/

PCT/US99/08435 ···· ·· • · · • · · • · · · • 9 9 ·

99

-2WO 99/52933 <223> Nle <220>

<22'1> PEPTID <222> (18)..(22) <223>

„Postranní řetězce Lys v pozici 18 a Asp v pozici 22 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 2

Ala Ala Ser 1

Glu

Ile Gin Leu Xaa His Asn

Leu Gly Lys His

Leu Asn 15

5

10

•

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

Asp

Trp

Leu

Arg

Lys

Leu

Gin

Asp

Val

20

25

30

<210> 3 <211> 31 <212> PRT , <213> Neznámý <220>

<221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> (18) .. (22) <223> „postranní řetězce Lys v pozici 18 a Asp v pozici 22 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina conh₂ <400> 3

Ala Val Ala Glu Ile Gin Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

5 10 15

Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val

25 30

<210>	4
<211>	31
<212>	PRT
<213>	Neznámý
<220>

i/

1/ • ·

WO 99/52933 “Ť

PCT/US99/08435 <221> MOD__RES <222> (8) <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> (18)..(22) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 18 a Asp v pozici 22 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 4

Ala 1

Val

Ser

Ala

Ile Gin Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His

Leu Asn 15

5

10

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

Asp

Trp

Leu

Arg

Lys

Leu

Leu Gin

Asp

Val

20

25

30

<210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> MOD_RES <222> (8)' <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> (18)..(22) . . <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 18 a Asp v pozici jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH, <400> 5

Ala Val Ser Glu Ala Gin Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1.5 10 15

Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val

25 30 <210> 6 <211> 31 ⁴<212> £rt <213> Neznámý i/

WO 99/52933	-	...... · · .··..·· • · · ·· 1 1 Ϊ i : :. : : .: : σ •Jv ·:· ····’··
-«r	PCT/US99/08435

<220>

<221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 6

Ala 1

Val

Ser

Glu

Ile 5

Ala

Leu

Xaa

His

Asn 10

Leu

Gly

Lys

His

Leu Asn 15

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

Asp

Trp

Leu

Arg

Lys

Leu

Gin

Asp

Val

25 30 <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> (18) . . (22) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 18 a Asp v pozici 22 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 7

Ala Val Ser Glu Ile Gin Ala Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15

Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val

25 30 <210> 8 <211> 31 iS

2/ • · · ·

PCT/US99/08435

- Μ

WO 99/52933 <212 > PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina conh₂ <400> 8

Ala 1

Val

Ser

Glu

Ile 5

Gin

Leu

Ala

His

Asn 10

Leu

Gly

Lys

His

Leu Asn 15

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

Asp

Trp

Leu

Arg

Lys

Leu

Gin

Asp

Val

25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle ' <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 9

Ala Val Ser Glu Ile Gin Leu Xaa His Ala Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15

Ser Lys. Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val 20 25 30 <210> 10 <211> 31 <212> PRT ‘ <213> Neznámý

1/ • · · 4 4

WO 99/52933 <220>

<221> MOD_RES <222> (8) <22-3> Nle

·..··..· .:· ·· PCT/US99/08435 <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 10

Ala 1	Val	Ser	Glu	Ile Gin Leu Xaa His Asn Ala Gly Lys His	Leu Asn 15
5	10
Ser	Lys	Glu	Arg	Val Asp Trp Leu	Arg Lys Leu Leu Gin Asp	Val
			20		25 30

<210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj . skupina CONH₂ <400> 11

Ala Val Ser Glu Ile Gin Leu Xaa His Asn Leu Ala Lys His Leu Asn

5 10 15

Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val

25 30 <210> 12 » <211> Í1 <212> PRT.

1/ i/ • a · ·

WO 99/52933 <213> Neznámý <22Q>

<221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle ” VCŤ/ÍUS99/O8435* <220>

<221> PEPTID' <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 12

Ala 1

Val

Ser

Glu

Ile 5

Gin Leu

Xaa His

Asn Leu Gly Ala 10

His

Leu Asn 15

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

Asp

Trp

Leu

Arg

Lys

Leu

Leu Gin

Asp

Val

20

25

30

<210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 13

Ala Val Ser Glu Ile Gin Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys Ala Leu Asn 15 10 15

Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val

25 30 <210> 14 i/

1' « 9 ···· ·« • * · • · « • · β • · · 4 • t ··

WO 99/52933 <211> 31 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> (18).. C <223> „postra jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 14

Ala Val Ser Glu Ile Gin Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Ala Asn 15 10 15

Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val 20 25 30 <210> 15 <211> 31 <212> PRT' <2i3> Neznámý <220>

<221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 15

Ala Vál Ser Glu Ile Gin Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Ala 5 10 15

Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val ‘ 20 25 30

Ser

22) «· «

99

9 <

• # • · • · ·«

PCT/US99/08435 nni řetězce Lys v pozici 18 a Asp v pozici 22 í/

1/

9 9 9 • ·

WO 99/52933 • · β · 9 9 • 9 «9 9 99 9 · · · · *

9 9*···

9 9 · · 9

999 999 9» 9 *

PCT/US99/08435 <210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> MOD_RES <222> (9) <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> (13)..(17) <223>„Postranní řetězce Lys v pozici 13 a Asp v pozici 17 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂

<400> 16 Ala Val Ser 1

Glu

Ile 5

Gin

Leu

Xaa

His

Asn 10

Leu

Gly

Lys

His

Leu Asn 15

Asp Lys Glu

Arg 20

Val

Asp

Trp

Leu

Arg 25

Lys

Leu

Gin

Asp 30

Val

<210> 17 <211> 31 <212 > PRT <213> Neznámý <220>

<221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> .(18) . . (22) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 18 a Asp v pozici 22 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (2^) . . (30) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 26 a Asp v pozici 30 Ijsou spojeny amidovou vazbou i/ i/

WO 99/52933 +Ů• · · • » · * • · · • · · · ·· 99 • 9 ® · • · · · «9 · · ·

FČT/UŠ99/08435 <220>

<221> PEPTID <222> (31) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 17

Ala 1

Val

Ser

Glu

Ile Gin Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His

Leu Asn 15

5

10

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

Asp

Trp

Leu

Arg

Lys

Leu

Leu Gin

Asp

Val

20

; i

25

30

<210> 18 <211> 34 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> (34) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina . CONH_Z <400> 18

Ala Val Ser Glu Ile Gin Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15

Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val His 20 25 30

Asn Phe

<210>	19
<211>	34
<212>	PRT
<213 >	Neznámý
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(8)‘
<223>	lile

Z/

1/ • ·

PCT/US99/O8435

WO 99/52933 <?rd-r <220>

<221> PEPTID <222> (13)..(17) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 13 a Asp v pozici 17 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (34) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 19

Ala 1

Val

Ser

Glu

Ile 5

Gin

Leu

Xaa His

Asn 10

Leu

Gly Lys

His

Leu 15

Asn

Asp

Lys

Glu

Arg

Val

Asp

Trp

Leu Arg

Lys

Leu

Leu Gin

Asp

Val

His

25 30

Asn Phe <210> 20 <211> 34 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (34) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 20

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 15

Asp Lys Arg Arg Arg Asp Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30

Thr Ala i

<210> 21 i/ • · · ·

PCT/TJS99/08435 ··

WO 99/52933 <211> 34 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (34) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 21

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 15

Asp Lys Arg Arg Arg Asp Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His 20 25 30

Thr Ala <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221 > PEPTID <222> (12)..(16) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 12 a Asp v pozici 16 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (28)

<223> „Touto C-koncovou aminokyselinou	je	amid, tj. skupina
	conh₂
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(2)
<223>	Nle
<400>	•22
Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn	Ser	Lys Glu Arg Val Asp
1	5 10		15
Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val His	Asn	Phe
	20 25

t i

<210> 23 i/ i/ • · · ·

WO 99/52933 -γ·?

-+3 <211> 28 <212> PRT <213> Neznámý ♦ · * 9 9

9 · 9 9

... . ; Ρ€Τ/υ|^/0?435 «9 999 999 9 9 99 <220>

<221> PEPTID <222> (12) . . (16) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 12 a Asp v pozici 16 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (28) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂

<400> 23 Leu Leu 1	His	Asp	Lys 5	Gly	Lys	Ser	Ile	Gin 10	Asp	Lys	Arg Arg Arg Asp 15
Phe Leu	His	His	Leu	Ile	Ala	Glu	Ile	His	Thr	Ala
		20					25

<210> 24 <211> 28 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> (7)..(11) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 7 a Asp v pozici 11 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (12)..(16) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 12 a Asp v pozici 16 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (28) <223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 24

Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Asp Lys Glu Arg Val Asp 15 10 15

Trp Leu i Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val His Asn Phe 20 25 í;

• · • ·

WO 99/52933

PCT/US*99/0S435 <210> 25 <211> 28 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> MOD_RES <222> (2) <223> Nle <220>

<221> PEPTID <222> (20)..(24) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 20 a Asp v pozici 24 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (28) ^<223> „Touto C-koncovou aminokyselinou je amid, tj. skupina CONH₂ <400> 25

Leu Xaa. His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser' Lys Glu Arg Val Asp 1 5 10 15

Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val His Asn Phe 20 25 <210> 26 <211> 34 <212> PRT <213> Neznámý <400> 26

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn ¹ 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His

25 30

Asn Phe <210> 27 <211> 34 ‘ <2i2> Vrt <213> Neznámý

1/ i/ • · · ·

WO 99/52933

FČT/UŠ99/08435 <400> 27

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin · 5 10 15

Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His

25 30

Thr Ala · <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (1) <223> FMOC-Trp(BOC) <220>

<221> PEPTID <222> (3) <223> Arg(PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (4) <223> Lys(BOC) <220>

<221> PEPTID <222> (7) <223> Gin(Trt) <220>

<221> PEPTID <222> (8) <223 > Asp(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (9) <223> „Tato C-koncová aminokyselina je vázána amidovou vazbou k chlortritylovanému polymernímu nosiči <400> 28

Trp Leu Árg Lys Leu Leu Gin Asp Val 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT* <213> Neznámý i/

1/ '1

WO 99/52933

<220>
<221>	PEPTID
<222>	(I)
<223>	FMOC-Trp(BOC)
<220>
<221>	PEPTID
<222>	(3)
<223>	produkt=Arg(PMC)
<220>
<221>	PEPTID
<222>	(4)
<223>	produkt=Lys(BOC)

-JO® ' H-6 « · · » * ♦ » ·

PCf/U§s£/0§435 • «· «» • · · <220>

<221 > PEPTID <222> (7) <223> produkt=Gln(Trt) <220>

<221> PEPTID <222> (8) <223> produkt=Asp(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (9) <223> „Tato C-koncová aminokyselina je vázána amidovou vazbou k Rink amidovému MBHA polymernímu nosiči <400> 29

Trp Leu -Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (1) <223> FMOC-Lys <220>

<221> PEPTID <222> (1)..(5) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 1 a Asp v pozici 5 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> Glu(OtBu) <220>

WO 99/52933 <221> PEPTID <222> (3) <223 > Arg(PMC) • · · · ··

Pff/U539/(5S435 • · · · <22 0 >

<221> PEPTID <222> (1)..(5) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 1 a Asp v pozici 5 jsou spojeny amidovou vazbou <400> 30

Lys Glu Arg Val Asp 1 5 <210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (1) <223> FMOC-Lys <220>

<221> PEPTID <222> (1) . . (5) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 1 a Asp v pozici 5 j_souspojeny amidovou vazbou ^J <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> Glu(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (3) <223> Arg(PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (1) . . (5) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 1 a Asp v pozici 5 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (6) <223> Trp(BOC) <220>

<221> PEPTID <222> (8) <223> Arg(PMC) i

<220>

si

WO 99/52933 ···· ·· • « · ·

Pff/USÍ9/(®435 • · « · • · · * · <221> PEPTID <222> (9) <223> Lys(BOC) ’ <220>

<221> PEPTID <222> (12) <223 > Gin (Trt.) <220>

<221> PEPTID <222> (13) <223> Asp(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (14) <223> „Tato C-koncová aminokyselina je vázána amidovou vazbou k Rink amidovému MBHA polymernímu nosiči <400> 31

Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val 15 10 <210> 32 <211> 19 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (1) <223> FMOC-Lys(BOC) <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> His(Trt) <220>

<221> PEPTID <222> (4) <223> Asn(Trt) <220>

<221> PEPTID <222> (5) <223> Ser(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (6)..(10) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 6 a Asp' v pozici 10 jsou spojeny amidovou vazbou <220> i <221> PEPTID

1/

WO 99/52933 Η <222> (7) <223> Glu(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (8) <223> Arg(PMC)

9 · ♦ • 9 9 ·

99 feq;/ys29/08435 • · · · • · · · • · · · »· «« <220>

<221> PEPTID <222> (6)..(10) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 6 a Asp v pozici 10 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (11) <223> Trp(BOC) <220:· <221> PEPTID <222> (13) <223> Arg(PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (14) <223> Lys(BOC) <220>

<221> PEPTID <222> (17) <223> Gln(Trt) <220>

<221> PEPTID <222> (18) <223> Asp(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (19) <223> „Tato C-koncová aminokyselina je vázána^amidovou vazbou k chlortritylovanému polymernímu nosiči <400> 32

Lys His Leu Asn Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu 15 10 15

Gin Asp Val <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Neznámý

WO 99/52933	/7		···:.··. J*€JíeS99/08435 « i . · ·
<220?			·· · · · · · · · * * • « * · · * · * · _ Φ* «· ··· ··· «· ··

<221? PEPTID <222? (1) , ’ <223> FMOC-Ala <220?

<221? PEPTID <222? (3) <223? Ser(OtBu) <220?

<221? PEPTID <222? (4) <223? Glu(OtBu) <220?

<221? PEPTID <222? (6) <223? Gln(Trt) <220?

<221? PEPTID <222? (9) <223? HislTrt) <220?

<221? PEPTID <222? (10) <223? Asn(Trt) <400? 33

Ala Val Ser Glu Ile Gin Leu His Asn Leu Gly 15 10

<210?	34
<211?	30
<212?	PRT
<213?	Neznámý
<220?
<221?	PEPTID
<222?	(1)
<223?	FMOC-Ala
<220?
<221?	PEPTID
<222?	(3)
<223?	Ser(OtBu)
<220?
<221?	PEPTID
<222?	(4)
<223?	Glu(OtBu)
<220?
<221?	PEPTID
<222?	(6)

WO 99/52933 /?

<223> Gln(Trt) <220>

<221> PEPTID <222> (9) <223> His(Trt) <220>

<221> PEPTID <222> (10) <223> Asn(Trt) <220>

<221> PEPTID <222> (13) <223 > Lys(BOC) <220>

<221> PEPTID <222> (14) <223> His(Trt) <220>

<221 > PEPTID <222> (16.) <223> Asn(Trt) <220>

<221> PEPTID <222> (17) <223> Ser(OtBu) x2-l ···· ·· • · ♦ fCT/VSa9/08435 • « · · • · · · • · ·' « ·· ·· <220>

<221> PEPTID <222> (19) <223> Glu(PtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (20) <223> Arg(PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (22)..(30) <223> „postranní řetězce Lys v -pozici 13 a Asp v pozici 30 jsou spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (23) <223> Trp(BOC)

WO 99/52933 ^/?		4444 4 • · 4 «4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 44 44*	PCT/US99/08435 4 4 4 * 4 4 * * 4 4 * 4 4 4 4' * 4 4 4 4 4. * *
<220>
<221>	PEPTID			1
<222>	(25)
<223>	Arg(PMC)
<220>
<221>	PEPTID
<222>	(26)
<223>	Lys(BOC)
<220>
<221>	PEPTID
<222>	(29)
<223>	Gln(Trt)
<220>
<221>	PEPTID
<222>	(18)
<223>	Asp(OtBu)
<220>
<221>	PEPTID
<222>	(30)·
<223>	„Tato C-koncová	aminokyselina je	vázána amidovou	vazbou

k Rink amidovému MBHA polymernímu nosiči <400> 34

Ala Val Ser Glu Ile Gin Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser 15 10 15

Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val 20 25 30 <210> 35 <211> 2 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID.

<222> (2) <223> Asp(OAllyl) <220>

<221> PEPTID <222> (1) <223 > BOC-Val <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> „Tato C-koncová aminokyselina je přítomna ve formě benzylesteru <400> 35

Val Asp /z

WO 99/52933 •··· ·· »· · • · · .« · • · · ·· ·» • · » » ^w ’ • ‘PfT^9Í08435 »·» ·· . ·· <210> 36 <211> 2 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<22l> PEPTID <222> (1) <223> „N-konec má formu hydrochlorídu <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> Asp(OAllyl) <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> „Tato C-koncová aminokyselina je přítomna ve formě benzylesteru <400> 36

Val Asp 1 <210> 37 <211> 3 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (1) <223> FMOC-Arg(PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (3) <223> Asp(OAllyl) <220>

<221> PEPTID <222> (3) <223> „Tato C-koncová aminokyselina je přítomna ve formě benzylesteru <400> 37

Arg Val Asp 1 k

<210> 38 <211> 3 i;

ς0Γ/Ι5599/ί)8435

WO 99/52933 /?

• · » · « · 9 9 <212> PRT <2i3> Neznámý <22Ó>

<221> PEPTID <222> (1) <222> Arg(PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (3) <223> Asp(OAllyl) <220>

<221> PEPTID <222> (3) <223> „Tato C-koncová benzylesteru aminokyselina je přítomna ve formě <400> 38 Arg Val Asp <210> 39 <211> 4 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (1) <223> FMOC-Glu(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> Arg(PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (4) <223> Asp(OAllyl) <220>

<221> PEPTID <222> (4) <223> „Tato C-koncová aminokyselina je přítomna ve formě benzylesteru <400> 39

Glu Arg Val Asp 1 <210> 40 <211> 4 <212 > PRT

1/

WO 99/52933 // <213> Neznámý

PCWS99/08435 • 4 · 4 4

4 4 · · ·

4 4 4 4

444 ·· 44 <220>

<221 > PEPTID ♦ <222> (1) <223> Glu(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> Arg(PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (4) <223> Asp(OAllyl) <220>

<221> PEPTID <222> (4) ^<223> „Tato C-koncová aminokyselina je přítomna ve formě benzylesteru <400> 40

Glu Arg Val Asp 1 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (1) <223> FMOC-Lys(Alloc) <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> Glu(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (3) <223> Arg(PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (5) <223> Asp(OAllyl) <220>

<221> PEPTID <222> (S) <223> „Tato C-koncová aminokyselina je přítomna ve formě benzylesteru

WO 99/52933 ,BeyiWS§9/08435

<400> 41

Lys Glu Arg Val Asp <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (1) <223> FMOC-Lys <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> Glu(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (3)· <223> Arg(PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (5) <223> „Tato C-koncová aminokyselina je přítomna ve formě benzylesteru <400> 42

Lys Glu Arg Val Asp 1 5 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (1) <223> FMOC-Lys <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> Glu(OtBu) rCWS»9/08435 » ·· 9 «» • · 9 · • · ® • · · · » · · · »· ·· ·

WO 99/52933 /?

<22 0> —/f'?'?

<221> PEPTID <222> (3) <:223> Arg (PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (5) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici spojeny amidovou vazbou <220>

<221> PEPTID <222> (5) <223> „Tato C-koncová aminokyselina je přítomna ve formě benzylesteru <400> 43

Lys Glu Arg Val Asp 1 5 • · · 9 9 · 9 9 · 9 ' · • ·· ·· a Asp v pozici 5 jsou <210> 44 <211> 5 <212> PRT' <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (1) <223 > FMOC-Lys <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> Glu(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (3) <223> Arg(PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (5) <223> „Postranní řetězce Lys v pozici 1 a Asp v pozici 5 jsou spojeny amidovou vazbou <400> 44

Lys Glu Arg Val Asp 1 5

WO 99/52933 /?

·«<· •

· • 0

0« « · * · • « · • » ·· • P<WS99/08435 • · · · · · • · · · í í Ϊ • · · ·

0· · ♦·· »·, ·· <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (1) <223> FMOC-Lys(Alloc) <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> Glu(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (3) <223> Arg(PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (5) .

<223 > Asp-(OAllyl) <220>

<221> PEPTID <222> (5) <223> „C-konec Asp je vázán amidovou vazbou k chlortritylovanému polymernímu nosiči <400> 45

Lys Glu Arg Val Asp 1 5

<210>	46
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Neznámý
<220>
<221>	PEPTID
<222>	(1)
<223>	FMOC-Lys
<220>
<221>	PEPTID
<222>	(2)
<223>	Glu(OtBu)
<220>
<221>	PEPTID
<222>	(3)
<223>	Arg(PMC)

<220>

<221>

<222>

<223>

WO 99/52933 /?

PEPTID (5)

. · · PC3VJJS99/08435 • * · · * · * * • · · · „C-konec Asp je vázán amidovou vazbou 'k chlortritylovanému polymernímu nosiči <400> 46

Lys Glu Arg Val Asp 1 5 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<221> PEPTID <222> (1) <223> FMOC-Lys <220>

<221> PEPTID <222> (1) ^<223> „C-konec Asp je vázán amidovou vazbou k chlortritylovanému polymernímu nosiči <220>

<221> PEPTID <222> (2) <223> Glu(OtBu) <220>

<221> PEPTID <222> (3) <223> Arg(PMC) <220>

<221> PEPTID <222> (5) <223> „C-konec Asp je vázán k chlortritylovanému polymernímu nosiči <400> 47

Lys Glu Arg Val Asp 1 5 w ' -τ. 1»Ι(„ VáCTEéíU ^WFfiAm^Háífflvaa

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1.

Způsob výroby sloučeniny obecného vzorce

kde - J, L, a M jsou lineární peptidové fragmenty, Ki není přítomna nebo je cyklický peptidový • fragment, a K₂ je cyklický peptidový fragment;

vyznačující se tím, že zahrnuje (1) přípravu postupným připojováním vhodně chráněných aminokyselinových zbytků k polymernímu nosiči za vzniku struktury obecného vzorce (III) kde je polymerní nosič vhodný pro syntézu peptidů a je polypeptidový fragment;

g-V” x/Z/999 9 · 9999

99 99 · 999 99 9 • 999 9 9 *999

99 99 999 999 99 99 (2) oddělenou přípravu cyklického peptidového fragmentu, obecného vzorce (IV), jehož N-konec je chráněný a jehož příprava zahrnuje běžně používaný způsob syntézy peptidů

PHN^ CO_H K₂ ² (IV) kde p je skupina vhodná pro chránění aminokyseliny, (3) spojení fragmentů (III) a (IV) obecného vzorce (V) za vzniku peptidu (V); přičemž (4) pokud skupina K₂ není přítomna, potom (a) uvedený způsob zahrnuje přípravu polypeptidových fragmentů J a L ve formě jediného polypeptidu obecného vzorce (VI)

PHN.

co₂h (VI) a spojení polypeptidu obecného vzorce (VI) s peptidem obecného vzorce (V) za vzniku peptidu obecného vzorce (VII)

3% nebo případně (b) postupné přidávání jednotlivých aminokyselinových prvků

9 9 9 · · 9 9 9 9

9 9 9 9 · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 999 999 99 99 (VII) ochráněných polypeptidů J a L k peptidovému fragmentu obecného vzorce (V), nebo případně (c) oddělenou přípravu jedné nebo obou skupin J a L ve formě peptidových fragmentů a jejich spojení s rostoucím peptidem, jehož řetězec začíná fragmentem obecného vzorce (V);

(5) pokud cyklická skupina K_x je přítomna, potom (a) uvedený způsob zahrnuje oddělenou přípravu polypeptidového fragmentu obecného vzorce (VIII)

PHN _XCO„H Kf ² (VIII) kde

P je skupina vhodná pro chránění aminos kupiny, přičemž tato příprava probíhá běžně používaným způsobem syntézy peptidů;

(b) přípravu peptidového fragmentu obecného vzorce (IX)

PHN. /CO-H L ² (IX) a jeho spojování s peptidovým fragmentem obecného vzorce >9(V) za vzniku peptidového fragmentu obecného vzorce (X)

PHN-L- a (c) spojení cyklického peptidového fragmentu (VIII) s peptidovým fragmentem obecného vzorce (X) za vzniku peptidového fragmentu obecného vzorce (XI)

PHN L ^K1 (XI) ;

(d) přípravu fragmentu obecného vzorce (XII)

PHN^ ^CO₂H vl (xii) který je následně spojován s fragmentem obecného vzorce (XI) ; a (6) odštěpení polymerního nosiče a chránících skupin.
2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že sloučeninou obecného vzorce (I) je cyklický peptid obecného vzorce

X^-Alo^_All-Al2^-Al3~Ai4-Ai5-Ai6-Ai7-Ai8’'Ai9-A20^-A21^-A22^-A23-A2 4^_A25^-A26-A27^-Y

9 99 9 99

9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 · ·· 9 9 kde substituent X je vybrán ze skupiny zahrnující (a) Ri_a-Ao^-Ai-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8^_A9-, (b) R_la-A2^_A3-A4-A5-Ag-A7-Ag-A9- , (c) Ri_b-A3-A4-A₅-A6-A7-A₈-A9-, (d) R]__a-A4-A5-A6-A7-Ag-A9-, (e) Ri_a-A₅-A6-A7-A₈-A9-, (f) Ri_a-A6-A7-Ag-Ag-, (g) Ri_a ^—A7 ^— Ag ^— Ag^— , (h) Rx_a ^— Ag—A9—, (í) Rla^-A9-, a (j) R_ia;

substituent Y je vybrán ze skupiny zahrnující (a) -R3/· (b) - A₂₈-R₃, (c) - A₂₈-A₂g-R₃, (d) — A₂₈ ^—A₂g^—A30*·R3, (e) -A₂8-A₂g-A3o-A3i-R3, (f) -A₂g-A₂9-A30-A3i-A3₂-R3, (g) - A₂8^-A29^-A30-A31-A32 ~ A33-R3, a ( h) -A2g-A₂9-A30-A3i-A32-A₃3-A34-R3 ;

R_la je atom vodíku, alkylová skupina, aralkylová skupina nebo skupina -COR₂;

»

Rlb je skupina R_la nebo skupina obecného vzorce

R₂ je alkylová skupina, alkenylová skupina, alkinylová skupina, arylová skupina nebo aralkylová skupina;

R₃ je skupina obecného vzorce

A35-OR4 nebo A35—NR4R5 kde

R₄ a R5 jsou nezávisle na sobě atomy vodíku nebo nižší alkylové skupiny;

R₆ a Rg jsou nezávisle na sobě atomy vodíku nebo alkylové skupiny;

R? je alkylová skupina;

Rg je atom vodíku, alkylová skupina nebo skupina obecného vzorce COR₂;

R10 je atom vodíku nebo atom halogenu;

Rn je alkylová skupina nebo aralkylová skupina;

····<· · · ·· · ··· · · · · · · ···· · ····♦· • · a · · · ···· ·· ·· ··· ··· ·· ·· m j e 1, 2 nebo 3;

n j e 3 nebo 4;

A_o není přítomen nebo je peptid složený z jednoho až šesti aminokyselinových zbytků;

Αχ je Ser, Ala, Gly nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₂ je Ala, Val nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₃ je Ala, Ser, Gly nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₄ je Glu, Ala nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A5 je Ile, His, Ala nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina ;

A₆ je Ala, Gin, Gly nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₇ je Ala, Leu, Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₈ je Leu, Nle, Gly nebo D-Pro, nebo ekvivalentní aminokyselina;

9 9

99 99

9 · · 9 a₉

Aio

Au

Al2

A13

A14

Ais

Al6

Al?

A₉

Aio

Au

Al2

A13

A14

Ais

Al6

Al?

je His, Ala, D-Pro nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina;

je Ala, Asn, Asp, Cys, homo-Cys, Glu, Gly, Lys, Orn, Ser, Thr, D-Pro, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) COnebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

je Ala, Gly, Leu nebo Lys, nebo ekvivalentní aminokyselina;

je Ala nebo Gly, nebo ekvivalentní aminokyselina;

je Ala, Asn, Asp, Cys, homo-Cys, Glu, Gly, Lys, Orn, Ser, Thr, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

je Ala, Asn, Asp, Cys, homo-Cys, Glu, Gly, His, Lys, Orn, Ser, Thr, D-Pro, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] C0-;

je Ala, Gly, Ile, D-Pro nebo Leu, nebo ekvivalentní aminokyselina;

je Asn, Ala, Gly, D-Pro nebo Gin, nebo ekvivalentní aminokyselina;

je Ala, Asn, Asp, Cys, homo-Cys, Glu, Gly, Lys, Orn, Ser, Thr, D-Pro, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) COnebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

• · · · 4 «

4 · 9

9 4 ·

9 9 9 • 9 9 9

99 »9 ·· ··

9 9

9 9 9 • 4 ··· ···

Φ · 9 9

9 9 9 ·

9 9 9 9 9

9 9 9 9

99 99

Ais je Asp, Cys, homo-Cys, Glu, His, Leu, Lys, Orn,

Nle, Ser, Thr, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

Aig je Arg nebo Glu, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₂₀ je Arg, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₂i je Arg, Asp, Cys, homo-Cys, Glu, Lys, Orn, Ser,

Thr, Val, skupina -NHCH(CH₂) _m(NH₂)CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

A₂₂ je Asp, Cys, homo-Cys, Glu, His, Lys, Orn, Phe,

Ser, Thr, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

A₂3 je Leu, Phe nebo Trp, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₂4 je Leu, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₂5 je Arg, Asp, Cys, homo-Cys, Glu, His, Lys, Orn,

D-Pro, Ser, Thr, skupina -NHCH(CH₂) _m (NH₂)CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

A₂₆ je Asp, Cys, homo-Cys, Glu, His, Lys, Orn, Ser,

Thr, skupina -NHCH (CH₂)_m(NH₂) CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

A₂7 je Leu nebo Lys, nebo ekvivalentní aminokyselina;

• · φ φ φ φ φ φ φ φ « φ φ β

Α₂₈ je Ιΐθ nebo Leu, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₂g je Ala, Asp, Cys, homo-Cys, Glu, Gin, Lys, Orn,

Ser, Thr, skupina -NHCH(CH₂) _m (NH₂)CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO- ;

A₃₀ je Asp, Cys, homo-Cys, Glu, Gly, Lys, Orn, Ser,

Thr, skupina -NHCH (CH₂) _m (NH₂) CO- nebo skupina -NHCH [ (CH₂) _nCO₂H] CO-;

A31 je Ile, Leu nebo Val, nebo ekvivalentní aminokyselina ;

A32 je His, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A₃₃ je Asn nebo Thr, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A34 je Ala nebo Phe, nebo ekvivalentní aminokyselina;

A35 není přítomen nebo je peptid složený z jedné až čtyř aminokyselin; přičemž postranní řetězce alespoň jednoho z dále uvedených párů aminokyselinových zbytků, tj . Αχ₀ a A₁₄, A_i3 a A_i7, A₂₄ a Ais, A17 a A₂i, Ais a A₂₂, A₂i a A₂s, A₂5 a A₂9 a A₂s a A30, jsou vzájemně spojeny amidovou, esterovou disulfidovou nebo lanthionínovou vazbou a tvoří tak můstek a postranní řetězce všech dále uvedených aminokyselinových zbytků, t j . A10, A13, A14, A17, Ais, A₂i, A₂₂, A₂5, A₂6, A₂g a A30 maximálně přispívají k vytváření jediného můstku; přičemž pokud postranní řetězce párů aminokyselinových zbytků

A₁₃ a Ai7 nebo A₂6 a A₃₀ jsou vzájemně spojeny amidovou, disulfidovou nebo lanthioninovou vazbou za tvorby můstku, potom postranní řetězce alespoň jednoho páru aminokyselinových zbytků A₁₀ a Αχ₄, A_i4 a Ais, A_i7 a A₂i, A₁₈a A₂₂, A₂i a A₂₅ a A₂₅ a A₂₉ jsou rovněž spojeny amidovou, esterovou, disulfidovou nebo lanthioninovou vazbou za tvorby můstku.
3. Způsob podle nároku 1 pro výrobu cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) [Ala¹, Nle⁸, Lys¹⁸, Asp²², Leu²⁷] hPTH (1-31) NH₂ vyznačující se tím, že zahrnuje (a) přípravu peptidového fragmentu A vázaného k polymernímu nosiči:

Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)Asp(OtBu)-Val-NH-polymerní nosič (A) ;

(b) přípravu cyklického peptidového fragmentu (B)

Fmoc—Lys-GIu(OtBu)-Arg(Pmc)—Val—Asp —OH (B);

(c) spojení fragmentu A ze stupně(a) s peptidovým fragmentem B ze stupně (b) za vzniku meziproduktu, kterým je peptid AB —'ίΕΓ'-

• · · · 4 · · « 4 4 4 4 9 · 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 · 4 4 * · 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 • 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

Fmoč-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-resin (AB) ;

(d) postupné přidávání Ser(OtBu), Asn(Trt), Leu,

His(Trt) a Lys(Boc) k peptidu AB za vzniku meziproduktu, kterým je peptid C

Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(OtBu) -Lys-Glu-Arg-Val-AspTrp(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-resin (C) ;

(e) přípravu peptidového fragmentu D:

Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-NleHis(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-OH (D) ;

(f) spojení fragmentů C a D za vzniku peptidu vázaného k polymernímu nosiči E:

Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-NleHis(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)Ser(OtBu)-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-polymerní nosič (E); a • · · · a a a a a a (g) odštěpení polymerního nosiče a chránících skupin.
4. Peptidy vhodné jako meziprodukty pro provedení způsobu podle nároku 3 vyznačující se tím, že jsou vybrány ze skupiny zahrnující

Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)Asp(OtBu)-Val-NH-polymerní nosič,

Fmoc-cyklo(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH, cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) Fmoc-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp (Boc) -LeuArg (Pmc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NHpolymerní nosič, cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) Fmoc-Lys (Boc) -His (Trt) -Leu-Asn (Trt) Ser(OtBu)-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-polymerní nosič,

Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-NleHis(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-OH, cyklo (Lys¹⁸-Asp²²) Fmoc-Ala-Val-Ser (OtBu) -Glu (OtBu) -IleGln (Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(OtBu)-Lys-Glu-Arg-Val-AspTrp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)Asp(OtBu)-Val-NH-polymerní nosič,

Boc-Val-Asp(OAllyl)-OBzl, • · · · · · • · ······ • · · · · · ··· ··· · · ··

HC1.Val-Asp(OAllyl)-OBzl,

Fmoc-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl,

Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl,

Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl,

Glu(OtBu)-(L)Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl,

Fmoc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl,

Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OBzl,

Fmoc-cyklo(Lys-Asp)Lys-Glu-Arg-Val-Asp-OBzl,

Fmoc-cyklo(Lys-Asp)Lys-Glu-Arg-Val-Asp-OH,

Fmoc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)chlortritylovaný polymerní nosič,

Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-chlortritylovaný polymerní nosič, a

Fmoc-cyklo(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Aspchlortritylovaný polymerní nosič.