CN101235080B

CN101235080B - 一种达托霉素的合成方法

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Publication number: CN101235080B
Application number: CN2007100370066A
Authority: CN
Inventors: 徐红岩; 陆婷婷
Original assignee: GL BIOCHEM (SHANGHAI) Ltd; Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Current assignee: GL BIOCHEM (SHANGHAI) Ltd; Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Priority date: 2007-01-31
Filing date: 2007-01-31
Publication date: 2010-09-08
Anticipated expiration: 2027-01-31
Also published as: CN101235080A

Abstract

本发明涉及一种达托霉素的合成方法。主要解决现有以玫孢链霉菌作为原料合成成本过高的技术问题。主要合成步骤：a.以2-氯三苯甲基氯树脂为载体，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十肽树脂，期间依次脱去Fmoc-保护基团；b.用同样的方法连接正癸酸后，再通过酯化的步骤连接下一个氨基酸，脱去Fmoc-保护基团，剩余的两个氨基酸按照正常的固相方法连接，并且脱去Fmoc-保护基团；c.用三氟醋酸或二氯甲烷溶液将全保护肽从树脂上切下，处理干燥后，在有机溶剂中完成首尾液相环化；d.最后用三氟醋酸和水及苯甲硫醚混合溶液将肽从树脂上切下，得到粗品。本发明主要可用于合成达托霉素。

Description

一种达托霉素的合成方法

技术领域：

本发明涉及新型抗生素达托霉素(Daptomycin)的一种合成方法。特别涉及固液相结合的达托霉素合成方法。

背景技术：

近年来随着抗生素应用的增多，细菌的耐药性问题日益严重。在美国，临床上分离到的金葡菌有95％对青霉素耐药，50％以上对甲氧西林耐药(FrindkinSK，Gaynes RP.Antimicrobial resistance in intensive care units.ClinChest Med.1999，20(2)：303-316)；在日本，耐甲氧西林金葡菌(MRSA)在皮肤感染中的比例逐年上升(Nishijima S.The incidence of isolation ofmethicillin-resistant Staphylococus aureus(MRSA)strains from skininfections during the past three years.J Dermatil，1993，20(4)：193-197)。尽管万古霉素常常被认为是抵抗革兰阳性菌感染的最后防线，但这道防线并非牢不可破，20世纪80年代以来，万古霉素耐药菌株有增长趋势，包括耐万古霉素金葡菌和肠球菌(The centers for Disease Control and Prevention.Staphylococus aureus with reduced sueceptibility to vancomycin-UnitedStates 1997.JAMA，1997，278(11)：891-892)。

革兰阳性菌是皮肤感染中很常见的致病菌，随着MRSA对万古霉素的敏感性下降，作用机制不同于万古霉素的抗生素显得极其重要。2003年9月，美国FDA批准注射用Daptomycin(商品名

)用于治疗复杂性皮肤及皮肤软组织感染(cSSSIs)，包括较大的脓肿，术后切口感染和感染性溃疡，特别是由金葡菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌似马亚种(Streptococcus dysgalactiaesubspecies equisimilis)以及耐万古霉素粪肠球菌引起的感染(Cubicin[packageinsert].Lexington，Mass：Cubist Pharmaceuticals，Inc.；2003)。

Daptomycin最初由Lily公司开发，于1994年转让给Cubist制药公司，Daptomycin的整个开发时间长达22年之久，是具有着独特抗菌特性的环脂肽类抗生素。独特的作用机制使得细菌对Daptomycin产生耐药性可能会比较困难。目前，Daptomycin是由玫孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵制得，由于专利保护等各种原因，玫孢链霉菌不易得。

发明内容：

本发明的目的是提供一种Daptomycin的合成方法，通过固液相结合，首次人工合成Daptomycin。主要解决现有以玫孢链霉菌作为原料合成成本过高的技术问题。

本发明的方法包括如下步骤：

以2-氯三苯甲基氯树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，其中Fmoc-AA、DIC、HOBT三者间重量比为1∶1∶1，Fmoc-AA缩合过量2～5倍，获得保护十肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，每一步连接氨基酸缩合都经过kaiser test检测，如反应呈阳性则重复接氨基酸。同样的固相方法连接正癸酸，至kaiser test检测阴性，无需脱去Fmoc-保护基团步骤。通过酯化的步骤连接下一个氨基酸，Fmoc-AA、DIC、DMAP三者间重量比为3∶3∶1，Fmoc-AA缩合过量1～2倍，一次反应时间为2～4h，连续反应两次，反应结束无需kaiser test检测，直接脱去Fmoc-保护基团。同样的固相方法连接剩余的两个氨基酸，并依次脱去Fmoc-保护基团。

用1～2％TFA或CH₂Cl₂溶液将全保护肽从树脂上切下，处理切割液浓缩至干，加入乙醚析出固体，干燥。

液相环化时，需添加环化剂：PyBOP、HOAT，全保护多肽∶PyBOP∶HOAT三者间重量比为1∶2∶2，全保护多肽的浓度为10^-3～10^-4mol/L，有机溶剂为DME，CH₂Cl₂或THF中的一种，反应过夜。

用TFA∶水∶苯甲硫醚三者间重量比为95∶2.5∶2.5的混合液处理环化产品2～3h，切去肽的保护基，吹干后加入乙醚析出固体，过滤后得粗品。本发明中一些常用的缩写具有以下含义：

2-Cl-Chlorotrityl Chloride Resin：2-氯三苯甲基氯树脂

Fmoc：芴甲氧羰基

tBu：叔丁基

O^tBu：叔丁氧基

Trt：三苯基

BOC：叔丁氧羰基

Fmoc-AA：N-芴甲氧羰基-氨基酸

Fmoc-Gly-OH：

Fomc-Asp(O^tBu)-OH：N-芴甲氧羰基-天冬氨酸

Fmoc-D-Ala-OH：N-芴甲氧羰基-D-丙氨酸

Fmoc-Orn(Boc)-OH：N-芴甲氧羰基-鸟氨酸(叔丁氧羰基)

Fmoc-Thr-OH：N-芴甲氧羰基-苏氨酸

Fmoc-Asn(Trt)-OH：N-芴甲氧羰基-天冬酰胺(三苯基)

Fmoc-Trp(Boc)-OH：N-芴甲氧羰基-色氨酸(叔丁氧羰基)

Decanoic acid：正癸酸

Fmoc-Kyn(Trt)-OH：N-芴甲氧羰基-犬尿氨酸(三苯基)

Fmoc-3-CH₃-Glu(O^tBu)-OH：N-芴甲氧羰基-3-甲基-谷氨酸(叔丁氧基)

Fmoc-D-Ser(^tBu)-OH：N-芴甲氧羰基-D-丝氨酸

Fmoc-Tyr(O^tBu)-OH：N-芴甲氧羰基-酪氨酸(叔丁氧基)

Fmoc-Glu(O^tBu)-OH：N-芴甲氧羰基-谷氨酸(叔丁氧基)

DIC：二异丙基碳化二亚胺

PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷

HOAT：N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑

HOBt：1-羟基苯并三唑

DMAP：4-二甲氨基吡啶

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

TFA：三氟醋酸

Piperidine：吡啶

CH₂Cl₂：二氯甲烷

THF：四氢呋喃

Et₂O：乙醚

合成路线如下：

本发明的有益效果是：我们选择了固液相结合的方式合成Daptomycin，并且应用DIC/DMAP体系进行酯化反应，效果理想。开环点的选择也有效地避免了消旋的产生。该方法简单易操作，适合结构类似物的大量合成。

具体实施方式：

以下将参照实例对本发明作进一步的详细描述，但本发明不限于此具体实例。本发明合成步骤也可用于具有达托霉素相似结构的环肽化合物的合成。

实施例.

Daptomycin合成

1.1固相制备全保护多肽

称取2-Cl-Chlorotrityl Chloride树脂(0.4～0.5mmol/g)0.5g，用100mlDMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干。取0.15gFmoc-Gly-OH放入接肽瓶中，60mlDMF溶解后加入0.6mlDIEA，25℃反应1小时。抽干，加入60ml甲醇反应10min。抽干，分别用DMF，MeOH，CH₂Cl₂及Et₂O各洗涤三次，干燥。称重0.081g。取代度为0.54mmol/g。

将上述树脂放入接肽瓶中，加入50ml20％piperidine(DMF)振荡5min，抽干。再加入50ml20％piperidine(DMF)振荡15min，然后抽干，用DMF，MeOH和CH₂Cl₂依次各洗涤三次，然后依次接Fmoc-Asp(O^tBu)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Asp(O^tBu)-OH、Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Asp(O^tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Decanoic acid，用0.627mmol的Fmoc-AA-OH/DIC/HOBt(三者之间重量比为1∶1∶1)缩合，DMF为溶剂，脱Fmoc用20％piperidine(DMF)，脱2次，第一次5分钟，第二次15分钟。其中，连接Decanoic acid方法同连接保护氨基酸，连接结束不需脱Fmoc。

洗涤后抽干，取出树脂，干燥。取0.5g干燥后的树脂放入接肽瓶中，加入0.81mmolFmoc-Kyn(Trt)-OH/DIC/DMAP(三者之间重量比为3∶3∶1)，DMF为溶剂，反应3h，连续反应2次。抽干，DMF，MeOH及CH₂Cl₂依次各洗涤三次，用20％piperidine(DMF)脱Fmoc，脱2次，第一次5分钟，第二次15分钟。同法洗涤后抽干，最后依次接Fmoc-3-CH₃-Glu(O^tBu)-OH、Fmoc-D-Ser(^tBu)-OH，方法同上。

1.2液相环化

将连接好的树脂干燥后放入100ml的茄形瓶中，加入40ml 1～2％TFA/CH₂Cl₂，振荡反应1h，过滤，取滤液。用三乙胺将滤液pH调至中性，浓缩至干。加入Et₂O，析出白色固体，用Et₂O反复洗涤后，干燥。

得0.04g固体，即1.5*10^-5mmol。将固体投入干燥的250ml茄形瓶中，并加入4.5*10^-5mmolPyBOP/HOAT(两者之间重量比为1∶1)，用100ml CH₂Cl₂溶解，室温反应过夜。

1.3切保护，纯化处理

将反应好的反应液常规处理后，浓缩至干，加入10ml TFA∶水∶苯甲硫醚的重量比为95∶2.5∶2.5的混合溶液，振荡反应2h后，用N2将切割液吹于，加入Et₂O有白色沉淀析出，Et₂O反复洗涤后，得粗品0.043g。

Claims

1.一种达托霉素的合成方法，主要包括如下步骤：

a、以2-氯三苯甲基氯树脂为载体，选择达托霉素结构中没有手性结构的Gly为起始点，通过固相合成的方法依次连接得到如下结构的保护十肽树脂：Trp(Boc)-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Thr-Gly-Orn(Boc)-Asp(OtBu)-D-Ala-Asp(OtBu)-Gly-2-氯三苯甲基，其中Thr侧链不带保护基团，期间依次脱去Fmoc-保护基团；

b、用同样的方法连接正癸酸后，再通过酯化的步骤连接下一个氨基酸，脱去Fmoc-保护基团，剩余的两个氨基酸按照正常的固相方法连接，并且脱去Fmoc-保护基团；

c、用三氟醋酸或二氯甲烷溶液将全保护肽从树脂上切下，处理干燥后，在有机溶剂和环化剂中完成首尾液相环化，有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或四氢呋喃中的一种，环化剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷和N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑，全保护多肽∶六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷∶N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑的重量比为1∶2∶2；

d、最后用三氟醋酸和水及苯甲硫醚混合溶液处理环化产品，切去肽的保护基，得到粗品。

2.根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是：固相合成连接氨基酸过程中，脱去Fmoc-保护基团的脱保护剂用N-芴甲氧羰基-氨基酸、二异丙基碳化二亚胺和1-羟基苯并三唑，三者之间重量比为1∶1∶1，N-芴甲氧羰基-氨基酸缩合过量2～5倍。

3.根据权利要求1或2所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是：在接氨基酸过程中每一步缩合都经过kaiser test检测，如反应呈阳性则重复接氨基酸。

4.根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是：酯化反应过程中，脱去Fmoc-保护基团脱保护剂用N-芴甲氧羰基-氨基酸、二异丙基碳化二亚胺和4-二甲氨基吡啶，三者之间重量比为3∶3∶1，N-芴甲氧羰基-氨基酸缩合过量1～2倍，一次反应时间为2～4h，连续反应两次，反应结束无需kaiser test检测，直接脱去Fmoc-保护基团。

5.根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是：所述的三氟醋酸或二氯甲烷溶液浓度为1～2％。

6.根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是：液相环化时，全保护多肽的浓度为10^-3～10^-4mol/L，室温反应过夜。

7.根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是：步骤d中混合溶液三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚的重量比为95∶2.5∶2.5。

8.根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是：肽从树脂上切下反应时间为1h。

9.根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是：步骤c处理干燥是指将切割液浓缩至干或吹干，加入乙醚析出固体处理。