ES2822598T3 - Métodos y composiciones para tratar enfermedades y trastornos musculares - Google Patents

Métodos y composiciones para tratar enfermedades y trastornos musculares

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 para la administración crónica para uso en un método de retraso, reducción o tratamiento de la fibrosis muscular en un paciente con miopatía muscular.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para tratar enfermedades y trastornos musculares
a n t e c e d e n t e s
Las distrofias musculares de Duchenne y Becker (DMD y BMD, por sus siglas en inglés) representan las enfermedades neuromusculares más frecuentes en los seres humanos, y se producen en entre uno de 3500 y uno de 6000 nacimientos vivos de varones dependiendo de la población estudiada (Bushby et al. (2010)). d Md y BMD son trastornos alélicos resultado de mutaciones en el gen de la distrofina. En DMD, la distrofina funcional está totalmente ausente del músculo, mientras que en BMD hay una cierta distrofina presente, aunque no en cantidades suficientes para una función muscular normal. Además de la debilidad del músculo esquelético, la deficiencia de distrofina en el miocardio da como resultado una miocardiopatía progresiva.
En la actualidad, se carece de terapias aprobadas específicas para el tratamiento de DMD/BMD. A menudo se utilizan dosis elevadas de corticosteroides para tratar la debilidad muscular y para mantener la capacidad de desplazarse tanto como sea posible, pero estas están asociadas con efectos secundarios inaceptables y/o respuestas subóptimas. Tampoco está claro si estos agentes terapéuticos ayudan o entorpecen la función cardiaca. Se necesitan estrategias terapéuticas adicionales para tratar tanto las anomalías esqueléticas como cardiacas de las distrofias musculares.
c o m p e n d io de la in v e n c ió n
La presente divulgación proporciona agentes terapéuticos de tipo péptido intestinal vasoactivo (VIP, por sus siglas en inglés) duraderos para tratar, retrasar, prevenir o mitigar la miopatía muscular. Los músculos miopáticos sufren daños durante las contracciones repetidas pero, debido a que carecen de la capacidad para repararse a ellos mismos de manera adecuada, los músculos desarrollan defectos tales como lesiones fibróticas. Estos defectos pueden inhibir la función muscular, y a menudo entorpecen la capacidad del músculo para contraerse. Prevenir, retrasar o mitigar la formación de estos defectos puede tratar la miopatía muscular en los pacientes. Los agentes terapéuticos VIP divulgados en la presente también pueden mejorar la función cardiaca en pacientes con miopatías musculares.
En un primer aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica tal como se define en la reivindicación 1.
La presente divulgación proporciona un método para tratar la miopatía muscular que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica que comprende un péptido intestinal vasoactivo (VIP) y uno o más péptidos de tipo elastina (ELP, por sus siglas en inglés).
La presente divulgación proporciona un método para proteger frente a la lesión inducida por la contracción muscular en un paciente que lo necesita que comprende administrar una composición farmacéutica que comprende un péptido intestinal vasoactivo (VIP) y uno o más péptidos de tipo elastina (ELP).
La presente divulgación proporciona un método para retrasar la evolución de la miocardiopatía que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica que comprende un péptido intestinal vasoactivo (VIP) y uno o más péptidos de tipo elastina (ELP).
La presente divulgación proporciona un método para tratar la miocardiopatía que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica que comprende un péptido intestinal vasoactivo (VIP) y uno o más péptidos de tipo elastina (ELP).
En las realizaciones de la invención, la composición farmacéutica comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.
d e s c r ip c ió n b r e v e de l a s f ig u r a s
La Figura 1A-B muestra la función cardiaca monitorizada mediante ecocardiografía: n = 10 - 11, *P <0,05 frente a los controles. El panel A muestra el acortamiento del área fraccional en MDX (ratones deficientes en distrofina). El Panel B muestra la relación E/A en ratones MDX. El tratamiento con PB1046 conserva el acortamiento del área fraccional después de las 32 semanas de tratamiento. La administración de PB1046 antes del desarrollo de la miocardiopatía conservó la duración de QRS en ratones mdx y con una doble inactivación genética y ralentizó el deterioro de la función cardiaca (acortamiento del área fraccional y relaciones E/A) en ratones mdx.
La Figura 2A-E muestra la evaluación in vivo de la función ventricular izquierda en ratones MDX en un procedimiento terminal. n = 4 - 5 (MDX) y n = 2 (DKO), *P < 0,05 frente a los controles. Tanto los animales mdx como con una doble inactivación genética tratados mostraron una conservación de dP/dtmáx (contracción) y Tau (relajación) más rápida.
La Figura 3A-B muestra Ios resultados de la evaluación de la fisiología del músculo esquelético en Ios músculos extensores largos de los dedos aislados de ratones MDX. n = 4 - 16. El tratamiento con PB1046 mantuvo la contracción excéntrica en comparación con ratones no tratados, lo que indica que los músculos en el grupo de tratamiento fueron más resistentes al daño inducido por la contracción.
La Figura 4 A-C muestra el contenido de colágeno (Paneles A-B) en ratones MDX medido con tinción con rojo sirio. La identificación de macrófagos (Panel C) se determinó mediante inmunohistoquímica n = 4 - 7, *P < 0,05 frente a los controles. El grado de fibrosis, determinado según la deposición de colágeno, se redujo tanto en el músculo esquelético (músculos gemelos) como en el músculo cardiaco.
d e s c r ip c ió n d e t a l l a d a
Las miopatías musculares, que pueden afectar al músculo esquelético o cardiaco, son trastornos en los que las fibras musculares ya no funcionan correctamente, lo que da como resultado debilidad muscular que puede dar lugar a atrofia muscular, parálisis e incluso la muerte. La disfunción cardiaca es una manifestación frecuente de diversas miopatías musculares y es una causa de muerte habitual para individuos con estas afecciones.
A menudo, en las miopatías heredadas tales como las distrofias musculares, los pacientes presentan una mutación en el gen de la distrofina. El gen de la distrofina desempeña tanto una función estructural como reguladora en la contracción muscular. La distrofina es parte de un complejo mayor que atraviesa la membrana, el complejo de distrofina-glucoproteína (DGC, por sus siglas en inglés) (Lapidos et al. (2004)), cuya ausencia afecta directamente la contractibilidad. En muchos pacientes con miopatía muscular (por ejemplo, las distrofias musculares de Duchenne o Becker, o la miocardiopatía asociada a distrofina), la proteína distrofina puede estar totalmente ausente o ser funcional tan solo en parte. La ausencia de distrofina aumenta el calcio intracelular y da como resultado una sobreproducción de óxido nítrico, que desencadena la degradación proteica, fibrosis, necrosis, la activación de los macrófagos y, en última instancia, da como resultado esquelético y miocardiopatía (Townsend et al. (2011); Judge et al. (2011)).
En los miocardiocitos, estas consecuencias patológicas están mediadas en parte por un aumento en la permeabilidad del calcio y aumento de las concentraciones de calcio en los miocitos, que a su vez inicia una cascada de eventos que incluyen la expresión de citocinas inflamatorias dentro de los miocitos, y células inflamatorias que responden a la necrosis de los miocitos (Zhou et al. (2010); Klinger et al. (2012)). Además, la alteración de las vías de señalización de guanosín-monofosfato cíclico (cGMP) intracelular contribuye directamente a la pérdida de la función muscular (Lapidos et al. (2004)); Townsend et al. (2011); Byers et al. (1991)).
Además de los efectos directos en la función muscular, la pérdida de distrofina y los cambios consecuentes en la actividad de la óxido nítrico sintasa dan como resultado estrés metabólico y mitocondrial que estimula la producción de citocinas y la apoptosis celular. Estos eventos dan como resultado más pérdida de masa muscular, pérdida de función muscular y, en última instancia, fibrosis. En particular, el estrés de los miocardiocitos aumenta la producción de IL-6 y TGF-p, que estimulan los fibroblastos, síntesis de colágeno e infiltración de macrófagos, todo lo cual contribuye al aumento de la fibrosis.
En los músculos sanos, tras una lesión tisular aguda, las células inflamatorias infiltrantes y las células madre residentes restauran la homeostasis celular. Sin embargo, durante el daño tisular crónico, tal como en las distrofias musculares, la infiltración de células inflamatorias y la activación de fibroblastos persiste, mientras que la capacidad reparadora de las células madre (por ejemplo, células satélite) se atenúa. En muchas distrofias, el músculo experimenta ciclos constantes de degeneración de fibras asociados con la inflamación crónica. En DMD, la población de células satélite responsable de reparar el músculo dañado se agota con el tiempo o pierde la capacidad de mediar en la reparación, y el tejido muscular se ve reemplazado progresivamente por tejido adiposo y fibrótico. La fibrosis y la pérdida de tejido muscular en las distrofias reducen las funciones contráctil y de motilidad.
La fibrosis muscular es la formación excesiva de bandas fibrosas de tejido cicatricial entre las fibras musculares. Aunque se puede desarrollar fibrosis en cualquier órgano, la fibrosis del músculo esquelético y la fibrosis del músculo cardiaco son las únicas fibrosis musculares conocidas. El tejido cicatricial fibroso se desarrolla después de que se haya dañado el músculo para rellenar los espacios abiertos en el músculo lesionado, y proporcionar más área superficial a la que se adhieran las fibras musculares regeneradoras. Las células de tejido conectivo que comprende el tejido cicatricial son incapaces de contraerse y relajarse para permitir el movimiento. Una vez que comienza la sobreproducción de tejido cicatricial fibroso, el músculo se vuelve progresivamente más débil.
El péptido intestinal vasoactivo (VIP) desempeña una función en el desarrollo de la fibrosis. VIP actúa a través de los receptores VPAC1 y VPAC2 para, entre otras actividades, aumentar los niveles de cAMP y cGMP. Notablemente, en los macrófagos murinos, se ha mostrado que VIP disminuye la producción de TGF-p, un mediador importante de la fibrosis cardiaca en DMD (Ameen et al. (2010); Burks et al. (2011); Bujak et al. (2007)). VIP también estimula los linfocitos T reguladores (Treg) que suprimen la inflamación muscular y la lesión en la distrofia muscular (Villata et al. (2014)).
La presente divulgación proporciona un método para prevenir, retrasar o mitigar la aparición de síntomas (incluido el desarrollo de la fibrosis muscular) en los pacientes con miopatía administrando agentes terapéuticos de tipo péptido intestinal vasoactivo (VIP) estables de acción prolongada.
Péptidos intestinales vasoactivos
El péptido intestinal vasoactivo (VIP) es un neuropéptido que se une a dos receptores, VPAC1 y VPAC2. Se sabe que VIP y sus análogos relacionados funcional y estructuralmente tienen muchas funciones fisiológicas, incluidas la relajación del músculo liso (broncodilatación, movilidad intestinal) y modulación de diversas funciones inmunitarias (antiinflamación, protección con células inmunitarias) (Hinkle etal. (2005)).
El VIP maduro tiene 28 residuos aminoacídicos con la siguiente secuencia: HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN (SEQ ID NO: 17). VIP es el resultado del procesamiento de la molécula precursora de 170 aminoácidos prepro-VIP. Se han descrito las estructuras de VIP y análogos a modo de ejemplo en las patentes de EE. UU.4835252, 4939224, 5 141 924, 4734400, 4605641,6 080837, 6316593, 5677419, 5972883, 6489297, 7094755 y 6608 174.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona composiciones terapéuticas que pueden incluir uno o más péptidos VIP, variantes o análogos. En algunos ejemplos, el péptido VIP es una variante. En algunos ejemplos, el péptido VIP es un análogo. En algunos ejemplos, el péptido VIP es VIP maduro (por ejemplo, la SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, el péptido VIP está modificado en comparación con el VIP maduro (por ejemplo, la SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, el péptido VIP modificado es una variante en comparación con el VIP maduro (por ejemplo, la SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, el péptido VIP modificado es una variante funcional en comparación con el VIP maduro (por ejemplo, la s Eq Id NO: 17). En algunos ejemplos, el péptido VIP modificado es un análogo funcional en comparación con el VIP maduro (por ejemplo, la SEQ ID NO: 17).
En algunos ejemplos, el péptido VIP modificado contiene una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del VIP maduro (por ejemplo, la SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, se sustituyen de uno a 20 aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del VIP maduro (SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, el péptido VIP modificado contiene aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9 o aproximadamente 10 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del VIP maduro (SEQ ID NO: 17).
En algunos ejemplos, el péptido VIP modificado contiene una o más deleciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del VIP maduro (SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, se eliminan de uno a 20 aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del VIP maduro (SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, el péptido VIP modificado tiene aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9 o aproximadamente 10 deleciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del VIP maduro (SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, se eliminan de uno a diez aminoácidos en cualquier extremo en comparación con la secuencia de aminoácidos del VIP maduro (SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, se eliminan de uno a diez aminoácidos de ambos extremos en comparación con la secuencia de aminoácidos del VIP maduro (SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, la secuencia de aminoácidos del péptido VIP modificado es idéntica en al menos aproximadamente un 70% a la secuencia de aminoácidos del VIP maduro (SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, la secuencia de aminoácidos del péptido VIP modificado es idéntica en aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 96% o aproximadamente un 97% a la secuencia de aminoácidos del VIP maduro (SEQ ID NO: 17). La identidad porcentual se puede calcular utilizando el programa de alineación ClustalW2, al que se puede acceder en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Se pueden utilizar los siguientes parámetros por defecto para la alineación por pares: Matriz de peso de proteínas = BLOSUM62; Apertura de hueco = 10; Extensión de hueco = 0,1.
En varios aspectos, la presente divulgación proporciona un péptido VIP modificado que tiene una preferencia de receptor relativa por VPAC2 o VPAC1, en comparación con el VIP maduro (es decir, la SEQ ID NO: 17). Por ejemplo, el péptido VIP modificado puede tener una preferencia de unión relativa por VPAC2 respecto a VPAC1 de al menos aproximadamente 2:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 25:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 100:1, aproximadamente 500:1 o más. En otros ejemplos, el péptido VIP modificado puede tener una preferencia de unión relativa por VPAC1 respecto a VPAC2 de al menos aproximadamente 2:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 25:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 100:1, aproximadamente 500:1 o más. En ciertos ejemplos, el péptido VIP modificado activa al receptor VPAC2 con una CE50 comprendida en un factor de aproximadamente 2 - 4 del VIP humano maduro (SEQ ID NO: 17). Sin embargo, en algunos ejemplos, este mismo péptido VIP modificado es 50 o 100 veces o más menos potente que el péptido VIP humano maduro no modificado (SEQ ID NO: 17) en la activación del receptor VPAC1.
En algunos ejemplos, el péptido VIP modificado contiene residuos aminoacídicos adicionales en comparación con el VIP maduro (SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, el péptido VIP modificado contiene uno o más aminoácidos añadidos en el extremo N y/o C en comparación con el VIP maduro (SEQ ID NO: 17). Tales péptidos VIP modificados pueden contener regiones N-terminal modificadas, tales como una adición de 1 a aproximadamente 500 aminoácidos a la histidina N-terminal del VIP, que puede incluir secuencias de aminoácidos de mamíferos (por ejemplo, no humanos) heterólogas. La secuencia adicional añadida al extremo N del VIP puede ser de cualquier secuencia, incluidas secuencias con actividad biológica y secuencias inertes desde un punto de vista biológico de 1 a aproximadamente 100, de 1 a aproximadamente 50, de 1 a aproximadamente 20, de 1 a aproximadamente 10, y de 1 a aproximadamente 5 aminoácidos. Por ejemplo, el VIP modificado puede contener una única metionina en el extremo N-terminal de la histidina N-terminal natural del VIP maduro. Aunque a veces se puede eliminar la metionina con metioninaaminopeptidasa (MA) en sistemas de expresión bacterianos, la histidina (H) es uno de los residuos menos favorecidos en la posición 2 para MA. En algunos ejemplos, el péptido VIP modificado es la SEQ ID NO: 14. Tales péptidos VIP modificados que contienen metionina N-terminal se pueden preparar en E. coli u otros sistemas de expresión bacterianos o de levaduras, ya que E. coli no eliminará la metionina cuando el aminoácido adyacente sea histidina. Como alternativa, el aminoácido N-terminal puede ser cualquiera de los aminoácidos de origen natural, concretamente alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina y prolina. En otras realizaciones, el péptido VIP puede ser activado por una peptidasa o proteasa, tal como una peptidasa o proteasa endógena. Tales secuencias activables se describen, por ejemplo, en la solicitud internacional n.2 PCT/US2009/068656. Tal como se utilizan en la presente, los términos «peptidasa» y «proteasa» son intercambiables. Por ejemplo, el péptido VIP se puede diseñar para que pueda ser activado por una dipeptidil-peptidasa. Las dipeptidil-peptidasas a modo de ejemplo incluyen la dipeptidil-peptidasa-1 (DPP-I), dipeptidil-peptidasa-3 (DPP-III), dipeptidil-peptidasa-4 (DPP-IV), dipeptidilpeptidasa-6 (DPP-VI), dipeptidil-peptidasa-7 (DPP-VII), dipeptidil-peptidasa-8 (Dp P-VIII), dipeptidil-peptidasa-9 (DPP-IX), dipeptidil-peptidasa-10 (DPP-X). Se conocen secuencias sustrato para tales dipeptidasas.
En algunos ejemplos, el extremo N de un péptido VIP activable puede tener la estructura Z-N, donde Z es un sustrato para una dipeptidasa (por ejemplo, Z se elimina mediante la exposición a dipeptidasas) y N es el extremo N del VIP. El péptido VIP activable puede tener una secuencia N-terminal con la fórmula M-X-N donde M es metionina, X es Pro, Ala o Ser, y N es el extremo N del VIP o análogo de VIP. De este modo, M y X serán sensibles a, y serán eliminados por, una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli), y/o una dipeptidasa (por ejemplo, DPP-IV), posteriormente. Como alternativa, la secuencia N-terminal del VIP activable puede ser X1-X2-N, donde X1 es Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Val o Pro; X2 es Pro, Ala o Ser; y N es el extremo N del VIP. X1-X2 es un sustrato para dipeptidasa (por ejemplo, DPP-IV) y la digestión con dipeptidasa expondrá N, el extremo N deseado del VIP o el análogo de VIP. En tales realizaciones, el péptido VIP se puede producir mediante la expresión de un constructo que codifica M-X1-X2-N (donde M es metionina) en una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli), ya que Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Val o Pro en la segunda posición señalizarán la eliminación de la Met, y de este modo dejarán X1-X2 en el extremo N, que puede ser activado por una dipeptidasa (por ejemplo, DPP-IV) in vivo. En algunas realizaciones, la peptidasa puede estar presente en el cuerpo y actuar en el péptido VIP activable después de la inyección. En algunos ejemplos, el péptido VIP activable contiene la secuencia de aminoácidos MAA añadida en el extremo N en comparación con el VIP maduro (por ejemplo, la SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, el péptido VIP activable es la SEQ ID NO: 18.
En otros ejemplos, el extremo N del péptido VIP activable modificado tiene la estructura M-Z-N, donde M es metionina, Z es un sustrato para una dipeptidasa (por ejemplo, se elimina Z con la exposición a dipeptidasas) y N es un extremo N que no es His de un VIP activable. Por ejemplo, el péptido VIP activable modificado puede tener una secuencia N-terminal con la fórmula M-X-N donde M es metionina; X es Pro, Ala o Ser; y N es un extremo N que no es His del VIP activable. De este modo, M y X serán sensibles a, y serán eliminados por, una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli), y/o una dipeptidasa (por ejemplo, DPP-IV), posteriormente. Como alternativa, la secuencia N-terminal del péptido VIP activable puede ser X1-X2-N, donde X1 es Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Val o Pro; X2 es Pro, Ala o Ser; y N es un extremo N que no es His del VIP activable. X1-X2 es un sustrato para dipeptidasa (por ejemplo, DPP-IV) y la digestión con dipeptidasa expondrá N, el extremo N que no es His deseado del VIP.
En otros ejemplos más, el extremo N de un péptido VIP activable tiene la estructura M-Z-S-N, donde M es metionina; Z es un sustrato para una dipeptidasa (por ejemplo, Z se elimina con la exposición a dipeptidasas); N es el extremo N del VIP maduro (His); y S es uno o más aminoácidos que se expondrán después de la digestión con dipeptidasas, y que proporcionan un VIP activable como se ha descrito previamente. Por ejemplo, el péptido VIP activable puede tener una secuencia N-terminal con la fórmula M-X-S-N donde M es metionina, X es Pro, Ala o Ser, y N es el extremo N del VIP maduro (por ejemplo, la SEQ ID NO: 17); y S es uno o más aminoácidos que se expondrán después de la digestión con dipeptidasa, y que proporcionarán la preferencia por un receptor. Como alternativa, la secuencia N-terminal del péptido V iP activable puede ser X1-X2-S-N, donde X1 es Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Val o Pro; X2 es Pro, Ala o Ser; y N es un extremo N que no es His del VIP; y S es uno o más aminoácidos que se expondrán después de la digestión con dipeptidasa. X1-X2 es un sustrato para dipeptidasa (por ejemplo, DPP-IV) y la digestión con dipeptidasa expondrá S.
En otras realizaciones más, el péptido VIP se modifica mediante la fusión con una proteína heteróloga de mamífero, tal como una proteína de mamífero eficaz para prolongar la semivida de las moléculas terapéuticas. Tales secuencias pueden ser secuencias de mamífero, tales como albúmina, transferrina o secuencias Fc de anticuerpos. Tales secuencias se describen en la patente de EE. UU. n.2 7238667 (particularmente con respecto a fusiones con albúmina), patente de EE. UU. n.27176278 (particularmente con respecto a fusiones con transferrina) y patente de EE. UU. n.2 5766883. En algunas realizaciones, el péptido VIP se modifica mediante la fusión con una proteína heteróloga de mamífero en el extremo N. En algunas realizaciones, el VIP se modifica mediante la fusión con una proteína heteróloga de mamífero en el extremo C. En algunas realizaciones, el VIP se modifica mediante la fusión con una proteína heteróloga de mamífero tanto en el extremo N como el C.
En algunas realizaciones, las modificaciones químicas N-terminales del extremo N del péptido VIP proporcionan preferencia por un receptor. En la técnica se conocen bien modificaciones químicas de proteínas y métodos de estas. Son modificaciones químicas a modo de ejemplo no limitantes la PEGilación, metilglioxilación, alquilación reductora, oxidación con ácido perfórmico, succinilación, aminoetilación y lipidación (Clifton, New Protein Techniques, Nueva Jersey: Humana Press, 1985. ISBX. 0-89603-126-8. Volumen 3 de Methods in Molecular Biology). Los grupos químicos, tal como en la PEGilación, se pueden adherir mediante modificaciones de grupos cisteína, metionina, histidina, lisina, arginina, triptófano, tirosina, carboxilo se han descrito previamente (véase Lundblad, Techniques in Protein Modification, CRC Press, 1995).
En otras realizaciones más, el péptido VIP se modifica mediante la fusión con una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos repetitivos, tal como una secuencia que comprende prolinas, alaninas y serinas (por ejemplo, PASilación (Schlapschy, M. et al. (2013)), o secuencias Xt EN (Schellenberger, V. et al. (2009)).
Péptidos de tipo elastina
En algunos aspectos, la divulgación proporciona composiciones terapéuticas que incluyen un péptido intestinal vasoactivo y uno o más péptidos de tipo elastina (ELP, por sus siglas en inglés). En algunos ejemplos, se fusionan un péptido VIP y uno o más ELP. En algunos ejemplos, se producen un péptido VIP y uno o más ELP como un polipéptido de fusión recombinante. En algunos ejemplos, la composición terapéutica incluye un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP como moléculas separadas. En otras realizaciones más, las composiciones incluyen una proteína de fusión VIP-ELP y ELP como moléculas separadas. En las realizaciones, las composiciones incluyen la SEQ ID NO: 15. En algunos ejemplos, las composiciones incluyen la SEQ ID NO: 19. En algunos ejemplos, las composiciones incluyen la SEQ ID NO: 16.
La secuencia de ELP incluye secuencias o unidades peptídicas estructurales que están relacionadas con la proteína elastina o la mimetizan. La secuencia de ELP se construye a partir de unidades estructurales de tres a aproximadamente veinte aminoácidos, o en algunos ejemplos, de cuatro a diez aminoácidos, tales como cuatro, cinco o seis aminoácidos. La longitud de las unidades estructurales individuales puede variar o puede ser uniforme. Por ejemplo, las unidades estructurales incluyen unidades definidas por las SEQ ID NOS: 1-13, que se pueden emplear como unidades estructurales repetitivas, incluidas unidades repetitivas en tándem, o se pueden emplear en alguna combinación. Por lo tanto, el ELP incluye unidad(es) esencialmente estructural(es) seleccionada(s) entre las SEQ ID NOS: 1-13.
En algunos ejemplos, la secuencia de aminoácidos de la unidad de ELP es de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 unidades estructurales, o en ciertos ejemplos de aproximadamente 9 a aproximadamente 200 unidades estructurales, o en ciertos ejemplos de aproximadamente 10 a 200 unidades estructurales, o en ciertos ejemplos de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 unidades estructurales, o en ciertos ejemplos de aproximadamente 80 a aproximadamente 200 unidades estructurales, o de aproximadamente 80 a aproximadamente 150 unidades estructurales, tales como una o una combinación de unidades definidas por las SEQ ID NOS: 1-13. Por lo tanto, las unidades estructurales pueden tener de manera colectiva una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 2000 residuos aminoacídicos, o de aproximadamente 100 a aproximadamente 800 residuos aminoacídicos, o de aproximadamente 200 a aproximadamente 700 residuos aminoacídicos, o de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 residuos aminoacídicos. En los ejemplos, la secuencia de aminoácidos de la unidad estructural de ELP incluye aproximadamente 3 unidades estructurales, aproximadamente 7 unidades estructurales, aproximadamente 9 unidades estructurales, aproximadamente 10 unidades estructurales, aproximadamente 15 unidades estructurales, aproximadamente 20 unidades estructurales, aproximadamente 40 unidades estructurales, aproximadamente 80 unidades estructurales, aproximadamente 90 unidades estructurales, aproximadamente 100 unidades estructurales, aproximadamente 120 unidades estructurales, aproximadamente 140 unidades estructurales, aproximadamente 144 unidades estructurales, aproximadamente 160 unidades estructurales, aproximadamente 180 unidades estructurales, aproximadamente 200 unidades estructurales o aproximadamente 500 unidades estructurales. En los ejemplos, las unidades estructurales pueden tener de manera colectiva una longitud de aproximadamente 45 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 90 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 100 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 200 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 300 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 400 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 500 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 600 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 700 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 720 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 800 residuos aminoacídicos o de aproximadamente 1000 residuos aminoacídicos.
La secuencia de aminoácidos de ELP puede mostrar una transición de fase visible y reversible con la formulación seleccionada. Es decir, la secuencia de aminoácidos de ELP puede presentar desorden estructural y ser sumamente soluble en la formulación por debajo de una temperatura de transición (Tt), pero mostrar una transición de fase de desorden a orden abrupta (intervalo de 2-32C) cuando la temperatura de la formulación se eleva por encima de la Tt. Además de la temperatura, la longitud del polímero de aminoácidos, composición de aminoácidos, fuerza iónica, pH, presión, temperatura, disolventes seleccionados, presencia de solutos orgánicos y concentración proteica también pueden afectar a las propiedades de transición, y estos se pueden adaptar en la formulación para conseguir el perfil de absorción deseado. El perfil de absorción se puede estudiar fácilmente determinando la concentración plasmática o la actividad del agente activo en el tiempo.
En ciertos ejemplos, el (los) componente(s) de ELP puede(n) estar formado(s) por unidades estructurales multipeptídicas (por ejemplo, tetrapéptidos, pentapéptidos, hexapéptidos, octapéptidos o nonapéptidos), que incluyen, sin carácter limitante:
(a) el tetrapéptido Val-Pro-Gly-Gly o VPGG (SEQ ID NO: 1);
(b) el tetrapéptido Ile-Pro-Gly-Gly o IPGG (SEQ ID NO: 2);
(c) el pentapéptido Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO: 3) o VPGXG, donde X es cualquier residuo aminoacídico natural o no natural, y donde X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas;
(d) el pentapéptido Ala-Val-Gly-Val-Pro o AVGVP (SEQ ID NO: 4);
(e) el pentapéptido Ile-Pro-Gly-X-Gly o IPGXG (SEQ ID NO: 5), donde X es cualquier residuo aminoacídico natural o no natural, y donde X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas;
(e) el pentapéptido Ile-Pro-Gly-Val-Gly o IPGVG (SEQ ID NO: 6);
(f) el pentapéptido Leu-Pro-Gly-X-Gly o LPGXG (SEQ ID NO: 7), donde X es cualquier residuo aminoacídico natural o no natural, y donde X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas;
(g) el pentapéptido Leu-Pro-Gly-Val-Gly o LPGVG (SEQ ID NO: 8);
(h) el hexapéptido Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly o VAPGVG (SEQ ID NO: 9);
(i) el octapéptido Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly o GVGVPGVG (SEQ ID NO: 10);
(j) el nonapéptido Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly o VPGFGVGAG (SEQ ID NO: 11);
(k) los nonapéptidos Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly o VPGVGVPGG (SEQ ID NO: 12); y
(l) el pentapéptido Xaa-Pro-Gly-Val-Gly o XPGVG (SEQ ID NO:13) donde X es cualquier residuo aminoacídico natural o no natural, y donde X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas.
Las unidades estructurales multipeptídicas como se definen en las SEQ ID NOS: 1-13 forman el componente peptídico de tipo elastina, o se pueden utilizar combinadas para formar un ELP. En algunos ejemplos, el ELP incluye más de una unidad estructural. En algunos ejemplos, el ELP incluye dos o más unidades estructurales de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-13, que pueden estar en cualquier combinación. En algunos ejemplos, las dos o más unidades estructurales son idénticas y se repiten en tándem. En algunos ejemplos, las dos o más unidades estructurales son diferentes y se repiten de manera alternante. En algunos ejemplos, el ELP incluye unidades estructurales repetidas en tándem para una o más porciones de la secuencia y también unidades estructurales diferentes repetidas de manera alternante para otras porciones de la secuencia. En algunos ejemplos, el componente ELP está formado totalmente (o casi totalmente) por una o una combinación de unidades estructurales (por ejemplo, 2, 3 o 4) seleccionadas entre las SEQ ID NOS: 1-13. En otros ejemplos, al menos un 75%, o al menos un 80%, o al menos un 90% del componente ELP está formado por una o una combinación de unidades estructurales seleccionadas entre las SEQ ID NOS: 1-13. En ciertos ejemplos, el ELP contiene unidades repetitivas, incluidas unidades repetidas en tándem, de Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO: 3), donde X es como se ha definido anteriormente, y donde el porcentaje de unidades de Val-Pro-Gly-X-Gly considerado con respecto a todo el componente ELP (que puede comprender unidades estructurales que no son VPGXG) es superior a aproximadamente un 50%, o superior a aproximadamente un 75%, o superior a aproximadamente un 85%, o superior a aproximadamente un 95% del ELP. El ELP puede contener motivos de 5 a 15 unidades estructurales (por ejemplo, aproximadamente 10 unidades estructurales) de la SEQ ID NO: 3, donde el residuo invitado X varía entre al menos 2 o al menos 3 de las unidades en el motivo. Los residuos invitado se pueden seleccionar independientemente, tal como entre residuos no polares o hidrófobos, tales como los aminoácidos V, I, L, A, G y W (y se pueden seleccionar de modo que se conserve una propiedad de la transición de fase inversa deseada). En ciertos ejemplos, los residuos invitado se seleccionan entre V, G y A. En algunos ejemplos, el ELP incluye la serie ELP 1 (VPGXG: V5A2G3). En algunos ejemplos, el ELP incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21. En algunos ejemplos, el ELP incluye la serie ELP 4 (VPGXG: V-5). En algunos ejemplos, el ELP incluye una combinación de las series ELP1 y ELP4. Sin desear ceñirse a la teoría, las diferencias en la hidrofobicidad del polímero ELP están determinadas por los residuos invitado y sus proporciones, siendo la serie ELP 4 más hidrófoba que la serie ELP1.
En ciertos ejemplos, el ELP es la serie ELP-1 que Incluye [VPGXGjm, donde m es cualquier número de 1 a 200, y cada X se selecciona entre V, G y A, y donde la proporción de V:G:A puede ser aproximadamente 5:3:2. En ciertos ejemplos, ELP incluye [VPGXGjgü, donde cada X se selecciona entre V, G y A, y donde la proporción de V:G:A puede ser aproximadamente 5:3:2. En ciertos ejemplos, el ELP incluye [VPGXG]120, donde cada X se selecciona entre V, G y A, y donde la proporción de V:G:A puede ser aproximadamente 5:3:2.
En ciertos ejemplos, el ELP incluye [VPGXG]144, donde cada X se selecciona entre V, G y A, y donde la proporción de V:G:A es aproximadamente 7:2:0. En ciertos ejemplos, el ELP incluye [VPGXG]144, donde cada X se selecciona entre V, G y A, y donde la proporción de V:G:A es aproximadamente 7:0:2. En ciertos ejemplos, el ELP incluye [VPGXG]144, donde cada X se selecciona entre V, G y A, y donde la proporción de V:G:A es aproximadamente 6:0:3. En ciertos ejemplos, el ELP incluye [VPGXG]144, donde cada X se selecciona entre V, G y A, y donde la proporción de V:G:A es aproximadamente 5:2:2.
En ciertos ejemplos, el ELP incluye [XPGVG]m, donde m es cualquier número de 1 a 200, y cada X se selecciona entre V, G y A. En ciertos ejemplos, el ELP incluye [XPGVG]144, donde m es cualquier número de 1 a 200, cada X se selecciona entre V, G y A y donde la proporción de V:G:A es aproximadamente 5:0:4. En ciertos ejemplos, el ELP incluye [XPGVG]144, donde cada X se selecciona entre V, G y A, y donde la proporción de V:G:A es aproximadamente 5:0:4.
Como alternativa, el ELP es la serie ELP-4 que incluye [VPGVG]g0, o [VPGVG]120. Ciento veinte unidades estructurales de este ELP pueden proporcionar una temperatura de transición a aproximadamente 372C con de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,05 mg/mL (por ejemplo, aproximadamente 0,01 mg/mL) de proteína. Como alternativa, el ELP incluye [VPGXG] 144 o [XPGVG]144. Por ejemplo, 144 unidades estructurales de cualquiera de estos ELP pueden proporcionar una temperatura de transición entre aproximadamente 282C y 352C.
En ciertos ejemplos, el ELP contiene unidades repetitivas, incluidas unidades repetidas en tándem, de Xaa-Pro-Gly-Val-Gly (SEQ ID NO: 13), donde X es como se ha definido anteriormente, y donde el porcentaje de unidades de Xaa-Pro-Gly-Val-Gly considerado con respecto a todo el componente ELP (que puede incluir unidades estructurales que no son XPGVG) es superior a aproximadamente un 50%, o superior a aproximadamente un 75%, o superior a aproximadamente un 85%, o superior a aproximadamente un 95% del ELP. El ELP puede contener motivos de 5 a 15 unidades estructurales (por ejemplo, aproximadamente 9 unidades estructurales) de la SEQ ID NO: 13, donde el residuo invitado X varía entre al menos 2 o al menos 3 de las unidades en el motivo. Los residuos invitado se pueden seleccionar independientemente, tal como entre residuos no polares o hidrófobos, tales como los aminoácidos V, I, L, A, G y W (y se pueden seleccionar de modo que se conserve una propiedad de la transición de fase inversa deseada). En ciertos ejemplos, los residuos invitado se seleccionan entre V y A.
En ciertos ejemplos, el ELP contiene unidades repetitivas, incluidas unidades repetitivas en tándem de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-13 ya sean solas o combinadas. En un ejemplo, el ELP contiene repeticiones de dos o más de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-13 combinadas. En ciertos ejemplos, el ELP contiene repeticiones de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 13. En algunos ejemplos, el ELP contiene repeticiones de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 13, donde los residuos invitado se seleccionan independientemente, tal como entre residuos no polares o hidrófobos, tales como los aminoácidos V, I, L, A, G y W (y se pueden seleccionar de modo que se conserve una propiedad de la transición de fase inversa deseada). En ciertos ejemplos, los residuos invitado se seleccionan entre V y A. En algunos ejemplos, el ELP comprende nonámeros que comprenden cinco copias de un pentapéptido divulgado en la presente. En algunos ejemplos, el ELP comprende nonámeros que comprenden las SEQ ID NOS: 3 y 13 en cualquier combinación. En algunos ejemplos, el ELP comprende una secuencia alternante entre las SEQ ID NOS: 3 y 13. En algunos ejemplos, el ELP incluye nonámeros que incluyen nueve copias de una o más unidades estructurales de ELP divulgadas en la presente. En algunos ejemplos, el ELP incluye nonámeros que incluyen nueve copias de un pentapéptido divulgado en la presente. En algunos ejemplos, el ELP incluye nonámeros que incluyen las SEQ ID NOS: 3 y 13 en cualquier combinación. En algunos ejemplos, el ELP incluye una secuencia alternante entre las SEQ ID NOS: 3 y 13. Se pueden combinar ELP con números variables de nonámeros para producir ELP con, por ejemplo, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 90, 99, 108, 117, 126, 135, 144, 153, 162, 171 o 180 copias del nonámero. En algunos ejemplos, el ELP incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20.
En ciertos ejemplos, el ELP incluye nonámeros que incluyen las SEQ ID NOS: 3, donde el residuo invitado se selecciona entre V, G y A. En ciertos ejemplos, el ELP incluye nonámeros que incluyen la SEQ ID NO: 3, donde V, G y A están en una proporción de 7:2:0 (alfa). En ciertos ejemplos, el ELP incluye nonámeros que incluyen la SEQ ID NO: 3, donde V, G y A están en una proporción de 7:0:2 (beta v1). En ciertos ejemplos, el ELP incluye nonámeros que incluyen la SEQ ID NO: 3, donde V, G y A están en una proporción de 6:0:3 (beta v2). En ciertos ejemplos, el ELP incluye nonámeros que incluyen la SEQ ID NO: 3, donde V, G y A están en una proporción de 5:2:2 (gamma). En ciertos ejemplos, el ELP incluye nonámeros que incluyen la SEQ ID NO: 13, donde el residuo invitado se selecciona entre V, G y A. En ciertos ejemplos, el ELP incluye nonámeros que incluyen la SEQ ID NO: 13, donde V, G y A están en una proporción de 5:0:4 (delta).
En algunos ejemplos, el ELP incluye combinaciones de los nonámeros alfa, beta v1, beta v2 y/o delta. Por ejemplo, el ELP gamma se construye alternando entre un nonámero alfa y un nonámero beta v1 durante 16 copias hasta que se construye un oligómero de 144 unidades. En ciertos ejemplos, el ELP incluye combinaciones de nonámeros alfa y beta v1. En ciertos ejemplos, el ELP incluye combinaciones de nonámeros alfa y beta v2. En ciertos ejemplos, el ELP incluye combinaciones de nonámeros alfa y delta. En ciertos ejemplos, el ELP incluye combinaciones de nonámeros beta v1 y beta v2. En ciertos ejemplos, el ELP incluye combinaciones de nonámeros beta v1 y delta. En ciertos ejemplos, el ELP incluye combinaciones de nonámeros beta v2 y delta. En ciertos ejemplos, el ELP incluye combinaciones de nonámeros alfa, beta v1 y beta v2. En ciertos ejemplos, el ELP incluye combinaciones de nonámeros alfa, beta v1 y delta. En ciertos ejemplos, el ELP incluye combinaciones de nonámeros alfa, beta v2 y delta. Por ejemplo, en disposiciones particulares, el ELP beta v2 puede incluir los siguientes residuos invitado en unidades estructurales iteradas en la siguiente secuencia: A-V-A-V-V-A-V-A-V. La secuencia iterada se puede repetir de manera secuencial en el ELP aproximadamente 10 veces, aproximadamente 15 veces, aproximadamente 16 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 25 veces, aproximadamente 30 veces o aproximadamente 35 veces o más. En algunos aspectos, el ELP contiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 secuencias iteradas. En otros aspectos, el ELP contiene de aproximadamente 15 a 20 secuencias iteradas. En algunos aspectos, el ELP contiene aproximadamente 16 secuencias iteradas.
En algunos ejemplos, el ELP incluye decámeros que incluyen diez copias de una o más unidades estructurales de ELP divulgadas en la presente. En algunos ejemplos, el ELP incluye decámeros que incluyen diez copias de un pentapéptido divulgado en la presente. En algunos ejemplos, el ELP incluye decámeros que incluyen las SEQ ID NOS: 3 y 13 en cualquier combinación. En algunos ejemplos, el ELP incluye una secuencia alternante entre las SEQ ID NOS: 3 y 13. Se pueden combinar ELP con números variables de decámeros para producir ELP con, por ejemplo, 20, 30, 40, 60, 90, 100, 120, 150, 160 o 200 copias del decámero.
En algunos ejemplos, el ELP puede formar una estructura de giro p. En la solicitud de patente internacional PCT/US96/05186 se describen secuencias peptídicas a modo de ejemplo adecuadas para crear una estructura de giro p. Por ejemplo, se puede alterar el cuarto residuo (X) en la secuencia VPGXG sin eliminar la formación de un giro P.
Se puede describir la estructura de ELP a modo de ejemplo utilizando la notación ELPk [XiYj-n], donde k designa una unidad repetida de ELP particular, las letras mayúsculas entre paréntesis son los códigos de aminoácidos de una única letra y sus subíndices correspondientes designan la proporción relativa de cada residuo invitado X en las unidades estructurales (cuando proceda), y n describe la longitud total del ELP en el número de repeticiones estructurales. Por ejemplo, ELP1 [V5A2G3-10] designa un componente ELP que contiene 10 unidades repetitivas del pentapéptido VPGXG, donde X es valina, alanina y glicina en una proporción relativa de aproximadamente 5:2:3; ELP1 [K1V2F1-4] designa un componente ELP que contiene 4 unidades repetitivas del pentapéptido VPGXG, donde X es lisina, valina y fenilalanina con una proporción relativa de aproximadamente 1:2:1; ELP1 [K1V7F1-9] designa un polipéptido que contiene 9 unidades repetitivas del pentapéptido VPGXG, donde X es lisina, valina y fenilalanina con una proporción relativa de aproximadamente 1:7:1; ELP1 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades repetitivas del pentapéptido VPGXG, donde X es valina; ELP1 [V-20] designa un polipéptido que contiene 20 unidades repetitivas del pentapéptido VPGXG, donde X es valina; ELP2 [5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades repetitivas del pentapéptido AVGVP (SEQ ID NO: 4); ELP3 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades repetitivas del pentapéptido IPGXG (SEQ ID NO: 5); donde X es valina; ELP4 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades repetitivas del pentapéptido LPGXG (SEQ ID NO: 7), donde X es valina.
Con respecto al ELP, la Tt es una función de la hidrofobicidad del residuo invitado. Por lo tanto, variando la identidad del (de los) residuo(s) invitado y su(s) fracción (fracciones) molar(es), se pueden sintetizar ELP que muestren una transición inversa en un intervalo amplio. Por lo tanto, se puede reducir la Tt con una longitud de ELP concreta incorporando una fracción mayor de residuos invitado hidrófobos en la secuencia de ELP. Los ejemplos de residuos invitado hidrófobos incluyen valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano y metionina. También se puede utilizar tirosina, que es moderadamente hidrófoba. En consecuencia, se puede aumentar la Tt incorporando residuos tales como los seleccionados entre: ácido glutámico, cisteína, lisina, aspartato, alanina, asparagina, serina, treonina, glicina, arginina y glutamina.
Para los polipéptidos que tienen un peso molecular >100000 Da, la escala de hidrofobicidad divulgada en el documento PCT/US96/05186 proporciona un medio para predecir la Tt aproximada de una secuencia de ELP específica. Para los polipéptidos que tienen un peso molecular <100000 Da, la Tt se puede predecir o determinar mediante la siguiente función cuadrática: Tt = M0 MIX M2X2 donde X es el PM de la proteína de fusión, y M0 = 116,21; M1 = -1,7499; M2 = 0,010349.
El ELP en algunos ejemplos se selecciona o se diseña para que proporcione una Tt que varía de aproximadamente 10 2C a aproximadamente 37 2C en las condiciones de formulación, tales como de aproximadamente 20 a aproximadamente 372C, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 372C. En algunos ejemplos, la temperatura de transición en condiciones fisiológicas (por ejemplo, solución salina al 0,9%) es de aproximadamente 34 a 36 2C, para tener en cuenta una temperatura periférica ligeramente menor.
Los polímeros proteicos de péptido de tipo elastina (ELP) y las proteínas de fusión recombinantes se pueden preparar como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.2 2010/0022455. En algunos ejemplos, los ELP se construyen mediante unión recursiva para clonar rápidamente polipéptidos sumamente repetitivos de cualquier secuencia y longitud especificada en un intervalo amplio de pesos moleculares. En un único ciclo, se unen entre sí dos mitades de un plásmido progenitor, conteniendo cada una una copia de un oligómero, para de esta manera dimerizar el oligómero y reconstituir un plásmido funcional. Este proceso se lleva a cabo de manera recursiva para ensamblar un gen oligomérico con el número deseado de repeticiones. Por ejemplo, una subunidad estructural de ELP (por ejemplo, un pentapéptido o un nonámero de pentapéptidos) se inserta en un vector. El vector se digiere, y se inserta otra unidad estructural de ELP (por ejemplo, un pentapéptido o un nonámero de pentapéptidos). Cada ronda posterior de digestión y unión dobla el número de unidades estructurales de ELP contenidas en el vector resultante hasta que el polímero de ELP tiene la longitud deseada.
En otros ejemplos, el ELP incluye una estructura extendida no globular o de hélice aleatoria. Por ejemplo, el ELP incluye una secuencia de aminoácidos divulgada en la publicación de patente de EE. UU. n.22008/0286808, publicación de patente WIPO n.22008/155134, y la publicación de patente de EE. UU. n.22011/0123487.
En algunos ejemplos, la secuencia de aminoácidos de ELP incluye un polímero recombinante no estructurado de al menos 40 aminoácidos. Por ejemplo, se puede definir el polímero no estructurado donde la suma de residuos de glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el polímero no estructurado, constituye más de aproximadamente un 80% de los aminoácidos totales. En algunos ejemplos, al menos un 50% de los aminoácidos están desprovistos de estructura secundaria según se determina mediante el algoritmo de Chou-Fasman. El polímero no estructurado incluye más de aproximadamente 100, 150, 200 o más aminoácidos contiguos. En algunos ejemplos, la secuencia de aminoácidos forma un dominio de hélice aleatorio. En particular, un polipéptido o polímero de aminoácidos que tiene o que forma una «conformación de hélice aleatoria» carece sustancialmente de una estructura secundaria y terciaria definida.
En varias realizaciones, el sujeto previsto es un ser humano, y la temperatura corporal es de aproximadamente 372C, y por lo tanto el agente terapéutico se diseña para que proporcione una liberación sostenida a esta temperatura o cerca de ella (por ejemplo, entre aproximadamente 28 2C y aproximadamente 37 2C). Una liberación lenta en la circulación con eliminación de enlaces de hidrógeno y/o interacciones hidrófobas está impulsada por una caída en la concentración según se difunde el producto en el sitio de inyección, aun cuando la temperatura corporal permanezca constante. En otras realizaciones, el sujeto es un mamífero no humano, y se diseña el agente terapéutico para mostrar una liberación sostenida a la temperatura corporal del mamífero, que puede ser de aproximadamente 30 a aproximadamente 402C en algunas realizaciones, tal como para ciertas mascotas domesticadas (por ejemplo, el perro o gato) o ganado (por ejemplo, la vaca, caballo, oveja o cerdo). Por lo general, la Tt es mayor que las condiciones de almacenamiento de la formulación (que pueden ser de aproximadamente 2 2C a aproximadamente 30 2C, o de aproximadamente 10 2C a aproximadamente 25 2C, o de aproximadamente 15 2C a aproximadamente 22 2C, o de aproximadamente 22C a aproximadamente 82C), de modo que el agente terapéutico permanece en solución para la inyección. Como alternativa, el agente terapéutico puede almacenarse congelado, tal como de aproximadamente -80 2C a aproximadamente -202C.
En algunos ejemplos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en el intervalo de 27 2C a 36 2C inclusive. En algunos ejemplos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en el intervalo de 282C a 35 2C inclusive. En algunos ejemplos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en el intervalo de 29 2C a 342C inclusive. En algunos ejemplos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en el intervalo de 27 2C a 33 2C inclusive. En algunos ejemplos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en el intervalo de 302C a 332C inclusive. En algunos ejemplos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en el intervalo de 31 2C a 31 2C inclusive. En algunos ejemplos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición de 27 °C, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C o 36 °C. En algunos ejemplos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en un intervalo de 282C a 352C inclusive con una concentración proteica de 10 mg/mL en NaCI 110 mM.
En algunas realizaciones, los polímeros proteicos de ELP se construyen mediante unión recursiva para clonar rápidamente ADN que codifica polipéptidos sumamente repetitivos de cualquier secuencia y longitud especificada en un intervalo amplio de pesos moleculares. En un único ciclo, se unen entre sí dos mitades de un plásmido progenitor, conteniendo cada una una copia de un oligómero, para de esta manera dimerizar el oligómero y reconstituir un plásmido funcional. Este proceso se lleva a cabo de manera recursiva para ensamblar un gen oligomérico con el número deseado de repeticiones. Por ejemplo, una subunidad estructural de ELP (por ejemplo, un pentapéptido o un nonámero de pentapéptidos) se inserta en un vector. El vector se digiere, y se inserta otra unidad estructural de ELP (por ejemplo, un pentapéptido o un nonámero de pentapéptidos). Cada ronda posterior de digestión y unión dobla el número de unidades estructurales de ELP contenidas en el vector resultante hasta que el polímero de ELP tiene la longitud deseada. Al variar el número de pentapéptidos en la unidad estructural inicial, se pueden construir fácilmente ELP de longitud variable. Se pueden utilizar medios de construcción alternativos (es decir, que no sean unión recursiva) para producir longitudes alternativas de ELP.
En algunos ejemplos, el vector contiene una o más repeticiones de unidades estructurales de ELP o aminoácidos adicionales. Por ejemplo, el vector puede añadir una repetición pentamérica adicional al extremo N del ELP con valina en la posición del residuo invitado y un pentámero adicional en el extremo C con un triptófano en el residuo invitado.
Se puede utilizar triptófano como un medio para aumentar el coeficiente de extinción de la molécula, y permitir así una mejor medida de la absorbancia, por ejemplo, a 280 nm, que puede ser útil para la determinación de la concentración proteica, o para monitorizar el contenido proteico durante la purificación. Los pentámeros añadidos en cualquier extremo también se pueden diseñar de manera que el ADN codificante contenga sitios de reconocimiento de enzimas de restricción para la clonación de compañeros de fusión en cualquier extremo de la secuencia codificante del ELP.
En algunos ejemplos, la composición terapéutica incluye un agente activo y uno o más ELP. En algunos ejemplos, la composición terapéutica incluye un agente activo con uno o más ELP en el extremo N o C. En algunos ejemplos, la composición terapéutica incluye un agente activo con uno o más ELP en el extremo N o C. En algunos ejemplos, los ELP tienen aproximadamente el mismo tamaño. En algunos ejemplos, los ELP tienen un tamaño diferente. En algunos ejemplos, un ELP en un extremo es mayor que un ELP en el otro extremo. En algunos ejemplos, un ELP en el extremo N es mayor que un ELP en el extremo C. En algunos ejemplos, un ELP en el extremo C es mayor que un ELP en el extremo N.
Miopatías y métodos de tratamiento
Las miopatías son enfermedades neuromusculares en las que las fibras musculares no funcionan por una cualquiera de muchas razones, lo que da como resultado debilidad muscular. Desde un punto de vista fenotípico, estas enfermedades están caracterizadas por la inflamación del tejido muscular, atrofia del músculo esquelético, pérdida muscular y fibrosis que pueden provocar la muerte prematura debido a la insuficiencia respiratoria y cardiaca. Las miopatías musculares pueden afectar a cualquier tipo de músculo, incluido el múscuo esquelético, músculo cardiaco y/o músculo liso. La composición farmacéutica de la invención es para la administración crónica para uso en un método de retraso, reducción o tratamiento de la fibrosis muscular en un paciente con miopatía muscular. En algunas realizaciones, la miopatía está caracterizada por una mayor fibrosis muscular. En algunas realizaciones, la miopatía está caracterizada por una reducción de la fuerza muscular y/o fuerza de contractibilidad. En algunas realizaciones, la miopatía está caracterizada por un menor acortamiento de los miocitos. En algunas realizaciones, la miopatía está caracterizada por una menor velocidad de realargamiento de los miocitos. En algunas realizaciones, la miopatía está caracterizada por una menor relajación de los miocitos. En algunas realizaciones, el miocito es un miocito del músculo esquelético. En algunas realizaciones, el miocito es un miocardiocito.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para tratar la miopatía muscular que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para prevenir la miopatía muscular que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para retrasar la miopatía muscular que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para ralentizar la evolución de la miopatía muscular que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para mitigar la miopatía muscular que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita.
Los tipos de miopatías que se pueden tratar, prevenir, retrasar o mitigar con las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente incluyen, sin carácter limitante, distrofias musculares, miotonía, neuromiotonía, miopatías congénitas (por ejemplo, miopatía nemalínica, miopatía por multi/minicuerpos, miopatía centronuclear), miopatías mitocondriales, parálisis periódica familiar, miopatías inflamatorias, miopatías metabólicas (por ejemplo, glucogenosis, lipidosis); miopatías adquiridas (por ejemplo, miopatía inducida por fármacos, miopatía por glucocorticoides, miopatía alcohólica), dermatomiositis, polimiositis, miositis por cuerpos de inclusión, miositis osificante, rabdomiólisis y mioglobinurias.
Los tipos de distrofia muscular que se pueden tratar, prevenir, retrasar o mitigar con las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente incluyen, sin carácter limitante, BMD (distrofia muscular de Becker), DMD (distrofia muscular de Duchenne), distrofia miotónica, LGMD (distrofia muscular de la cintura y las extremidades), distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular congénita, distrofia muscular distal, distrofia muscular de Landouzy-Dejerine, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, y distrofia muscular fascioescapohumeral.
La miocardiopatía es el deterioro medible de la capacidad del miocardio para contraerse, lo que da lugar a insuficiencia cardiaca. La enfermedad evoluciona con el tiempo con un inicio variable de arritmias y disfunción ventricular. Se pueden detectar anomalías electrocardiográficas en el inicio de la enfermedad y evolucionan con la edad. El desarrollo de la miocardiopatía está caracterizado por una disfunción diastólica inicial seguida por hipertrofia excéntrica.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para tratar la miocardiopatía que comprenden administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para prevenir la miocardiopatía que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para retrasar la miocardiopatía que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para ralentizar la evolución de la miocardiopatía que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para mitigar la miocardiopatía que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita.
Los tipos de miocardiopatía que se pueden tratar, prevenir, retrasar o mitigar con las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente incluyen, sin carácter limitante, miocardiopatías genéticas (por ejemplo, miocardiopatía hipertrófica (HCM o HOCM, por sus siglas en inglés); miocardiopatía ventricular derecha arritmogénica (ARVC, por sus siglas en inglés); falta de compactación ventricular aislada; miopatía mitocondrial), miocardiopatía dilatada (DCM, por sus siglas en inglés), miocardiopatía restrictiva (RCM, por sus siglas en inglés), miocardiopatías adquiridas (por ejemplo, miocardiopatía del periparto; miocardiopatía de Takotsubo; endocarditis de Loeffler), miocardiopatías metabólicas/por almacenamiento (por ejemplo, amiloidosis, hemocromatosis), miocardiopatías inflamatorias (por ejemplo, «miocarditis viral»; miocardiopatía causada por la enfermedad de Chagas), miocardiopatías endocrinas (por ejemplo, miocardiopatía diabética; miocardiopatía causada por hipertiroidismo; acromegalia), miocardiopatías causadas por toxicidad (por ejemplo, miocardiopatía por quimioterapia, miocardiopatía alcohólica), miocardiopatía dilatada ligada al cromosoma X y/o miocardiopatía neuromuscular (por ejemplo, distrofia muscular). En algunas realizaciones preferidas, la miocardiopatía es el resultado de una distrofia muscular. En algunas realizaciones, la miocardiopatía es el resultado de una distrofia muscular de Duchenne. En algunas realizaciones, la miocardiopatía es el resultado de una distrofia muscular de Becker.
El tratamiento, prevención, retraso o alivio de los síntomas miocardiopáticos se pueden medir mediante cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, la evaluación puede incluir evaluación ecocardiográfica, obtención de imágenes por resonancia magnética cardiaca (MRI, por sus siglas en inglés), MRI cardiaca con realce tardío con gadolinio. En particular, también se pueden evaluar en el LV el tamaño, grosor, volumen, EF, y cantidad de cicatrices/inflamación del miocardio, así como también la deformación. La deformación, cambio en la dimensión y volumen del LV, y la cantidad de cicatrices son medidas claves.
El tratamiento, prevención, retraso o alivio de los síntomas miopáticos se puede medir mediante cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, las pruebas utilizadas para evaluar a los pacientes con miopatías incluyen, sin carácter limitante, niveles de creatina-cinasa (CK, por sus siglas en inglés) con isoenzimas, niveles de electrolitos, calcio y magnesio, niveles de mioglobina sérica, niveles de creatinina sérica y nitrógeno ureico sanguíneo, análisis de orina (por ejemplo, mioglobinuria indicada por un análisis de orina positivo con pocos glóbulos rojos tras su evaluación con microscopio, hemograma completo, velocidad de sedimentación de eritrocitos, pruebas de la función tiroidea, niveles de aspartato-aminotransferasa, electrocardiografía, niveles de anticuerpos antinucleares, electromiografía, obtención de imágenes por resonancia magnética y/o biopsia muscular. Los efectos de la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente se pueden medir en cualquier músculo relevante, incluidos, sin carácter limitante, músculo esquelético, músculo cardiaco, músculos gemelos, músculo cuádriceps, músculo del diafragma y/o músculo tibial anterior.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para prevenir el deterioro cardiaco que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para retrasar el deterioro cardiaco que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para ralentizar la evolución del deterioro cardiaco que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para mitigar el deterioro cardiaco que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, el deterioro cardiaco se previene, retrasa o mitiga durante aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 5 años, y/o aproximadamente 10 años en comparación con el deterioro cardiaco en un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, el deterioro cardiaco se previene, retrasa o mitiga en aproximadamente un 1%, aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, o aproximadamente un 90% en comparación con el deterioro cardiaco en un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, esta prevención, retraso o alivio del deterioro cardiaco se observa en los puntos temporales divulgados en la presente. Por ejemplo, el deterioro cardiaco se puede retrasar en aproximadamente un 20% a las 32 semanas. En algunas realizaciones, el deterioro cardiaco es un descenso en el inotropismo. En algunas realizaciones, el deterioro cardiaco es un descenso en el lusitropismo. En algunas realizaciones, el deterioro cardiaco es un engrosamiento del músculo cardiaco. En algunas realizaciones, el deterioro cardiaco es hipertrofia cardiaca.
En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente mejora la función cardiaca en un sujeto en comparación con un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, la función cardiaca se mejora durante aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 5 años, y/o aproximadamente 10 años en comparación con la función cardiaca de un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, la función cardiaca se mejora en aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, o aproximadamente un 90% en comparación con la función cardiaca de un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, esta mejora de la función cardiaca se observa en los puntos temporales divulgados en la presente. En algunas realizaciones, la mejora cardiaca es un aumento en el inotropismo. En algunas realizaciones, la mejora cardiaca es un aumento en el lusitropismo. En algunas realizaciones, la mejora cardiaca es un menor engrosamiento del músculo cardiaco en comparación con un sujeto miocardiopático. En algunas realizaciones, la mejora cardiaca es menos hipertrofia cardiaca en comparación con un sujeto miocardiopático.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para prevenir el desarrollo de fibrosis que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para retrasar el desarrollo de la fibrosis que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para ralentizar la evolución de la fibrosis que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para mitigar el desarrollo de la fibrosis que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, el desarrollo de la fibrosis se previene, retrasa o mitiga durante aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 5 años, y/o aproximadamente 10 años en comparación con el desarrollo de la fibrosis en un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, el desarrollo de la fibrosis se previene, retrasa o mitiga en aproximadamente un 1%, aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, o aproximadamente un 90% en comparación con el desarrollo de la fibrosis en un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, esta prevención, retraso o alivio de la fibrosis se observa en los puntos temporales divulgados en la presente. En algunas realizaciones, la fibrosis se mide utilizando técnicas histológicas en una biopsia (por ejemplo, tinción con hematoxilina y eosina (HE) y tricolor) donde la fibrosis se puede evaluar determinando el porcentaje de colágeno presente en comparación con el área del tejido total.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para reducir la producción de colágeno que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para retrasar la producción de colágeno que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para mitigar la producción de colágeno que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, la producción de colágeno se reduce, retrasa o mitiga durante aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 5 años, o aproximadamente 10 años en comparación con la producción de colágeno en un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, la producción de colágeno se reduce, retrasa o mitiga en aproximadamente un 1%, aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, o aproximadamente un 90% en comparación con la producción de colágeno en un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, esta reducción, retraso o alivio de la producción de colágeno se observa en los puntos temporales divulgados en la presente. Por ejemplo, la cantidad de colágeno producida en un paciente miopático se puede reducir en aproximadamente un 25% a las 32 semanas.
En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente mantiene la contractibilidad y/o fuerza contráctil musculares en un sujeto. En algunas realizaciones, la contractibilidad y/o fuerza contráctil musculares se mantienen en aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95% o aproximadamente un 99% de la contractibilidad y/o fuerza contráctil musculares de un sujeto sano. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente mantiene la contractibilidad y/o fuerza contráctil musculares en un sujeto durante aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 5 años y/o aproximadamente 10 años en comparación con la contractibilidad y/o fuerza contráctil musculares de un sujeto sano. En algunas realizaciones, el grado de contractibilidad y/o fuerza contráctil musculares se mantiene en el sujeto en Ios puntos temporales divulgados en la presente. Se define un sujeto sano como un sujeto que no padece una distrofia muscular u otra enfermedad o trastorno de atrofia muscular.
En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente mantiene la fuerza muscular en un sujeto. En algunas realizaciones, la fuerza muscular se mantiene en aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95% o aproximadamente un 99% de la fuerza muscular de un sujeto sano. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente mantiene la fuerza muscular en un sujeto durante aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 5 años y/o aproximadamente 10 años en comparación con la fuerza muscular de un sujeto sano. En algunas realizaciones, el grado de fuerza muscular se mantiene en el sujeto en los puntos temporales divulgados en la presente. La función muscular se puede medir a nivel de todo el sujeto, a nivel de los órganos y/o a nivel de miocitos. La fuerza del músculo esquelético se puede medir por cualquier medio conocido en la técnica y, por ejemplo, mediante pruebas musculares manuales y/o el uso de un dinamómetro. La fuerza muscular cardiaca se puede medir por cualquier medio conocido en la técnica y, por ejemplo, mediante el uso de electrocardiogramas, ecocardiografía, obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), evaluación de la presión-volumen (por ejemplo, fracción de eyección, acortamiento fraccional, volumen telediastólico (EDV, por sus siglas en inglés), volumen telesistólico (ESV), volumen sistólico (SV, por sus siglas en inglés), deformación miocárdica, presión telediastólica (EDP, por sus siglas en inglés), presión telesistólica (ESP, por sus siglas en inglés)). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la administración de la composición farmacéutica conserva el acortamiento del área fraccional en comparación con un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, la administración de la composición farmacéutica conserva la fracción de eyección en comparación con un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, la administración de la composición farmacéutica aumenta la velocidad de llenado ventricular en comparación con un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, la administración de la composición farmacéutica eleva la velocidad máxima de elevación de la presión en comparación con un sujeto miopático no tratado. En otras realizaciones más, la administración de la composición farmacéutica aumenta la constante de relajación Tau en comparación con un sujeto miopático no tratado.
En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente previene, retrasa o mitiga la lesión muscular inducida por la contracción en un sujeto. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente previene, retrasa o mitiga la lesión muscular inducida por la contracción en aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 90% y/o aproximadamente un 95% en comparación con un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente previene, retrasa o mitiga la lesión muscular inducida por la contracción en un sujeto durante aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 5 años y/o aproximadamente 10 años en comparación con un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, el grado de prevención, retraso o alivio de la lesión muscular inducida por la contracción se observa en el sujeto en los puntos temporales divulgados en la presente. Por ejemplo, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente puede reducir la lesión muscular inducida por la contracción en un 25% a las 10 semanas. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente previene, retrasa o mitiga la lesión muscular inducida por la contracción en un sujeto sin cambiar la fuerza muscular específica. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente previene, retrasa, ralentiza la evolución o mitiga la lesión muscular inducida por la contracción en un sujeto y mejora la fuerza muscular específica.
En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente mantiene la función de los miocitos. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente mantiene el acortamiento de los miocitos, realargamiento de los miocitos, relajación y/o contractibilidad de los miocitos. En algunas realizaciones, el acortamiento de los miocitos, realargamiento de los miocitos, relajación y/o contractibilidad de los miocitos se mantienen en aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95% y/o aproximadamente un 99% del acortamiento de los miocitos, realargamiento de los miocitos, relajación y/o contractibilidad de los miocitos en un sujeto sano. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente mantiene el acortamiento de los miocitos, realargamiento de los miocitos, relajación y/o contractibilidad de los miocitos en un sujeto durante aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 5 años y/o aproximadamente 10 años en comparación con el acortamiento de los miocitos, realargamiento de los miocitos, relajación y/o contractibilidad de los miocitos en un sujeto sano. En algunas realizaciones, el mantenimiento del grado de acortamiento de Ios miocitos, realargamiento de Ios miocitos, relajación y/o contractibilidad de Ios miooitos se observa en el sujeto en los puntos temporales divulgados en la presente. La función de los miocitos se puede estudiar mediante cualquier medio conocido en la técnica, que incluyen, por ejemplo, la medida de biomarcadores asociados con la función y/o daño, y/o estudio directo de los miocitos. En algunas realizaciones, los miocitos son miocitos esqueléticos. En algunas realizaciones, los miocitos son miocardiocitos.
En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente afecta al recuento de células inmunitarias en un músculo. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente disminuye el recuento de células inmunitarias en un músculo. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente disminuye el recuento de macrófagos en un músculo. En algunas realizaciones, el recuento de células inmunitarias se reduce en aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95%, o aproximadamente un 99% del recuento de células inmunitarias en el músculo de un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente disminuye el recuento de células inmunitarias en el músculo de un sujeto durante aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 5 años y/o aproximadamente 10 años en comparación con el recuento de células inmunitarias en el músculo de un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, esta reducción en el recuento de células inmunitarias en un músculo se observa en el sujeto en los puntos temporales divulgados en la presente. Por ejemplo, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente puede reducir el recuento de células inmunitarias en un músculo en aproximadamente un 25% a las 32 semanas.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para prevenir la inflamación que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para retrasar la inflamación que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para ralentizar el desarrollo de la inflamación que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para mitigar la inflamación que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para reducir la inflamación que comprende administrar composiciones farmacéuticas de un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP a un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, la inflamación se previene, retrasa, reduce o mitiga durante aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 5 años, y/o aproximadamente 10 años en comparación con la inflamación en un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, la inflamación se previene, retrasa, reduce o mitiga en aproximadamente un 1%, aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, o aproximadamente un 90% en comparación con la inflamación en un sujeto miopático no tratado. En algunas realizaciones, esta prevención, retraso, reducción o alivio de la inflamación se observa en los puntos temporales divulgados en la presente. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente previene, retrasa, reduce o mitiga la inflamación al inhibir la expresión o actividad de citocinas proinflamatorias. En algunas realizaciones, la citocina proinflamatoria es cualquier citocina proinflamatoria, incluidas, sin carácter limitante, OPN, LTp4, TNF-alfa, interleucina-6 (IL-6) y el receptor del factor de necrosis tumoral alfa soluble (sTNFR).
Composiciones farmacéuticas y administración
La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen un péptido intestinal vasoactivo y uno o más ELP con uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
La presente divulgación proporciona formulaciones de liberación sostenida que incluyen un agente terapéutico divulgado en la presente y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, tales excipientes incluyen sales y otros excipientes que pueden actuar para estabilizar los enlaces de hidrógeno. Se puede utilizar cualquier excipiente apropiado conocido en la técnica. Los excipientes a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, aminoácidos tales como histidina, glicina o arginina; glicerol; azúcares, tales como sacarosa; agentes tensioactivos tales como polisorbato 20 y polisorbato 80; ácido cítrico; citrato de sodio; antioxidantes; sales incluidas sales de metales alcalinotérreos tales como sodio, potasio y calcio; contraiones tales como cloruro y fosfato; conservantes; alditoles (por ejemplo, manitol, sorbitol); y agentes tamponantes. Las sales a modo de ejemplo incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, fosfato dibásico de sodio, fosfato monobásico de sodio, fosfato monobásico de potasio y fosfato dibásico de sodio. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente tienen una mejor eficacia, biodisponibilidad, semivida terapéutica, permanencia, resistencia a la degradación, etc.
En ciertas realizaciones, la formulación puede incluir de histidina aproximadamente 5 mM a histidina aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, la formulación incluye histidina aproximadamente 50 mM, histidina aproximadamente 40 mM, histidina aproximadamente 30 mM, histidina aproximadamente 25 mM, histidina aproximadamente 20 mM o histidina aproximadamente 15 mM. En ciertas realizaciones, la formulación puede incluir de cloruro de sodio aproximadamente 10 mM a cloruro de sodio aproximadamente 200 mM. En algunas realizaciones, la formulación incluye cloruro de sodio aproximadamente 20 mM, cloruro de sodio aproximadamente 40 mM, cloruro de sodio aproximadamente 60 mM, cloruro de sodio aproximadamente 75 mM, cloruro de sodio aproximadamente 100 mM, cloruro de sodio aproximadamente 120 mM o cloruro de sodio aproximadamente 150 mM. En ciertas realizaciones, la formulación puede incluir de histidina aproximadamente 10 mM a histidina aproximadamente 30 mM y de cloruro de sodio aproximadamente 60 mM a cloruro de sodio aproximadamente 80 mM. En ciertas realizaciones, la formulación puede incluir histidina aproximadamente 20 mM y cloruro de sodio aproximadamente 75 mM.
La composición farmacéutica se formula a un pH, fuerza iónica y, por lo general, con excipientes suficientes para permitir la formación de la matriz a la temperatura corporal (por ejemplo, 37 sC o de 34 a 26 sC en algunas realizaciones). Por lo general, la composición farmacéutica se prepara de manera que no forme la matriz en las condiciones de almacenamiento. La formulación se puede almacenar congelada, refrigerada o a temperatura ambiente. Las condiciones de almacenamiento pueden estar por debajo de la congelación, tal como inferior a aproximadamente -10 2C, o inferior a aproximadamente -20 2C, o inferior a aproximadamente -40 2C, o inferior a aproximadamente -70 2C. Las condiciones de almacenamiento están por lo general por debajo de la temperatura de transición de la formulación, tal como por debajo de aproximadamente 322C, o por debajo de aproximadamente 302C, o por debajo de aproximadamente 272C, o por debajo de aproximadamente 252C, o por debajo de aproximadamente 202C, o por debajo de aproximadamente 15 2C. En algunas realizaciones, la formulación se almacena a 2-8 2C. Por ejemplo, la formulación puede ser isotónica con la sangre o tener una fuerza iónica que mimetiza las condiciones fisiológicas. Por ejemplo, la formulación puede tener una fuerza iónica de al menos la de cloruro de sodio 25 mM, o al menos la de cloruro de sodio 30 mM, o al menos la de cloruro de sodio 40 mM, o al menos la de cloruro de sodio 50 mM, o al menos la de cloruro de sodio 75 mM, o al menos la de cloruro de sodio 100 mM o al menos la de cloruro de sodio 150 mM. En ciertas realizaciones, la formulación tiene una fuerza iónica equivalente a la de solución salina al 0,9% (cloruro de sodio 154 mM).
En algunas realizaciones, la formulación se formula a pH fisiológico. En algunas realizaciones, la formulación se formula a un pH en el intervalo de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5. En algunas realizaciones, la formulación se formula a un pH en el intervalo de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0. En algunas realizaciones, la formulación se formula a un pH en el intervalo de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5. En algunas realizaciones, la formulación se formula a un pH de 7,5. En algunas realizaciones, las formulaciones con un pH inferior demuestran una mejor estabilidad de formulación en comparación con formulaciones a un pH superior. En algunas realizaciones, las formulaciones con un pH superior demuestran una mejor estabilidad de formulación en comparación con formulaciones a un pH inferior.
En algunas realizaciones, la formulación es estable en las condiciones de almacenamiento. La estabilidad se puede medir utilizando cualquier medio adecuado de la técnica. Por lo general, una formulación estable es una que muestra menos de un 5% de incremento en productos de degradación o impurezas. En algunas realizaciones, la formulación es estable durante al menos aproximadamente 1 mes, al menos aproximadamente 2 meses, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente un año o al menos aproximadamente 2 años o más en las condiciones de almacenamiento. En algunas realizaciones, la formulación es estable durante al menos aproximadamente 1 mes, al menos aproximadamente 2 meses, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses o al menos aproximadamente un año o más a 252C.
La concentración proteica en la formulación se adapta para permitir la formación del coacervado a la temperatura de administración. Por ejemplo, concentraciones proteicas más elevadas ayudan a impulsar la formación del coacervado, y la concentración proteica necesaria para este fin varía dependiendo de la serie de ELP utilizada. Por ejemplo, en algunos ejemplos que utilizan un ELP1-120, o ELP con temperaturas de transición comparables, la proteína está presente en el intervalo de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL, o está presente en el intervalo de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 125 mg/mL. En ejemplos que utilizan un ELP4-120, o secuencias de aminoácidos con temperaturas de transición comparables, la proteína está presente en el intervalo de aproximadamente 0,005 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, o está presente en el intervalo de aproximadamente 0,01 mg/mL a aproximadamente 5 mg/mL.
En los ejemplos, la divulgación proporciona una composición farmacéutica de liberación sostenida que incluye un péptido intestinal vasoactivo divulgado en la presente (por ejemplo, que tiene un resto N-terminal tal como una metionina) y una o más secuencias de aminoácidos que incluyen [VPGXG]9ü , [VPGXG]12ü , [VPGXG]16ü o [VPGXG]18ü donde cada X se selecciona entre V, G y A. V, G y A pueden estar presentes en una proporción de aproximadamente 5:3:2, de aproximadamente 7:2:0, de aproximadamente 7:0:2, de aproximadamente 6:0:3 o de aproximadamente 5:2:2. Como alternativa, la secuencia de aminoácidos incluye [VPGVGjgü o [VPGVG]i20. En los ejemplos, la divulgación proporciona una composición farmacéutica de liberación sostenida que incluye un péptido intestinal vasoactivo o derivados de este (por ejemplo, que tienen un resto N-terminal tal como una metionina) y una o más secuencias de aminoácidos que incluyen [XPGVG]i44 donde cada X se selecciona entre V, G y A. V, G y A pueden estar presentes en una proporción de aproximadamente 5:0:4. Como alternativa, la secuencia de aminoácidos incluye [XPGVG]i44. La formulación incluye además uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables para la formación de una matriz reversible a partir de una forma acuosa tras la administración a un sujeto humano. Se divulgan VIP y derivados de este en la publicación de patente de EE. UU. n.22011/0178017.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para suministrar un régimen de liberación sostenida de un péptido intestinal vasoactivo divulgado en la presente. El método comprende administrar la composición farmacéutica descrita en la presente a un sujeto que lo necesite, donde la composición farmacéutica se administra de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 veces al mes. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para su administración aproximadamente 1 vez, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces y/o aproximadamente 4 veces al mes. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para la administración semanal. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para la administración diaria. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para la administración de una a tres veces a la semana. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para la administración una vez cada dos semanas. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para la administración de una a tres veces al mes. En realizaciones particulares, la composición farmacéutica es para la administración aproximadamente 1 vez al mes. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para la administración aproximadamente una vez cada 2 meses, aproximadamente una vez cada 3 meses, aproximadamente una vez cada 4 meses, aproximadamente una vez cada 5 meses y/o aproximadamente una vez cada 6 meses. En algunos ejemplos, el VIP puede tener un resto adicional tal como metionina en el extremo N para alterar el perfil de unión del receptor, como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.2 2011/0178017. En algunos ejemplos, el VIP se fusiona con ELP1 (que tiene de aproximadamente 90 a aproximadamente 180 unidades de ELP). En algunos ejemplos, el VIP se fusiona con ELP4 (que tiene de aproximadamente (que tiene de aproximadamente 90 a aproximadamente 180 unidades de ELP). En algunos ejemplos, el VIP se fusiona con ELPbetav2 (que tiene de aproximadamente 90 a aproximadamente 180 unidades de ELP). La composición farmacéutica se puede empaquetar en forma de bolígrafos rellenados o jeringuillas rellenadas previamente para la administración una vez a la semana, dos veces a la semana, o de una a ocho veces al mes, o como alternativa, utilizar para rellenar viales convencionales y similares.
Convenientemente, las composiciones proporcionan una exposición farmacocinética prolongada debido a la liberación sostenida del agente activo. En aspectos particulares, el nivel de exposición máximo se puede conseguir aproximadamente 10 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas o aproximadamente 72 horas después de la administración; normalmente el nivel de exposición máximo se consigue entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 48 horas después de la administración. Después de conseguir el nivel de exposición máximo las composiciones pueden conseguir un nivel prolongado de liberación mediante el cual se obtiene un porcentaje sustancial del nivel máximo durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, el nivel sostenido puede ser de aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 90% o aproximadamente un 100%. Los periodos de tiempo a modo de ejemplo para mantener la tasa sostenida son de aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas o aproximadamente 8 semanas, después de conseguir la tasa de exposición máxima. Posteriormente, el nivel sostenido puede ser inferior a un nivel de exposición reducido. Tales tasas de exposición reducidas pueden ser de aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50% o aproximadamente un 60%.
En las realizaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente son para la administración crónica. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente son para la administración durante aproximadamente 6 meses, durante aproximadamente 7 meses, durante aproximadamente 8 meses, durante aproximadamente 9 meses, durante aproximadamente 10 meses, durante aproximadamente 11 meses, durante aproximadamente 1 año, durante aproximadamente 2 años, durante aproximadamente 3 años, durante aproximadamente 4 años, durante aproximadamente 5 años, durante aproximadamente 10 años o más. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en cualquier dosis y/o frecuencia requeridas divulgadas en la presente.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente son para su administración hasta que mejoren los síntomas miopáticos. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente son para su administración hasta que se mitiguen los síntomas miopáticos. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente son para su administración hasta que se retrasen los síntomas miopáticos. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente son para su administración hasta que se curen los síntomas miopáticos.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente son para su administración antes de que el paciente comience a mostrar uno o más síntomas miopáticos. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente son para su administración cuando aparecen los síntomas miopáticos. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente son para su administración antes de que el paciente comience a mostrar miocardiopatía. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente son para su administración cuando aparecen los síntomas de la miocardiopatía.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para su administración a un sujeto del que se ha determinado que padece atrofia muscular. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para su administración a un sujeto del que se ha determinado que padece miopatía muscular. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un aumento de los niveles de proteína muscular que circulan en la sangre en comparación con un sujeto no miopático. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un aumento de los niveles de creatina-cinasa (CK) que circulan en la sangre en comparación con un sujeto no miopático. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un aumento de los niveles de lactatodeshidrogenasa (LDH, por sus siglas en inglés) que circulan en la sangre en comparación con un sujeto no miopático. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto tiene un aumento de los niveles de piruvato cinasa (PK, por sus siglas en inglés) que circulan en la sangre en comparación con un sujeto no miopático. Los niveles de proteína muscular se pueden determinar utilizando un análisis de enzimas séricas.
En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta una alteración de los niveles de electrolitos en la orina. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un aumento de los niveles de calcio en la orina en comparación con sujetos no miopáticos. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un aumento de los niveles de magnesio en la orina en comparación con sujetos no miopáticos. Los niveles de electrolitos en la orina se pueden determinar utilizando un análisis de orina.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para su administración a un sujeto del que se ha determinado que padece miopatía inflamatoria. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un aumento de los niveles de anticuerpos que circulan en la sangre en comparación con un sujeto no miopático. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un aumento de los niveles de anticuerpos asociados con la miositis que circulan en la sangre en comparación con un sujeto no miopático. En algunas realizaciones, los anticuerpos asociados con la miositis incluyen, sin carácter limitante, Jo-1, PL-7, PI-12, EK, OJ, KS, Zo y Ha. En algunas realizaciones, los anticuerpos asociados con la miositis se unen a antígeno que incluyen, sin carácter limitante, aquellos a los que se unen los anticuerpos Jo-1, PL-7, PI-12, EK, OJ, KS, Zo y Ha. En algunas realizaciones, los anticuerpos incluyen, sin carácter limitante, SRP, Mi-2, PMS1, P155, p140, CADM-140, MJ (p140), MU, SAE, decorina, KU, KJ, HMGCR, Mup44, Cortactina, poro nuclear, FHL1, PM-Scl, 56kD, SSA/ro, U1-nRNP, U2-NRNP, Fer, MAS, y mitocondriales. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a antígeno que incluyen, sin carácter limitante, aquellos a los que se unen los anticuerpos SRP, Mi-2, PMS1, P155, p140, CADM-140, MJ (p140), MU, SAE, decorina, KU, KJ, HMGCR, Mup44, Cortactina, poro nuclear, FHL1, PM-Scl, 56kD, SSA/ro, U1-nRNP, U2-NRNP, Fer, MAS, y mitocondriales.
En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un ecocardiograma anómalo en comparación con un sujeto no miocardiopático. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta cambios en la eficacia cardiaca en comparación con un sujeto no miocardiopático. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un mayor intervalo P-R en comparación con sujetos no miocardiopáticos. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un aumento de las ondas U en comparación con sujetos no miocardiopáticos. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un QRS amplio en comparación con sujetos no miocardiopáticos. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta cambios ST-T no específicos en comparación con sujetos no miocardiopáticos. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta arritmias sinusales en comparación con sujetos no miocardiopáticos. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta ondas Q profundas y ondas R elevadas en derivaciones precordiales en comparación con sujetos no miocardiopáticos. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta una contracción tónica (TC, por sus siglas en inglés) anómala en comparación con sujetos no miocardiopáticos. En algunas realizaciones, la contracción tónica es el resultado de un periodo de desregulación del calcio que se manifiesta como una contracción sostenida de miocitos impulsada por iones, que da como resultado la aparición en la ecocardiografía de un ventrículo izquierdo «que no se rellena lo suficiente» (Su etal. (2015). En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta una arritmia en comparación con sujetos no miocardiopáticos. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta una taquicardia sinusal en comparación con sujetos no miocardiopáticos. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta una disfunción sistólica en comparación con sujetos no miocardiopáticos. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta una disfunción diastólica en comparación con sujetos no miocardiopáticos. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta una reducción de la velocidad de la onda sistólica mitral en comparación con sujetos no miocardiopáticos. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta anomalías en la movilidad de la pared en comparación con sujetos no miocardiopáticos. La función y/o características cardiacas se pueden medir utilizando un electrocardiograma.
En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un aumento de la expresión de oitooinas proinflamatorias en comparación con un sujeto no miocardiopático. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un aumento de la actividad de citocinas proinflamatorias en comparación con un sujeto no miocardiopático. En algunas realizaciones, la citocina proinflamatoria es cualquier citocina proinflamatoria, incluidas, sin carácter limitante, OPN, LTp4, TNF-alfa, interleucina-6 (IL-6) y el receptor del factor de necrosis tumoral alfa soluble (sTNFR). La expresión o actividad de citocinas proinflamatorias en un sujeto se puede medir mediante ensayos de citocinas.
En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta una reducción de la expresión de la proteína nNOS en comparación con un sujeto no miocardiopático. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta una reducción de la actividad de la proteína nNOS en comparación con un sujeto no miocardiopático. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta una alteración de la acumulación de la proteína nNOS en comparación con un sujeto no miocardiopático. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta un aumento de la acumulación de la proteína nNOS en el citosol del músculo esquelético en comparación con un sujeto no miocardiopático. En algunas realizaciones, se ha determinado que el sujeto presenta una reducción de la acumulación de la proteína nNOS en el sarcolema del músculo esquelético en comparación con un sujeto no miocardiopático. La acumulación de proteínas se puede estudiar mediante técnicas histológicas. La expresión de proteínas se puede estudiar mediante técnicas de inmunoprecipitación. La actividad proteica se puede medir mediante ensayos catalíticos con NOS.
La composición farmacéutica es por lo general para el «suministro sistémico», lo que significa que el agente no se suministra localmente en un sitio patológico o un sitio de acción. En su lugar, el agente es absorbido por el torrente sanguíneo desde el sitio de inyección, donde el agente actúa de manera sistémica o es transportado a un sitio de acción por la circulación. El agente terapéutico se puede administrar por cualquier vía conocida tal como, por ejemplo, vía oral, intravenosa, intramuscular, nasal, subcutánea, intravaginal e intrarrectal. En una realización, la formulación es por lo general para la administración subcutánea. En una realización, los parámetros farmacocinéticos (PK) se prolongan cuando el agente se administra por vía subcutánea. En una realización, se prolonga la semivida de la proteína de fusión. En una realización, los parámetros PK cuando se administra el agente por vía subcutánea se prolongan en comparación con el agente administrado por otro medio (por ejemplo, por vía intravenosa). En una realización, la liberación retardada del agente se prolonga cuando el agente se administra por vía subcutánea en comparación con el agente administrado por otro medio (por ejemplo, por vía intravenosa).
En algunas realizaciones, la formulación es para su administración aproximadamente mensual y se puede administrar por vía subcutánea o intramuscular. En algunas realizaciones, la formulación es para su administración aproximadamente semanal y se puede administrar por vía subcutánea o intramuscular. En algunas realizaciones, el sitio de administración no es un sitio patológico, por ejemplo, no es el sitio de acción previsto.
En varias realizaciones, la concentración plasmática del agente activo no cambia en más de un factor de 10, o un factor de aproximadamente 5, o un factor de aproximadamente 3 a lo largo de la tanda de una pluralidad de administraciones, tal como al menos 2, al menos 5 o al menos aproximadamente 10 administraciones de la formulación. Las administraciones se espacian de manera sustancialmente regular tal como, por ejemplo, aproximadamente diaria, o aproximadamente una vez a la semana, o de una a aproximadamente cinco veces al mes, o aproximadamente una vez cada dos meses, o aproximadamente una vez cada tres meses.
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente se pueden administrar en dosis más pequeñas y/o con menos frecuencia que los equivalentes no infundidos o no conjugados. Aunque un experto en la técnica puede determinar la dosis deseable en cada caso, una dosis adecuada del agente terapéutico para conseguir un beneficio terapéutico puede, por ejemplo, estar en un intervalo de aproximadamente 1 microgramo (gg) a aproximadamente 100 miligramos (mg) por kilogramo de peso corporal del receptor al día, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 10 gg a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal al día y de la manera más preferente en un intervalo de aproximadamente 100 gg a aproximadamente 10 mg por kilogramo de peso corporal al día. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para su administración en una dosis baja. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para su administración en una dosis entre 1 mg por kilogramo de peso corporal al día y aproximadamente 9 mg por kilogramo de peso corporal al día. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para su administración en aproximadamente 1 mg por kilogramo de peso corporal al día, aproximadamente 3 mg por kilogramo de peso corporal al día y/o aproximadamente 9 mg por kilogramo de peso corporal al día. La dosis deseada se puede presentar como una dosis o dos o más subdosis administradas a intervalos apropiados a lo largo del día. Estas subdosis se pueden administrar en formas farmacéuticas unitarias, por ejemplo, que contienen de aproximadamente 10 gg a aproximadamente 1000 mg, preferentemente de aproximadamente 50 gg a aproximadamente 500 mg, y de la manera más preferente de aproximadamente 50 gg a aproximadamente 250 mg de principio activo por forma farmacéutica unitaria. Como alternativa, si la afección del receptor lo requiere, las dosis se pueden administrar como una infusión continua.
En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano, pero en otras realizaciones puede ser un mamífero no humano tal como una mascota domesticada (por ejemplo, un perro o gato) o ganado o un animal de granja (por ejemplo, un caballo, vaca, oveja o cerdo).
Terapias combinadas
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente se pueden administrar con diversas terapias utilizadas para tratar, prevenir, retrasar o mitigar miopatías, distrofias musculares y/o miocardiopatías, incluidas, sin carácter limitante, fisioterapia, fisioterapia respiratoria, logopedia, terapia ocupacional, cirugía correctora y/o agentes terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente se pueden utilizar solas o combinadas con uno o más agentes terapéuticos. El uno o más agentes terapéuticos pueden ser cualquier compuesto, molécula o sustancia que ejerza un efecto terapéutico en un sujeto que lo necesita.
El uno o más agentes terapéuticos se pueden «coadministrar», es decir, administrar juntos de manera coordinada a un sujeto, ya sea como composiciones farmacéuticas separadas o mezclados en una única composición farmacéutica. Cuando se «coadministran», el uno o más agentes terapéuticos también se pueden administrar simultáneamente con las presentes composiciones farmacéuticas, o se pueden administrar por separado, que incluye en diferentes momentos y con diferentes frecuencias. El uno o más agentes terapéuticos se pueden administrar mediante cualquier vía conocida, tal como por vía oral, intravenosa, intramuscular, nasal, subcutánea, intravaginal, intrarrectal y similares; y el agente terapéutico también se puede administrar mediante cualquier vía conveniente. En muchas realizaciones, al menos un agente terapéutico se puede administrar por vía subcutánea.
Estos uno o más agentes terapéuticos incluyen, sin carácter limitante, corticosteroides; esteroides, fenitoína; procainamida; quinina; glucocorticoides (por ejemplo, deflazacort, VPB15, prednisona triamcinolona, metilprednisona sistémica, betametasona, bedesonida, prednisolona, hidrocortisona, dexametasona y/o cortisona); anticonvulsivo; inmunosupresores (por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus, prednisolona, hidrocortisona, sirolimus, everolimus, azatioprina, ácido micofenólico, metotrexato, basiliximab, daclizumab, rituximab, globulina antitimocítica, globulina antilinfocítica); penicilinas (por ejemplo, penicilina y amoxicilina); cefalosporinas (por ejemplo, cefalexina); macrólidos (por ejemplo, eritromicina, claritromicina y azitromicina); fluoroquinolonas (por ejemplo, ofloxacina, levofloxacina y ofloxacina); sulfonamidas (por ejemplo, cotrimoxazol y trimetoprim); tetraciclinas (por ejemplo, tetraciclina y doxiciclina); aminoglucósidos (por ejemplo, gentamicina y tobramicina)); inhibidores de ACE (por ejemplo, perindopril y enalapril); bloqueantes del receptor de angiotensina II; betabloqueantes; bloqueantes de los canales de calcio; digoxina; antiarrítmicos; anticoagulantes; antibióticos; diuréticos (por ejemplo, espironolactona, eplerenona); terapia de omisión de exones (por ejemplo, eteplirsen, drisapersen); anticuerpos anti-miostatina (por ejemplo, PF-06252616); anticuerpos anti-factor de crecimiento del tejido conectivo (por ejemplo, FG-3019), inhibidores de PDE5 (por ejemplo, tadalafilo, sildenafilo); inhibidores de PDE9; inhibidores de NF-kB; fármacos para ultralectura más allá del codón de parada (por ejemplo, ataluren); moduladores de utrofina (por ejemplo, SMT C1100, SMT022357); agentes antifibróticos (por ejemplo, halofuginona, angiotensina [1-7]); análogos sintéticos de la coenzima Q10 (por ejemplo, idebenona); terapia con células cardiacas alogénicas (por ejemplo, CAP-1002; antagonistas del receptor de tipo Toll (por ejemplo, IMO-8400); antagonistas del receptor de mineralocorticoides; antagonistas del adrenorreceptor p; reservatol; activadores de SIRT1.
Cuando se utilizan dos o más agentes terapéuticos combinados, la dosificación de cada agente terapéutico es habitualmente idéntica a la dosificación del agente cuando se utiliza independientemente. Sin embargo, cuando un agente terapéutico interfiere con el metabolismo de otros, la dosificación de cada agente terapéutico se ajusta de manera adecuada. Como alternativa, cuando los dos o más agentes terapéuticos muestran efectos singérgicos, se puede reducir la dosis de uno o más. Cada agente terapéutico se puede administrar de manera simultánea o por separado en un intervalo de tiempo adecuado.
Se debe entender que las formas en singular tales como «un», «uno/a» y «el/la» se utilizan a lo largo de esta solicitud por conveniencia, sin embargo, excepto cuando el contexto o una afirmación explícita indica lo contrario, se pretende que las formas en singular incluyan el plural. Se debe entender que todos los intervalos numéricos incluyen todos y cada uno de los puntos numéricos dentro del intervalo numérico, y se deben interpretar como si todos y cada uno de los puntos numéricos se enumeraran individualmente. Los puntos finales de todos los intervalos referidos al mismo componente o propiedad son inclusivos y se pretende que sean combinables independientemente.
El término «aproximadamente» cuando se utiliza en relación con una indicación numérica citada se refiere a la indicación numérica citada más o menos hasta un 10% de la indicación numérica citada. Por ejemplo, la expresión «aproximadamente 50» cubre el intervalo de 45 a 55.
Tal como se utiliza en la presente, se pretende que la palabra «incluir», y sus variantes, no sea limitante, de modo que la enumeración de artículos en una lista no excluya otros artículos similares que también puedan ser útiles en los materiales, composiciones, dispositivos y métodos de esta tecnología. De manera similar, se pretende que el término «puede» y sus variantes no sean limitantes, de modo que la lectura de que una realización puede comprender ciertos elementos o características no excluye otras realizaciones de la presente tecnología que no contengan esos elementos o características. Aunque la expresión abierta «que comprende», como un sinónimo de expresiones tales como que incluye, que contiene o que tiene, se utiliza en la presente para describir y reivindicar la divulgación, la presente tecnología, o realizaciones de esta, se pueden describir de manera alternativa, utilizando expresiones más limitantes tales como «que consiste en» o «que consiste esencialmente en» los ingredientes enumerados.
A menos que se definan de otra manera, todos Ios términos técnicos y científicos de la presente tienen el mismo significado que le adjudica habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Aunque se pueden utilizar cualesquiera métodos y materiales, similares o equivalentes a los descritos en la presente, para llevar a la práctica o poner a prueba la presente divulgación, en la presente se describen los métodos y materiales preferidos.
Esta divulgación se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 - Efectos de PB1046 en la miocardiopatía y miopatía del músculo esquelético en pacientes con distrofia muscular
Se realiza un ensayo clínico en pacientes con distrofia muscular de Duchenne y distrofia muscular de Becker para estudiar la eficacia del tratamiento con PB1046 para retrasar la aparición de síntomas esqueléticos y cardiacos.
Diseño: Este es un ensayo aleatorizado (2:1), con doble enmascaramiento, controlado con placebo. Inicialmente, se evaluarán los pacientes con una edad de 18 años o más, pero el estudio se abrirá a adolescentes con una edad de 12 años o más. Con el fin de evaluar la respuesta a la dosis, se evaluarán al menos dos niveles posológicos, por ejemplo, dosis entre 0,4 mg/kg y 3,2 mg/kg, por ejemplo, 0,8 mg/kg y 1,6 mg/kg. Dependiendo de las consideraciones de seguridad, también se evaluarán dosis mayores o menores. Se tratarán al menos seis pacientes en cada nivel posológico.
Los criterios de valoración principales del estudio son la eficacia, que se mide como un cambio respecto a la situación inicial en las propiedades de la función cardiaca/regional tras 12 semanas de tratamiento. Esta función se evaluará adicionalmente a las 24 semanas. Para la evaluación se utilizarán ecocardiografía y MRI cardiaca con realce tardío con gadolinio. Se medirá el efecto del tratamiento en la deformación circunferencial ventricular izquierda. Se medirán el volumen telediastólico ventricular izquierdo (LVEDV, por sus siglas en inglés), el volumen telediastólido ventricular derecho (RVEDV), el grado de realce como una medida de la fibrosis cardiaca, acortamiento fraccional (FS, por sus siglas en inglés) y/o gasto cardiaco. Son medidas clave el tamaño, grosor, volumen, fracción de eyección del LV, y cantidad de cicatrices/inflamación del miocardio, así como también la deformación, cambio en la dimensión y volumen del LV, y cantidad de cicatrices.
Los criterios de valoración secundarios del estudio son la función respiratoria, fuerza muscular cuantitativa, evaluaciones funcionales y de la calidad.
Una vez que el estudio finalice, se ofrecerá a los pacientes continuar en la terapia sin enmascaramiento basada en las recomendaciones del Comité de Vigilancia de Datos y Seguridad.
Ejemplo 2 - Tratamiento crónico con PB1046, un agonista del receptor del péptido intestinal vasoactivo de acción prolongada y estable, mejora la función muscular cardiaca y esquelética en modelos en ratones de la distrofia muscular de Duchenne
Materiales y métodos: A ratones MDX (C57BL10/ScSnDMDmdx, deficientes en distrofina, n = 21) y DKO (con una doble inactivación génica) mdx/utrn-/- (deficientes en distrofina/utrofina, n = 13) se les administró PB1046 (1,5 mg/kg) o solución salina con NaCI al 0,9% (control) por vía subcutánea tres veces a la semana durante la duración del estudio (32 semanas para MDX y hasta 4 semanas para DKO). Se monitorizaron los cambios en la función ventricular izquierda (mediante ecocardiografía; ECHO) y electrocardiografía (ECG) durante revisiones de rutina. Las evaluaciones finales incluyeron una preparación con anestesia en un animal instrumentalizado con un catéter de presión para medir la hemodinámica ventricular izquierda/sistémica o evaluación de la fuerza del músculo esquelético en el extensor largo de los dedos (EDL, por sus siglas en inglés) (solo MDX). Las muestras tisulares se congelaron súbitamente o se fijaron en formalina para las evaluaciones histológicas (tinción con rojo sirio y recuento de macrófagos y CD).
El parámetro ecocardiográfico de la eficacia ventricular utilizado más habitualmente es el acortamiento fraccional (%FS) que se utiliza como una estimación de la contractibilidad del miocardio y es una proporción entre el diámetro del ventrículo izquierdo al final de la diástole y su diámetro al final de la sístole. Acortamiento del área fraccional (FAS, por sus siglas en inglés) y acortamiento fraccional medidos. Para calcular el FAS, se visualizaron las áreas ventriculares izquierdas en el eje corto al nivel papilar y utilizando imágenes de sección transversal, se trazaron manualmente los límites endocárdicos telediastólicos y telesistólicos. Se determinó el FAS en los animales antes y durante el ciclo del tratamiento. La velocidad de la elevación de la presión del ventrículo izquierdo (LV, por sus siglas en inglés) al comienzo de la sístole (dP/dtmáx) mide la contractibilidad global del LV. Cuanto mayor sea la fuerza contráctil ejercida, mayor será la velocidad del incremento en la presión ventricular izquierda. Esta velocidad se puede medir de manera invasiva, por ejemplo, utilizando catéteres micromanométricos de alta fidelidad dentro del LV, así como también de manera no invasiva, a partir de una onda continua de examen Doppler del chorro de regurgitación mitral. También se midió Tau, que representa la disminución exponencial de la presión ventricular durante la relajación isovolumétrica. Una Tau más prolongada indica disfunción cardiaca.
Se disecaron Ios músculos extensores largos de Ios dedos (EDL) de ambas patas de Ios ratones en Ios tendones y se colocaron en tampón de Krebs-Henselet (K-H). Los músculos se analizaron como se divulga en Heller et al. (2013) y Rodino-Klapac et al. (2007) con algunas adaptaciones. Resumiendo, se acopló un tendón al brazo de la palanca del transductor de fuerza y el otro tendón se acopló a un servomotor lineal. Una vez que se hubo estabilizado el músculo, se fijó a una longitud óptima de 1 gramo y se sometió a un calentamiento que consistió en tres contracciones de 1 Hz cada 30 segundos seguidas por tres contracciones de 150 Hz cada minuto. Después de un periodo de descanso de 3 minutos, se estimuló el EDL a 50, 100, 150 y 200 Hz, con un periodo de descanso de 1 minuto entre cada estímulo para determinar la fuerza tetánica máxima. Se midió la longitud del músculo tras la estimulación. Después de un descanso de 5 minutos, se evaluó la susceptibilidad del músculo EDL al daño inducido por la contracción. Después de una estimulación de 500 ms, se alargó el músculo en un 10% de la longitud óptima y se estimuló a 150 Hz durante 700 ms. Después de la estimulación, se devolvió el músculo a la longitud óptima. El ciclo se repitió cada minuto durante 10 ciclos en total.
Se calculó la fuerza específica dividiendo la fuerza tetánica máxima por el área transversal del músculo EDL. A efectos comparativos, todas las medidas de fuerza se expresaron por unidad de área transversal del material contráctil (CSA) (tensión o fuerza isométrica normalizada, mN/mm2). Se calculó el CSA utilizando la siguiente ecuación:
CSA = ___________________ (masa muscular en g)___________________
[(longitud óptima de la fibra en cm) X (densidad muscular en g/cm3)]
Además, se analizaron las muestras tisulares por tinción con rojo sirio para determinar el grado de depósito de colágeno como un marcador de la fibrosis.
Resultados: PB1046 crónico ralentizó el deterioro cardiaco en ratones MDX. Se conservó el acortamiento del área fraccional (un índice de la función sistólica) durante la duración del estudio (P<0,05) (Figura 1A). Las velocidades de relleno ventricular (proporción E/A, un índice de la función diastólica) tendieron a ser más rápidas a lo largo del estudio, pero no llegaron a alcanzar significación estadística (Figura 1B). También se conservó el acortamiento fraccional (FS) durante la duración del estudio (datos que no se muestran).
También se evaluaron los electrocardiogramas en estos puntos temporales. A lo largo del estudio, los ratones MDX tratados con PB1046 tendieron a tener QRS más cortos (conducción ventricular conservada) cuando se compararon con los animales tratados con placebo, pero no alcanzaron significación estadística (datos que no se muestran). Se observaron tendencias similares en los ratones DKO, donde el tratamiento amortiguó la prolongación de QRS observada en los controles (datos que no se muestran).
El análisis in vivo mostró que la velocidad máxima elevada de la elevación de la presión (dP/dtmáx, un índice de la función sistólica) fue significativamente mayor (Figura 2A-B) y la constante de relajación Tau fue más rápida con el tratamiento con PB1046 en ratones MDX (P<0,05) (Figura 2C-E).
En la evaluación de la función del músculo esquelético, el tratamiento con PB1046 protegió contra el daño inducido por la contracción en músculos EDL aislados sin cambiar la fuerza específica en ratones MDX (Figura 3A-B).
En consonancia con un aumento de la función esquelética y cardiaca, PB1046 disminuyó significativamente el grado de fibrosis (contenido de colágeno) en los músculos gemelos en los ratones MDX (sin efecto estadísticamente significativo en los músculos tibial anterior, del diafragma o cuádriceps, aunque las tendencias fueron evidentes) (Figura 4A). Además, hubo una tendencia a reducir el contenido de colágeno en el músculo cardiaco de MDX (Figura 4B). Aunque fueron pequeñas, se observaron tendencias similares en la fibrosis en los corazones de ratones DKO (datos que no se muestran).
Se observó una reducción significativa en el recuento total de macrófagos después del tratamiento con PB1046 (Figura 4C). Aunque no se observaron diferencias en otras células inmunitarias (CD3, CD4, CD8; datos que no se muestra).
Conclusión: El tratamiento crónico con un agonista del receptor de VIP novedoso, PB1046, mitigó la miopatía en DMD al ralentizar el deterioro cardiaco y protegió contra el daño inducido por la contracción en el músculo esquelético. Además de los efectos inotrópicos y lusitrópicos positivos en la función cardiaca, es probable que la disminución de la fibrosis (contenido de colágeno) contribuya a los efectos positivos de PB1046 tanto en el músculo cardiaco como esquelético.
Esta solicitud cita las siguientes publicaciones: US 2001/0034050; US 2009/0220455; US 8334257; US 2013/0310538 ; US 2013/0172274; US 2011/0236384; US 6582926; US 7429458; US 7364859; US 8178495; US 2013/0079277; US 2013/0085099; US 2013/0143802; US 2014/0024600; US 2011/0178017; US 7709227; US 2011/0123487; US 8729018; US 2014/0171370; US 2013/0150291; WO/2014/113434; US 2014/0213516; y la solicitud de EE. UU. n.a 62/082945 presentada el 21 de noviembre de 2014.
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Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 para la administración crónica para uso en un método de retraso, reducción o tratamiento de la fibrosis muscular en un paciente con miopatía muscular.
2. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la miopatía muscular es una distrofia muscular, una miopatía inflamatoria o una miocardiopatía.
3. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 2, donde la distrofia muscular se selecciona del grupo que consiste en distrofia muscular miotónica, distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de la cintura y las extremidades, distrofia muscular fascioescapulohumeral, distrofia muscular congénita, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular distal y distrofia muscular de Emery-Dreifuss.
4. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 2, donde la miopatía inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en poliomiositis, dermatomiositis y miositis por cuerpos de inclusión.
5. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, donde la composición farmacéutica se formula para la administración subcutánea, intramuscular, subcutánea o intravenosa.
6. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, donde la composición farmacéutica se administra en una dosis entre 0,1 mg/kg/día y 10 mg/kg/día.
7. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, donde la composición farmacéutica se administra a diario, de una a tres veces a la semana, semanalmente, o de una a dos veces al mes.
8. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde se retrasa, reduce o trata la fibrosis muscular en un músculo esquelético o un músculo cardiaco.
9. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 8, donde se retrasa o reduce la fibrosis muscular en un 5%, 10%, 20%, 30%, 40% o 50% en comparación con los pacientes no tratados; y opcionalmente donde se retrasa o reduce la fibrosis muscular durante 1 mes, 6 meses, 1 año o 5 años en comparación con pacientes no tratados.
10. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 8, donde se conserva la contractibilidad muscular y/o fuerza muscular en el músculo esquelético o músculo cardiaco.
11. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde se conserva la contractibilidad muscular en aproximadamente un 90%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 60% o aproximadamente un 50% en comparación con pacientes sanos.
12. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde se conserva la fuerza muscular en un 90%, 80%, 70%, 60% o 50% en comparación con pacientes sanos.
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