ES2302201T3

ES2302201T3 - Agonistas peptidicos del receptor vpac2 selectivos.

Info

Publication number: ES2302201T3
Application number: ES05749168T
Authority: ES
Inventors: Bengt Krister Lilly Forschung GmbH BOKVIST; Robert Chadwick Cummins; Wolfgang Glaesner; Jesper Lindgren Lilly Forschung GmbH GROMADA; John Philip Mayer; Lianshan Zhang; Jorge Alsina-Fernandez
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2004-05-21
Filing date: 2005-05-19
Publication date: 2008-07-01
Anticipated expiration: 2025-05-19
Also published as: EP1753780B1; ATE389670T1; DE602005005476T2; CA2567635A1; WO2005113593A1; US20080096811A1; EP1753780A1; DE602005005476D1

Abstract

Un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende una secuencia de fórmula: (Ver fórmula) Fórmula 9 (SEQ ID NO:14) en la que: Xaa1 es: His, dH, o está ausente; Xaa2 es: dA, Ser, Val, Gly, Thr, Leu, dS, Pro, o Aib; Xaa3 es: Asp o Glu; Xaa4 es: Ala, Ile, Tyr, Phe, Val, Thr, Leu, Trp, Gly, dA, Aib, o NMeA; Xaa5 es: Val, Leu, Phe, Ile, Thr, Trp, Tyr, dV, Aib, o NMeV; Xaa6 es: Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp, o Tyr; Xaa8 es: Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg, o Tyr; Xaa9 es: Asn, Gln, o Glu; Xaa10 es: Tyr, Trp, o Tyr(OMe); Xaa12 es: Arg, Lys, hR, Orn, Aib, Cit, o Ala; Xaa13 es: Leu, Phe, Glu, Ala, o Aib; Xaa14 es: Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Phe, Gln, Aib, o Cit; Xaa15 es: Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, hR, Orn, Phe, Gln, Aib, K(Ac), o Cit; Xaa16 es: Gln, Lys, Ala, hR, Orn, o Cit; Xaa17 es: Val, Ala, Leu, Ile, Met, Nle, Lys, o Aib; Xaa19 es: Ala, Gly, o Leu; Xaa20 es: Lys, Gln, hR, Arg, Ser, Orn, Ala, Aib, Trp, Thr, Leu, Ile, Phe, Tyr, Val, K(Ac), o Cit; Xaa21 es: Lys, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac), o Cit; Xaa22 es: Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, Ile, Val, Tyr(OMe), Ala, o Aib; Xaa23 es: Leu, Phe, Ile, Ala, Trp, Thr, Val, o Aib; Xaa24 es: Gln, o Asn; Xaa25 es Ser, Asp, Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Gln, Asn, Tyr, Aib, o Glu; Xaa26 es: Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Tyr, Phe o Aib; Xaa27 es: Lys, hR, Arg, Gln, Orn, o dK; Xaa28 es: Asn, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Cit, Pro, dK, o está ausente; Xaa29 es: Lys, Ser, Arg, Asn, hR, Orn, Cit, Aib o está ausente; Xaa30 es: Arg, Lys, Ile, hR, Cit, Aib, Orn, o está ausente; Xaa31 es: Tyr, His, Phe, o está ausente; y Xaa32 es: Cys, o está ausente; con la condición de que si Xaa28, Xaa29, Xaa30 o Xaa31 está ausente, el siguiente aminoácido presente cadena abajo es el siguiente aminoácido en la secuencia del agonista peptídico, y una extensión C-terminal, en la que el N-terminal de la extensión C-terminal está unido al C-terminal del péptido de fórmula 9 y en la que la extensión C-terminal comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula: (Ver fórmula) Fórmula 8 (SEQ ID NO:13) en la que: Xaa1 es: Ser, o está ausente; Xaa2 es: Arg, Ser, hR, Orn, His, o está ausente; Xaa3 es: Thr, o está ausente; Xaa4 es: Ser, o está ausente; Xaa5 es: Pro, Ser, Ala, o está ausente; Xaa6 es: Pro, Ser, Ala, Arg, o está ausente; Xaa7 es: Pro, Ser, Ala, o está ausente; Xaa8 es: Lys, K(W), Pro, o está ausente; Xaa9 es: K(E-C16), Ser, o está ausente; y Xaa10 es: Ser, o está ausente; con la condición de que al menos tres de Xaa1 a Xaa10 de la extensión C-terminal están presentes, y con la condición de que si Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8 o Xaa9 está ausente, el siguiente aminoácido presente cadena abajo es el siguiente aminoácido en la extensión C-terminal, y en el que el aminoácido C-terminal puede estar amidado.

Description

Agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos.

Esta invención se refiere al campo de la medicina. Más en concreto, esta invención se dirige a agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos.

La diabetes de tipo 2, o diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM), es la forma más habitual de diabetes, que afecta al 90% de diabéticos. Con la NIDDM, los pacientes presentan una función alterada de las células \beta que produce como resultado una producción insuficiente de insulina y/o una disminución de la sensibilidad a la insulina. Si la NIDDM no se controla, el exceso de glucosa se acumula en la sangre, dando como resultado la hiperglucemia. A medida que pasa el tiempo pueden surgir complicaciones más graves, incluyendo la disfunción renal, problemas cardiovasculares, pérdida de visión, ulceración de las extremidades inferiores, neuropatía e isquemia. Los tratamientos para la NIDDM incluyen mejorar la dieta, hacer ejercicio y controlar el peso, así como el uso de una diversidad de medicaciones orales. Los individuos con NIDDM pueden controlar inicialmente sus niveles de glucosa sanguínea tomando estas medicaciones orales. Sin embargo, estas medicaciones no frenan la pérdida progresiva de la función de las células \beta que se produce en pacientes con diabetes de tipo 2 y, por tanto, no resultan suficientes para controlar los niveles de glucosa sanguínea en las etapas posteriores de la enfermedad. Además, el tratamiento con las medicaciones disponibles en la actualidad expone a los pacientes con NIDDM a unos potenciales efectos secundarios, tales como hipoglucemia, problemas gastrointestinales, retención de fluidos, edema y/o ganancia de peso.

Los compuestos, tales como péptidos, que son selectivos para un receptor acoplado a proteína G concreto, conocido como el receptor VPAC2, se identificaron, en un primer momento, porque modificaban el péptido intestinal vasoactivo (VIP) y/o el polipéptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria (PACAP) (véase, por ejemplo, Xia et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 281:629-633 (1997); Tsutsumi et al., Diabetes, 51:1453-1460 (2002); documentos WO 01/23420; WO 2004/006839 y US 2004/0058870). Muchos de estos péptidos no son adecuados como candidatos comerciales, debido a cuestiones sobre su estabilidad asociadas con los polipéptidos en una formulación, así como a cuestiones sobre la semivida corta de estos polipéptidos.

El PACAP pertenece a la familia de péptidos del péptido intestinal vasoactivo (VIP)/glucagón/secretina y actúa a través de tres receptores acoplados a proteína G que ejercen su acción a través de las vías de transducción de señales mediadas por AMPc y otras mediadas por Ca^{2+}. Estos receptores se conocen como receptor de tipo 1 que prefiere a PACAP (PAC1) (Isobe, et al., Regul. Pept., 110:213-217 (2003); Ogi, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 196:1511-1521 (1993)) y dos receptores de tipo 2 que comparten a VIP (VPAC1 y VPAC2) (Sherwood et al., Endocr. Rev., 21:619-670 (2000); Hammar et al., Pharmacol. Rev., 50:265-270 (1998); Couvineau, et al., J. Biol. Chem., 278:24759-24766 (2003); Sreedharan, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 193:546-553 (1993); Lutz, et al., FEBS Lett., 458: 197-203 (1999); Adamou, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 209: 385-392 (1995)).

El PACAP tiene actividades comparables hacia los tres receptores, mientras que VIP activa selectivamente los dos receptores VPAC (Tsutsumi, 2002). Se ha demostrado que VIP (Eriksson et al., Peptides, 10: 481-484 (1989)) y PACAP (Filipsson et al., JCEM, 82:3093-3098 (1997)) no sólo estimulan la secreción de insulina en el ser humano cuando se administran por vía intravenosa, sino que también aumentan la secreción de glucagón y la emisión de glucosa hepática. Como consecuencia, la estimulación de PACAP o VIP no produce, en general, una mejora neta de la glucemia. La activación de múltiples receptores por PACAP o VIP tiene también amplios efectos fisiológicos sobre los sistemas nervioso, endocrino, cardiovascular, reproductor, muscular e inmunológico (Gozes et al., Curr. Med. Chem., 6:1019-1034 (1999)). Además, parece que la diarrea acuosa inducida por VIP en ratas está mediada sólo por uno de los receptores VPAC (Ito et al., Peptides, 22:1139-1151 (2001); Tsutsumi, 2002). Además los receptores VPAC1 y PAC1 se expresan sobre células \alpha y hepatocitos y, por tanto, es más probable que estén implicados en los efectos de la emisión de glucosa hepática.

El documento WO 91/06565 (Diacel Chemical Industries and Meiji Seika Kaisha Ltd.) describe tres péptidos que tienen una actividad de relajar el músculo liso o los músculos no estriados. Se describen péptidos que incluyen un derivado de helodermina que comprende una combinación de la secuencia de aminoácidos VIP con una parte de la secuencia de aminoácidos de la helodermina, así como un péptido compuesto por una combinación de una parte de la secuencia de aminoácidos de VIP con otra parte de la secuencia de aminoácidos de la helodermina.

El documento JP 6.092.991 describe una serie de derivados de VIP, algunos de los cuales comprenden aminoácidos de la secuencia de la helodermina. Se indica que estos derivados tienen una actividad relajante del músculo liso y una acción broncodilatadora debido a una acción de elevar el flujo sanguíneo vascular.

Los péptidos relacionados con VIP naturales conocidos incluyen la helodermina y la heloespectina, que se aislan a partir de las excreciones salivares del monstruo de Gila (Heloderma suspectum). La principal diferencia entre la helodermina y la heloespectina es la presencia en la helodermina de dos restos ácidos consecutivos en las posiciones 8 y 9. El diferente comportamiento de la helodermina y la helospectina en ratas y en humanos tiene un interés particular, puesto que los péptidos de lagarto son análogos de VIP de acción prolongada.

Li et al. (Biomed. Res., 14(3):61-69 (1993)) utilizaron cuatro análogos de helodermina sintéticos con porciones C-terminales sistémicamente acortadas y cuatro análogos de helodermina-VIP quiméricos para estudiar la importancia de los restos C- y N-terminales de la helodermina para descubrir un efecto de tipo VIP en la vasoactividad canina, y la unión al receptor de afinidad por helodermina y la producción de AMPc en células NM-Ok-1 de neuroblastoma humanas. Li et al. también estudiaron la liberación de insulina inducida por glucosa y descubrieron que la helodermina y la helodermina (1-27)-NH_{2} potenciaban la liberación de insulina inducida por glucosa.

Recientes estudios han demostrado que los péptidos selectivos para el receptor VPAC2 son capaces de estimular la secreción de insulina desde el páncreas sin efectos secundarios gastrointestinales (GI), y sin potenciar la liberación de glucagón y la emisión de glucosa hepática (Tsutsumi, 2002). Sin embargo, muchos de los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 descritos hasta la fecha tienen una potencia, selectividad y perfiles de estabilidad menores que los deseables, lo cual puede impedir su viabilidad química.

Por tanto, resultan necesarias nuevas terapias que solucionen los problemas asociados con las medicaciones actuales para la NIDDM. La presente invención busca proporcionar compuestos mejorados que sean selectivos para el receptor VPAC2 y que induzcan la secreción de insulina desde el páncreas sólo en presencia de altos niveles de glucosa sanguínea. Los compuestos de la presente invención son péptidos, que también se cree que aumentan la función de las células \beta. Sin embargo, estos péptidos pueden tener el efecto fisiológico de inducir la secreción de insulina sin los efectos secundarios GI o un correspondiente aumento en la emisión de glucosa hepática y también, en general, tienen mayor selectividad, potencia y/o estabilidad in vivo comparados con los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 conocidos. Los compuestos de la presente invención incluyen agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos.

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende una secuencia de fórmula:

1

en la que:

Xaa_{1} es: His, dH, o está ausente;

Xaa_{2} es: dA, Ser, Val, Gly, Thr, Leu, dS, Pro, o Aib;

Xaa_{3} es: Asp o Glu;

Xaa_{4} es: Ala, Ile, Tyr, Phe, Val, Thr, Leu, Trp, Gly, dA, Aib, o NMeA;

Xaa_{5} es: Val, Leu, Phe, Ile, Thr, Trp, Tyr, dV, Aib, o NMeV;

Xaa_{6} es: Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp, o Tyr;

Xaa_{8} es: Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg, o Tyr;

Xaa_{9} es: Asn, Gln, o Glu;

Xaa_{10} es: Tyr, Trp, o Tyr(OMe);

Xaa_{12} es: Arg, Lys, hR, Orn, Aib, Cit, o Ala;

Xaa_{13} es: Leu, Phe, Glu, Ala, o Aib;

Xaa_{14} es: Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Phe, Gln, Aib, o Cit;

Xaa_{15} es: Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, hR, Orn, Phe, Gln, Aib, K(Ac), o Cit;

Xaa_{16} es: Gln, Lys, Ala, hR, Orn, o Cit;

Xaa_{17} es: Val, Ala, Leu, Ile, Met, Nle, Lys, o Aib;

Xaa_{19} es: Ala, Gly, o Leu;

Xaa_{20} es: Lys, Gln, hR, Arg, Ser, Orn, Ala, Aib, Trp, Thr, Leu, Ile, Phe, Tyr, Val, K(Ac), o Cit;

Xaa_{21} es: Lys, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac), o Cit;

Xaa_{22} es: Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, Ile, Val, Tyr(OMe), Ala, o Aib;

Xaa_{23} es: Leu, Phe, Ile, Ala, Trp, Thr, Val, o Aib;

Xaa_{24} es: Gln, o Asn;

Xaa_{25} es Ser, Asp, Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Gln, Asn, Tyr, Aib, o Glu;

Xaa_{26} es: Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Tyr, Phe o Aib;

Xaa_{27} es: Lys, hR, Arg, Gln, Orn, o dK;

Xaa_{28} es: Asn, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Cit, Pro, dK, o está ausente;

Xaa_{29} es: Lys, Ser, Arg, Asn, hR, Orn, Cit, Aib o está ausente;

Xaa_{30} es: Arg, Lys, Ile, hR, Cit, Aib, Orn, o está ausente;

Xaa_{31} es: Tyr, His, Phe, o está ausente; y

Xaa_{32} es: Cys, o está ausente;

con la condición de que si Xaa_{28}, Xaa_{29}, Xaa_{30} o Xaa_{31} está ausente, el siguiente aminoácido presente cadena abajo es el siguiente aminoácido en la secuencia del agonista peptídico, y una extensión C-terminal, en la que el N-terminal de la extensión C-terminal está unido al C-terminal del péptido de fórmula 9 y en la que la extensión C-terminal comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula:

100

en la que:

Xaa_{1} es: Ser, o está ausente;

Xaa_{2} es: Arg, Ser, hR, Orn, His, o está ausente;

Xaa_{3} es: Thr, o está ausente;

Xaa_{4} es: Ser, o está ausente;

Xaa_{5} es: Pro, Ser, Ala, o está ausente;

Xaa_{6} es: Pro, Ser, Ala, Arg, o está ausente;

Xaa_{7} es: Pro, Ser, Ala, o está ausente;

Xaa_{8} es: Lys, K(W), Pro, o está ausente;

Xaa_{9} es: K(E-C_{16}), Ser, o está ausente; y

Xaa_{10} es: Ser, o está ausente;

con la condición de que al menos tres de Xaa_{1} a Xaa_{10} de la extensión C-terminal están presentes, y con la condición de que si Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4}, Xaa_{5}, Xaa_{6}, Xaa_{7}, Xaa_{8} o Xaa_{9} está ausente, el siguiente aminoácido presente cadena abajo es el siguiente aminoácido en la extensión C-terminal, y en el que el aminoácido C-terminal puede estar amidado.

\vskip1.000000\baselineskip

Preferiblemente, al menos cuatro de Xaa_{1} a Xaa_{10} de la extensión C-terminal están presentes. Más preferiblemente, al menos cinco, seis, siete, ocho, nueve o todos los Xaa_{1} a Xaa_{10} están presentes.

Preferiblemente, Xaa_{30} y Xaa_{31} de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) están ausentes. Como alternativa, Xaa_{29}, Xaa_{30} y Xaa_{31} de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) están todos ausentes.

\newpage

\global\parskip0.950000\baselineskip

El agonista peptídico del receptor VPAC2 comprende preferiblemente una secuencia de fórmula:

2

en la que:

Xaa_{3} es: Asp, o Glu;

Xaa_{8} es: Asp, o Glu;

Xaa_{9} es: Asn, o Gln;

Xaa_{12} es: Arg, hR, Lys, u Orn;

Xaa_{14} es: Arg, Leu, Gln, Aib, hR, Orn, Cit, Lys, o Ala;

Xaa_{15} es: Lys, Leu, Ala, Aib, u Orn;

Xaa_{16} es: Gln, Lys, o Ala;

Xaa_{17} es: Val, Ala, Leu, Ile, Lys, o Nle;

Xaa_{20} es: Lys, Aib, Val, Leu, Ala, o Gln;

Xaa_{21} es: Lys, Aib, Orn, Ala, o Gln;

Xaa_{27} es: Lys, Orn, o hR; y

Xaa_{28} es: Asn, Gln, Lys, hR, Aib, Pro, u Orn;

y una extensión C-terminal, en la que el N-terminal de la extensión C-terminal está unido al C-terminal del péptido de fórmula 10 y en la que la extensión C-terminal comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula:

3

en la que:

Xaa_{1} es: Ser, o está ausente;

Xaa_{2} es: Arg, Ser, hR, Orn, His, o está ausente;

Xaa_{3} es: Thr, o está ausente;

Xaa_{4} es: Ser, o está ausente;

Xaa_{5} es: Pro, Ser, Ala, o está ausente;

Xaa_{6} es: Pro, Ser, Ala, Arg, o está ausente;

Xaa_{7} es: Pro, Ser, Ala, o está ausente;

Xaa_{8} es: Lys, K(W), Pro, o está ausente;

Xaa_{9} es: K(E-C_{16}), Ser, o está ausente; y

Xaa_{10} es: Ser, o está ausente;

\global\parskip1.000000\baselineskip

Preferiblemente, el agonista peptídico del receptor VPAC2 de la presente invención comprende una secuencia de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que Xaa_{3} es Asp o Glu, Xaa_{8} es Asp o Glu, Xaa_{9} es Asn o Gln, Xaa_{12} es Arg, hR, Lys, u Orn, Xaa_{14} es Arg, Gln, Aib, hR, Orn, Cit, Lys, Ala, o Leu, Xaa_{15} es Lys, Leu, Aib, u Orn, Xaa_{16} es Gln o Lys, Xaa_{17} es Val, Leu, Ala, Ile, Lys o Nle, Xaa_{20} es Lys, Val, Leu, Aib, Ala, o Gln, Xaa_{21} es Lys, Aib, Orn, Ala, o Gln, Xaa_{27} es Lys, Orn, o hR, y Xaa_{28} es Asn, Gln, Lys, hR, Aib, Pro, u Orn.

Más preferiblemente, el agonista peptídico del receptor VPAC2 de la presente invención comprende una secuencia de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que Xaa_{12} es Arg, hR, u Orn, Xaa_{14} es Arg, Aib, Gln, Ala, Leu, Lys, u Orn, Xaa_{15} es Lys o Aib, Xaa_{17} es Val o Leu, Xaa_{21} es Lys, Aib, o Gln, y Xaa_{28} es Asn o Gln.

Preferiblemente, el agonista peptídico del receptor VPAC2 de la presente invención tiene la secuencia de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que Xaa_{14} o Xaa_{15} es Aib.

Preferiblemente, el agonista peptídico del receptor VPAC2 de la presente invención tiene la secuencia de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que Xaa_{20} o Xaa_{21} es Aib.

Más preferiblemente, el agonista peptídico del receptor VPAC2 de la presente invención tiene la secuencia de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que Xaa_{14} o Xaa_{15} es Aib, y Xaa_{20} o Xaa_{21} es Aib.

Preferiblemente, el agonista peptídico del receptor VPAC2 de la presente invención tiene la secuencia de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que Xaa_{28} es Gln.

Preferiblemente, el agonista peptídico del receptor VPAC2 de la presente invención tiene la secuencia de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que Xaa_{12} es hR u Orn, y Xaa_{27} es hR u Orn.

Más preferiblemente, el agonista peptídico del receptor VPAC2 comprende una secuencia de fórmula:

4

en la que:

Xaa_{9} es: Asn, o Gln;

Xaa_{14} es: Arg, o Leu;

Xaa_{15} es: Lys, Leu, o Aib;

Xaa_{16} es: Gln, Lys, o Ala;

Xaa_{17} es: Val, o Ala;

Xaa_{20} es: Lys, o Aib; y

Xaa_{28} es: Asn, o Gln;

y una extensión C-terminal, en la que el N-terminal de la extensión C-terminal está unido al C-terminal del péptido de fórmula 11 y en la que la extensión C-terminal comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula:

400

en la que:

Xaa_{1} es: Ser, o está ausente;

Xaa_{2} es: Arg, Ser, hR, Orn, His, o está ausente;

Xaa_{3} es: Thr, o está ausente;

Xaa_{4} es: Ser, o está ausente;

Xaa_{5} es: Pro, Ser, Ala, o está ausente;

Xaa_{6} es: Pro, Ser, Ala, Arg, o está ausente;

Xaa_{7} es: Pro, Ser, Ala, o está ausente;

Xaa_{8} es: Lys, K(W), Pro, o está ausente;

Xaa_{9} es: K(E-C_{16}), Ser, o está ausente; y

Xaa_{10} es: Ser, o está ausente;

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Preferiblemente, la extensión C-terminal del agonista peptídico del receptor VPAC2 comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

en la que:

Xaa_{1} es: Ser o está ausente;

Xaa_{2} es: Arg o está ausente;

Xaa_{3} es: Thr o está ausente;

Xaa_{4} es: Ser o está ausente;

Xaa_{5} es: Pro o está ausente;

Xaa_{6} es: Pro o está ausente;

Xaa_{7} es: Pro o está ausente;

Xaa_{8} es: Lys, K(W), o está ausente; y

Xaa_{9} es: K(E-C_{16}) o está ausente;

con la condición de que al menos tres de Xaa_{1} a Xaa_{9} de la extensión C-terminal están presentes, y con la condición de que si Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4}, Xaa_{5}, Xaa_{6}, Xaa_{7} o Xaa_{8} está ausente, el siguiente aminoácido presente cadena abajo es el siguiente aminoácido en la extensión C-terminal, y en el que el aminoácido C-terminal puede estar amidado.

\vskip1.000000\baselineskip

Más preferiblemente, la extensión C-terminal del agonista peptídico del receptor VPAC2 se selecciona de:

\vskip1.000000\baselineskip

6

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La secuencia del agonista peptídico del receptor VPAC2 puede comprender también un resto histidina en la región de la extensión N-terminal de la secuencia peptídica antes de Xaa_{1}.

Preferiblemente, el agonista peptídico del receptor VPAC2 de la presente invención comprende además una modificación N-terminal en el N-terminal del agonista peptídico, en la que la modificación N-terminal se selecciona de:

(a) la adición de D-histidina, isoleucina, metionina, o norleucina;

(b) la adición de un péptido que comprende la secuencia Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg, en la que Arg está unida al N-terminal del agonista peptídico;

(c) la adición de alquilo C_{1}-C_{16} opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de arilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, -NH_{2}, -OH, halógeno y -CF_{3};

(d) la adición de -C(O)R^{1}, en el que R^{1} es un alquilo C_{1}-C_{16} opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de arilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, -NH_{2}, -OH, halógeno, -SH y -CF_{3}; un arilo o aril(alquilo C_{1}-C_{4}) opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6}, -NH_{2}, -OH, halógeno y -CF_{3}; -NR^{2}R^{3}, en el que R^{2} y R^{3} son independientemente hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, arilo o aril(alquilo C_{1}-C_{4}); u -OR^{4}, en el que R^{4} es alquilo C_{1}-C_{16} opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de arilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, -NH_{2}, -OH, halógeno y -CF_{3}, arilo o aril(alquilo C_{1}-C_{4}) opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6}, -NH_{2}, -OH, halógeno y -CF_{3};

(e) la adición de -SO_{2}R^{5}, en el que R^{5} es arilo, aril(alquilo C_{1}-C_{4}) o alquilo C_{1}-C_{16};

(f) la formación de un grupo succinimida opcionalmente sustituido con alquilo C_{1}-C_{6} o -SR^{6}, en el que R^{6} es hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6}; y

(g) la adición de sulfóxido de metionina.

Preferiblemente, la modificación N-terminal es la adición de un grupo seleccionado de acetilo, propionilo, butirilo, pentanoílo, hexanoílo, metionina, sulfóxido de metionina, 3-fenilpropionilo, fenilacetilo, benzoílo, norleucina, D-histidina, isoleucina y 3-mercaptopropionilo, y más preferiblemente es la adición de acetilo, hexanoílo, propionilo, 3-fenilpropionilo y benzoílo.

Un experto en la técnica apreciará que pueden realizarse diversas combinaciones de la secuencia del agonista peptídico del receptor VPAC2, la secuencia de la extensión C-terminal y las modificaciones N-terminales descritas anteriormente, basándose en la presente descripción.

Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

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Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 más preferidos de la presente invención comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

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Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 de la presente invención para su uso como un medicamento.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 de la presente invención para su uso en el tratamiento de la diabetes no dependiente de insulina.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 de la presente invención para su uso en el tratamiento de la diabetes dependiente de insulina.

Otras realizaciones de la presente invención se describen a continuación.

Otras realizaciones alternativas de la presente invención incluyen un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende además una modificación N-terminal unida al N-terminal de la secuencia del péptido, en el que la modificación N-terminal implica la acilación, alquilación, acetilación, un grupo carbobenzoílo, un grupo succinimida, un grupo sulfonamida, un grupo carbamato o un grupo urea.

Otras realizaciones alternativas de la presente invención incluyen un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende además una modificación N-terminal unida al N-terminal de la secuencia del péptido, en el que la modificación N-terminal se selecciona del grupo que consiste en D-histidina o isoleucina.

Otras realizaciones de la presente invención incluyen también un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende además una modificación N-terminal unida al N-terminal de la secuencia del péptido, en el que la modificación N-terminal se selecciona del grupo que consiste en acetilo, propionilo, butirilo, pentanoílo, hexanoílo, Met, 3-fenilpropionilo, fenilacetilo, benzoílo, o norleucina.

Por tanto, los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 de la presente invención tienen la ventaja de que poseen mayor selectividad, potencia y/o estabilidad frente a los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 conocidos. En particular, la adición de la extensión de secuencia C-terminal aumenta sorprendentemente la selectividad del receptor VPAC2, así como aumenta la estabilidad proteolítica.

Un "agonista peptídico del receptor VPAC2 selectivo" de la presente invención es un péptido que activa selectivamente el receptor VPAC2 para inducir la secreción de insulina. Preferiblemente, la secuencia de un agonista peptídico del receptor VPAC2 selectivo de la presente invención tiene de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 aminoácidos que aparecen en la naturaleza y/o que no aparecen en la naturaleza. Más preferiblemente, la secuencia tiene de 28 a 31 aminoácidos que aparecen en la naturaleza y/o que no aparecen en la naturaleza.

Opcionalmente, el agonista peptídico del receptor VPAC2 selectivo también puede tener una modificación N-terminal. Los ejemplos incluyen la adición de uno o más aminoácidos que aparecen en la naturaleza o que no aparecen en la naturaleza, o la acilación del N-terminal.

La modificación N-terminal de los péptidos de la presente invención puede comprender la adición de uno o más aminoácidos que aparecen en la naturaleza o que no aparecen en la naturaleza a la secuencia del agonista peptídico del receptor VPAC2, preferiblemente no más de 10 aminoácidos, siendo preferido un aminoácido. Los aminoácidos que aparecen en la naturaleza que pueden añadirse al N-terminal incluyen metionina e isoleucina. Un aminoácido modificado añadido al N-terminal puede ser D-histidina. Como alternativa, pueden añadirse los siguientes aminoácidos al N-terminal: SEQ ID NO:352, Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg, en el que Arg está unida al N-terminal del agonista peptídico. Preferiblemente, cualquier aminoácidos que se añada al N-terminal se une al N-terminal a través de un enlace peptídico.

La expresión "unido a", tal como se utiliza en la presente con referencia a la expresión modificación N-terminal, incluye la adición o unión de aminoácidos o grupos químicos directamente al N-terminal del agonista del receptor VPAC2. La adición de las anteriores modificaciones N-terminales normalmente se logra bajo condiciones de acoplamiento normales para la formación de enlaces peptídicos.

Los N-terminales del agonista peptídico también pueden modificarse mediante la adición de un grupo alquilo (R), preferiblemente un grupo alquilo C_{1}-C_{16}, para formar (R)NH-.

Como alternativa, el N-terminal del agonista peptídico puede modificarse mediante la adición de un grupo de fórmula -C(O)R^{1}, para formar una amida de fórmula R^{1}C(OH)NH-. La adición de un grupo de fórmula -C(O)R^{1} puede lograrse mediante una reacción con un ácido orgánico de fórmula R^{1}COOH. La modificación del N-terminal de una secuencia de aminoácidos utilizando la acilación se demuestra en la técnica (por ejemplo, Gozes et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 273:161-167 (1995)). La adición de un grupo de fórmula -C(O)R^{1} puede dar como resultado la formación de un grupo urea (véanse los documentos WO 01/23240, WO 2004/006839) o un grupo carbamato en el N-terminal.

El N-terminal del agonista peptídico puede modificarse mediante la adición de un grupo de fórmula -SO_{2}R^{5}, para formar un grupo sulfonamida en el N-terminal.

El N-terminal del agonista peptídico también puede modificarse haciéndolo reaccionar con anhídrido succínico para formar un grupo succinimida en el N-terminal. El grupo succinimida incorpora el nitrógeno en el N-terminal del péptido.

El N-terminal puede modificarse de forma alternativa mediante la adición de sulfóxido de metionina.

Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención también tienen una extensión C-terminal.

La extensión C-terminal de la presente invención comprende una secuencia que tiene de uno a diez aminoácidos que aparecen en la naturaleza o que no aparecen en la naturaleza unidos al C-terminal de la secuencia del agonista peptídico en el N-terminal de la extensión C-terminal a través de un enlace peptídico.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "unido a" con referencia a la expresión extensión C-terminal, incluye la adición o unión de aminoácidos o grupos químicos directamente al C-terminal del péptido de fórmula 9 (SEQ ID NO:14), fórmula 10 (SEQ ID NO:15) o fórmula 11 (SEQ ID NO:16).

La mayoría de las secuencias de la presente invención, incluyendo las modificaciones N-terminales y las extensiones C-terminales, contienen los códigos de una sola letra convencionales para los veinte aminoácidos que aparecen en la naturaleza. Los otros códigos usados se definen como sigue:

Ac = acetilo

C3 = propionilo

C6 = hexanoílo

"d" seguida del código de aminoácidos de una sola letra, por ejemplo, dA = isoforma D (no aparece en la naturaleza) del respectivo aminoácido, D-alanina, dS = D-serina, dK = D-lisina

hR = homoarginina

_ = posición no ocupada

Aib = ácido aminoisobutírico

CH2 = etileno

Met(O) = sulfóxido de metionina

OMe = metoxi

Nle = norleucina

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NMe = metilo unido al grupo alfa-amino de un aminoácido, por ejemplo, NMeA = N-metilalanina, NMeV = N-metilvalina

Orn = ornitina

Cit = citrulina

K(Ac) = \varepsilon-acetil-lisina

M = metionina

I = isoleucina

K(E-C_{16}) = (\varepsilon-(\gamma-L-glutamil(N-\alpha-palmitoil))lisina

K(W) = \varepsilon-(L-triptofil)lisina

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El término "VPAC2" se utiliza para referirse al receptor particular y en conjunción con el receptor particular (véase Lutz, 1999; Adamou, 1995) que activan los agonistas de la presente invención. Este término también se emplea para referirse a los agonistas y en conjunción con los agonistas de la presente invención.

El VIP se produce en la naturaleza como una secuencia sencilla que tiene 28 aminoácidos. Sin embargo, PACAP existe como un péptido de 38 aminoácidos (PACAP-38) o como un péptido de 27 aminoácidos (PACAP-27) con un carboxilo amidado (Miyata et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 170:643-648 (1990)). Las secuencias para VIP, PACAP-27 y PACAP-38 son las siguientes:

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La expresión "aminoácido que aparece en la naturaleza", tal como se utiliza en la presente, significa los veinte aminoácidos codificados por el código genético humano (es decir, los veinte aminoácidos convencionales). Estos veinte aminoácidos son: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.

Los ejemplos de "aminoácidos que no aparecen en la naturaleza" incluyen aminoácidos sintéticos y los modificados por el cuerpo. Éstos incluyen D-aminoácidos, aminoácidos de tipo arginina (por ejemplo, homoarginina) y otros aminoácidos que tienen un metileno más en la cadena lateral ("homo" aminoácidos), y aminoácidos modificados (por ejemplo, norleucina, isopropil-lisina (en la que la cadena lateral de amina de la lisina está modificada con un grupo isopropilo). También se incluyen aminoácidos como la ornitina y el ácido aminobutírico. Sin embargo, preferiblemente los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención comprenden, con más frecuencia, aminoácidos que aparecen en la naturaleza, excepto que se indique lo contrario en la presente.

"Selectivo", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un agonista peptídico del receptor VPAC2 con mayor selectividad por el receptor VPAC2, comparado con otros receptores conocidos. El grado de selectividad se determina mediante la proporción entre la afinidad de unión al receptor VPAC2 y la afinidad de unión al receptor VPAC1, y entre la afinidad de unión al receptor VPAC2 y la afinidad de unión al receptor PAC1. Preferiblemente, los agonistas de la presente invención tienen una proporción de selectividad en la que la afinidad por el receptor VPAC2 en al menos 50 veces mayor que por los receptores VPAC1 y/o PAC1. Más preferiblemente, esta afinidad es al menos 100 veces mayor por VPAC2 que por VPAC1 y/o PAC1. Aún más preferiblemente, la afinidad es al menos 200 veces mayor por VPAC2 que por VPAC1 y/o PAC1. Todavía más preferiblemente, la afinidad es al menos 500 veces mayor por VPAC2 que por VPAC1 y/o PAC1. Aún todavía más preferiblemente, la afinidad es al menos 1000 veces mayor por VPAC2 que por VPAC1 y/o PAC1. La afinidad de unión se determina como se describe a continuación en el ejemplo 4.

El "porcentaje (%) de coincidencia de secuencia", tal como se utiliza en la presente, se emplea para indicar secuencias que cuando están alineadas tienen aminoácidos similares (idénticos o sustituidos de forma conservativa) en las mismas posiciones o regiones, en las que los aminoácidos idénticos o sustituidos de forma conservativa no alteran la actividad o función de la proteína, comparada con la proteína de partida. Por ejemplo, dos secuencias de aminoácidos con una coincidencia de al menos 85% entre sí tienen al menos 85% restos similares (idénticos o sustituidos de forma conservativa) en la misma posición cuando se alinean de forma óptima y dejando hasta 3 huecos, con la condición de que, con respecto a los huecos, un total de no más de 15 restos aminoácidos se ven afectados. El porcentaje de coincidencia de secuencia puede calcularse determinando el número de restos que se diferencian entre un péptido incluido en la presente invención y un péptido de referencia, tal como VIP, tomando este número y dividiéndolo entre el número de aminoácidos en el péptido de referencia (por ejemplo, 28 aminoácidos para VIP), multiplicando el resultado por 100, y restando este número resultante de 100. Por ejemplo, una secuencia que tenga 28 aminoácidos con cuatro aminoácidos que son diferentes de VIP tendría un porcentaje (%) de coincidencia de secuencia de 86% (por ejemplo, 100 - ((4/28) x 100)). Para una secuencia que sea más larga que 28 aminoácidos, el número de restos que se diferencia de la secuencia de VIP incluirá los demás aminoácidos además de los 28 para el cálculo anteriormente mencionado. Por ejemplo, una secuencia que tenga 31 aminoácidos con cuatro aminoácidos diferentes de los 28 aminoácidos en la secuencia VIP y con tres aminoácidos más en el carboxi-terminal que no están presentes en la secuencia VIP, tendría un total de siete aminoácidos diferentes de VIP. Por tanto, esta secuencia tendría un porcentaje (%) de coincidencia de secuencia de 75% (por ejemplo, 100 - ((7/28) x 100)). El grado de coincidencia de secuencia puede determinarse utilizando procedimientos muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., "Rapid Similarity Searches of Nucleic Acid and Protein Data Banks", Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 80, 726-730 (1983); y Myers E. y Miller W., "Optimal Alignments in Linear Space", Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)). Un programa que puede emplearse para determinar el grado de similitud es el procedimiento de un pareja MegAlign Lipman-Pearson (utilizando parámetros por defecto), que puede obtenerse en DNAstar Inc, 1128, Selfpark Street, Madison, Wisconsin, 53715, EEUU, como parte del sistema Lasergene. Otro programa que puede emplearse es Clustal W. Es un paquete de alineamiento de múltiples secuencias de Thompson et al. (Nucleic Acids Research, 1994, Vol. 22, nº 22, 4673-4680) para secuencias de ADN o proteínas. Esta herramienta es útil para realizar comparaciones entre secuencias relacionadas entre especies y visualizar la conservación de la secuencia. El Clustal W es un programa de alineamiento de múltiples secuencias de objetivos generales para ADN o proteínas. Produce alineamientes de múltiples secuencias con sentido biológico de secuencias divergentes. Calcula el mejor apareamiento para las secuencias seleccionadas, y las alinea para que puedan observarse las coincidencias, similitudes y diferencias. Pueden observarse las relaciones evolutivas mediante cladogramas o filogramas.

La secuencia de los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención es selectiva para el receptor VPAC2 y preferiblemente tiene una coincidencia de secuencia en el intervalo del 60% al 70%, del 60% al 65%, del 65% al 70%, del 70% al 80%, del 70% al 75%, del 75% al 80%, del 80% al 90%, del 80% al 85%, del 85% al 90%, del 90% al 97%, del 90% al 95%, o del 95% al 97% con VIP (SEQ ID NO:1). Más preferiblemente, la secuencia tiene una coincidencia de secuencia con VIP de aproximadamente 61%, 64%, 68%, 71%, 75%, 79%, 82%, 86%, 89%, 93%, o 96%.

La expresión "alquilo C_{1}-C_{16}", tal como se utiliza en la presente, significa un radical hidrocarbonado de cadena lineal, ramificada o cíclica monovalente saturado que tiene de 1 a 16 átomos de carbono. Por tanto, la expresión "alquilo C_{1}-C_{16}" incluye, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-heptilo, n-octilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. El grupo alquilo C_{1}-C_{16} puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes.

La expresión "alquilo C_{1}-C_{6}", tal como se utiliza en la presente, significa un radical hidrocarbonado de cadena lineal, ramificada o cíclica monovalente saturado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Por tanto, la expresión "alquilo C_{1}-C_{6}" incluye, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. El grupo alquilo C_{1}-C_{6} puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes.

La expresión "alquenilo C_{2}-C_{6}", tal como se utiliza en la presente, significa un radical hidrocarbonado de cadena lineal, ramificada o cíclica monovalente que tiene al menos un doble enlace y que tiene de 2 a 6 átomos de carbono. Por tanto, la expresión "alquenilo C_{2}-C_{6}" incluye vinilo, prop-2-enilo, but-3-enilo, pent-4-enilo e isopropenilo. El grupo alquenilo C_{2}-C_{6} puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes.

La expresión "alquinilo C_{2}-C_{6}", tal como se utiliza en la presente, significa un radical hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada monovalente que tiene al menos un triple enlace y que tiene de 2 a 6 átomos de carbono. Por tanto, la expresión "alquinilo C_{2}-C_{6}" incluye prop-2-inilo, but-3-inilo y pent-4-inilo. El grupo alquinilo C_{2}-C_{6} puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes.

El término "halo" o "halógeno" significa flúor, cloro, bromo o yodo.

El término "arilo", cuando se utiliza por sí solo o como parte de un grupo, es un grupo aromático o heteroaromático de 5 a 10 miembros que incluye un grupo fenilo, un grupo heteroaromático monocíclico de 5 ó 6 miembros, pudiendo estar cada uno de los miembros opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 ó 5 sustituyentes (dependiendo del número de posiciones de sustitución posibles), un grupo naftilo o un grupo heteroaromático bicíclico de 8, 9 ó 10 miembros, pudiendo estar cada uno de los miembros opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 sustituyentes (dependiendo del número de posiciones de sustitución posibles). Dentro de esta definición de arilo, las sustituciones adecuadas incluyen alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, amino, hidroxi, halógeno, -SH y CF_{3}.

La expresión "aril(alquilo C_{1}-C_{4})", tal como se utiliza en la presente, significa un grupo alquilo C_{1}-C_{4} sustituido con un arilo. Por tanto, el término "aril(alquilo C_{1}-C_{4})" incluye bencilo, 1-feniletilo (\alpha-metilbencilo), 2-feniletilo, 1-naftalenmetilo o 2-naftalenmetilo.

El término "naftilo" incluye 1-naftilo y 2-nafitlo. Se prefiere el 1-naftilo.

El término "bencilo", tal como se utiliza en la presente, significa un radical fenilo no sustituido monovalente unido al punto de sustitución a través de un grupo -CH_{2}-.

La expresión "grupo heteroaromático monocíclico de 5 ó 6 miembros", tal como se utiliza en la presente, significa un grupo aromático monocíclico con un total de 5 ó 6 átomos en el anillo, en el que de 1 a 4 de estos átomos se seleccionan cada uno independientemente de N, O y S. Los grupos preferidos tienen 1 ó 2 átomos en el anillo que se seleccionan cada uno independientemente de N, O y S. Los ejemplos de grupos heteroaromáticos monocíclicos de 5 miembros incluyen pirrolilo (también denominado azolilo), furanilo, tienilo, pirazolilo (también denominado 1H-pirazolilo y 1,2-diazolilo), imidazolilo, oxazolilo (también denominado 1,3-oxazolilo), isoxazolilo (también denominado 1,2-oxazolilo), tiazolilo (también denominado 1,3-tiazolilo), isotiazolilo (también denominado 1,2-tiazolilo), triazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, tetrazolilo, oxatriazolilo y tiatriazolilo. Los ejemplos de grupos heteroaromáticos monocíclicos de 6 miembros incluyen piridinilo, pirimidilo, pirazinilo, piridazinilo y triazinilo.

La expresión "grupo heteroaromático bicíclico de 8, 9 ó 10 miembros", tal como se utiliza en la presente, significa un grupo aromático bicíclico condensado con un total de 8, 9 ó 10 átomos en el sistema de anillos, en el que de 1 a 4 de estos átomos se seleccionan cada uno independientemente de N, O y S. Los grupos preferidos tienen de 1 a 3 átomos en el sistema de anillos que se seleccionan cada uno independientemente de N, O y S. Los grupos heteroaromáticos bicíclicos de 8 miembros adecuados incluyen imidazo[2,1-b][1,3]tiazolilo, tieno[3,2-b]tienilo, tieno[2,3-d][1,3]tiazolilo y tieno[2,3-d]imidazolilo. Los grupos heteroaromáticos bicíclicos de 9 miembros adecuados incluyen indolilo, isoindolilo, benzofuranilo (también denominado benzo[b]furanilo), isobenzofuranilo (también denominado benzo[c]furanilo), benzotienilo (también denominado benzo[b]tienilo), isobenzotienilo (también denominado benzo[c]tienilo), indazolilo, benzimidazolilo, 1,3-benzoxazolilo, 1,2-benzisoxazolilo, 2,1-benzisoxazolilo, 1,3-benzotiazolilo, 1,2-benzoisotiazolilo, 2,1-benzoisotiazolilo, benzotriazolilo, 1,2,3-benzoxadiazolilo, 2,1,3-benzoxadiazolilo, 1,2,3-benzotiadiazolilo, 2,1,3-benzotiadiazolilo, tienopiridinilo, purinilo e imidazo[1,2-a]piridina. Los grupos heteroaromáticos bicíclicos de 10 miembros adecuados incluyen quinolinilo, isoquinolinilo, cinolinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, 1,5-naftiridilo, 1,6-naftiridilo, 1,7-naphtiridilo y 1,8-naftiridilo.

La expresión "alcoxi C_{1}-C_{6}", tal como se utiliza en la presente significa un radical hidrocarbonado de cadena lineal o de cadena ramificada saturado no sustituido monovalente que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, unido al punto de sustitución a través de radical O divalente. Por tanto, la expresión "alcoxi C_{1}-C_{6}" incluye, por ejemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, isobutoxi, sec-butoxi y terc-butoxi. El alcoxi C_{1}-C_{6} puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes.

La expresión "modificación N-terminal", tal como se utiliza en la presente, incluye la adición o unión de aminoácidos o grupos químicos directamente al N-terminal de un péptido y la formación de grupos químicos, que incorporan el nitrógeno en el N-terminal de un péptido.

En una realización preferida, el agonista peptídico del receptor VPAC2 comprende una secuencia de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que hay al menos una sustitución de aminoácido seleccionada de:

Xaa_{3} es: Glu;

Xaa_{8} es: Glu;

Xaa_{9} es: Gln;

Xaa_{12} es: hR, Orn, o Lys;

Xaa_{14} es: Aib, Gln, Ala, Leu, Lys, Orn, Cit, o hR;

Xaa_{15} es: Aib, Leu, u Orn;

Xaa_{16} es: Lys;

Xaa_{17} es: Leu, Ala, Ile, Lys, o Nle;

Xaa_{20} es: Aib, Gln, Leu, Ala, o Val;

Xaa_{21} es: Aib, Orn, Ala, o Gln;

Xaa_{27} es: Orn o hR; y

Xaa_{28} es: Gln, Lys, hR, Aib, Pro, u Orn;

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y una extensión C-terminal, en la que el N-terminal de la extensión C-terminal está unido al C-terminal del péptido de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), y en la que la extensión C-terminal comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 8 (SEQ ID NO:13).

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Se prefiere más que el agonista peptídico del receptor VPAC2 comprenda al menos dos de las anteriores sustituciones de aminoácidos.

Según otra realización de la presente invención, el agonista peptídico del receptor VPAC2 comprende una secuencia de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15) en la que Xaa_{14} es Leu, Xaa_{15} es Ala, Xaa_{16} es Lys, Xaa_{17} es Leu y Xaa_{20} es Gln.

Según una realización preferida de la presente invención, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la Xaa_{3} es Asp o Glu, Xaa_{8} es Asp o Glu, Xaa_{9} es Asn o Gln, Xaa_{12} es Arg, hR, Lys, u Orn, Xaa_{14} es Arg, Gln, Aib, hR, Orn Cit, Lys, Ala, o Leu, Xaa_{15} es Lys, Leu, Aib, u Orn, Xaa_{16} es Gln, o Lys, Xaa_{17} es Val, Leu, Ala, Ile, Lys, o Nle, Xaa_{20} es Lys, Val, Leu, Aib, Ala, o Gln, Xaa_{21} es Lys, Aib, Orn, Ala, o Gln, Xaa_{27} es Lys, Orn, o hR, y Xaa_{28} es Asn, Gln, Lys, hR, Aib, Pro, u Orn, y una extensión C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 8 (SEQ ID NO:13), más preferiblemente la extensión C-terminal comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 12 (SEQ ID NO:17).

Según otra realización preferida de la presente invención, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 11 (SEQ ID NO:16) y una extensión C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 12 (SEQ ID NO:17).

Según otra realización preferida de la presente invención, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15) en la que Xaa_{9} es Gln, Xaa_{14} es Leu, Xaa_{15} es Leu o Aib, Xaa_{16} es Lys o Ala, Xaa_{17} es Ala, Xaa_{20} es Aib, y Xaa_{28} es Gln, y una extensión C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 12 (SEQ ID NO:17).

Se prefiere más que la extensión C-terminal se seleccione de SRTSPPP (SEQ ID NO:9) o SRTSPPP-NH_{2} (SEQ ID NO:10).

Según otra realización preferida de la presente invención, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 9 (SEQ ID NO:14), en la que Xaa_{30} y Xaa_{31} están ausentes, y una extensión C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 12 (SEQ ID NO:17).

Como alternativa, en otra realización preferida de la presente invención, el agonista peptídico del receptor VPAC2 comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 9 (SEQ ID NO:14), en la que Xaa_{29}, Xaa_{30} y Xaa_{31} están ausentes, y una extensión C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 12 (SEQ ID NO:17).

Según otra realización preferida de la presente invención, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15) y una extensión C-terminal en la que el N-terminal de la extensión C-terminal está unido al C-terminal del péptido de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que Xaa_{14} o Xaa_{15} es Aib, y Xaa_{20} o Xaa_{21} es Aib, y en la que la extensión C-terminal comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 12 (SEQ ID NO:17).

Según otra realización preferida de la presente invención, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15) y una extensión C-terminal en la que el N-terminal de la extensión C-terminal está unido al C-terminal del péptido de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que Xaa_{28} es Gln, y en la que la extensión C-terminal comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 12 (SEQ ID NO:17).

Según otra realización preferida de la presente invención, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15) y una extensión C-terminal en la que el N-terminal de la extensión C-terminal está unido al C-terminal del péptido de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que Xaa_{12} es hR u Orn, y Xaa_{17} es hR u Orn, y en la que la extensión C-terminal comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 12 (SEQ ID NO:17).

En las anteriores realizaciones preferidas de la presente invención, se prefiere especialmente que el agonista peptídico del receptor VPAC2 comprenda además una modificación N-terminal, en la que la modificación N-terminal es la adición de un grupo selecconado de acetilo, propionilo, butirilo, pentanoílo, hexanoílo, metionina, sulfóxido de metionina, 3-fenilpropionilo, fenilacetilo, benzoílo, norleucina, D-histidina, isoleucina y 3-mercaptopropionilo, y más preferiblemente es la adición de acetilo o hexanoílo.

\newpage

En una realización preferida, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que Xaa_{14} o Xaa_{15} es Aib, y Xaa_{20} o Xaa_{21} es Aib, y una extensión C-terminal seleccionada de SRTSPPP (SEQ ID NO:9) y SRTSPPP-NH_{2} (SEQ ID NO:10), y en el que el agonista peptídico del receptor VPAC2 comprende además una modificación N-terminal, siendo dicha modificación la adición de hexanoílo o acetilo.

En otra realización preferida, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que Xaa_{14} o Xaa_{15} es Aib, y Xaa_{20} o Xaa_{21} es Aib, y Xaa_{28} es Gln, y una extensión C-terminal seleccionada de SRTSPPP (SEQ ID NO:9) y SRTSPPP-NH_{2} (SEQ ID NO:10), y en el que el agonista peptídico del receptor VPAC2 comprende además una modificación N-terminal, siendo dicha modificación la adición de hexanoílo o acetilo.

En otra realización preferida, se proporciona un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula 9 (SEQ ID NO:14) o fórmula 10 (SEQ ID NO:15), en la que Xaa_{14} o Xaa_{15} es Aib, y Xaa_{20} o Xaa_{21} es Aib, Xaa_{12} es hR u Orn, y Xaa_{27} es hR u Orn, y una extensión C-terminal seleccionada de SRTSPPP (SEQ ID NO:9) y SRTSPPP-NH_{2} (SEQ ID NO:10), y en el que el agonista peptídico del receptor VPAC2 comprende además una modificación N-terminal, siendo dicha modificación la adición de hexanoílo o acetilo.

Preferiblemente, los agonistas de la presente invención tienen una proporción de selectividad, en la que la afinidad por el receptor VPAC2 es al menos 50 veces mayor que por los receptores VPAC1 y/o PAC1. Más preferiblemente, esta afinidad es al menos 100 mayor por VPAC2 que por VPAC1 y/o PAC1. Aún más preferiblemente, la afinidad es al menos 200 veces mayor por VPAC2 que por VPAC1 y/o PAC1. Todavía más preferiblemente, la afinidad es al menos 500 veces mayor por VPAC2 que por VPAC1 y/o PAC1. Aún todavía más preferiblemente, la afinidad es al menos 1000 veces mayor por VPAC2 que por VPAC1 y/o PAC1. Preferiblemente, estos agonistas tienen una coincidencia de secuencia en el intervalo del 60% al 70%, del 60% al 65%, del 65% al 70%, del 70% al 80%, del 70% al 75%, del 75% al 80%, del 80% al 90%, del 80% al 85%, del 85% al 90%, del 90% al 97%, del 90% al 95%, o del 95% al 97% con VIP (SEQ ID NO: 1). Más preferiblemente, la secuencia tiene una coincidencia de secuencia con VIP de aproximadamente 61%, 64%, 68%, 71%, 75%, 79%, 82%, 86%, 89%, 93%, o 96%.

Las extensiones C-terminales preferidas de los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 de la presente invención incluyen las siguientes secuencias y sus variantes:

10

Preferiblemente, la extensión C-terminal se diferencia de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10 en no más de seis aminoácidos, más preferiblemente en no más de cinco aminoácidos, aún más preferiblemente en no más de cuatro aminoácidos, todavía más preferiblemente en no más de tres, aún todavía más preferiblemente en no más de dos aminoácidos, y lo más preferible en no más de un aminoácido.

Estas secuencias contienen los códigos de una sola letra convencionales para los veinte aminoácidos que aparecen en la naturaleza. La SEQ ID NO:10 contiene una secuencia que está amidada en el C-terminal de la secuencia.

La "actividad insulinotrópica" se refiere a la capacidad para estimular la secreción de insulina en respuesta a unos elevados niveles de glucosa, provocando, con ello, la captación de la glucosa por las células y disminuyendo los niveles plasmáticos de glucosa. La actividad insulinotrópica puede evaluarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo el empleo de experimentos que miden la actividad de unión al receptor VPAC2 o la activación del receptor (por ejemplo, la secreción de insulina por islotes o líneas celulares de insulinoma, el ensayo de la tolerancia a la glucosa intravenosa (IVGTT), el ensayo de la tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT), y el ensayo de la tolerancia a la glucosa oral (OCT)). La actividad insulinotrópica se mide de forma rutinaria en seres humanos midiendo los niveles de insulina o los niveles de péptido C. Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención pueden tener actividad insulinotrópica.

La "potencia in vitro", tal como se utiliza en la presente, es la medida de la capacidad de un péptido para activar el receptor VPAC2 en un ensayo basado en células. La potencia in vitro se expresa como la "CE_{50}", que la concentración eficaz de compuesto que produce 50% de incremento máximo en la actividad en un experimento de dosis única-respuesta. Para los fines de la presente invención, la potencia in vitro se determina utilizando dos ensayos diferentes: DiscoveRx y Alpha Screen. Véase el ejemplo 3 para más detalles acerca de estos ensayos. Aunque estos ensayos se realizan de diferente forma, los resultados demuestran una correlación general entre los dos ensayos.

La presente invención incluye el descubrimiento de que la modificación N-terminal de un agonista peptídico del receptor VPAC2 selectivo puede aumentar la potencia y/o proporcionar estabilidad frente a la ruptura por DPP-IV.

La presente invención incluye el descubrimiento de que la adición de aminoácidos específicos al C-terminal de una secuencia peptídica de un agonista peptídico del receptor VPAC2 proporciona características que pueden proteger al péptido, así como pueden potenciar la actividad, selectividad y/o potencia. Por ejemplo, estas extensiones C-terminales pueden estabilizar la estructura helicoidal del péptido y los sitios dentro del péptido propensos a la ruptura enzimática que están cerca del C-terminal. Además, muchos de los péptidos con extensión C-terminal descritos en la presente pueden ser más selectivos para el receptor VPAC2 y pueden ser más potentes que VIP, PACAP, y otros agonistas peptídicos del receptor VAPC2 conocidos.

El VIP y algunos agonistas peptídicos del receptor VAPC2 conocidos son susceptibles a la ruptura por diversas enzimas y, por tanto, tienen una semivida in vivo corta. Se analizan cuatro regiones, identificadas a continuación, que se corresponden con las mismas posiciones en VIP (SEQ ID NO:1), con relación a la posición de los aminoácidos en VIP, y son aplicables a las secuencias indicadas en la presente. La región 1 contiene un sitio de ruptura en la posición de aminoácido 2 de las fórmulas 9, 10 y 11 para la enzima dipeptidil-peptidasa IV (DPP-IV). La ruptura del péptido se produce entre la posición 2 (serina) y la posición 3 (ácido aspártico). Los compuestos de la presente invención son estables frente a la ruptura por DPP-IV debido a diversas sustituciones en la posición 2 de fórmula 9 y/o la adición de una modificación N-terminal, como se analizó anteriormente. Los ejemplos de aminoácidos en la posición 2 que pueden mejorar la estabilidad frente a la inactivación por DPP-IV incluyen preferiblemente valina, D-alanina o D-serina. Más preferiblemente, la posición 2 es valina o D-alanina. Los ejemplos de modificaciones N-terminales que pueden mejorar la estabilidad frente a la inactivación por DPP-IV incluyen la adición de acetilo, propionilo, butirilo, pentanoílo, hexanoílo, metionina, sulfóxido de metionina, 3-fenilpropionilo, fenilacetilo, benzoílo, norleucina, D-histidina, isoleucina y 3-mercaptopropionilo. Preferiblemente, la modificación N-terminal es la adición de acetilo o hexanoílo. Para estos ejemplos y los ejemplos preferidos de modificaciones N-terminales, los aminoácidos preferidos en la posición 2 incluyen serina, además de valina, D-alanina o D-serina, prefiriéndose aún más que la posición 2 esté sustituida por valina o D-alanina. El ejemplo 8 ilustra la estabilidad de diversos agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos frente a la inactivación por DPP-IV incluidos en la presente invención.

Las regiones 2 y 3, que incluyen aminoácidos básicos en las posiciones 14 y 15 y las posiciones 20 y 21, respectivamente, en VIP de tipo salvaje, al igual que muchos agonistas del receptor VPAC2 conocidos en la técnica, también son susceptibles a la ruptura enzimática. Los agonistas del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención tienen, en general, una mayor estabilidad proteolítica in vivo debido a sustituciones en estas dos regiones. Estas sustituciones pueden hacer que el péptido sea resistente a la ruptura por enzimas de tipo tripsina, incluyendo la tripsina. Los ejemplos de aminoácidos en la posición 14 que confieren alguna resistencia a la ruptura por enzimas de tipo tripsina por sí sólos, o en combinación con los aminoácidos especificados para la posición 15 a continuación, incluyen glutamina, ácido aminoisobutírico, homoarginina, ornitina, citrulina, lisina, alanina y leucina. Además, la posición 14 puede ser arginina cuando la posición 15 es un aminoácido distinto de la lisina. Además, la posición 14 puede ser arginina cuando la posición 15 es lisina, pero esta combinación específica no soluciona la ruptura enzimática. Los ejemplos de aminoácidos en la posición 15 que confieren alguna resistencia a la ruptura por enzimas de tipo tripsina por sí sólos, o en combinación con los aminoácidos especificados anteriormente para la posición 14, incluyen ácido aminoisobutírico y ornitina. Además, la posición 15 puede ser lisina cuando la posición 14 es un aminoácido distinto de la arginina. Además, la posición 15 puede ser lisina cuando la posición 14 es arginina, pero esta combinación específica no soluciona la ruptura enzimática. Los ejemplos de aminoácidos en la posición 20 que confieren alguna resistencia a la ruptura por enzimas de tipo tripsina por sí sólos, o en combinación con los aminoácidos especificados para la posición 21, incluyen valina, leucina, ácido aminoisobutírico, alanina y glutamina. Además, la posición 20 puede ser lisina cuando la posición 21 es un aminoácido distinto de la lisina. Además, la posición 20 puede ser lisina cuando la posición 21 es lisina, pero esta combinación específica no soluciona la ruptura enzimática. Los ejemplos de aminoácidos en la posición 21 que confieren alguna resistencia a la ruptura por enzimas de tipo tripsina por sí sólos, o en combinación con los aminoácidos especificados para la posición 20, incluyen ácido aminoisobutírico, ornitina, alanina o glutamina. Además, la posición 21 puede ser lisina cuando la posición 20 es un aminoácido distinto de la lisina. Además, la posición 21 puede ser lisina cuando la posición 20 es lisina, pero esta combinación específica no soluciona la ruptura enzimática. La mayor estabilidad de un número representativo de agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos con resistencia a la ruptura por peptidasas e incluidos en la presente invención se demuestra en el ejemplo 6.

La región 4 incluye los aminoácidos en las posiciones 25 y 26 de fórmulas 9, 10 y 11. La región 4 es otra área que es susceptible a la ruptura enzimática. Este sitio de ruptura puede eliminarse total o parcialmente mediante la sustitución del aminoácido en la posición 25 y/o el aminoácido en la posición 26. Los ejemplos de aminoácidos en las posición 25 que confieren al menos alguna resistencia a la ruptura enzimática incluyen fenilalanina, isoleucina, leucina, treonina, valina, triptófano, glutamina, asparagina, tirosina o ácido aminoisobutírico. Además, la posición 25 puede ser serina cuando la posición 26 es un aminoácido distinto de la isoleucina. Además, la posición 25 puede ser serina cuando la posición 26 es isoleucina, pero esta combinación específica no soluciona la ruptura enzimática. Los ejemplos de aminoácidos en la posición 26 que confieren al menos alguna resistencia a la ruptura enzimática por sí sólos, o en combinación con los aminoácidos especificados anteriormente para la posición 25, incluyen leucina, treonina, valina, triptófano, tirosina, fenilalanina o ácido isobutírico. Además, la posición 26 puede ser isoleucina cuando la posición 25 es un aminoácido distinto de la serina. Además, la posición 26 puede ser isoleucina cuando la posición 25 es serina, pero esta combinación específica no soluciona la ruptura enzimática.

Además de los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos con resistencia a la ruptura por diversas peptidasas, los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención también pueden incluir péptidos con mayor selectividad por el receptor VPAC2, mayor potencia y/o mayor estabilidad comparados con algunos péptidos conocidos en la técnica. Los ejemplos de posiciones de aminoácidos que pueden afectar a estas propiedades incluyen las posiciones 3, 8, 12, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 27, 28 y 29 de las fórmulas 9 y 11. Por ejemplo, el aminoácido en la posición 3 es preferiblemente ácido aspártico o ácido glutámico; el aminoácido en la posición 8 es preferiblemente ácido aspártico o ácido glutámico; el aminoácido en la posición 9 es preferiblemente asparagina o glutamina; el aminoácido en la posición 12 es preferiblemente arginina, homoarginina, orinitina o lisina; el aminoácido en la posición 14 es preferiblemente arginina, glutamina, ácido aminoisobutírico, homoarginina, ornitina. citrulina, lisina, alanina o leucina; el aminoácido en la posición 15 es preferiblemente lisina, leucina, ácido aminoisobutírico u ornitina; el aminoácido en la posición 16 es preferiblemente glutamina o lisina; el aminoácido en la posición 17 es preferiblemente valina, alanina, leucina, isoleucina, lisina o norleucina; el aminoácido en la posición 20 es preferiblemente lisina, valina, leucina, ácido aminoisobutírico, alanina o glutamina; el aminoácido en la posición 21 es preferiblemente lisina, ácido aminoisobutírico, ornitina, alanina o glutamina; el aminoácido en la posición 27 es preferiblemente lisina, ornitina u homoarginina el aminoácido en la posición 28 es preferiblemente asparagina, glutamina, lisina, homoarginina, ácido aminoisobutírico, prolina u ornitina; y si está presente, el aminoácido en la posición 29 es preferiblemente lisina, ornitina u homoarginina. Preferiblemente, estas sustituciones de aminoácidos pueden combinarse con sustituciones en posiciones que afecten a las cuatro regiones mencionadas anteriormente susceptibles de ruptura por diversas enzimas.

La mayor potencia y selectividad de diversos agonistas peptídicos del receptor VPAC2 de la presente invención se demuestra en los ejemplos 3 y 4. Por ejemplo, la tabla 1 del ejemplo 3 proporciona una lista de agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos y sus correspondientes resultados de potencia in vitro. Preferiblemente, los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención tienen un valor de CE_{50} menor que 2 nM. Más preferiblemente, el valor de CE_{50} es menor que 1 nM. Aún más preferiblemente, el valor de CE_{50} es menor que 0,5 nM. Todavía más preferiblemente, el valor de CE_{50} es menor que 0,1 nM.

La tabla 2 del ejemplo 4 proporciona una lista de agonistas peptídicos del receptor VPAC2 y sus correspondientes resultados de selectividad para VPAC2, VPAC1 y PAC1. Véase el ejemplo 4 para más detalles acerca de estos ensayos. Estos resultados se ofrecen como una proporción entre la afinidad de unión a VPAC2 y la afinidad de unión a VPAC1, y una proporción entre la afinidad de unión a VPAC2 y la afinidad de unión a PAC1. Preferiblemente, los agonistas de la presente invención tienen una proporción de selectividad en la que la afinidad por VPAC2 es al menos 50 veces mayor que por VPAC1 y/o PAC1. Más preferiblemente, esta proporción es al menos 100 mayor que por VPAC1 y/o PAC1. Aún más preferiblemente, esta proporción es al menos 200 mayor que por VPAC1 y/o PAC1. Todavía más preferiblemente, esta proporción es al menos 500 mayor que por VPAC1 y/o PAC1. Aún todavía más preferiblemente, esta proporción es al menos 1000 mayor que por VPAC1 y/o PAC1.

Tal como se utilizan en la presente, los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos también incluyen las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en la presente. Un agonista peptídico del receptor VPAC2 selectivo de esta invención puede poseer suficientes grupos funcionales ácidos, básicos o ambos grupos funcionales y, por consiguiente, puede reaccionar con uno cualquiera de una serie de bases inorgánicas, y ácidos inorgánicos y orgánicos, para formar una sal. Los ácidos que se emplean habitualmente para formar sales de adición de ácidos son ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos, tales como ácido p-toluensulfónico, ácido metansulfónico, ácido oxálico, ácido p-bromofenilsulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético, ácido trifluoroacético y similares. Los ejemplos de estas sales incluyen las sales sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfito, fosfato, monobifosfato, dibifosfato, metafosfato, pirofosfato, cloruro, bromuro, yoduro, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formiato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butin-1,4-dioato, hexin-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilensulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gamma-hidroxibutirato, glicolato, tartrato, metansulfonato, propansulfonato, naftalen-1-sulfonato, naftalen-2-sulfonato, mandelato y similares.

Las sales de adición de bases incluyen las derivadas de bases inorgánicas, tales como hidróxidos, carbonatos y bicarbonatos de amonio, de metales alcalinos o de metales alcalino-térreos y similares. Estas bases útiles para preparar las sales de esta invención incluyen, por tanto, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, carbonato de potasio y similares.

Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención pueden administrarse por vía parenteral. La administración parenteral puede incluir, por ejemplo, la administración sistémica, tal como mediante inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea, intradérmica o intraperitoneal. Estos agonistas pueden administrarse al sujeto junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable como parte de una composición farmacéutica para tratar la NIDDM. Pueden emplearse técnicas de formulación farmacéuticas convencionales, tales como las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishin Company, Easton, PA. Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención pueden formularse para su administración a través de la vía bucal, tópica, oral, transdérmica, nasal o pulmonar.

Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos descritos en la presente pueden utilizarse para tratar sujetos con una amplia variedad de enfermedades y trastornos. Los agonistas que incluye la presente invención ejercen sus efectos biológicos actuando en un receptor denominado receptor VPAC2. Los sujetos con enfermedades y/o trastornos que responden favorablemente a la estimulación del receptor VPAC2 o a la administración'de los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 pueden tratarse, por tanto, con los agonistas de VPAC2 de la presente invención. Se dice que estos sujetos "necesitan un tratamiento con los agonistas de VPAC2" o "necesitan la estimulación del receptor VPAC2".

Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención pueden emplearse para tratar la diabetes, incluyendo la diabetes de tipo 1 y de tipo 2 (diabetes mellitus no dependiente de insulina). También se incluyen los sujetos que requieren un tratamiento profiláctico con un agonista del receptor VPAC2, por ejemplo, sujetos con riesgo de desarrollar la NIDDM. Este tratamiento también puede retrasar la aparición de la diabetes y las complicaciones diabéticas. Otros sujetos incluyen aquéllos con una alteración de la tolerancia a la glucosa o con glucemia basal alterada, sujetos cuyo peso corporal es aproximadamente 25% mayor que el peso corporal normal según la altura y la constitución del sujeto, sujetos que tienen uno o más progenitores con NIDDM, sujetos que han padecido diabetes gestacional, y sujetos con trastornos metabólicos, tales como los que se producen como resultado de una disminución de la secrección endógena de insulina. Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos pueden utilizarse para evitar que sujetos con una alteración de la tolerancia a la glucosa desarrollen la diabetes de tipo 2, para evitar el deterioro de las células \beta pancreáticas, para inducir la proliferación de células \beta, para mejorar la función de las células \beta, para activar células \beta inactivas, para diferenciar células en células \beta, para estimular la replicación de células \beta, y para inhibir la apoptosis de células \beta. Otras enfermedades y trastornos que pueden tratarse o prevenirse utilizando los compuestos de la invención incluyen diabetes juvenil de aparición en la edad adulta (MODY) (Herman, et al., Diabetes, 43:40, 1994); diabetes autoinmunológica latente de adultos (LADA) (Zimmet, et al., Diabetes Med., 11:299, 1994); alteración de la tolerancia a la glucosa (IGT) (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care, 22 (supl. 1):S5, 1999); glucemia basal alterada (IFG) (Charles, et al., Diabetes 40:796, 1991); diabetes gestacional (Metzger, Diabetes, 40:197, 1991); síndrome X metabólico, dislipidemia, hiperglucemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, y resistencia a la insulina.

Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención también pueden ser eficaces en la prevención o el tratamiento de trastornos tales como la obesidad, enfermedad aterosclerótica, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, bajos niveles de HDL, hipertensión, hipertensión pulmonar primaria, enfermedad cardiovascular (incluyendo aterosclerosis, enfermedad cardíaca coronaria, enfermedad de la arteria coronaria, e hipertensión), enfermedad cerebrovascular, y enfermedad de los vasos periféricos; y para el tratamiento del lupus, síndrome de ovario poliquístico, carcinogénesis, e hiperplasia, asma, problemas reproductivos masculinos y femeninos, trastornos sexuales, úlceras, trastornos del sueño, trastornos del metabolismo de lípidos y carbohidratos, disfunción del ritmo circadiano, trastornos del crecimiento, trastornos de la homeostasis energética, enfermedades inmunológicas, incluyendo enfermedades autoinmunológicas (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico), así como enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, artritis reumatoide, y choque séptico.

Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención también pueden ser útiles para tratar trastornos fisiológicos relacionados, por ejemplo, con la diferenciación celular para producir células que acumulan lípidos, la regulación de la sensibilidad a la insulina y los niveles sanguíneos de glucosa, que están implicados, por ejemplo, en una función anómala de las células \beta pancreáticas, tumores que segregan insulina y/o hipoglucemia autoinmunológica debida a autoanticuerpos contra la insulina, autoanticuerpos contra el receptor de insulina, o autoanticuerpos que son estimulados por las células \beta pancreáticas, la diferenciación de macrófagos que conduce a la formación de placas ateroscleróticas, la respuesta inflamatoria, carcinogénesis, hiperplasia, expresión de genes de adipocitos, diferenciación de adipocitos, reducción de la masa de células \beta pancreáticas, secreción de insulina, sensibilidad a la insulina de tejidos, crecimiento de células de liposarcoma, enfermedad del ovario poliquístico, anovulación crónica, hiperandrogenismo, producción de progesterona, esteroidogénesis, estrés oxidativo y del potencial redox en células, producción de óxido nítrico sintasa (NOS), aumento de la gamma-glutamil transpeptidasa, catalasa, triglicéridos plasmáticos, niveles de colesterol HDL y LDL, y similares.

Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos también pueden utilizarse para tratar causas secundarias de la diabetes (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care, 22 (supl. 1):S5, 1999). Estas causas secundarias incluyen el exceso de glucocorticoides, exceso de la hormona del crecimiento, feocromocitoma, y diabetes inducida por fármacos. Los fármacos que pueden inducir la diabetes incluyen, pero no se limitan a piriminil, ácido nicotínico, glucocorticoides, fenitoína, hormona tiroidea, agentes \beta-adrenérgicos, \alpha-interferón, y fármacos utilizados para tratar la infección por VIH.

Además, los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la invención pueden utilizarse para el tratamiento del asma (Bolin, et al., Biopolymer, 37:57-66, 1995; patente de EEUU nº 5.677.419; lo cual demuestra que el polipéptido R3PO es activo para relajar el músculo liso traqueal de cobayas); la inducción de la hipotensión (el VIP induce la hipotensión, la taquicardia, y el rubor facial en pacientes asmáticos (Morice, et al., Peptides, 7:279-280, 1986; Morice, et al., Lancet 2:1225-1227, 1983)); problemas reproductivos masculinos (Siow, et al., Arch. Androl., 43(1):67-71, 1999); como agente neuroprotector/antiapoptosis (Brenneman, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 865:207-212, 1998); cardioprotección durante acontecimientos isquémicos (Kalfin, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1268(2):952-958, 1994; Das, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 865:297-308, 1998), manipulación del reloj circadiano y sus trastornos asociados (Hamar, et al., Cell, 109:497-508, 2002; Shen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:11575-11580, 2000), y como agente antiúlcera (Tuncel, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 865:309-322, 1998).

Una "cantidad eficaz" de un agonista peptídico del receptor VPAC2 selectivo es la cantidad que produce como resultado un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado sin provocar efectos secundarios inaceptables cuando se administra a un sujeto que necesita la estimulación del receptor VPAC2. Un "efecto terapéutico deseado" incluye uno o más de los siguientes: 1) una mejora del(de los) síntoma(s) asociado(s) con la enfermedad o trastorno; 2) un retraso en la aparición de los síntomas asociados con la enfermedad o trastorno; 3) una mayor longevidad comparada con la ausencia de tratamiento; y 4) una mayor calidad de vida comparada con la ausencia de tratamiento. Por ejemplo, una "cantidad eficaz" de un agonista de VPAC2 para el tratamiento de la NIDDM es la cantidad que produce como resultado un mayor control de la concentración sanguínea de glucosa que en ausencia de tratamiento, dando como resultado, con ello, un retraso en la aparición de complicaciones diabéticas, tales como retinopatía, neuropatía, o enfermedad renal. Una "cantidad eficaz" de un agonista peptídico del receptor VPAC2 selectivo para la prevención de la NIDDM es la cantidad que retrasaría, comparado con la ausencia de tratamiento, la aparición de elevados niveles sanguíneos de glucosa que requiere un tratamiento con fármacos antihipoglucémicos, tales como sulfonilureas, tiazolidindionas, insulina y/o bisguanidinas.

Una "cantidad eficaz" de un agonista peptídico del receptor VPAC2 selectivo administrada a un sujeto también dependerá del tipo y gravedad de la enfermedad y de las características del sujeto, tales como salud general, edad, sexo, peso corporal y tolerancia a fármacos. La dosis del agonista peptídico del receptor VPAC2 selectivo eficaz para normalizar la glucosa sanguínea del paciente dependerá de una serie de factores, entre los cuales se incluyen, sin limitación, el sexo, el peso y la edad del sujeto, la gravedad de la incapacidad de regular la glucosa sanguínea, la vía de administración y biodisponibilidad, el perfil farmacocinético del péptido, la potencia y la formulación.

Un intervalo de dosis típico para los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención variará de aproximadamente 1 \mug diario a aproximadamente 5000 \mug diarios. Preferiblemente, la dosis varía de aproximadamente 1 \mug diario a aproximadamente 2500 \mug diarios, más preferiblemente de aproximadamente 1 \mug diario a aproximadamente 1000 \mug diarios. Aún más preferiblemente, la dosis varía de aproximadamente 5 \mug diarios a aproximadamente 100 \mug diarios. Otro intervalo de dosis preferido es de aproximadamente 10 \mug diarios a aproximadamente 50 \mug diarios. Lo más preferible es una dosis de aproximadamente 20 \mug diarios.

Un "sujeto" es un mamífero, preferiblemente un ser humano, pero también puede ser un animal, por ejemplo, animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos y similares), y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas y similares).

Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos de la presente invención pueden prepararse utilizando procedimientos convencionales de técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida. Los sintetizadores de péptidos están disponibles en el mercado, por ejemplo, en Rainin-PTI Symphony Peptide Synthesizer (Tucson, AZ). Los reactivos para la síntesis en fase sólida están disponibles en el mercado, por ejemplo, en Glycopep (Chicago, IL). Los sintetizadores de péptidos en fase sólida pueden utilizarse según las instrucciones del fabricante para bloquear grupos que puedan interferir, protegiendo a los aminoácidos que se van a hacer reaccionar, a acoplar, a desacoplar y a introducir un casquete de los aminoácidos sin reaccionar.

De forma típica, un aminoácido \alpha-N-protegido y el aminoácido N-terminal en la cadena peptídica en crecimiento sobre una resina se acoplan a temperatura ambiente en un disolvente inerte, tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidona o cloruro de metileno, en presencia de agentes de acoplamiento, tales como diciclohexilcarbodiimida y 1-hidroxibenzotriazol, y una base, tal como diisopropiletilamina. El grupo \alpha-N-protector se retira del péptido resultante en la resina utilizando un reactivo, tal como ácido trifluoroacético o piperidina, y la reacción de acoplamiento se repite con el siguiente aminoácido N-protegido deseado para ser añadido a la cadena peptídica. Los grupos protectores de amina adecuados son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Green y Wuts, "Protecting Groups in Organic Síntesis", John Wiley and Sons, 1991. Los ejemplos incluyen t-butiloxicarbonilo (tBoc) y fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc).

Los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos también se sintetizan utilizando protocolos de síntesis en fase sólida automáticos convencionales utilizando t-butoxicarbonil- o fluorenilmetoxicarbonil-alfa-aminoácidos con una protección apropiada en la cadena lateral. Después de completar la síntesis, los péptidos se retiran del soporte en fase sólida con una desprotección simultánea de la cadena lateral utilizando procedimientos de fluoruro de hidrógeno convencionales o ácido trifluoroacético (TFA). Los péptidos brutos entonces se purifican aún más utilizando una cromatografía en fase inversa sobre columnas Vydac C18 empleando gradientes de acetonitrilo en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%. Para eliminar el acetonitrilo, los péptidos se liofilizan de una disolución que contiene TFA al 0,1%, acetonitrilo y agua. La purificación se puede verificar mediante una cromatografía en fase inversa analítica. La identidad de los péptidos puede verificarse mediante una espectrometría de masas. Los péptidos pueden solubilizarse en tampones acuosos a pH neutro.

Los agonistas peptídicos descritos en la presente también pueden fabricarse utilizando procedimientos recombinantes conocidos en la técnica.

Diversas características y realizaciones preferidas de la presente invención se describirán a continuación sólo como ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Preparación de los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos mediante la química de t-Boc en fase sólida

Se colocan aproximadamente 0,5-0,6 gramos (0,38-0,45 mmol) de resina Boc Pro-MBHA en un recipiente de reacción de 60 ml convencional. Se realizan acoplamientos dobles en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems ABI430A. Se obtienen los siguientes aminoácidos protegidos en su cadena lateral (cartuchos de 2 mmol de Boc-aminoácidos) de Midwest Biotech (Fishers, IN) y se emplean en la síntesis:

Arg-tosilo (TOS), éster Asp-\delta-ciclohexílico (CHXL), éster Glu-\delta-ciclohexílico (CHXL), His-benciloximetilo
(BOM), Lys-2-clorobenciloxicarbonilo (2Cl-Z), éter Ser-O-bencílico (OBzl), éster Thr-O-bencílico (OBzl), Trp-formilo (CHO) y Tyr-2-bromobenciloxicarbonilo (2Br-Z), y resina Boc Gly PAM. El ácido trifluoroacético (TFA), la diisopropiletilamina (DIEA), el hidroxibenzotriazol (HOBt) 0,5 M en DMF, y la diciclohexilcarbodiimida (DCC) 0,5 M en diclorometano se adquirieron en PE-Applied Biosystems (Foster City, CA). La dimetilformamida (DMF - Burdick and Jackson) y el diclorometano (DCM - Mallinkrodt) se obtuvieron en Mays Chemical Co. (Indianápolis, IN).

Se realizan acoplamientos dobles convencionales utilizando anhídridos simétricos o ésteres de HOBt, ambos formados utilizando DCC. Después de completar la síntesis, el grupo Boc N-terminal se retira y las resinas de peptidilo se tratan con piperidina al 20% en DMF para desformilar la cadena lateral de Trp, si el Trp está presente en la secuencia. Para la acilación N-terminal, se añade a la resina del péptido un exceso en cuatro veces del anhídrido simétrico del correspondiente ácido. El anhídrido simétrico se prepara mediante activación de diisopropilcarbodiimida (DIC) en DCM. Se deja que la reacción se desarrolle durante 4 horas y se controla mediante un ensayo de ninhidrina. Después de lavar con DCM, las resinas se trasladan a un recipiente de reacción de TEFLÓN y se secan al vacío.

Las rupturas se realizan uniendo los recipientes de reacción a un aparato de HF (ácido fluorhídrico) (Penninsula Laboratories). Se añade 1 ml de m-cresol por gramo/resina y se condensan 10 ml de HF (adquirido en AGA, Indianápolis, IN) sobre el recipiente preenfriado. Se añade 1 ml de DMS por gramo de resina cuando está presente la metionina. Las reacciones se agitan una hora en una baño de hielo. El HF se elimina al vacío. Los residuos se suspenden en éter etílico. Los sólidos se filtran y se lavan con éter. Cada péptido se extrae en ácido acético acuoso y se liofiliza o se carga directamente sobre una columna de fase inversa.

Las purificaciones se realizan en una columna VYDAC C18 2,2 x 25 cm en tampón A (ácido trifluoroacético al 0,1% en agua, B: TFA al 0,1% en acetonitrilo). Se hace pasar un gradiente de B del 20% al 90% a través de una columna de HPLC (Waters) a lo largo de 120 minutos a 10 ml/minuto mientras se controla el UV a 280 nm (4,0 A) y se recogen fracciones cada minuto. Se reúnen las fracciones apropiadas, se congelan y se liofilizan. Los productos secos se analizan mediante HPLC (METASIL AQ C18 0,46 x 15 cm) y espectrometría de masas MALDI.

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Ejemplo 2 Preparación de agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos mediante la química de FMoc en fase sólida

Se colocan aproximadamente 114 mg (50 mmol) de resina de amida FMOC-Rink (obtenida en GlycoPep, Chicago, IL) en cada recipiente de reacción. La síntesis se realiza en un sintetizador de péptidos Rainin Symphony. Se preparan análogos con una amida C-terminal utilizando 75 mg (50 \mumol) de resina Rink Amide AM (Rapp Polymere, Tuebingen, Alemania).

Se obtuvieron los siguientes FMOC-aminoácidos en GlycoPep (Chicago, IL) y NovaBiochem (La Jolla, CA): Arg-2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5 sulfonilo (Pbf), Asn-tritilo (Trt), éster Asp-\beta-t-butílico (tBu), éster Glu-\delta-t-butílico (tBu), Gln-tritilo (Trt), His-tritilo (Trt), Lys-t-butiloxicarbonilo (Boc), éter Ser-t-butílico (OtBu), éter Thr-t-butílico (OtBu), Trp-t-butiloxicarbonilo (Boc), éter Tyr-t-butílico (OtBu).

Los disolventes dimetilformamida (DMF - Burdick and Jackson), N-metilpirrolidona (NMP - Burdick and Jackson), diclorometano (DCM-Mallinkrodt) se obtuvieron en Mays Chemical Co. (Indianápolis, IN).

El hidroxibenzotriazol (HOBt), la diisopropilcarbodiimida (DIC), la diisopropiletilamina (DIEA), y la piperidina (Pip) se obtuvieron en Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI).

Todos los aminoácidos se disolvieron en DMF 0,3 M. Se realizaron acoplamientos de tres horas activados por DIC/HOBt después de 20 minutos de desprotección utilizando Pip al 20%/DMF. Cada resina se lava con DMF después de las desprotecciones y acoplamientos. Después del último acoplamiento y desprotección, las resinas de peptidilo se lavan con DCM y se secan al vacío en el recipiente de reacción. Para la acilación N-terminal se añade un exceso en cuatro veces del anhídrido simétrico del correspondiente ácido sobre la resina del péptido. El anhídrido simétrico se prepara mediante la activación de la diisopropilcarbodiimida (DIC) en DCM. Se deja que la reacción se desarrolle durante 4 horas y se controla mediante un ensayo con ninhidrina. La resina del péptido entonces se lava con DCM y se seca al vacío.

La reacción de ruptura se mezcla durante 2 horas con un cóctel de ruptura que consiste en 0,2 ml de tioanisol, 0,2 ml de metanol, 0,4 ml de triisopropilsilano, por cada 10 ml de ácido trifluoroacético (TFA), habiéndose obtenido todos en Aldrich Chemical co., Milwaukee, WI. Si Cys está presente en la secuencia se añade etanditiol al 2%. Los filtrados de TFA se añaden a 40 ml de éter etílico. Los precipitantes se centrifugan durante 2 minutos a 2000 rpm. Los sobrenadantes se decantan. Los sedimentos se resuspenden en 40 ml de éter, se recentrifugan, se redecantan, se secan bajo una atmósfera de nitrógeno y después al vacío.

Se disuelven 0,3-0,6 mg de cada producto en 1 ml de TFA al 0,1%/acetonitrilo (ACN), analizándose 20 \mul en una columna de HPLC (METASIL AQ C18 0,46 x 15 cm, 1 ml /min, 45ºC, 214 nm (0,2 A), A = TFA al 0,1%/ACN al 50%; Gradiente = de B al 50% a B al 90% a lo largo de 30 minutos).

Las purificaciones se realizan en una columna VYDAC C18 de 2,2 x 25 cm en tampón A (ácido trifluoroacético al 0,1% en agua, B: TFA al 0,1% en acetonitrilo). Se hace pasar un gradiente de B del 20% al 90% en una columna de HPLC (Waters) a lo largo de 120 minutos a 10 ml/minuto mientras se controla el UV a 280 nm (4,0 A) y se recogen fracciones cada minuto. Se reúnen las fracciones apropiadas, se congelan y se liofilizan. Los productos secos se analizan mediante HPLC (METASIL AQ C18 0,46 x 15 cm) y espectrometría de masas MALDI.

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Ejemplo 3 Potencia in vitro

DiscoveRx: Una línea de células CHO-S que expresa de forma estable el receptor VPAC2 humano en una placa de microvaloración de 96 pocillos se siembra con 50.000 células/pocillo el día anterior al ensayo. Se deja que las células prendan durante 24 horas en 200 \mul de medio de cultivo. El día del experimento se retira el medio. Además, las células se lavan dos veces. Las células se incuban en tampón de ensayo más IBMX durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después se añaden los estímulos y se disuelven en el tampón de ensayo. Los estímulos están presentes durante 30 minutos. Después, el tampón de ensayo se retira con suavidad. Se añade el reactivo de lisis celular del kit de AMPc DiscoveRx. Después se utiliza el protocolo convencional para revelar la señal de AMPc, según describen los fabricantes (DiscoveRx Inc., EEUU). Se calculan los valores de CE_{50} para la generación de AMPc a partir de la señal bruta, o se basan en los niveles absolutos de AMPc determinados mediante una curva patrón realizada en cada placa. En el caso de los receptores VPAC1 y PAC1, las células CHO-PO se transfectan de forma transitoria con ADN del receptor VPAC1 o PAC1 humano utilizando reactivos de transfección disponibles en el mercado (Lipofectamine de Invitrogen). Las células se siembran a una densidad de 10.000/pocillo en una placa de 96 pocillos y se dejan crecer durante 3 días en 200 ml de medio de cultivo. En el día 3, se realiza el ensayo descrito anteriormente para la línea celular del receptor VPAC2.

Los resultados para cada agonista son la media de dos ensayos independientes. Los resultados de VPAC1 y PAC1 sólo se generaron utilizando el ensayo DiscoveRx. Las concentraciones de péptido típicas ensayadas fueron: 1000, 300, 100, 10, 1, 0,3, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 y 0 nM.

Selección Alpha: Las células se lavaron en el matraz de cultivo una vez con PBS. Después, las células se enjuagaron con tampón de disociación exento de enzimas. Se retiraron las células disociadas. Las células entonces se centrifugaron y se lavaron en tampón de estimulación. Para cada punto de los datos se emplearon 50.000 células suspendidas en tampón de estimulación. Se añadió tampón de lisis y esferas donantes de selección Alpha y se incubó durante 60 a 120 minutos. La señal de selección Alpha (indicativa de los niveles intracelulares de AMPc) se lee en un instrumento adecuado (por ejemplo, AlphaQuest de Perkin-Elmer). Se realizan las etapas que incluyen las esferas aceptoras y donantes de selección Alpha con poca luz. Se calcula la CE_{50} para la generación de AMPc a partir de la señal bruta, o se basa en los niveles absolutos de AMPc determinados mediante una curva patrón realizada en cada placa.

Los resultados para cada agonista proceden, como mínimo, de dos análisis realizados en un mismo ensayo. Para algunos agonistas, los resultados son la media de más de un ensayo. Las concentraciones de péptido ensayadas fueron: 10000, 1000, 100, 10, 3, 1, 0,1, 0,01, 0,003, 0,001, 0,0001 y 0,00001 nM. La actividad (CE_{50} (nM)) para los receptores VPAC2, VPAC1 y PAC1 humanos se indica en la tabla 1.

TABLA 1

11

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Ensayos 4

Selectividad

Ensayos de unión: Se emplean membranas preparadas a partir de una línea celular de VPAC2 estable (véase el ejemplo 3) o a partir de células transfectadas de forma transitoria con VPAC1 o PAC1 humano. Se realiza un ensayo de unión en filtro utilizando VIP marcado con ^{125}I para VPAC1 y VPAC2, y PACAP-27 marcado con ^{125}I para PAC1 como marcadores.

Para este ensayo, las disoluciones y equipo incluían:

Disolución de preempapado: polietilenamina al 0,1% en Aquadest

Tampón para enjuagar las placas de filtro: HEPES 25 nM, pH 7,4

Tampón de bloqueo: HEPES 25 nM, pH 7,4; proteasa al 0,2% exenta de BSA

Tampón de ensayo: HEPES 25 nM, pH 7,4; proteasa al 0,5% exenta de BSA

Placa de ensayo y dilución: microplaca PS, forma de U

Placa de filtración: placa opaca Multiscreen FB; filtro de fibra de vidrio de tipo B de 1,0 \muM

Para preparar las placas de filtro se aspira la disolución de preempapado mediante una filtración al vacío. Se enjuagan las placas dos veces con 200 \mul de tampón de enjuagado. Se añaden 200 \mul de tampón de bloqueo a la placa de filtro. La placa de filtro entonces se incuba con 200 \mul de disolución de preempapado durante 1 hora a temperatura ambiente.

Se llena la placa de ensayo con 25 \mul de tampón de ensayo, 25 \mul de membranas (2,5 \mug) suspendidas en tampón de ensayo, 25 \mul de compuesto (agonista) en tampón de ensayo, y 25 \mul de marcador (aproximadamente 40000 cpm) en tampón de ensayo. Se incuba la placa de filtro durante 1 hora con agitación.

Se realiza la transferencia desde la placa de ensayo a la placa de filtro. Se aspira el tampón de bloqueo mediante filtración al vacío y se lava dos veces con tampón de enjuagado. Se trasladan 90 \mul de la placa de ensayo a la placa de filtro. Se aspiran los 90 \mul trasladados desde la placa de ensayo y se lava tres veces con 200 \mul de tampón de enjuagado. Se retira el soporte de plástico. Se seca durante 1 hora a 60ºC. Se añaden 300 \mul de Microscint. Se realiza el recuento.

La selectividad (CI_{50}) para VPAC2, VPAC1 y PAC1 humano se indica en la tabla 2.

TABLA 2

13

Las células CHO-PO se transfectaron de forma transitoria con ADN del receptor VPAC1 o VPAC2 de rata. La actividad (CE_{50} (nM)) para estos receptores se indica en la tabla a continuación.

TABLA 3

15

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Ejemplo 5 Ensayo in vivo

Ensayo de la tolerancia a la glucosa intravenosa (IVGTT): Se dejan en ayunas durante la noche a ratas Wistar normales y se anestesian antes del experimento. Se inserta en las ratas un catéter de toma de muestras de sangre. El compuesto se administra a través de la vena yugular. Se toman muestras de sangre desde la arteria carótida. Se extrae una muestra de sangre inmediatamente antes de la inyección de glucosa junto con el compuesto. Después de la muestra de sangre inicial, la glucosa mezclada con el compuesto se inyecta por vía intravenosa (i.v.). Se administra una dosis de prueba de glucosa de 0,5 g/kg de peso corporal, inyectando un total de 1,5 ml de vehículo con glucosa y agonista por kg de peso corporal. La concentración del péptido varía para producir la dosis deseada en \mug/kg. Se extraen muestras de sangre a los 2, 4, 6 y 10 minutos después de administrar la glucosa. El grupo control de animales recibe el mismo vehículo junto con glucosa, pero sin compuesto añadido. En algunos casos se extrae una muestra de sangre 30 minutos después de administrar la glucosa. Se añade aprotinina a la muestra de sangre (250 kIU/ml de sangre). Entonces se analiza el suero para detectar glucosa e insulina utilizando metodologías convencionales.

El ensayo utiliza un disolución madre en PBS de péptido formulada y calibrada. Normalmente, esta disolución madre es una disolución madre 100 \muN prediluida. Sin embargo, se emplea una disolución madre más concentrada con aproximadamente 1 mg de agonista por ml. La concentración específica siempre es conocida. La variabilidad en la respuesta máxima es debida, principalmente, a la variabilidad en la dosis del vehículo.

Los detalles del protocolo son los siguientes:

ESPECIE/RAZA/PESO: Rata/Wistar Unilever/aproximadamente 275-300 g

DURACIÓN DEL TRATAMIENTO: una dosis

VOLUMEN DE LA DOSIS/VÍA: 1,5 ml/kg/intravenosa

VEHÍCULO: PEG300 al 8%, BSA al 0,1% en agua

RÉGIMEN DE ALIMENTO/AGUA: Las ratas se dejan en ayunas durante la noche antes de la cirugía.

PARÁMETROS DE LA FASE VIVA: Los animales se sacrifican al final del ensayo.

IVGTT (realizada en ratas [con dos catéteres, vena yugular y arteria carótida] de cada grupo, bajo anestesia de pentobarbital): glucosa en inyección en embolada intravenosa: 500 mg/kg como una disolución al 10% (5 ml/kg) en el momento = 0. Compuesto por vía intravenosa: justo después de la glucosa. Toma de muestras de sangre (300 \mul de la arteria carótida; EDTA como anticoagulante; aprotinina y PMSF como antiproteolíticos; mantenidas en hielo): 0, 2, 4, 6 y 10 minutos. Parámetro determinado: insulina.

TOXICOCINÉTICA: Las muestras de plasma remanentes después de la medidas de insulina se mantienen a -20ºC y se envían a Hamburgo para la determinación de los niveles de compuesto.

NÚMERO DE MUESTRAS: 150

16

Ejemplo 6 Estudios de estabilidad en suero de rata

Para determinar la estabilidad de los agonistas peptídicos del receptor VPAC2 en suero de rata, se obtiene el clon nº 6 de células CHO-VPAC2 (placas de 96 pocillos/50.000 células/pocillo y 1 día de cultivo), PBS 1 X (Gibco), los péptidos para el análisis en disolución madre 100 \muM, suero de rata procedente de una rata Wistar normal sacrificada, aprotinina, y un kit de ensayo DiscoveRx. El suero de rat se conserva a 4ºC hasta su uso y se emplea dentro de las siguientes dos semanas.

En el día 0 se preparan dos partes alícuotas de 100 \mul de péptido 10 \muM en suero de rata añadiendo 10 \mul de disolución madre de péptido a 90 \mul de suero de rata para cada parte alícuota. Se añaden 210 kIU de aprotinina/ml a una de estas partes alícuotas. Se conserva la parte alícuota con aprotinina a 4ºC. Se conserva la parte alícuota sin aprotinina a 37ºC. Se dejan las partes alícuotas en incubación durante 18 horas.

En el día 1, después de la incubación de las partes alícuotas preparadas el día 0 durante 18 horas, se prepara un tampón de incubación que contiene PBS + CaCl_{2} 1,3 mM, MgCl_{2} 1,2 mM, glucosa 2 mM, e IBMX 0,25 mM. Se prepara una placa con 11 diluciones en serie 5 x del péptido para las partes alícuotas de 4ºC y 37ºC para cada péptido estudiado. Se emplea 2000 nM como la máxima concentración si el péptido tiene una CE_{50} mayor que 1 nM, y 1000 nM como la máxima concentración si el péptido tiene una CE_{50} menor que 1 nM de la selección primaria (véase el ejemplo 3). Se lava(n) la(s) placa(s) con las células dos veces en tampón de incubación. Se dejan las placas con 50 \mul de medio de incubación por pocillo durante 15 minutos. Se trasladan 50 \mul de disolución por pocillo a las células de la placa preparadas con 11 diluciones en serie 3 x del péptido para las partes alícuotas de 4ºC y 37ºC para cada péptido estudiado, utilizando las concentraciones máximas indicadas por la selección primaria, por duplicado. Esta etapa diluye la concentración del péptido en un factor de dos. Se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se retira el sobrenadante. Se añaden 40 \mul/pocillo del tampón de extracción/anticuerpo de DiscoveRx. Se incuba en un agitador (300 rpm) durante 1 hora. Se procede de forma normal con el kit DiscoveRx. Se incluyen los patrones de AMPc en la columna 12. Se determinan los valores de CE_{50} para los datos del ensayo de AMPc. La cantidad remanente de péptido activo se estima mediante la fórmula CE_{50}, 4C/CE_{50}, 37C para cada condición.

TABLA 5

17

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TABLA 6

18

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<110> Eli Lilly and Company

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<120> Agonistas peptídicos del receptor VPAC2 selectivos

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<130> X16650

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<160> 368

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 28

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> constructo sintético

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<400> 1

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\hskip1cm

19

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<210> 2

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> constructo sintético

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (27)..(27)

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<223> Amidación

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<400> 2

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\hskip1cm

20

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<210> 3

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<211> 37

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> constructo sintético

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (37)..(37)

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<223> Amidación

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<400> 3

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\hskip1cm

21

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<210> 9

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> constructo sintético

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<400> 9

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\hskip1cm

22

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<210> 10

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> constructo sintético

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (7)..(7)

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<223> Amidación

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<400> 10

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\hskip1cm

23

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<210> 13

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> constructo sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CARACTERÍSTICA_MISC

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<222> (1)..(1)

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<223> Xaa en la posición 1 es Ser o está ausente

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 2 es Arg, Ser, hR, Orn, His o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 3 es Thr o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 4 es Ser o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 5 es Pro, Ser, Ala o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 6 es Pro, Ser, Ala, Arg o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 7 es Pro, Ser, Ala o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 8 es Lys, Lys con Trp acoplado a la cadena lateral del resto Lys, Pro o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 9 es K(E-C16) (épsilon-(gamma-L-glutamil(N-alfa-palmitoil))lisina, Ser o está ausente

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 10 es Ser o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 1 es His, dH o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 2 es dA, Ser, Val, Gly, Thr, Leu, dS, Pro o Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 3 es Asp o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 4 es Ala, Ile, Tyr, Phe, Val, Thr, Leu, Trp, Gly, dA, Aib o NMeA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 5 es Val, Leu, Phe, Ile, Thr, Trp, Tyr, dV, Aib o NMeV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 6 es Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp o Tyr

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 8 es Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 9 es Asn, Gln o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 10 es Tyr, Trp o Tyr(OMe)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 12 es Arg, Lys, hR, Orn, Aib, Cit o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 13 es Leu, Phe, Glu, Ala o Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 14 es Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Phe, Gln, Aib o Cit

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 15 es Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, hR, Orn, Phe, Gln, Aib, K(Ac) o Cit

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 16 es Gln, Lys, Ala, hR, Orn o Cit

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 17 es Val, Ala, Leu, Ile, Met, Nle, Lys o Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 19 es Ala, Gly o Leu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 20 es Lys, Gln, hR, Arg, Ser, Orn, Ala, Aib, Trp, Thr, Leu, Ile, Phe, Tyr, Val, K(Ac) o Cit

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 21 es Lys, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac) o Cit

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 22 es Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, Ile, Val, Tyr(OMe), Ala o Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (23)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 23 es Leu, Phe, Ile, Ala, Trp, Thr, Val o Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)..(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 24 es Gln o Asn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 25 es Ser, Asp, Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Gln, Asn, Tyr, Aib o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 26 es Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Tyr, Phe o Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 27 es Lys, hR, Arg, Gln, Orn o dK

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)..(28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 28 es Asn, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Cit, Pro, dK o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (29)..(29)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 29 es Lys, Ser, Arg, Asn, hR, Orn, Cit, Aib o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)..(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 30 es Arg, Lys, Ile, hR, Cit, Aib, Orn o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)..(31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 31 es Tyr, His, Phe o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (32)..(32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 32 es Cys o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 3 es Asp o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 8 es Asp o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 9 es Asn o Gln

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 12 es Arg, hR, Lys u Orn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 14 es Arg, Leu, Gln, Aib, hR, Orn, Cit, Lys o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 15 es Lys, Leu, Ala, Aib u Orn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 16 es Gln, Lys o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 17 es Val, Ala, Leu, Ile, Lys o Nle

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 20 es Lys, Aib, Val, Leu, Ala o Gln

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 21 es Lys, Aib, Orn, Ala o Gln

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 27 es Lys, Orn o hR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)..(28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 28 es Asn, Glu, Lys, hR, Aib, Pro u Orn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 9 es Asn o Gln

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 14 es Arg o Leu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 15 es Lys, Leu o Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 16 es Gln, Lys o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 17 es Val o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 20 es Lys o Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)..(28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 28 es Asn o Gln

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 1 es Ser o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 2 es Arg o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 3 es Thr o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 4 es Ser o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 5 es Pro o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 6 es Pro o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 7 es Pro o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 8 es Lys, Lys con Trp acoplado a la cadena lateral del resto Lys o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 9 es Glu con el grupo 16-carbono del acilo conectado al grupo alfa-amino de Glu o está ausente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 352

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 352

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 353

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 353

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 354

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Acilación C6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 354

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 355

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Acetilación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 355

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 356

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> K(E-C16) = (épsilon-(gamma-L-glutamil(N-alfa-palmitoil)lisina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 356

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Acilación C6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> K(E-C16) = (épsilon-(gamma-L-glutamil(N-alfa-palmitoil)lisina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 357

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 358

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 3-fenilpropionilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 358

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 359

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Benzoílo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 359

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Propionilo C3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> K(E-C16) = (épsilon-(gamma-L-glutamil(N-alfa-palmitoil)lisina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 360

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 361

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 361

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 362

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 363

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Acilación C6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> K(W) = épsilon-(L-triptofil)lisina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 363

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 364

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> K(W) = épsilon-(L-triptofil)lisina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 364

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 365

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Acilación C6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 365

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 366

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Acilación C6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 366

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 367

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Acilación C6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 367

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 368

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Acilación C6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 15 es Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 20 es Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Amidación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 368

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

47

Claims

1. Un agonista peptídico del receptor VPAC2 que comprende una secuencia de fórmula:

48

en la que:

Xaa_{1} es: His, dH, o está ausente;

Xaa_{2} es: dA, Ser, Val, Gly, Thr, Leu, dS, Pro, o Aib;

Xaa_{3} es: Asp o Glu;

Xaa_{4} es: Ala, Ile, Tyr, Phe, Val, Thr, Leu, Trp, Gly, dA, Aib, o NMeA;

Xaa_{5} es: Val, Leu, Phe, Ile, Thr, Trp, Tyr, dV, Aib, o NMeV;

Xaa_{6} es: Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp, o Tyr;

Xaa_{8} es: Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg, o Tyr;

Xaa_{9} es: Asn, Gln, o Glu;

Xaa_{10} es: Tyr, Trp, o Tyr(OMe);

Xaa_{12} es: Arg, Lys, hR, Orn, Aib, Cit, o Ala;

Xaa_{13} es: Leu, Phe, Glu, Ala, o Aib;

Xaa_{14} es: Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Phe, Gln, Aib, o Cit;

Xaa_{15} es: Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, hR, Orn, Phe, Gln, Aib, K(Ac), o Cit;

Xaa_{16} es: Gln, Lys, Ala, hR, Orn, o Cit;

Xaa_{17} es: Val, Ala, Leu, Ile, Met, Nle, Lys, o Aib;

Xaa_{19} es: Ala, Gly, o Leu;

Xaa_{21} es: Lys, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac), o Cit;

Xaa_{22} es: Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, Ile, Val, Tyr(OMe), Ala, o Aib;

Xaa_{23} es: Leu, Phe, Ile, Ala, Trp, Thr, Val, o Aib;

Xaa_{24} es: Gln, o Asn;

Xaa_{25} es Ser, Asp, Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Gln, Asn, Tyr, Aib, o Glu;

Xaa_{26} es: Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Tyr, Phe o Aib;

Xaa_{27} es: Lys, hR, Arg, Gln, Orn, o dK;

Xaa_{28} es: Asn, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Cit, Pro, dK, o está ausente;

Xaa_{29} es: Lys, Ser, Arg, Asn, hR, Orn, Cit, Aib o está ausente;

Xaa_{30} es: Arg, Lys, Ile, hR, Cit, Aib, Orn, o está ausente;

Xaa_{31} es: Tyr, His, Phe, o está ausente; y

Xaa_{32} es: Cys, o está ausente;

480

en la que:

Xaa_{1} es: Ser, o está ausente;

Xaa_{2} es: Arg, Ser, hR, Orn, His, o está ausente;

Xaa_{3} es: Thr, o está ausente;

Xaa_{4} es: Ser, o está ausente;

Xaa_{5} es: Pro, Ser, Ala, o está ausente;

Xaa_{6} es: Pro, Ser, Ala, Arg, o está ausente;

Xaa_{7} es: Pro, Ser, Ala, o está ausente;

Xaa_{8} es: Lys, K(W), Pro, o está ausente;

Xaa_{9} es: K(E-C_{16}), Ser, o está ausente; y

Xaa_{10} es: Ser, o está ausente;

2. El agonista peptídico del receptor VPAC2 según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de fórmula:

49

en la que:

Xaa_{3} es: Asp, o Glu;

Xaa_{8} es: Asp, o Glu;

Xaa_{9} es: Asn, o Gln;

Xaa_{12} es: Arg, hR, Lys, u Orn;

Xaa_{14} es: Arg, Leu, Gln, Aib, hR, Orn, Cit, Lys, o Ala;

Xaa_{15} es: Lys, Leu, Ala, Aib, u Orn;

Xaa_{16} es: Gln, Lys, o Ala;

Xaa_{17} es: Val, Ala, Leu, Ile, Lys, o Nle;

Xaa_{20} es: Lys, Aib, Val, Leu, Ala, o Gln;

Xaa_{21} es: Lys, Aib, Orn, Ala, o Gln;

Xaa_{27} es: Lys, Orn, o hR; y

Xaa_{28} es: Asn, Gln, Lys, hR, Aib, Pro, u Orn;

50

en la que:

Xaa_{1} es: Ser, o está ausente;

Xaa_{2} es: Arg, Ser, hR, Orn, His, o está ausente;

Xaa_{3} es: Thr, o está ausente;

Xaa_{4} es: Ser, o está ausente;

Xaa_{5} es: Pro, Ser, Ala, o está ausente;

Xaa_{6} es: Pro, Ser, Ala, Arg, o está ausente;

Xaa_{7} es: Pro, Ser, Ala, o está ausente;

Xaa_{8} es: Lys, K(W), Pro, o está ausente;

Xaa_{9} es: K(E-C_{16}), Ser, o está ausente; y

Xaa_{10} es: Ser, o está ausente;

3. El agonista peptídico del receptor VPAC2 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende una secuencia de fórmula:

51

en la que:

Xaa_{9} es: Asn, o Gln;

Xaa_{14} es: Arg, o Leu;

Xaa_{15} es: Lys, Leu, o Aib;

Xaa_{16} es: Gln, Lys, o Ala;

Xaa_{17} es: Val, o Ala;

Xaa_{20} es: Lys, o Aib; y

Xaa_{28} es: Asn, o Gln;

\vskip1.000000\baselineskip

510

en la que:

Xaa_{1} es: Ser, o está ausente;

Xaa_{2} es: Arg, Ser, hR, Orn, His, o está ausente;

Xaa_{3} es: Thr, o está ausente;

Xaa_{4} es: Ser, o está ausente;

Xaa_{5} es: Pro, Ser, Ala, o está ausente;

Xaa_{6} es: Pro, Ser, Ala, Arg, o está ausente;

Xaa_{7} es: Pro, Ser, Ala, o está ausente;

Xaa_{8} es: Lys, K(W), Pro, o está ausente;

Xaa_{9} es: K(E-C_{16}), Ser, o está ausente; y

Xaa_{10} es: Ser, o está ausente;

\vskip1.000000\baselineskip

4. El agonista peptídico del receptor VPAC2 según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la extensión C-terminal comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

511

en la que:

Xaa_{1} es: Ser o está ausente;

Xaa_{2} es: Arg o está ausente;

Xaa_{3} es: Thr o está ausente;

Xaa_{4} es: Ser o está ausente;

Xaa_{5} es: Pro o está ausente;

Xaa_{6} es: Pro o está ausente;

Xaa_{7} es: Pro o está ausente;

Xaa_{8} es: Lys, K(W), o está ausente; y

Xaa_{9} es: K(E-C_{16}) o está ausente;

\newpage

5. El agonista peptídico del receptor VPAC2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la extensión C-terminal se selecciona de:

52

6. El agonista peptídico del receptor VPAC2 según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además una modificación N-terminal en el N-terminal del agonista peptídico, en la que la modificación N-terminal se selecciona de:

(a) la adición de D-histidina, isoleucina, metionina, o norleucina;

(g) la adición de sulfóxido de metionina.

7. El agonista peptídico del receptor VPAC2 según la reivindicación 6, en el que la modificación N-terminal es la adición de un grupo seleccionado de acetilo, propionilo, butirilo, pentanoílo, hexanoílo, metionina, sulfóxido de metionina, 3-fenilpropionilo, fenilacetilo, benzoílo, norleucina, D-histidina, isoleucina y 3-mercaptopropionilo.

8. El agonista peptídico del receptor VPAC2 según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que la modificación N-terminal es la adición de un grupo seleccionado de acetilo, hexanoílo, propionilo, 3-fenilpropionilo y benzoílo.

9. El agonista peptídico del receptor VPAC2 según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

53

10. El agonista peptídico del receptor VPAC2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso como un medicamento.

11. El agonista peptídico del receptor VPAC2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento de la diabetes no dependiente de insulina o de la diabetes dependiente de insulina.