BRPI0708316A2

BRPI0708316A2 - agonistas peptìdicos seletivos do receptor vpac2

Info

Publication number: BRPI0708316A2
Application number: BRPI0708316-5A
Authority: BR
Inventors: Lianshan Zhang; Jorge Alsina-Fernandez
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2007-02-20
Publication date: 2011-05-24
Also published as: MX2008011050A; CN101437848A; US20090082276A1; JP2009529007A; WO2007133828A3; WO2007133828A2; AU2007249632A1; CA2638868A1

Abstract

AGONISTAS PEPTIDICOS SELETIVOS DO RECEPTOR VPAC2. A presente invenção refere-se peptídeos que ativam seletivamente o receptor VPAC2 e são úteis no tratamento de diabetes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGONISTASPEPTÍDICOS SELETIVOS DO RECEPTOR VPAC2".

A presente invenção refere-se aos agonistas peptídicos seletivosdo receptor VPAC2.

Em particular, a presente invenção está relacionada aos agonis-tas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 que compreendem uma exten-são no terminal C, que compreende a seqüência de aminoácido: GGPSS-GAPPPK(E-Ci6).

O diabetes do tipo 2, ou diabetes melito não dependente de in-sulina (NIDDM), é a forma mais comum de diabetes, afetando 90% das pes-soas com diabetes. Com o NIDDM, os pacientes possuem defeitos da fun-ção de célula β que resultam na produção insuficiente de insulina e/ou nadiminuição da sensibilidade à insulina. Caso o NIDDM não seja controlado,há um acúmulo de glicose em excesso no sangue, causando hiperglicemia.Com o tempo, podem surgir complicações mais sérias, incluindo disfunçãorenal, problemas cardiovasculares, perda visual, ulceração dos membrosinferiores, neuropatia e isquemia. Os tratamentos para o NIDDM incluem ocontrole da dieta, exercícios e controle do peso, além da utilização de diver-sas medicações orais. Os indivíduos com NIDDM podem inicialmente contro-lar seus níveis sangüíneos de glicose utilizando essas medicações orais.Essas medicações, no entanto, não retardam a perda progressiva da funçãodas células β que ocorre em pacientes com NIDDM e, dessa forma, não sãosuficientes para controlar os níveis sangüíneos de glicose nos estágios maisavançados da doença. Além disso, o tratamento com as medicações dispo-níveis atualmente expõe os pacientes com NIDDM a efeitos colaterais po-tenciais, tais como hipogliçemia, problemas gastrintestinais, retenção de lí-quidos, edema e/ou ganho de peso.

O peptídeo de ativação de adenilato ciclase (PACAP) da hipófisee o peptídeo vasoativo intestinal (VIP) pertencem à mesma família de peptí-deos como secretina e glucagon. PACAP e VIP trabalham por meio de trêsreceptores acoplados à proteína G que exercem sua ação por meio das viasde transdução de sinal mediadas por cAMP e outras vias mediadas por Ca2+.Esses receptores são conhecidos como o receptor do tipo 1 com preferênciade PACAP (PAC1) (Isobe, et ai, fíegul. Pept., 110: 213-217 (2003); Ogi, etal., Biochem. Biophys. Fies. Commun., 196: 1.511-1.521 (1993)) e os doisreceptores do tipo 2 que compartilham VIP (VPAC1 e VPAC2) (Sherwood etai, Endocr. Rev., 21: 619-670 (2000); Hammar et al., Pharmacoi Rev., 50:265-270 (1998); Couvineau, et al., J. BioL Chem., 278: 24.759-24.766(2003); Sreedharan, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 193: 546-553(1993); Lutz1 et al., FEBS Lett., 458: 197-203 (1999); Adamou, et al., Bio-chem. Biophys. Res. Commun., 209: 385-392 (1995)). Uma série de análo-gos de PACAP é revelada em U.S. 6.242.563 e WO 2000/05260.

PACAP possui atividades comparáveis contra todos os três re-ceptores, enquanto VIP ativa seletivamente os dois receptores VPAC (Tsut-sumi et al., Diabetes, 51: 1.453-1.460 (2002)). Foi demonstrado que tantoVIP (Eriksson et ai, Peptides, 10: 481-484 (1989)) quanto PACAP (Filipssonet al., JCEM, 82: 3.093-3.098 (1997)) não apenas estimulam a secreção deinsulina no homem quando administrados por via intravenosa, mas tambémaumentam a secreção de glucagon e o débito hepático de glicose. Em con-seqüência, a estimulação de PACAP ou VIP geralmente não causa um au-mento final da glicemia. A ativação de vários receptores por PACAP ou VIPtambém possui efeitos fisiológicos amplos sobre os sistemas nervoso, endó-crino, cardiovascular, reprodutor, muscular e imunológico (Gozes et al., Curr.Med. Chem., 6: 1.019-1.034 (1999)). Além disso, parece que a diarréia a-quosa induzida por VIP em ratos é mediada por apenas um dos receptoresVPAC, VPAC1 (Ito etal., Peptides, 22: 1.139-1.151 (2001); Tsutsumi et ai,Diabetes, 51: 1.453-1.460 (2002)). Além do mais, os receptores VPAC1 ePAC1 são expressos em células α e hepatócitos e, dessa forma, estão muitoprovavelmente envolvidos nos efeitos sobre débito hepático de glicose.

A exendina-4 é encontrada nas excreções salivares do monstro-de-gila, Heloderma Suspectum (Eng et ai, J.Biol.Chem., 267(11): 7.402-7.405 (1992)). Ela é um peptídeo de 39 aminoácidos, que possui atividadesecretagoga de insulina glicose-dependente. Peptídeos agonistas específi-cos de exendina PEGuiIada e de exendina são descritos em WO2000/66629. Derivados de exendina que possuem pelo menos um aminoá-cido anexado a um substituinte lipofílico são descritos em WO 99/43708.

Estudos recentes demonstraram que peptídeos seletivos para oreceptor VPAC2 são capazes de estimular a secreção de insulina pelo pân-creas, sem efeitos colaterais gastrintestinais (GI) e sem aumento da libera-ção de glucagon e do débito hepático de glicose (Tsutsumi et al., Diabetes,51: 1.453-1.460 (2002)). Os peptídeos seletivos para o receptor VPAC2 fo-ram identificados inicialmente por modificação de VIP e/ou PACAP (vide, porexemplo, Xia etal., J. PharmacoL Exp. Ther., 281: 629-633 (1997); Tsutsumiet al., Diabetes, 51: 1.453-1.460 (2002); WO 01/23420; WO 2004/006839).

Muitos dos agonistas peptídicos do receptor VPAC2 relatadosaté hoje, no entanto, possuem perfis de potência, seletividade e estabilidademenores do que o desejável, o que poderia impedir sua viabilidade clínica.Além do mais, muitos desses peptídeos não são adequados como candida-tos comerciais em conseqüência de questões relacionadas à estabilidadeassociadas aos polipeptídeos na formulação, além de questões associadasà meia-vida curta desses polipeptídeos in vivo. Além disso, foi identificadoque alguns agonistas peptídicos do receptor VPAC2 são inativados por di-peptidil-peptidase (DPP-IV). Uma meia-vida sérica curta poderia impedir ouso desses agonistas como agentes terapêuticos. Há, portanto, necessidadede novas terapias que superem os problemas associados às medicaçõesatuais para o NIDDM.

A presente invenção busca fornecer compostos aperfeiçoadosque são seletivos para o receptor VPAC2 e que induzem a secreção de insu-lina pelo pâncreas, somente na presença de níveis sangüíneos elevados deglicose. Os compostos da presente invenção são peptídeos, que suposta-mente também aumentam a função de células beta. Esses peptídeos podemter o efeito fisiológico de induzir a secreção de insulina sem efeitos colateraisGl ou um aumento correspondente do débito hepático de glicose, e tambémgeralmente possuem seletividade potência e/ou estabilidade in vivo aumen-tada do peptídeo, comparados com agonistas peptídicos conhecidos do re-ceptor VPAC2.De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecidoum agonista peptídico do receptor VPAC2 que compreende uma seqüênciada fórmula:

Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Thr-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa3i -Xaa32Fórmula 1 (ID. DE SEQ. N9: 1)em que:

Xaai é: His1 dH ou está ausente;Xaa2 é: dA, Ser, Vai, Gly, Thr, Leu, dS, Pro ou Aib;Xaa3 é: Asp ou Glu;Xaa4 é: Ala, lie, Tyr, Phe, Vai, Thr, Leu, Trp, Gly, dA, Aib ouNMeA;

Xaa5 é: Vai, Leu, Phe, lie, Thr, Trp, Tyr, dV, Aib ou NMèV;Xaa6 é: Phe, lie, Leu, Thr, Vai, Trp ou Tyr;Xaa8 é: Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg ou Tyr;Xaa9 é: Asn, Gln, Glu, Ser, Cys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa10 é: Tyr, Trp ou Tyr(OMe);Xaa12 é: Arg, Lys, hR, Orn, Aib, Ala, Leu, Gln, Phe ou Cys;Xaa13 é: Leu, Phe, Glu, Ala, Aib, Ser, Cys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa14 é: Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Phe, Gln, Aib ou Cit;Xaa15 é: Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, Orn, Phe, Gln, Aib, K(Ac), Cys,K(W) ou K(CO(CH2)2SH);Xaa16 é: Gln, Lys, Ala, Ser, Cys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa17 é: Vai, Ala, Leu, lie, Met, Nle, Lys, Aib, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH)OuK(W);Xaa18 é: Ala, Ser, Cys ou Abu;Xaa19 é: Ala, Leu, Gly, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH) ou Abu;Xaa20 é: Lys, Gln, hR, Arg, Ser, Orn, Ala, Aib, Trp, Thr, Leu, lie,Phe, Tyr, Vai, K(Ac), Cys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa21 é: Lys, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac), Ser,Cys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou hC;Xaa2Z é: Tyr1 Trp, Phe, Thrj Leu, lie, Vai, Tyr(OMe)1 Ala, Aib ouSer;

Xaa23 é: Leu, Phe, lie, Ala, Trp, Thr, Vai, Aib ou Ser;Xaa24 é: Gln, Asn, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa25 é: Ser, Asp, Phe, lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Gln, Asn, Tyr, Aib,Glu, Cys, K(CO(CH2)2SH) ou hC;

Xaa26 é: lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Tyr, Phe, Aib, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH)OuK(W);

Xaa27 é: Lys, hR, Arg, Gln, Orn ou dK;

Xaa28 é: Asn, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Pro, dK, Cys,K(CO(CH2)2SH) ou K(W);

Xaa29 é: Lys, Ser, Arg, Asn, hR, Cys, Orn ou está ausente;

Xaa3O é: Arg, Lys, lie, hR ou está ausente;

Xaa3I é: Tyr, His, Phe, Gln ou está ausente; e

Xaa32 é: Cys ou está ausente;

desde que, se Xaa29, Xaa3o, Xaa3I ou Xaa32 estiver ausente, oaminoácido seguinte presente a jusante seja o aminoácido seguinte na se-qüência do agonista peptídico;

e uma extensão no terminal C que compreende a seqüência deaminoácido:

GGPSSGAPPPK(E-C16) (ID. DE SEQ. Ns: 8)em que o aminoácido do terminal C pode ser amidado.

De preferência, o agonista peptídico do receptor VPAC2 com-preende uma seqüência da fórmula:

His-Ser-Xaa3-Ala-Val-Phe-Thr-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Xaai2-Xaa13- Xaau-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa2O-Xaa21-Xaa22- Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa3rXaa32

Fórmula 2 (ID. DE SEQ. Ns: 2)em que:

Xaa3 é: Asp ou Glu;

Xaa8 é: Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg ou Tyr;

Xaa9 é: Asn, Gln, Glu, Ser, Cys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa10 é: Tyr, Trp ou Tyr(OMe);

Xaai2 é: Arg, Lys, hR, Orn1 Aib1 Ala1 Leu1 Gln1 Phe ou Cys;

Xaa13 é: Leu, Phe1 Glu, Ala, Aib, Ser, Cys ou K(CO(CH2)2SH);

Xaa14 é: Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Phe, Gln, Aib ou Cit;

Xaa15 é: Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, Orn1 Phe, Gln, Aib, K(Ac), Cys,K(W)OuK(CO(CH2)2SH);

Xaa16 é: Gln, Lys, Ala, Ser, Cys ou K(CO(CH2)2SH);

Xaa17 é: Vai, Ala, Leu, lie, Met, Nle, Lys, Aib, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH)OuK(W);

Xaa18 é: Ala, Ser, Cys ou Abu;

Xaa19 é: Ala, Leu, Gly, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH) ou Abu;

Xaa20 é: Lys, Gln, hR, Arg, Ser, Orn, Ala, Aib, Trp, Thr, Leu, lie,Phe, Tyr, Vai, K(Ae), Cys ou K(CO(CH2)2SH);

Xaa21 é: Lys, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac), Ser,Cys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou hC;

Xaa22 é: Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, lie, Vai, Tyr(OMe), Ala, Aib ouSer;

Xaa23 é: Leu, Phe, lie, Ala, Trp, Thr, Vai, Aib ou Ser;

Xaa24 é: Gln, Asn, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH) ou K(W);

Xaa25 é: Ser, Asp, Phe, lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Gln, Asn, Tyr, Aib,Glu, Cys, K(CO(CH2)2SH) ou hC;

Xaa26 é: lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Tyr, Phe, Aib, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH)OuK(W);

Xaa27 é: Lys, hR, Arg, Gln, Orn ou dK;

Xaa28 é: Asn, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Pro1 dK, Cys,K(CO(CH2)2SH)OuK(W);

Xaa29 é: Lys, Ser, Arg, Asn, hR, Cys, Orn ou está ausente;

Xaa30 é: Arg, Lys, lie, hR ou está ausente;

Xaa31 é: Tyr, His, Phe, Gln ou está ausente; e

Xaa32 é: Cys ou está ausente;

desde que, se Xaa29, Xaa30, Xaa31 ou Xaa32 estiver ausente, oaminoácido seguinte presente a jusante seja o aminoácido seguinte na se-qüência do agonista peptídico;

e uma extensão no terminal C que compreende a seqüência deaminoácido:

GGPSSGAPPPK(E-C16) (ID. DE SEQ. N°: 8)

em que o aminoácido do terminal C pode ser amidado.

De preferência, o agonista peptídico do receptor VPAC2 da pre-sente invenção compreende uma seqüência de Fórmula 1 (ID. DE SEQ. N°:

1) ou Fórmula 2 (ID. DE SEQ. Ne: 2), em que Xaa3 é Asp ou Glu1 Xaa8 é Aspou Glu, Xaa9 é Asn ou Gln, Xaa10 é Tyr ou Tyr(OMe)1 Xaai2 é Arg, hR, Lysou Orn, Xaai4 é Arg, Gln, Aib, hR, Orn, Cit, Lys, Ala ou Leu, Xaai5 é Lys1 Aib,Orn ou Arg, Xaai6 é Gln ou Lys, Xaai7 é Vai, Leu, Ala, lie, Lys ou Nle, Xaai9é Ala ou Abu, Xaa20 é Lys, Vai, Leu, Aib, Ala, Gln ou Arg, Xaa2I é Lys, Aib,Orn, Ala, Gln ou Arg, Xaa23 é Leu ou Aib, Xaa25 é Ser ou Aib, Xaa27 é Lys,Orn, hR ou Arg, Xaa28 é Asn, Gln, Lys, hR, Aib, Orn ou Pro, e/ou Xaa29 éLys, Orn, hR ou está ausente.

1) ou Fórmula 2 (ID. DE SEQ. N9: 2), em que Xaa8 é Glu, Xaa9 é Gln e Xaa10é Tyr(OMe).

1) ou Fórmula 2 (ID. DE SEQ. Ns: 2), em que um de Xaa14 ou Xaa15 é Aib.e Tyr(OMe).

1) ou Fórmula 2 (ID. DE SEQ. Ne: 2), em que um de Xaa20 ou Xaa21 é Aib.

Mais preferivelmente, o agonista peptídico do receptor VPAC2da presente invenção compreende uma seqüência de Fórmula 1 (ID. DESEQ. Ns: 1) ou Fórmula 2 (ID. DE SEQ. N0: 2), em que Xaa15 é Aib e/ou Xa-a20éAib.

1) ou Fórmula 2 (ID. DE SEQ. Ns: 2), em que Xaa12, Xaa21, Xaa27 e Xaa28são todos Orn.

De preferência, o agonista peptídico do receptor VPAC2 da pre-sente invenção compreende uma seqüência de Fórmula 1 (ID. DE SEQ. Ns:1) ou Fórmula 2 (ID. DE SEQ. Ne: 2), em que Xaa19 é Abu.

De preferência, o agonista peptídico do receptor VPAC2 da pre-sente invenção compreende uma seqüência de Fórmula 1 (ID. DE SEQ. Ns;1) ou Fórmula 2 (ID. DE SEQ. Ne: 2), em que Xaa23 é Aib.

De preferência, o agonista peptídico do receptor VPAC2 da pre-sente invenção compreende uma seqüência de Fórmula 1 (ID. DE SEQ. Ns:1) ou Fórmula-2 (ID. DE SEQ. Ns: 2), em que Xaa25 é Aib.

De preferência, o agonista peptídico do receptor VPAC2 da pre-sente invenção compreende uma seqüência de Fórmula 1 (ID. DE SEQ. Ns:1) ou Fórmula 2 (ID. DE SEQ. N9: 2), em que Xaa30, Xaa31 e Xaa32 estão au-sentes. Ainda mais preferivelmente, Xaa29, Xaa30, Xaa31 e Xaa32 estão todosausentes.

De preferência, o agonista peptídico do receptor VPAC2 da pre-sente invenção é PEGuilado.

Uma molécula de PEG pode ser anexada de forma covalente aquaisquer resíduos Lys1 Cys, K(W) ou K(CO(CH2)2SH), em qualquer posiçãono agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com o primeiro aspectoda presente invenção.

Qualquer resíduo Lys no agonista peptídico do receptor VPAC2pode substituir um K(W) ou um K(CO(CH2)2SH), que pode ser PEGuilado,Além do mais, qualquer resíduo Cys no agonista peptídico pode substituirum resíduo de cisteína modificado, por exemplo, hC. O resíduo Cys modifi-cado pode ser anexado de forma covalente a uma molécula de PEG.

Quando houver mais de uma molécula de PEG, poderá haveruma combinação de PEGuilação de Lys, Cys, K(CO(CH2)2SH) e K(W). Porexemplo, caso haja duas moléculas de PEG, uma poderá estar anexada aum resíduo Lys e uma poderá estar anexada a um resíduo Cys.

De preferência, a molécula de PEG é ramificada. Alternativa-mente, a molécula de PEG pode ser linear.De preferência, a molécula de PEG possui peso molecular entre1.000 dáltons e 100.000 dáltons. Mais preferivelmente a molécula de PEG éselecionada de 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000 e 60.000 dáltons.Ainda mais preferivelmente, ela é selecionada de 20.000, 30.000, 40.000 ou60.000 dáltons. Quando houver duas moléculas de PEG anexadas de formacovalente ao agonista peptídico da presente invenção, cada uma terá 1.000a 40.000 dáltons e, de preferência, elas possuirão pesos moleculares de20.000 e 20.000 dáltons, 10.000 e 30.000 dáltons, 30.000 e 30.000 dáltons,ou 20.000 e 40.000 dáltons.

De preferência, o agonista peptídico do receptor VPAC2 dá pre-sente invenção é cíclico.

O agonista peptídico do receptor VPAC2 pode ser ciclizado pormeio de uma ponte de lactama. Prefere-se que a ponte de Iactama seja for-mada pela adesão covalente da cadeia lateral do resíduo em Xaan à cadeialateral do resíduo em Xaan+4, em que η é 1 a 28. De preferência, η é 12, 20ou 21. Mais preferivelmente, η é 21. Prefere-se também que a ponte de lac-tama seja formada pela adesão covalente da cadeia lateral de um resíduoLys ou Orn à cadeia lateral de um resíduo Asp oü Glu. Um resíduo Lys ouOrn pode substituir um resíduo Dab, cuja cadeia lateral pode ser anexada deforma covalente à cadeia lateral de um resíduo Asp ou Glu.

O agonista peptídico do receptor VPAC2 pode, alternativamente,ser ciclizado por meio de uma ponte bissulfeto. Prefere-se que a ponte bis-sulfeto seja formada pela adesão covalente da cadeia lateral do resíduo emXaan à cadeia lateral do resíduo em Xaan+4, em que η é 1 a 28. De preferên-cia, η é 12, 20 ou 21. Mais preferivelmente, η é 21. Prefere-se também que aponte bissulfeto seja formada pela adesão covalente da cadeia lateral de umresíduo Cys ou hC à cadeia lateral de outro resíduo Cys ou hC.

Alternativamente, a ponte de lactama ou a ponte bissulfeto podeser formada pela adesão covalente da cadeia lateral do resíduo em Xaan àcadeia lateral do resíduo em Xaan+3, em que η é 1 a 28. A ponte de lactamaou a ponte bissulfeto também pode ser formada pela adesão covalente dacadeia lateral do resíduo em Xaai à cadeia lateral do resíduo em Xaai+7 ouXaai+8, em que i é 1 a 24.

A seqüência do agonista peptídico do receptor VPAC2 pode ain-da compreender um resíduo de histidina no terminal N do peptídeo, antes deXaai.

De preferência, o agonista peptídico do receptor VPAC2 de a -cordo com o primeiro aspecto da presente invenção ainda compreende umamodificação do terminal N no terminal N do agonista peptídico, em que amodificação do terminal N é selecionada de:

a) adição de D-histidina, isoleucina, metionina ou norleucina;

b) adição de um peptídeo que compreende a seqüência Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg (ID. DE SEQ. Ne: 6), em que a Arg está ligadaao terminal N do agonista peptídico;

c) adição de C1-C16 alquila opcionalmente substituído com um oumais substituintes selecionados independentemente de arila, Ci-Ce alcóxi, -NH2, -OH, halogênio e -CF3;

d) adição de -C(O)R1, em que R1 é uma CrCi6 alquila opcional-mente substituída com um ou mais substituintes selecionados independen-temente de arila, CrC6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio, -SH e -CF3; uma arilaopcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados inde-pendentemente de Ci-C 6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, CrC6 al-cóxi, -NH2, -OH, halogênio e -CF3; uma arila CrC4 alquila opcionalmentesubstituída com um ou mais substituintes selecionados independentementede Ci-C 6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, Ci-C6 alcóxi, -NH2, -OH,halogênio e -CF3; -NR2R3, em que R2 e R3 são independentemente hidrogê-nio, CrC6 alquila, arila ou arila CrC4 alquila; -OR4, em que R4 é Ci-Ci6 alqui-la opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionadosindependentemente de arila, CrC6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio e -CF3, arilaopcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados inde-pendentemente de CrC 6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, CrC6 al-cóxi, -NH2, -OH, halogênio e -CF3, arila CrC4 alquila opcionalmente substitu-ída com um ou mais substituintes selecionados independentemente de CrC6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, CrC6 alcóxi, -NH2, -OH, halogê-nio e -CF3; ou 5-pirrolidin-2-ona;

e) adição de -SO2R5, em que R5 é arila, arila CrC4 alquila ou C1-C16 alquila;

f) formação de um grupo succinimida opcionalmente substituídocom C1-C6 alquila ou -SR6, em que R6 é hidrogênio ou C1-C6 alquila;

g) adição de sulfóxido de metionina;

h) adição de ácido biotinila-6-aminoexanóico (ácido 6-aminocapróico); e

i) adição de-C(=NH)-NH2.

De preferência, a modificação do terminal N é a adição de umgrupo selecionado de: acetila, propionil, butiril, pentanoil, hexanoil, metioni-na, sulfóxido de metionina, 3-fenilpropionil, fenilacetila, benzoil, norleucina,D-histidina, isoleucina, 3-mercaptopropionil, ácido biotinila-6-aminoexanóico(ácido 6-aminocapróico) e -C(=NH)-NH2. Prefere-se especialmente que amodificação do terminal N seja a adição de acetila ou hexanoila.

Será observado por aqueles versados na técnica que agonistaspeptídicos do receptor VPAC2 que compreendem várias combinações deseqüência de peptídeos de acordo com a Formula i ou Fórmula 2 e modifi-cações do terminal N, como aqui descritas, podem ser feitos com base dadescrição acima.

Prefere-se que o agonista peptídico do receptor VPAC2 de acor-do com o primeiro aspecto da presente invenção compreenda a seqüênciade aminoácidos:

Agonista Ne ID. DE SEQ. Ns SeqüênciaP603 7 C6-HSDAVFTEQY(OMc)TornLRAibQLAAbu- AibOrn YAibQAibIOrnOrnGG PSSGAPPPK(E- C16)-NH2

De acordo com o segundo aspecto da presente invenção, é for-necida uma composição farmacêutica que compreende um agonista peptídi-co cíclico do receptor VPAC2 para a presente invenção e um ou mais diluen-tes, veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, é for-necido um agonista peptídico do receptor VPAC2 da presente invenção parauso como um medicamento.

De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, é for-necido um agonista peptídico do receptor VPAC2 da presente invenção parauso no tratamento de diabetes não dependente de insulina ou diabetes de-pendente de insulina ou para uso na supressão da ingestão de alimentos.

De acordo com um quinto aspecto da presente invenção, é for-necido o uso de um agonista peptídico do receptor VPAC2 da presente in-venção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de diabetesnão dependente' de insulina ou diabetes dependente de insulina ou para asupressão da ingestão de alimentos.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, éfornecido um método de tratamento de diabetes não dependente de insglinaou diabetes dependente de insulina ou de supressão da ingestão de alimen-tos em um paciente que dele necessite que compreende a administração deuma quantidade eficaz de um agonista peptídico do receptor VPAC2 da pre-sente invenção.

De acordo com um outro aspecto adicional da presente inven-ção, é fornecida uma composição farmacêutica que contém um agonistapeptídico do receptor VPAC2 da presente invenção para o tratamento dediabetes não dependente de insulina ou diabetes dependente de insulina oupara a supressão da ingestão de alimentos.

Os agonistas peptídicos do receptor VPAC2 da presente inven-ção possuem a vantagem de possuírem seletividade, potência e/ou estabili-dade aumentada em relação aos agonistas peptídicos conhecidos do recep-tor VPAC2. In vivo, o grupo ácido palmítico no terminal C pode se ligar à al-bumina sérica evitando, dessa forma, a filtração renal e prolongando a açãobiológica do agonista peptídico do receptor VPAC2.

Os agonistas peptídicos do receptor VPAC2 da presente inven-ção podem ser PEGuilados.

A adesão covalente de uma ou mais moléculas de PEG a resí-duos específicos de um agonista peptídico do receptor VPAC2 resulta emum agonista peptídico PEGuiIado do receptor VPAC2 biologicamente ativocom uma meia-vida prolongada e uma depuração (clearance) reduzida,quando comparado com as de agonistas peptídicos não-PEGuilados do re-ceptor VPAC2.

Os agonistas peptídicos do receptor VPAC2 da presente inven-ção podem ser cíclicos.

Os agonistas peptídicos cíclicos do receptor VPAC2 possuemmobilidade conformacional restrita, comparados com os agonistas peptídicosdo receptor VPAC2 lineares de tamanho pequeno/médio e, por essa razão,os peptídeos cíclicos possuem um número menor de conformações permiti-das, comparados com peptídeos lineares. A restrição da flexibilidade con-formacional de peptídeos lineares por ciclização aumenta a afinidade de li-gação ao receptor, aumenta a seletividade e melhora a estabilidade proteolí-tica e a biodisponibilidade, comparados com peptídeos lineares.

O termo "VPAC2" é usado para se referir ao receptor específico(Lutz, et ai, FEBS Lett., 458: 197-203 (1999); Adamou, et ai, Biochem. Bio-phys. Res. Commun., 209: 385-392 (1995)) que os agonistas da presenteinvenção ativam. Esse termo também é usado para se referir aos agonistasda presente invenção.

Um "agonista peptídico seletivo do receptor VPAC2" ou um "a-gonista peptídico do receptor VPAC2" da presente invenção é um peptídeoque ativa seletivamente o receptor VPAC2 para induzir a secreção de insuli-na. De preferência, a seqüência para um agonista peptídico seletivo do re-ceptor VPAC2 da presente invenção possui de vinte e oito a trinta e dois a-minoácidos de ocorrência natural e/ou de ocorrência não-natural, e adicio-nalmente compreende uma extensão no terminal C que compreende a se-qüência de aminoácido: GGPSSGAPPPK (E-Ci6).

Um "agonista peptídico PEGuiIado seletivo do receptor VPAC2"ou "agonista peptídico PEGuiIado do receptor VPAC2" é um agonista peptí-dico seletivo do receptor VPAC2 anexado de forma covalente a uma ou maismoléculas de polietileno glicol (PEG) ou um derivado deste, em que cadaPEG é anexado a um aminoácido cisteína ou Iisina ou a um resíduo K(W) ouK(CO(CH2)2SH).

Um "agonista peptídico cíclico seletivo do receptor VPAC2" ouum "agonista peptídico cíclico do receptor VPAC2" é um agonista peptídicoseletivo do receptor VPAC2 ciclizado por meio de uma ligação covalente queune as cadeias laterais de dois aminoácidos na cadeia peptídica. A ligaçãocovalente pode ser, por exemplo, uma ponte de Iactama ou uma ponte bis-sulfeto.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 da presen-te invenção possuem uma extensão no terminal C. A "extensão no terminalC" da presente invenção compreende a seqüência GGPSSGAPPPK (E-C16)e está ligada ao terminal C da seqüência peptídica de Fórmula 1 (ID. DESEQ. Ns: 1) ou de Fórmula 2 (ID. DE SEQ. Ne: 2) no terminal N da extensãono terminal C por meio de uma ligação peptídica. A seqüência GGPSS-GAPPPK(E-C16) é uma variante da seqüência do terminal C de Exendina-4.Ò resíduo de Iisina do terminal C possui um resíduo de ácido glutâmico, queé acetilado no grupo alfa-amino com ácido palmítico, anexado a sua cadeialateral.

Como aqui usado, o termo "ligado a", com relação ao termo "ex-tensão no terminal C", inclui a adição ou adesão de aminoácidos ou gruposquímicos diretamente ao terminal C da seqüência peptídica de Fórmula 1 oude Fórmula 2.

Opcionalmente, o agonista peptídico seletivo do receptor VPAC2também pode ter uma modificação do terminal Ν. O termo "modificação doterminal N", como aqui usado, inclui a adição ou adesão de aminoácidos ougrupos químicos diretamente ao terminal N de um peptídeo, e a formação degrupos químicos, os quais incorporam o nitrogênio no terminal N de um pep-tídeo.

A modificação do terminal N pode compreender a adição de umou mais aminoácidos de ocorrência natural ou de ocorrência não-natural àseqüência do agonista peptídico do receptor VPAC2; de preferência, não hámais de dez aminoácidos, preferindo-se um aminoácido. Aminoácidos deocorrência natural que podem ser adicionados ao terminal N incluem metio-nina e isoleucina. Um aminoácido modificado adicionado ao terminal N podeser D-histidina. Alternativamente, os seguintes aminoácidos podem ser adi-cionados ao terminal N: ID. DE SEQ. N9: 6 Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg1 em que a Arg está ligada ao terminal N do agonista peptídico. Depreferência, quaisquer aminoácidos adicionados ao terminal N estão ligadosao terminal N por uma ligação peptídica.

O termo "ligado a", como aqui usado, com relação ao termo mo-dificação do terminal N, inclui a adição ou adesão de aminoácidos ou gruposquímicos diretamente ao terminal N do agonista do receptor VPAC2. A adi-ção das modificações do terminal N acima pode ser feita sob condições deacoplamento normais para a formação da ligação peptídica.

O terminal N do agonista peptídico também pode ser modificadopela adição de um grupo alquila (R), de preferência um grupo CrCi6 alquila,para formar (R)NH-.

Alternativamente, o terminal N do agonista peptídico pode sermodificado pela adição de um grupo da fórmula -C(O)R1 para formar umaamida da fórmula R1C(O)NH-. A adição de um grupo da fórmula -C(O)R1 po-de ser obtida por reação com um ácido orgânico da fórmula R1COOH. Amodificação do terminal N de uma seqüência de aminoácidos com o uso deacilação é demonstrada na técnica (por exemplo, Gozes et ai, J. PharmacolExp Ther, 273: 161-167 (1995)). A adição de um grupo da fórmula -C(O)R1pode resultar na formação de um grupo uréia (vide WO 01/23240, WO2004/006839) ou um grupo carbamato no terminal N. Além disso, o terminalN pode ser modificado pela adição de ácido piroglutâmico ou ácido 6-aminoexanóico.

O terminal N do agonista peptídico pode ser modificado pela a-dição de um grupo da fórmula -SO2R5, para formar um grupo sulfonamida noterminal N.

O terminal N do agonista peptídico também pode ser modificadopor reação com anidrido succínico para formar um grupo succinimida noterminal Ν. O grupo succinimida incorpora o nitrogênio no terminal N do pep-tídeo.O terminal N pode alternativamente ser modificado pela adiçãode sulfóxido de metionina, ácido biotinila-6-aminoexanóico ou -C(=NH)-NH2.A adição de -C(=NH)-NH2 é uma modificação de guanidação, em que o ter-minal NH2 do terminal N aminoácido se torna -NH-C(=NH)-NH2.

A maioria das seqüências da presente invenção, incluindo asmodificações do terminal N e as extensões do terminal C, contém os códigospadronizados de uma letra ou de três letras para os vinte aminoácidos deocorrência natural. Os outros códigos usados são definidos da seguinte for-ma:

Ac = acetiia

C6 = hexanoila

d = a isoforma D (de ocorrência não-natural) do respectivo ami-noácido, por exemplo, dA = D-alanina, dS = D-serina, dK = D-IisinahR = homoarginina = posição não-ocupadaAib = ácido amino isobutíricoCH2 = ImetiIenoOMe = metóxiNle = Nor-Ieucina

NMe = N-metila anexado ao grupo alfa-amino de um aminoáci-do, por exemplo, NMeA = N-metila alanina, NMeV = N-metila valinaOrn = ornitina

K(CO(CH2)2SH) = e-(3'-mercaptopropionil)-lisinaK(W) = e-(L-triptofil)-lisina

Abu = ácido α-amino-n-butírico ou ácido 2-aminobutanóicoCit = citrulina

Dab = ácido diaminobutírico

K(Ac) = ε-acetila lisina

PEG = polietileno glicol

PEG40K = molécula de PEG de 40.000 Dáltons

PEG30K = molécula de PEG de 30.000 Dáltons

PEG20K = molécula de PEG de 20.000 DáltonsK (E-C16) = (e-(Y-L-glutamil(N-α-palmitoil))-lisina = uma ponte de Iactama ou uma ponte bissulfeto

VIP ocorre naturalmente como uma seqüência única que possui28 aminoácidos. No entanto, PACAP existe como um peptídeo de 38 amino-ácidos (PACAP-38) ou como um peptídeo de 27 aminoácidos (PACAP-27)com uma carboxila amidada (Miyata, et al., Biochem. Biophys. Res. Com-mun., 170: 643-648 (1990)). As seqüências para VIP, PACAP-27 e PACAP-38 são as seguintes:

<table>table see original document page 18</column></row><table>

O termo "aminoácido de ocorrência natural", como aqui usado,significa os vinte aminoácidos codificados pelo código genético humano (istoé, os vinte aminoácidos padronizados). Esses vinte aminoácidos são: alani-na, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmi-co, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, proli-na, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.

Exemplos de "aminoácidos de ocorrência não-natural" incluemtanto aminoácidos sintéticos quanto aqueles modificados pelo corpo. Essesincluem D-aminoácidos, aminoácidos do tipo arginina (por exemplo, homo-arginina), e outros aminoácidos que possuem um metileno extra na cadeialateral ("homo" aminoácidos), e aminoácidos modificados (por exemplo, nor-leucina, lisina (isopropila) - em que a amina da cadeia lateral de lisina é mo-dificada por um grupo isopropila). Também estão incluídos aminoácidos co-mo, por exemplo, ornitina, ácido amino isobutírico e ácido aminobutanóico.

"Seletivo", como aqui usado, refere-se a um agonista peptídicodo receptor VPAC2 com seletividade aumentada pelo receptor VPAC2 com-parada com outros receptores conhecidos. O grau de seletividade é determi-nado por uma proporção de afinidade de ligação ao receptor VPAC2 em re-lação à afinidade de ligação ao receptor VPAC1, e por uma proporção daafinidade de ligação ao receptor VPAC2 em relação à afinidade de ligaçãoao receptor PAC1. A afinidade de ligação é determinada como descrito abai-xo no Exemplo 4.

"Atividade insulinotrópica" refere-se à habilidade para estimular asecreção de insulina em resposta aos níveis de glicose elevados causando,dessa forma, a captação de glicose por células e redução dos níveis plasmá-ticos de glicose. A atividade insulinotrópica pode ser avaliada por métodosconhecidos na técnica, incluindo a utilização de experimentos que medem aatividade de ligação ao receptor VPAC2 ou a ativação do receptor (por e-xemplo, secreção de insulina por linhagens de células de insulinoma ou ilho-tas, teste de tolerância à glicose intravenosa (IVGTT), teste de tolerância àglicose intraperitoneal (IPGTT) e teste de tolerância à glicose oral (OGTT)).A atividade insulinotrópica é medida rotineiramente em seres humanos me-dindo-se os níveis de insulina ou os níveis de C-peptídeo. Agonistas peptídi-cos seletivos do receptor VPAC2 da presente invenção possuem atividadeinsulinotrópica.

O termo "potência in vitro" , como aqui usado, é a medida da ha-bilidade de um peptídeo para ativar o receptor VPAC2 em um ensaio basea-do em células. A potência in vitro é expressa como a "EC50", que é a concen-tração eficaz de composto que produz 50% do aumento máximo da atividadeem um único experimento dose-resposta. Para as finalidades da presenteinvenção, a potência in vitro é determinada com o uso de dois ensaios dife-rentes: DiscoveRx e Alpha Screen. Vide os Exemplos 3 e 5 para mais deta-lhes sobre esses ensaios. Embora esses ensaios sejam realizados de for-mas diferentes, os resultados demonstram uma correlação geral entre osdois ensaios.

O termo "meia-vida plasmática" refere-se ao tempo pelo qualmetade das moléculas relevantes circulam no plasma antes de serem depu-radas. Um termo usado alternativamente é "meia-vida de eliminação". Otermo "prolongada" ou "mais longa", usado no contexto da meia-vida plas-mática ou da meia-vida de eliminação, indica que há um aumento estatisti-camente significativo da meia-vida de um agonista peptídico PEGuiIado doreceptor VPAC2 em relação àquela da molécula de referência (por exemplo,a forma não-PEGuilada do peptídeo ou o peptídeo nativo), determinadas sobcondições comparáveis. A meia-vida aqui relatada é a meia-vida de elimina-ção; é a que corresponde à taxa de eliminação terminal log-linear. Aquelesversados na técnica percebem que a meia-vida é um parâmetro derivadoque se altera em função tanto da depuração quanto do volume de distribui-ção.

A depuração é a medida da capacidade do corpo para eliminarum fármaco. À medida que a depuração diminui em função, por exemplo', demodificações a um fármaco, a meia-vida supostamente aumentaria. No en-tanto, esse relacionamento recíproco só é exato quando não há alteração novolume de distribuição. Um relacionamento aproximado útil entre a meia-vidaterminal log-linear (t ^), a depuração (C) e o volume de distribuição (V) édado pela equação: t % = 0,693 (V/C). A depuração não indica a quantidadedo fármaco que está sendo removida, mas, em vez disso, indica o volume defluido biológico, por exemplo, sangue ou plasma, que teria que ser comple-tamente depurado de fármaco para que a eliminação ocorresse. A depura-ção é expressa como um volume por unidade de tempo.

O termo "percentual de (%) identidade de seqüência", como aquiusado, representa seqüências que, quando alinhadas, possuem aminoáci-dos similares (idênticos ou substituídos conservadoramente) em posições ouregiões similares, em que aminoácidos idênticos ou substituídos conserva-doramente são aqueles que não alteram a atividade ou a função da proteína,quando comparados com a proteína de partida. Por exemplo, duas seqüên-cias de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade entre elas possuempelo menos 85% de resíduos similares (idênticos ou substituídos conserva-doramente) em uma posição similar, quando alinhadas otimamente, permi-tindo até 3 lacunas, desde que, em relação às lacunas, seja afetado um totalde, no máximo, 15 resíduos de aminoácidos.

O peptídeo de referência aqui usado para os cálculos de percen-tagem de identidade de seqüência é:<table>table see original document page 21</column></row><table>

O percentual de identidade de seqüência pode ser calculado de-terminando-se o número de resíduos que diferem entre um peptídeo englo-bado pela presente invenção e um peptídeo de referência como, por exem-plo, P603 (ID. DE SEQ. Ne: 7), tomando-se esse número e dividindo-o pelonúmero de aminoácidos no peptídeo de referência (por exemplo, 39 aminoá-cidos para P603), multiplicando-se o resultado por 100, e subtraindo-se essenúmero resultante de 100. Por exemplo, uma seqüência que possui 39 ami-noácidos com quatro aminoácidos que são diferentes de P603 teria um per-centual (%) de identidade de seqüência de 90% (por exemplo, 100 - ((4 / 39)χ 100)). Para uma seqüência que é mais longa do que 39 aminoácidos, onúmero de resíduos que diferem da seqüência de P603 incluirá os aminoá-cidos adicionais sobre 39 para fins do cálculo mencionado anteriormente.Por exemplo, uma seqüência que possui 40 aminoácidos, com quatro ami-noácidos diferentes dos 39 aminoácidos na seqüência de P603 e com umaminoácido adicional no terminal carbóxi que não está presente na seqüên-cia de P603, teria um total de cinco aminoácidos que diferem de P603. Des-sa forma, essa seqüência teria um percentual (%) de identidade de seqüên-cia de 87% (por exemplo, 100 - ((5 / 39) χ 100)). O grau de identidade deseqüência pode ser determinado com a utilização de métodos bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Wilbur, W.J. e Lipman, D.J., Proc.NatL Acad. Sei. USA 80: 726-730 (1983) e Myers E. e Miller W., ComputAppi Biosci. 4: 11-17 (1988)). Um programa que pode ser usado na deter-minação do grau de similaridade é o método de um par MegAIign Lipman-Pearson (com o uso de parâmetros-padrão), que pode ser obtido de DNAs-tar Inc, 1128, Selfpark Street, Madison, Wisconsin, 53715, EUA, como partedo sistema "Lasergene". Outro programa que pode ser usado é "Clustal W",que é um pacote de alinhamento de múltiplas seqüências desenvolvido porThompson et aí. (Nucleic Acids Research, 22(22): 4.673-4.680(1994)) paraseqüências de DNA ou proteínas. Essa ferramenta é útil para a realizaçãode comparações entre espécies de seqüências relacionadas e para a visua-lização de conservação de seqüência. "Clustal W" é um programa de ali-nhamento de múltiplas seqüências de DNA ou proteínas de uso geral. Eleproduz alinhamentos de múltiplas seqüências biologicamente significativasde seqüências divergentes. Ele calcula a melhor combinação para as se-qüências selecionadas, e as alinha a fim de que possam ser observadas asidentidades, similaridades e diferenças. Os relacionamentos evolutivos po-dem ser observados por meio da visualização de cladogramas ou filogra-mas.

A seqüência para um agonista peptídico seletivo do receptorVPAC2 da presente invenção é seletiva para o receptor VPAC2 e, de prefe-rência, possui uma identidade de seqüência na faixa de 60% a 70%, 60% a65%, 65% a 70%, 70% a 80%, 70% a 75%, 75% a 80%, 80% a 90%, 80% a85%, 85% a 90%, 90% a 97%, 90% a 95% ou 95% a 97%, com P603 (ID.DE SEQ. Ns: 7). De preferência, a seqüência possui uma identidade de se-qüência acima de 82% com P603 (ID. DE SEQ. Ns: 7). Mais preferivelmente,a seqüência possui mais de 90% de identidade de seqüência com P603 (ID.DE SEQ. N2: 7). Ainda mais preferivelmente, a seqüência possui mais de92% de identidade de seqüência com P603 (ID. DE SEQ. Ne: 7). Ainda maispreferivelmente, a seqüência possui mais de 95% de identidade de seqüên-cia ou 97% de identidade de seqüência com P603 (ID. DE SEQ. N9: 7).

O termo "CrCi6 alquila", como aqui usado, significa um radicalhidrocarboneto monovalente saturado, de cadeia linear, ramificada ou cícli-ca, que possui de 1 a 16 átomos de carbono ou, quando cíclico, que possuide 3 a 16 átomos de carbono. Dessa forma, o termo "C1-C16 alquila" inclui,por exemplo, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila,terc-butila, n-heptila, n-octila, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e ciclohexi-la. O grupo CrCi6 alquila pode ser opcionalmente substituído com um oumais substituintes que incluem, por exemplo, arila, Cr C6 alcóxi, -OH, halo-gênio, -CF3 e -SH.

O termo nC1- C6 alquila", como aqui usado, significa um radicalhidrocarboneto monovalente saturado, de cadeia linear, ramificada ou cícli-ca, que possui de 1 a 6 átomos de carbono ou, quando cíclico, que possuide 3 a 6 átomos de carbono. Dessa forma, o termo "Ci-C6alquila" inclui, porexemplo, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e ciclohexila. O grupo CrC6 alquilãpode ser opcionalmente substituído com um ou mais substituintes.

O termo "C2-C6 alquenila", como aqui usado, significa um radicalhidrocarboneto monovalente de cadeia linear, ramificada ou cíclica, que pos-sui pelo menos uma ligação dupla e que possui de 2 a 6 átomos de carbono,ou, quando cíclico, que possui de 3 a 6 átomos de carbono. Dessa forma, otermo "C2-C6 alquenila" inclui vinila, prop-2-enila, but-3-enila, pent-4-enila eisopropenila. O grupo C2-C6 alquenila pode ser opcionalmente substituídocom um ou mais substituintes.

O termo "C2-C6 alquinila", como aqui usado, significa um radicalhidrocarboneto monovalente de cadeia linear ou ramificada, que possui pelomenos uma ligação tripla e que possui de 2 a 6 átomos de carbono. Dessaforma, o termo "C2-C6 alquinila" inclui prop-2-inila, but-3-inila e pent-4-inila. AC2-C6 alquinila pode ser opcionalmente substituída com um ou mais substitu-intes.

O termo "C1-C6 alcóxi", como aqui usado, significa um radicalhidrocarboneto monovalente não-substituído saturado de cadeia linear ou decadeia ramificada que possui de 1 a 6 átomos de carbono ligados ao pontode substituição por um radical O divalente. Dessa forma, o termo "C1-C6 al-cóxi" inclui, por exemplo, metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n-butóxi, isobu-tóxi, sec-butóxi e terc-butóxi. O grupo C1-C6 alcóxi pode ser opcionalmentesubstituído com um ou mais substituintes.

O termo "halo" ou "halogênio" significa flúor, cloro, bromo ou io-do.

O termo "arila", quando usado isoladamente ou como parte deum grupo, é um grupo aromático ou heteroaromático de 5 a 10 membros,que inclui um grupo fenila, um grupo heteroaromático monocíclico de 5 ou 6membros, cada membro podendo ser opcionalmente substituído com 1, 2, 3,4 ou 5 substituintes (dependendo do número de posições de substituiçãodisponíveis), um grupo naftila ou um grupo heteroaromático bicíclico de 8, 9ou 10 membros, cada membro podendo ser opcionalmente substituído com1, 2, 3, 4, 5 ou 6 substituintes (dependendo do número de posições de subs-tituição disponíveis). Dentro dessa definição de arila, substituições adequa-das incluem CrC6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, amino, hidróxi,halogênio,-SH e CF3.

O termo "arila CrC4 alquila", como aqui usado, significa um gru-po Ci-C4 alquila substituído com uma arila. Dessa forma, o termo "arila CrC4alquila" inclui benzila, 1-feniletila (α-metilbenzila), 2-feniletila, 1-naftalenometila ou 2-naftalenometila.

O termo "naftila" inclui 1-naftila e 2-naftila. Prefere-se 1-naftila. - -

O termo "benzila", como aqui usado, significa um radical fenilamonovalente não-substituído ligado ao ponto de substituição por um grupo -CH2.

O termo "grupo heteroaromático monocíclico de 5 ou 6 mem-bros", como aqui usado, significa um grupo aromático monocíclico com umtotal de 5 ou 6 átomos no anel, em que de 1 a 4 desses átomos são selecio-nados, cada independentemente, de Ν, O e S. Grupos preferidos possuem 1ou 2 átomos no anel que são selecionados, cada um independentemente, deN, O e S. Exemplos de grupos heteroaromáticos monocíclicos de 5 membrosincluem pirrolila (também denominada azolila), furanila, tienila, pirazolila(também denominada 1 H-pirazolila e 1,2-diazolila), imidazolila, oxazolila(também denominada 1,3-oxazolila), isoxazolila (também denominada 1,2-oxazolila), tiazolila (também denominada 1,3-tiazolila), isotiazolila (tambémdenominada 1,2-tiazolila), triazolila, oxadiazolila, tiadiazolila, tetrazolila, oxa-triazolila e tiatriazolila. Exemplos de grupos heteroaromáticos monocíclicosde 6 membros incluem piridinila, pirimidil, pirazinila, piridazinila e triazinila.

O termo "grupo heteroaromático bicíclico de 8, 9 ou 10 mem-bros", como aqui usado, significa um grupo aromático bicíclico fundido comum total de 8, 9 ou 10 átomos no sistema em anel, em que de 1 a 4 dessesátomos são selecionados, cada um independentemente, de N, O e S. Gru-pos preferidos possuem de 1 a 3 átomos no sistema em anel que são sele-cionados, cada um independentemente, de Ν, O e S. Grupos heteroaromáti-cos bicíclicos de 8 membros adequados incluem imidazo[2,1-b][1,3]tiazolila,tieno[3,2-b]tienila, tieno[2,3-d][1,3]tiazolila e tieno[2,3-d]imidazolila. Gruposheteroaromáticos bicíclicos de 9 membros adequados incluem indolila, isoin-dolila, benzofuranila (também denominada benzofbjfuranila), isobenzofurani-la (também denominado benzo[c]furanila), benzotienila (também denomina-da benzo[b]tienila), isobenzotienila (também denominada benzo[c]tienila),indazolila, benzimidazolila, 1,3-benzoxazolila, 1,2-benzisoxazolila, 2,1-benzisoxazolila, 1,3-benzotiazolila, 1,2-benzoisotiazolila, 2,1-benzoisotiazolila, benzotriazolila, 1,2,3-benzoxadiazolila, 2,1,3-benzoxadiazolila, 1,2,3-benzotiadiazolila, 2,1,3-benzotiadiazolila, tienopiridi-nila, purinila e imidazo[1,2-a]piridina. Grupos heteroaromáticos bicíclicos de10 membros adequados incluem quinolinila, isoquinolinila, cinolinila, quina-zolinila, quinoxalinila, 1,5-naftiridila, 1,6-naftiridila, 1,7-naftiridila e 1,8-naftiridila.

O termo "PEG", como aqui usado, significa uma molécula depolietileno glicol. Em sua forma típica, PEG é um polímero linear com gruposterminais hidroxil, e que possui a fórmula H0-CH2CH2-(CH2CH20)n-CH2CH2-OH1 em que η é de cerca de 8 a cerca de 4.000. O hidrogênio terminal podeser substituído com um grupo de proteção como, por exemplo, um grupoalquila ou alcanol. De preferência, PEG possui pelo menos um grupo hidróxi,mais preferivelmente ele é um grupo hidróxi terminal. É esse grupo hidróxique é preferivelmente ativado para reagir com o peptídeo. Há muitas formasde PEG úteis para a presente invenção. Existem vários derivados de PEGna técnica que são adequados para uso na invenção (vide, por exemplo,Patentes U.S. Nos: 5.445.090, 5.900.461, 5.932.462, 6.436.386, 6.448.369,6.437.025, 6.448.369, 6.495.659, 6.515.100 e 6.514.491, e Zalipsky, S. Bio-conjugate Chem. 6: 150-165, 1995). A molécula de PEG anexada de formacovalente aos agonistas peptídicos do receptor VPAC2 na presente inven-ção não deve ser limitada a um tipo em particular. O peso molecular da mo-lécula de PEG é, de preferência, de 500-100.000 dáltons. PEG pode ser li-near ou ramificado, e agonistas peptídicos PEGuiIados do receptor VPAC2podem ter uma, duas ou três moléculas de PEG anexadas ao peptídeo. Pre-fere-se que haja uma ou duas moléculas de PEG por agonista peptídicoPEGuiIado do receptor VPAC2; no entanto, quando houver mais de uma mo-lécula de PEG por molécula de peptídeo, prefere-se que não haja mais quetrês. Contempla-se ainda que ambas as extremidades da molécula de PEGpodem ser homo- ou heterofuncionalizadas para o entrecruzamento de doisou mais agonistas peptídicos do receptor VPAC2 em conjunto. Quando esti-verem presentes duas moléculas de PEG, cada uma das moléculas de PEGserá, de preferência, molécula de PEG de 20.000 dáltons ou moléculas de30.000 dáltons. No entanto, podem ser usadas moléculas de PEG que pos-suam um peso molecular diferente, por exemplo, uma molécula de PEG de10.000 dáltons e uma molécula de PEG de 30.000 dáltons, ou uma moléculade PEG 20.000 dáltons e uma molécula de PEG de 40.000 dáltons.

Uma molécula de PEG pode ser anexada de forma covalente aum resíduo Cys ou Lys. Uma molécula de PEG também pode ser anexadade forma covalente a um resíduo Trp que esteja acoplado à cadeia lateral deum resíduo Lys (K(W)). Alternativamente, um grupo K(CO(CH2)2SH) podeser PEGuiIado para formar K(CO(CH2)2S-PEG). Qualquer resíduo Lys noagonista peptídico pode substituir um K(W) ou K(CO(CH2)2SH), que podeentão ser PEGuilado. Além do mais, qualquer resíduo Cys no agonista pep-tídico pode substituir um resíduo de cisteína modificado, por exemplo, hC. Oresíduo Cys modificado pode ser anexado de forma covalente a uma molé-cula de PEG.

O termo "PEGuilação", como aqui usado, significa a adesão co-valente de uma ou mais moléculas de PEG, como descrito acima, aos ago-nistas peptídicos do receptor VPAC2 da presente invenção.

O termo "ponte de lactama", como aqui usado, significa uma li-gação covalente, em particular uma ligação amida, que liga o terminal aminoda cadeia lateral de um aminoácido no agonista peptídico ao terminal carbó-xi da cadeia lateral de outro aminoácido no agonista peptídico. De preferên-cia, a ponte de lactama é formada pela adesão covalente da cadeia lateralde um resíduo em Xaan à cadeia lateral de um resíduo em Xaan+4, em que ηé 1 a 28. Também preferivelmente, a ponte de lactama é formada pela ade-são covalente do terminal amino da cadeia lateral de um resíduo Lys ou Ornao carbóxi terminal da cadeia lateral de um resíduo Asp ou Glu.

O termo "ponte bissulfeto", como aqui usado, significa uma liga-ção covalente que liga um átomo de enxofre no terminal da cadeia lateral deum aminoácido no agonista peptídico a um átomo de enxofre no terminal dacadeia lateral de outro aminoácido no agonista peptídico. De preferência, aponte bissulfeto é formada pela adesão covalente da cadeia lateral de umresíduo em Xaan à cadeia lateral de um resíduo em Xaan+4, em que η é 1 a28. Também preferivelmente, a ponte bissulfeto é formada pela adesão co-valente da cadeia lateral de um resíduo Cys ou hC à cadeia lateral de outroresíduo Cys ou hC.

De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção,é fornecido um agonista peptídico do receptor VPAC2 que compreende umaseqüência de aminoácidos de Fórmula 1 (ID. DE SEQ. Ng: 1) ou Fórmula 2(ID. DE SEQ. Ns: 2), em que Xaa3 é Asp ou Glu, Xaa8 é Asp ou Glu, Xaa9 éAsn ou Gln, Xaa10 é Tyr ou Tyr(OMe)1 Xaa12 é Arg, hR, Lys ou Orn, Xaa14 éArg, Gln, Aib1 hR, Orn, Cit, Lys, Ala ou Leu, Xaa15 é Lys, Aib, Orn ou Arg1Xaa16 é Gln ou Lys, Xaa17 é Vai, Leu, Ala, lie, Lys ou Nle, Xaa19 é Ala ou A-bu, Xaa20 é Lys, Vai, Leu, Aib, Ala, Gln ou Arg, Xaa21 é Lys, Aib, Orn, Ala,Gln ou Arg, Xaa23 é Leu ou Aib1 Xaa25 é Ser ou Aib, Xaa27 é Lys, Orn, hR ouArg, Xaa28 é Asn, Gln, Lys, hR, Aib, Orn ou Pro, e/ou Xaa29 é Lys, Orn, hRou está ausente, uma extensão no terminal C que compreende a seqüência:GGPSSGAPPPK (E-C16), e uma modificação do terminal N, em que essamodificação é a adição de hexanoila ou acetila.

De acordo com outra modalidade preferida da presente inven-cão, é fornecido um agonista peptídico do receptor VPAC2 que compreendeuma seqüência de aminoácidos de Fórmula 1 (ID. DE SEQ. N9: 1) ou Fórmu-la 2 (ID= DE SEQ. Ns: 2), em que Xaa8 é Glu, Xaa9 é Gln, Xaa10 é Tyr(OMe),Xaa12 é Orn, Xaa15 é Aib, Xaa19 é Abu, Xaa20 é Aib, Xaa21 é Orn, Xaa23 éAib, Xaa25 é Aib, Xaa27 é Orn, e/ou Xaa28 é Orn, uma extensão no terminal Cque compreende a seqüência: GGPSSGAPPPK (E-C16), e uma modificaçãodo terminal N, em que essa modificação é a adição de hexanoila ou acetila.Deacordocomaindaoutramodalidadepreferidadapresenteinvenção, é fornecido um agonista peptídico do receptor VPAC2 que com-preende uma seqüência de aminoácidos de Fórmula 2 (ID. DE SEQ. NQ: 2),uma extensão no terminal C que compreende a seqüência: GGPSSGAPPPK(E-C16) e uma modificação do terminal N, em que essa modificação é a adi-ção de hexanoil ou acetila.

A presente invenção se baseia no achado de que a adição deuma extensão no terminal C que compreende a seqüência: GGPSSGAPPPK(E-C16) ao terminal Cde uma seqüência peptídica de acordo com Fórmula 1ou Fórmula 2 fornece características que podem proteger o peptídeo, além -de aumentar a atividade, seletividade e/ou potência. Por exemplo, a exten-são no terminal C pode estabilizar a estrutura helicoidal do peptídeo e esta-bilizar sítios localizados próximos ao terminal C, que possuem tendência àclivagem enzimática. Além disso, os peptídeos estendidos no terminal C aquirevelados podem ser mais seletivos para o receptor VPAC2 e podem sermais potentes do que VIP, PACAP e outros agonistas peptídicos conhecidosdo receptor VPAC2.

A PEGuilação de proteínas pode superar muitos dos problemasfarmacológicos e toxicológicos/imunológicos associados à utilização de pep-tídeos ou proteínas como substâncias terapêuticas. No entanto, para qual-quer peptídeo individual, é incerto se a forma PEGuiIada do peptídeo teráuma perda significativa da bioatividade, quando comparada com a formanão-PEGuilada do peptídeo.

A bioatividade de proteínas PEGuiIadas pode ser afetada porfatores como: (i) o tamanho da molécula de PEG; (ii) os sítios de adesãoespecíficos; (iii) o grau de modificação; (iv) condições de acoplamento ad-versas; (v) se é utilizado um vinculador para adesão ou se o polímero é ane-xado diretamente; (vi) geração de co-produtos prejudiciais; (vii) dano causa-do pelo polímero ativado; ou (viii) retenção de carga. Um trabalho realizadosobre a PEGuilação de citocinas, por exemplo, mostra os efeitos que a PE-Guilação pode ter. Dependendo da reação de acoplamento usada, a modifi-cação de citocinas por polímero produziu reduções dramáticas na bioativida-de [Francis, G.E., et ai, (1998) "PEGylation of cytokines and other therapeu-tic proteins and peptides: the importance of biological optimization of cou-pling techniques", Intl. J. Hem. 68: 1-18]. A manutenção da bioatividade depeptídeos PEGuiIados é ainda mais problemática do que para proteínas.Como os peptídeos são menores do que as proteínas, a modificação porPEGuilação pode potencialmente ter um efeito maior sobre a bioatividade.

Os agonistas peptídicos do receptor VPAC2 da presente inven-ção podem ser modificados pela adesão covalente de uma ou mais molécu-las de PEG. Os peptídeos PEGuiIados geralmente possuem perfis farmaco-cinéticos aprimorados em função da degradação proteolítica e depuraçãorenal mais lentas. A PEGuilação aumentará o tamanho aparente dos agonis-tas peptídicos do receptor VPAC2 reduzindo, dessa forma, a filtração renal ealterando a biodistribuição. A PEGuilação pode proteger epitopos antigêni-cos dos agonistas peptídicos do receptor VPAC2 reduzindo, desse modo, adepuração reticuloendotelial e o reconhecimento pelo sistema imunológico, etambém reduzindo a degradação por enzimas proteolíticas, por exemplo,DPP-IV.

A adesão covalente de uma ou mais moléculas de PEG a umpequeno agonista peptídico do receptor VPAC2 biologicamente ativo possuio risco de afetar de forma adversa o agonista, por exemplo, por desestabili-zação da estrutura secundária inerente e a conformação bioativa e reduçãoda bioatividade, tornando o agonista inadequado para uso como uma subs-tância terapêutica. A adesão covalente de uma ou mais moléculas de PEG aresíduos específicos de um agonista peptídico do receptor VPAC2 surpreen-dentemente resulta em um agonista peptídico PEGuiIado do receptor VPAC2biologicamente ativo com uma meia-vida prolongada e uma depuração redu-zida, quando comparado com as de agonistas peptídicos não-PEGuilados doreceptor VPAC2.

A fim de determinar os sítios de PEGuilação potenciais em umagonista peptídico do receptor VPAC2, pode ser realizada a varredura deserina. Um resíduo Ser é substituído em uma posição específica no peptí-deo, e o peptídeo modificado com Ser é testado quanto à potência e seletivi-dade. Gaso a substituição de Ser tenha um impacto mínimo sobre a potênciae o peptídeo modificado com Ser seja seletivo para o receptor VPAC2, o re-síduo Ser substituirá um resíduo Cys ou Lys, servindo como um sítio de PE-Guilação direto ou indireto. A PEGuilação indireta de um resíduo é a PEGui-lação de um grupo químico ou resíduo que está ligado ao resíduo do sítio dePEGuilação. A PEGuilação indireta de Lys inclui PEGuilação de K(W) eK(CO(CH2)2SH).

A invenção aqui descrita fornece agonistas peptídicos do recep-tor VPAC2 que podem ser anexados de forma covalente a uma ou mais mo-léculas de PEG ou a um derivado desta, em que cada PEG pode ser anexa-do a um aminoácido Cys ou Lys, a um K(W) ou a um K(CO(CH2)2SH) no a-gonista peptídico. A PEGuilação pode aumentar a meia-vida dos agonistaspeptídicos seletivos do receptor VPAC2, resultando em agonistas peptídicosdo receptor VPAC2 com uma meia-vida de eliminação de pelo menos umahora, de preferência pelo menos 3, 5, 7, 10, 15, 20 ou 24 horas e, principal-mente, pelo menos 48 horas. Os agonistas peptídicos PEGuiIados do recep-tor VPAC2 preferivelmente possuem um valor de depuração de 200 ml/h/kgou menos, mais preferivelmente 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg ou me-nos e, principalmente, menos de 50, 40 ou 20 ml/h/kg.

A região de VIP do tipo selvagem de ácido aspártico na posição8 à isoleucina na posição 26 possui uma estrutura em alfa-hélice. O aumentodo teor helicoidal de um peptídeo aumenta a potência e a seletividade, en-quanto, ao mesmo tempo, melhora a proteção contra degradação enzimáti-ca. O uso de uma extensão no terminal C pode aumentar a helicidade dopeptídeo. Além do mais, a introdução de uma ligação covalente, por exem-plo, uma ponte de lactama, ligando as cadeias laterais de dois aminoácidosna superfície da hélice, também aumenta a helicidade do peptídeo.

Foi descoberto ainda que a modificação do terminal N do agonis-ta peptídico do receptor VPAC2 pode aumentar a potência e/ou fornecer es-tabilidade contra clivagem por DPP-IV.

VIP e alguns agonistas peptídicos conhecidos do receptorVPAC2 são suscetíveis à clivagem por várias enzimas e, dessa forma, pos-suem uma meia-vida in vivo curta. Vários sítios de clivagem enzimática nosagonistas peptídicos do receptor VPAC2 serão discutidos abaixo. Os sítiosde clivagem são discutidos em relação às posições de aminoácidos em VIP(ID. DE SEQ. Ns: 3), e são aplicáveis às seqüências aqui observadas.

A clivagem do agonista peptídico pela enzima dipeptidil-peptidase-IV (DPP-IV) ocorre entre a posição 2 (serina em VIP) e a posição3 (ácido aspártico em VIP). Os agonistas da presente invenção podem setornar mais estáveis à clivagem por DPP-IV nessa região pela adição deuma modificação do terminal N. Exemplos de modificações do terminal Nque podem aumentar a estabilidade contra clivagem por DPP-IV incluem aadição de acetila, propionila, butirila, pentanoila, hexanoila, metionina, sulfó-xido de metionina, 3-fenilpropionila, fenilacetila, benzoila, norleucina, D-histidina, isoleucina, 3-mercaptopropionila, ácido biotinila-6-aminoexanóicoou -C(=NH2)-NH2. De preferência, a modificação do terminal N é a adição deacetila ou hexanoila.

Há sítios de clivagem de quimiotripsina em VIP do tipo selvagementre os aminoácidos 10 e 11 (tirosina e treonina) e aqueles em 22 e 23 (ti-rosina e leucina). A realização das substituições na posição 10 e/ou 11 e naposição 22 e/ou 23 pode aumentar a estabilidade do peptídeo nesses sítios.Por exemplo, a substituição de tirosina na posição 10 e/ou posição 22 comTyr(OMe) pode aumentar a estabilidade. Uma ponte de lactama, por exem-plo, ligando as cadeias laterais dos aminoácidos nas posições 21 e 25, podeproteger o sítio 22-23 da clivagem.

Há um sítio de clivagem de tripsina entre os aminoácidos nasposições 12 e 13 de VIP do tipo selvagem. Certos aminoácidos tornam opeptídeo menos suscetível à clivagem nesse sítio, por exemplo, ornitina naposição 12.

Em VIP do tipo selvagem, e em vários agonistas peptídicos doreceptor VPAC2 conhecidos na técnica, há sítios de clivagem entre os ami-noácidos básicos nas posições 14 e 15 e entre aqueles nas posições 20 e21. Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 da presente inven-ção podem ter estabilidade proteolítica in-vivo aumentada em função dassubstituições nesses sítios. As substituições preferidas nesses sítios sãoaquelas que tornam o peptídeo menos suscetível à clivagem por enzimas dotipo tripsina, incluindo tripsina. Por exemplo, ácido amino isobutírico na posi-ção 15, ácido amino isobutírico na posição 20 e ornitina na posição 21 sãotodas substituições preferidas que podem levar a um aumento da estabilida-de.

Também há um sítio de clivagem entre os aminoácidos nas po-sições 25 e 26 de VIP do tipo selvagem. Esse sítio de clivagem pode sercompleta ou parcialmente eliminado por meio da substituição do aminoácidona posição 25*e/ou do aminoácido na posição 26.

A região do agonista peptídico do receptor VPAC2 que englobaos aminoácidos nas posições 27, 28 e 29 também é suscetível à clivagemenzimática. A adição de uma extensão no terminal C pode tornar o agonistapeptídico mais estável contra neuroendopeptidase (NEP); ela também podeaumentar a seletividade pelo receptor VPAC2. Essa região também pode seratacada por enzimas do tipo tripsina. Caso isso ocorra, o agonista peptídicopode perder sua extensão no terminal C com a atividade adicional de carbo-xipeptidase levando a uma forma inativa do peptídeo. A resistência à cliva-gem nessa região pode ser aumentada por substituição do aminoácido naposição 27, 28 e/ou 29 com ornitina.

Além de agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 comresistência à clivagem por várias peptidases, os agonistas peptídicos seleti-vos do receptor VPAC2 da presente invenção também podem englobar pep-tídeos com seletividade aumentada pelo receptor VPAC2, potência aumen-tada e/ou estabilidade aumentada, comparado com alguns peptídeos conhe-cidos na técnica.

De preferência, os agonistas peptídicos seletivos do receptorVPAC2 não-PEGuilados possuem um valor EC50 menor do que 2 nM. Maispreferivelmente, o valor EC5O é menor do que 1 nM. Ainda mais preferivel-mente, a ÈC5o é menor do que 0,5 nM. Ainda mais preferivelmente, o valorEC5O é menor do que 0,1 nM. De preferência, agonistas peptídicos PEGuiIa-dos seletivos do receptor VPAC2 possuem um valor EC50 menor do que 200nM. Mais preferivelmente, o valor EC5O é menor do que 50 nM. Ainda maispreferivelmente, o valor EC5O é menor do que 30 nM. Ainda mais preferivel-mente, o valor EC50 é menor do que 10 nM.

O Exemplo 4 descreve ensaios para a determinação da seletivi-dade como uma proporção da afinidade de ligação ao receptor VPAC2 emrelação à afinidade de ligação ao receptor VPAC1, e como uma proporçãoda afinidade de ligação ao receptor VPAC2 em relação à afinidade de liga-ção ao receptor PAC1. De preferência, os agonistas da presente invençãopossuem uma proporção de seletividade em que a afinidade pelo receptorVPAC2 é pelo menos 50 vezes maior do que pelos receptores VPAC1 e/ou "PAC1.. Mais preferivelmente, essa afinidade é pelo menos 100 vezes maiorpara VPAC2 do que para VPAC1 e/ou para PAC1. Ainda mais preferivel-mente, a afinidade é pelo menos 200 vezes maior para VPAC2 do que paraVPAC1 e/ou para PAC1. Ainda mais preferivelmente, a afinidade é pelo me-nos 500 vezes maior para VPAC2 do que para VPAC1 e/ou para PAC1. Ain-da mais preferivelmente, a proporção é pelo menos 1.000 vezes maior paraVPAC2 do que para VPAC1 e/ou para PAC1.

Como aqui usado, o termo "agonistas peptídicos seletivos doreceptor VPAC2" também inclui sais farmaceuticamente aceitáveis dos com-postos aqui descritos. Um agonista peptídico seletivo do receptor VPAC2desta invenção pode possuir um grupo funcional suficientemente ácido, umgrupo funcional suficientemente básico ou ambos os grupos funcionais e,conseqüentemente, reage com qualquer uma dentre várias bases inorgâni-cas e ácidos inorgânicos e orgânicos, para formar um sal. Os ácidos comu-mente empregados para formar sais de adição ácida são ácidos inorgânicos,tais como ácido clorídrico, ácido hidrobrômico, ácido hidroiódico, ácido sulfú-rico, ácido fosfórico, e similares, e ácidos orgânicos, tais com o ácido p-toluenossulfônico, ácido metanossulfônico, ácido oxálico, ácido p-bromofenila-sulfônico, ácido carbônico, ácido succínico, ácido cítrico, ácidobenzóico, ácido acético, ácido trifluoracético, e similares. Exemplos dessessais incluem os sais de sulfato, pirossulfato, bissulfato, sulfito, bissulfito, fos-fato, monoidrogenfosfato, diidrogenfosfato, metafosfato, pirofosfato, cloreto,brometo, iodeto, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formato,isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato,suberato, sebacato, fumarato, maleato, butine-1,4-dioato, hexine-1,6-dioato,benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato,metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenossulfonato, fenilacetato, fenilpropio-nato, fenilbutirato, citrato, lactato, gama-hidroxibutirato, glicolato, tartarato,metanossulfonato, propanossulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftáleno-2-sulfonato, mandelato, e similares.

Sais de adição básica incluem aqueles derivados de bases inor-gânicas como, por exemplo, amônio ou hidróxidos de metais alcaíinos oualcalinos terrosos, carbonatos, bicarbonatos, e similares. Essas bases úteisna preparação dos sais desta invenção incluem, desse forma, hidróxido desódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, carbonato de potássio, esimilares.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 da presen-te invenção são formulados preferivelmente como composições farmacêuti-cas. Podem ser empregadas técnicas padronizadas de formulação farma-cêutica, tais como aquelas descritas em "Remington1S Pharmaceutical Sci-ences", Mack Publishing Company, Easton, PA. Os agonistas peptídicos se-letivos do receptor VPAC2 da presente invenção podem ser formulados paraadministração por meio da via bucal, tópica, oral, transdérmica, nasal oupulmonar, ou para administração parenteral.

A administração parenteral pode incluir, por exemplo, adminis-tração sistêmica, por exemplo, por injeção intramuscular, intravenosa, sub-cutânea, intradérmica ou intraperitoneal. Os agonistas peptídicos seletivosdo receptor VPAC2 podem ser administrados ao indivíduo em conjunto comum veículo, diluente ou excipiente farmacêutico aceitável como parte de umacomposição farmacêutica para o tratamento de NIDDM ou dos distúrbiosdiscutidos abaixo. A composição farmacêutica pode ser uma solução ou, seadministrada parenteralmente, uma suspensão do agonista peptídico do re-ceptor VPAC2 ou uma suspensão do agonista peptídico do receptor VPAC2em complexo com um cátion metálico divalente como, por exemplo, zinco.Veículos farmacêuticos adequados podem conter ingredientes inertes quenão interagem com o peptídeo ou derivado peptídico. Veículos farmacêuti-cos adequados para administração parenteral incluem, por exemplo, águaestéril, soro fisiológico, solução salina bacteriostática (solução salina conten-do cerca de 0,9% mg/ml de álcool benzílico), soro fisiológico tamponado comfosfato, solução de Hank1 Ringer-Iactato e similares. Alguns exemplos deexcipientes adequados incluem lactose, dextrose, sacarose, trealose, sorbi-tol e manitol.

Os agonistas peptídicos do receptor VPAC2 da invenção podemser formulados para administração de tal "forma "que os níveis sangüíneosplasmáticos sejam mantidos na faixa eficaz por períodos de tempo prolon-gados. A principal barreira à liberação eficaz do fármaco por via oral é a bai-xa biodisponibilidade em função da degradação dos peptídeos por ácidos eenzimas, baixa absorção através de membranas epiteliais e transição depeptídeos até uma forma insolúvel após exposição ao ambiente de pH ácidono trato digestivo. Sistemas de liberação oral para peptídeos como aquelesenglobados pela presente invenção são conhecidos na técnica. Por exem-plo, os agonistas peptídicos do receptor VPAC2 podem ser encapsuladoscom o uso de microesferas e depois liberados oralmente. Por exemplo, osagonistas peptídicos do receptor VPAC2 podem ser encapsulados em mi-croesferas compostas por um polímero biocompatível e biodegradável, co-mercialmente disponível, poli(lactida-co-glicolida)-COOH e azeite de olivacomo um enchimento (vide Joseph, et al. Diabetologia 43: 1.319-1.328(2000)). Outros tipos de tecnologias de microesfera também são disponíveiscomercialmente como, por exemplo, polímeros biodegradáveis MedisorbD eProIeaseD de Alkermes. Os polímeros MedisorbD podem ser produzidoscom qualquer um dos isômeros de lactida. As proporções de lactida:glicolidapodem variar entre 0:100 e 100:0, o que permite uma ampla gama de propri-edades do polímero. Isso permite o design de sistemas de liberação e dispo-sitivos implantáveis com tempos de reabsorção que variam de semanas ameses. Emisphere também publicou vários artigos que discutem a tecnolo-gia de liberação oral para peptídeos e proteínas. Por exemplo, vide WO95/28838 por Leone-bay et al. que revela veículos específicos compostospor aminoácidos modificados para facilitar a absorção.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 aqui des-critos podem ser usados para tratar indivíduos com uma ampla variedade dedoenças e condições. Os agonistas englobados pela presente invenção e-xercem seus efeitos biológicos ao atuarem em um receptor denominado re-ceptor VPAC2. Os indivíduos com doenças e/ou condições que respondemfavoravelmente à estimulação do receptor VPAC2 ou à administração deagonistas peptídicos do receptor VPAC2 podem, portanto, ser tratados comos agonistas-de VPAC2 éa presente invenção. Esses indivíduos são consi-derados como "necessitando de tratamento com agonistas de VPAC2" ou"necessitando de estimulação do receptor VPAC2".

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 da presen-te invenção podem ser empregados para o tratamento de diabetes, incluindodiabetes do tipo 1 e do tipo 2 (diabetes melito não dependente de insulina ouNIDDM). Os agonistas também podem ser usados para tratar indivíduos quenecessitam de tratamento profilático com um agonista do receptor VPAC2,por exemplo, indivíduos em risco para o desenvolvimento de NIDDM. Essetratamento também pode retardar o surgimento de diabetes e de complica-ções diabéticas. Indivíduos adicionais que podem ser tratados com os ago-nistas da presente invenção incluem aqueles com tolerância à glicose alte-rada (IGT) ("Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus", Diabe-tes Care 22 (Supl. 1): S5, 1999) ou glicose de jejum alterada (IFG) (Charles,et al., Diabetes 40: 796, 1991), indivíduos cujo peso corporal esteja cerca de25% acima do peso corporal normal para a altura e constituição corporal doindivíduo, indivíduos que possuam um ou mais progenitores com NIDDM,indivíduos que tenham tido diabetes gestacional e indivíduos com distúrbiosmetabólicos tais como aqueles causados pela diminuição da secreção endó-gena de insulina. Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 po-dem ser usados para evitar que indivíduos com tolerância à glicose alteradaevoluam para o desenvolvimento de NIDDM, evitar a deterioração de célulasβ pancreáticas, induzir a proliferação de células β, melhorar a função dascélulas β, ativar células β dormentes, diferenciar células em células β, esti-mular a replicação de células β e inibir a apoptose de células β. Outras do-enças e condições que podem ser tratadas ou evitadas com a utilização dosagonistas da invenção em métodos da invenção incluem: diabetes do adultono jovem (MODY) (Herman, et al., Diabetes 43: 40, 1994); diabetes auto-imune latente do adulto (LADA) (Zimmet, et al., Diabetes Med. 11: 299,1994); diabetes gestacional (Metzger, Diabetes, 40: 197, 1991); síndromemetabólica X, dislipidemia, hiperglicemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceride-mia e resistência à insulina.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 da inven-ção também podem ser usados para tratar causas secundárias de diabetes("Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus", Diabetes Care 22(Supp. 1): S5, 1999). Essas causas secundárias incluem excesso de glico-corticóide, excesso de hormônio de crescimento, feocromocitoma e diabetesinduzido por fármacos. Fármacos que podem induzir diabetes incluem, semlimitação, piriminila, ácido nicotínico, glicocorticóides, fenitoína, hormôniotireoidiano, agentes β-adrenérgicos, α-interferon e fármacos usados no tra-tamento de infecção pelo HIV.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 da presen-te invenção podem ser eficazes na supressão da ingestão de alimentos e notratamento de obesidade.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 da presen-te invenção também podem ser eficazes na prevenção ou no tratamento dedistúrbios como doença aterosclerótica, hiperlipidemia, hipercolesterolemia,níveis baixos de HDL, hipertensão, hipertensão pulmonar primária, doençacardiovascular (incluindo aterosclerose, doença cardíaca coronariana e do-ença arterial coronariana), doença cerebrovascular e doença de vasos peri-féricos; e para o tratamento de lúpus, síndrome de ovário policístico, carci-nogênese e hiperplasia, problemas masculinos e femininos de reprodução,distúrbios sexuais, úlceras, distúrbios do sono, distúrbios do metabolismo delipídeos e carboidratos, disfunção circadiana, distúrbios do crescimento, dis-túrbios da homeostasia de energia, doenças imunes, incluindo doenças au-to-imunes (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico), além de doenças in-flamatórias agudas e crônicas, artrite reumatóide e choque séptico.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 da presen-te invenção também podem ser úteis para o tratamento de distúrbios fisioló-gicos relacionados, por exemplo, à diferenciação celular para a produção decélulas de acúmulo de lipídeos, regulação da sensibilidade à insulina e dosníveis sangüíneos de glicose, que estão envolvidos, por exemplo, na funçãoanormal de células β pancreáticas, tumores secretores de insulina e/ou hi-poglicemia auto-imune causada por auto-anticorpos à insulina, auto-anticorpos ao receptor de insulina ou auto-anticorpos que são estimuladoresde células β pancreáticas, diferenciação de macrófagos que leva à formaçãode placas aterosclerótica, resposta inflamatória, carcinogênese, hiperplasia,expressão gênica de adipócitos, diferenciação de adipócitos, redução damassa de células β pancreáticas, secreção de insulina, sensibilidade tecidualà insulina, crescimento de células de lipossarcoma, doença ovariana policís-tica, anovulação crônica, hiperandrogenismo, produção de progesterona,esteroidogênese, estresse de potencial de redox e oxidativo nas células,produção de óxido nítrico-sintase (NOS), níveis aumentados de gama gluta-mil transpeptidase, catalase, triglicerídeos, colesterol HDL e LDL plasmáti-cos, e similares.

Além do mais, os agonistas peptídicos seletivos do receptorVPAC2 da invenção podem ser usados para o tratamento de asma (Bolin, etal., Biopolimer 37: 57-66 (1995); Patente U.S. N2 5.677.419, que mostra queo polipeptídeo R3PO é ativo no relaxamento de músculo liso traqueal deporquinhos-da-índia); indução de hipotensão (VIP induz hipotensão, taqui-cardia e rubor facial em pacientes asmáticos (Morice, et al., Peptides 7: 279-280 (1986); Morice, et al., Lancet 2: 1.225-1.227 (1983)); para o tratamentode problemas masculinos de reprodução (Siow, et al., Arch. Androl. 43(1):67-71 (1999)); como um agente antiapoptose/neuroprotetor (Brenneman, etal., Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 865: 207-12 (1998)); para cardioproteção duranteeventos isquêmicos (Kalfin, et al., J. Pharmacoi Exp. Ther. 1.268(2): 952-8(1994); Das, et ai, Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 865: 297-308 (1998)); para a mani-pulação do ciclo circadiano e seus distúrbios associados (Hamar, et al., Cell109: 497-508 (2002); Shen, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 97: 11.575-80,(2000)); como um agente antiúleera (Tuncel, et al., Ann. Ν. Y. Acad. Sei.865: 309-22, (1998)), e como um tratamento para AIDS (Branch, et al., Blo-od, 106: Resumo 1.427, (2005)).

Uma "quantidade eficaz" de um agonista peptídico seletivo doreceptor VPAC2 é a quantidade que produz um efeito terapêutico e/ou profi-lático desejado, sem causar efeitos colaterais inaceitáveis, quando adminis-trada a um indivíduo que necessita de estimulação do receptor VPAC2. Um"efeito terapêutico desejado" inclui um ou mais dos seguintes^ 1) uma melho-ra dos sintomas associados à doença ou condição; 2) um retardo do surgi-mento de sintomas associados à doença ou condição; 3) aumento da longe-vidade, comparado com a ausência do tratamento; e 4) melhor qualidade devida, comparado com a ausência do tratamento. Por exemplo, uma "quanti-dade eficaz" de um agonista de VPAC2 para o tratamento de NIDDM é aquantidade que produziria um maior controle da concentração sangüínea deglicose do que na ausência de tratamento causando, dessa forma, um retar-do do surgimento de complicações diabéticas como, por exemplo, retinopati-a, neuropatia ou doença renal. Uma "quantidade eficaz" de um agonista pep-tídico seletivo do receptor VPAC2 para a prevenção de NIDDM é a quanti-dade que retardaria, comparada com a ausência de tratamento, o surgimen-to de níveis sangüíneos elevados de glicose que necessitem de tratamentocom fármacos hipoglicêmicos anti-hipoglicêmico como, por exemplo, sulfoni-luréias, tiazolidinedionas, insulina e/ou biguanidinas.

Uma "quantidade eficaz" do agonista peptídico seletivo do recep-tor VPAC2 administrada a um indivíduo também dependerá do tipo e da gra-vidade da doença e das características do indivíduo como, por exemplo, asaúde geral, idade, sexo, peso corporal e tolerância a fármacos. A dose deagonista peptídico seletivo do receptor VPAC2 eficaz para normalizar a gli-cemia de um paciente dependerá de diversos fatores, dentre os quais estãoincluídos, sem limitação, o sexo, o peso e a idade do indivíduo, a gravidadeda incapacidade de regular a glicemia, a via de administração e biodisponibi-lidade, o perfil farmacocinético do peptídeo, a potência e a formulação.

Uma faixa de dose típica para os agonistas peptídicos seletivosdo receptor VPAC2 da presente invenção irá variar entre 1 pg por dia a cer-ca de 5.000 pg por dia. De preferência, a dose varia de cerca de 1 pg por diaa cerca de 2.500 pg por dia, mais preferivelmente de cerca de 1 pg por dia acerca de 1.000 pg por dia. Ainda mais preferivelmente, faixas de dose decerca de 5 pg por dia a cerca de 100 pg por dia. Uma faixa de dose preferidaé de cerca de 10 pg por dia a cerca de 50 pg por dia. Principalmente, a doseé de cerca de 20 pg por dia.

Um "indivíduo" é um mamífero-, de preferência um ser humano,mas também pode ser um animal, por exemplo, animais de estimação (porexemplo, cachorros, gatos, e similares), animais de criação (por exemplo,vacas, carneiros, porcos, cavalos, e similares) e animais de laboratório (porexemplo, ratos, camundongos, porquinhos-da-índia, e similares).

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 da presen-te invenção podem ser preparados pela utilização de métodos padronizadosde técnicas de síntese peptídica de fase sólida. Sintetizadores de peptídeosestão disponíveis comercialmente, por exemplo, por Rainin-11PTI SymphonyPeptide Synthesizer" (Tucson, AZ). Reagentes para síntese de fase sólidaestão disponíveis comercialmente, por exemplo, por Glycopep (Chicago, IL).Sintetizadores de peptídeos de fase sólida podem ser usados de acordo comas instruções do fabricante para bloqueio de grupos interferentes, proteçãodo aminoácido a ser reagido, acoplado, desacoplado, e cobertura de amino-ácidos não reagidos.

Tipicamente, um aminoácido oc-/V-protegido e o aminoácido doterminal N na cadeia peptídica em crescimento em uma resina são acopla-dos em temperatura ambiente em um solvente inerte como, por exemplo,dimetilformamida, N-metilpirrolidona ou cloreto de metileno, na presença deagentes de acoplamento como, por exemplo, dicicloexilcarbodiimida e 1-hidroxibenzotriazol, e uma base como, por exemplo, diisopropiletilamina. Ogrupo a-/V-protetor é removido da resina peptídica resultante com o uso deum reagente como, por exemplo, ácido trifluoracético ou piperidina, e a rea-ção de acoplamento repetida com o aminoácido N-protegido desejado se-guinte a ser adicionado à cadeia peptídica. Grupos de proteção amina ade-quados são bem-conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, emGreen e Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley e Sons,1991. Exemplos incluem t-butiloxicarbonil (t-Boc) e fluorenilmetoxicarbonil(Fmoc).

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 tambémpodem ser sintetizados com o uso de protocolos padronizados de síntese defase sólida automatizada que utilizam t-butoxicarbonil- ou fluorenilmetoxicar-bonil-alfa-aminoácidos com a proteção da cadeia lateral apropriada. Após otérmino da síntese, a modificação do terminal N pode ser obtida por reaçãodo grupo α-amino com, por exemplo: (i) ésteres ativos (com a utilização deprotocolos similares aos descritos acima para a introdução de um aminoáci-do α-Ν-protegido); (ii) aldeídos na presença de um agente redutor (procedi-mento de aminação redutora); e (iii) reagentes de guanidação. A seguir, ospeptídeos são clivados do suporte de fase sólida com desproteção simultâ-nea da cadeia lateral com o uso de métodos padronizados de fluoreto dehidrogênio ou ácido trifluoracético (TFA). Os peptídeos brutos são então adi-cionalmente purificados com o uso de cromatografia de fase reversa em co-lunas VYDAC C18 com o uso dé gradientes de acetonitrila em TFA 0,1%.Para a remoção da acetonitrila, os peptídeos são liofilizados por uma solu-ção que contém TFA 0,1%, acetonitrila e água. A pureza pode ser verificadapor cromatografia de fase reversa analítica. A identidade dos peptídeos podeser verificada por espectrometria de massa. Os peptídeos podem ser solubi-lizados em tampões aquosos em pH neutro.

Os agonistas peptídicos da presente invenção também podemser feitos por métodos recombinantes conhecidos na técnica com o uso dehospedeiros celulares eucarióticos e procarióticos.

Após a preparação e purificação de um peptídeo da presenteinvenção, ele pode ser modificado por ligação de forma covalente de uma oumais moléculas de PEG aos resíduos Cys, Lys, K(W) ou K(CO(CH2)2SH) nopeptídeo. Foi descrita na técnica uma ampla variedade de métodos para aprodução de peptídeos conjugados de forma covalente a PEG, e o métodoespecífico usado para a presente invenção não visa ser Iimitante (para umartigo de revisão, vide Roberts, M. et al. Advanced Drug Dellvery Revlews,54: 459-476, 2002).

Um exemplo de uma molécula de PEG que pode ser usada émetóxi-PEG2-MAL-40K, uma PEG-maleimida bifurcada (Nektar, Huntsville,Alabama). Outros exemplos incluem, sem limitação, mPEG-SBA-20K (Nek-tar) a granel, mPEG2-ALD-40K (Nektar) e metóxi-PEG-MAL-30K (Dow).

Um método para a preparação de agonistas peptídicos do recep-tor VPAC2 envolve o uso de PEG-maleimida para anexar diretamente PEG aum grupo tiol do peptídeo. A introdução de uma funcionalidade tiol pode serfeita por adição ou inserção de um resíduo Cys ou hC sobre ou no peptídeonas posições descritas acima. Uma funcionalidade tiol também pode ser in-troduzida na cadeia lateral do peptídeo (por exemplo, acilação do grupo ε-amino Iisina por um ácido que contém tiol, por exemplo, ácido mercaptopro-piônico). Um processo de PEGuilação da presente invenção utiliza a adiçãode Michael para formar um vinculador tioéter estável. A reação é altamenteespecífica, e ocorre sob condições leves na presença de outros grupos fun-cionais. PEG-maleimida tem sido usada como um polímero reativo para apreparação de conjugados PEG-proteína bioativos bem definidos. É preferí-vel que o procedimento utilize um excesso molar, de preferência, de 1 a 10molares em excesso de um agonista peptídico contendo tiol do receptorVPAC2 em relação à PEG-maleimida para levar a reação até o término. Asreações são realizadas preferivelmente em pH entre 4,0 e 9,0, em tempera-tura ambiente, por 10 minutos a 40 horas. O excesso de peptídeo não-PEGuiIado que contém tiol é facilmente separado do produto PEGuiIado pormétodos convencionais de separação. O agonista peptídico do receptorVPAC2 é isolado preferivelmente com o uso de HPLC de fase reversa oucromatografia por exclusão de tamanho. As condições específicas necessá-rias para a PEGuilação de agonistas peptídicos do receptor VPAC2 são a-presentadas no Exemplo 8. A PEGuilação de cisteína pode ser realizadacom o uso de PEG-maleimida ou PEG-maleimida bifurcada.Um método alternativo para a PEGuilação de agonistas peptídi-cos do receptor VPAC2 envolve a PEGuilação de um resíduo de Iisina com ouso de um derivado de PEG-succinimidila. A fim de obter PEGuilação sítio-específica, os resíduos Lys que não são usados para PEGuilação podemsubstituir resíduos Arg.

Outra abordagem para a PEGuilação é por meio da reação dePictet-Spengler. É necessário um resíduo Trp com sua amina livre para in-corporar a molécula de PEG em um peptídeo seletivo para o receptorVPAC2. Uma abordagem para que isso seja obtido é introduzir de forma sí-tio-específica um resíduo Trp na amina de uma cadeia lateral· de Lys pormeio de uma ligação amida durante a síntese de fase sólida (vide Exemplo 10).

A ciclização de um agonista peptídico do receptor VPAC2 podeser realizada em solução ou em um suporte sólido. A ciclização em um su-porte sólido pode ser feita imediatamente após a síntese de fase sólida dopeptídeo. Isso envolve a proteção seletiva ou ortogonal dos aminoácidos queserão ligados de forma covalente na ciclização.

Várias características e modalidades preferidas da presente in-venção serão agora descritas com referência aos seguintes exemplos não-limitantes.

Exemplo 1 - Preparação dos agonistas peptídicos seletivos do receptorVPAC2 por química de fase sólida t-Boc:

Aproximadamente 0,5-0,6 grama (0,38-0,45 mmol) de resina BocSer(BzI)-PAM é colocado em um vaso de reação padronizado de 60 ml. A-coplamentos duplos são feitos em um sintetizador de peptídeos Applied Bi-osystems ABI430A. Os aminoácidos protegidos da cadeia lateral (cartuchosde 2 mmols de aminoácidos Boc) seguintes são obtidos de Midwest Biotech(Fishers, IN) e são usados na síntese:

Arg-tosil (Tos), Asp-cicloexila éster (OcHx), Asp-9-fluorenilmetila(Fm), Cys-p-metilbenzila (p-MeBzl), Glu-cicloexila éster (OcHx), His-benziloximetila(Bom), Lys-2-clorobenziloxicarbonil (2CI-Z), Lys-9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc), Orn-2-clorobenziloxicarbonil (2CI-Z), Ser-O-benzila éter (OBzl), Thr-O-benzila éter (OBzI)1 Trp-formil (CHO), Tyr-2-bromobenziloxicarbonil (2Br-Z), resina Boc-Ser(OBzI) PAM e resina MBHA.Ácido trifluoracético (TFA), di-isopropiletilamina (DiEA)1 1,0 M de hidroxiben-zotriazol (HOBt) em NMP e 1,0 M de dicicloexilcarbodiimida (DCC) em NMPforam adquiridos de PE-AppIied Biosystems (Foster City, CA). Dimetilforma-mida (DMF-Burdick e Jackson) e diclorometano (DCM-MaIIinkrodt) foramadquiridos de Mays Chemical Co. (Indianapolis, IN). Benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonioexafluorofosfato (BOP) foi obtido de NovaBiochem(San Diego, CA).

São feitos acoplamentos duplos padronizados com o uso de és-teres de anidrido assimétrico ou HOBt, ambos formados com o uso de DCC.Ao término das sínteses, o grupo Boc do terminal N é removido, e as resinasde peptidila são tratadas com piperidina 20% em DMF para desformilar acadeia lateral Trp, caso Trp esteja presente na seqüência. Para a acilaçãodo terminal N, um excesso de quatro vezes de anidrido assimétrico do ácidocorrespondente é adicionado à resina peptídica. O anidrido assimétrico épreparado por ativação de diisopropilcarbodiimida (DIC) em DCM. Permite-se que a reação proceda por 4 horas, e ela é monitorada pelo teste de ninhi-drina. Após lavagem com DCM, as resinas são transferidas para um vaso dereação de TEFLON e são secas in vácuo.

As clivagens são feitas por anexação dos vasos de reação a umaparelho de HF (ácido fluorídrico) (Penninsula Laboratories). Um ml de m-cresol por grama/resina é adicionado, e 10 ml de HF (adquirido de AGA, In-dianapolis, IN) são condensados no vaso pré-resfriado. Um ml DMS porgrama de resina é adicionado quando metionina estiver presente. As rea-ções são agitadas uma hora em um banho de gelo. O HF é removido in vá-cuo. Os resíduos são suspensos em éter etílico. Os sólidos são filtrados esão lavados com éter. Cada peptídeo é extraído em ácido acético aquoso eliofilizado ou carregado diretamente em uma coluna de fase reversa.

As purificações são feitas em uma coluna VYDAC C18 de 2,2 χ25 cm em tampão A (TFA 0,1% em água). Um gradiente de 20% a 90% B(TFA 0,1% em acetonitrila) é executado em uma HPLC (Waters) ao longo de120 minutos a 10 ml/minuto, enquanto se monitora o UV a 280 nm (4,0 A) ese coletam frações de um minuto. As frações apropriadas são combinadas,congeladas e üofilizadas. Os produtos secos são analisados por HPLC (ME-TASILAQ C18 0,46 χ 15 cm) e espectrometria de massa MALDI.

Os agonistas peptídicos cíclicos do receptor VPAC2 com umaponte de Iactama que ligam um resíduo de Iisina e um resíduo de ácido as-pártico podem ser preparados protegendo-se seletivamente as cadeias late-rais dos resíduos de Iisina e de ácido aspártico com Fmoc e Fm, respectiva-mente. Todos os outros aminoácidos usados na síntese são Boc-aminoácidos padronizados protegidos de cadeia lateral benzila. A ciclizaçãopode então ser realizada no suporte sólido, imediatamente após a síntese defase sólida do peptídeo. Os grupos de proteção Fmoc e Fm são removidosseletivamente, e a ciclização é feita por ativação do grupo carboxila do ácidoaspártico com BOP na presença de DIEA. Permite-se que a reação procedapor 24 horas, e ela é monitorada pelo teste de ninhidrina.

Exemplo 2 - Preparação dos agonistas peptídicos seletivos do receptorVPAC2 por química de fase sólida FMoc:

Aproximadamente 114 mg (50 mMols) de resina WANG FMOCSer(tBu) (adquirida de GIycoPep, Chicago, IL) são colocados em cada vasode reação. A síntese é feita em um sintetizador de peptídeos Rainin Sym-phony. Análogos com uma amida no terminal C são preparados com o usode 75 mg (50 μη-iols) de resina Rink Amide AM (Rapp Polymere. Tuebingen,Alemanha).

Os aminoácidos Fmoc a seguir foram adquiridos de GIycoPep(Chicago, IL), e NovaBiochem (La Jolla, CA): Arg-2,2,4,6,7-pentametildiidrobenzofuran-5-sulfonil (Pbf), Asn-tritil (Trt), éster Asp-p-t-butílico (tBu), éster Asp-p-alílico (Alila), éster Glu-ô-t-butílico (tBu), éster Glu-δ-alílico (Alila), Gln-tritil (Trt), His-tritil (Trt), Lys-t-butiloxicarbonil (Boc), Lys-aliloxicarbonil (Aloc), Orn-aliloxicarbonil (Aloc), éter Ser-t-butílico (OtBu), éterThr-t-butílico (OtBu), Trp-t-butiloxicarbonil (Boc), éter Tyr-t-butílico (OtBu).

Os solventes dimetilformamida (DMF-Burdick e Jackson), N-metila pirrolidona (NMP-Burdick e Jackson), diclorometano (DCM-Mallinkrodt) foram adquiridos de Mays Chemical Co. (Indianapolis, IN).

Hidroxibenzotrizol (HOBt), diisopropilcarbodiimida (DIC), diiso-propiletilamina (DIEA) e piperidina (Pip) foram adquiridos de Aldrich Chemi-cal Co (Milwaukee, Wl). Benzotriazol-1-il-óxi-tris-(dimetilamino)-fosfonioexa-fluorofosfato (BOP) foi obtido de NovaBiochem (San Diego, CA).

Todos os aminoácidos são dissolvidos em 0,3 M em DMF. Sãofeitos acoplamentos de três horas ativados por DIC/HOBt após 20 minutosde desproteção com o uso de piperidina 20%/DMF. Cada resina é lavadacom DMF após as desproteções e os acoplamentos. Após o último acopla-mento e desproteção, as resinas de peptidila são lavadas com DCM, e sãosecas in vácuo no vaso de reação. Para a acilação do terminal N, é adicio-nado um excesso de quatro vezes de anidrido assimétrico do ácido corres-pondente na resina peptídica. O anidrido assimétrico é preparado por ativa-ção de DIC em DCM. Permite-se que a reação proceda por 4 horas, e ela émonitorada pelo teste de ninhidrina. A resina peptídica é então lavada comDCM e seca in vácuo.

A reação de clivagem é misturada por 2 horas com um coquetelde clivagem que consiste em 0,2 ml de tioanisol, 0,2 ml de metanol, 0,4 mlde triisopropilsilano, por 10 ml de TFA, todos adquiridos de Aldrich ChemicalCo., Milwaukee, Wl. Caso Cys esteja presente na seqüência, são adiciona-dos 2% de etanoditiol. Os filtrados de TFA são adicionados a 40 ml de éteretílico. Os precipitantes são centrifugados por 2 minutos a 2.000 rpm. Ossobrenadantes são decantados. Os péletes são ressuspensos em 40 ml deéter, recentrifugados, redecantados, secos sob nitrogênio e depois in vácuo.

É dissolvido 0,3-0,6 mg de cada produto em 1 ml de TFA0,1%/acetonitrila (ACN), com 20 μΙ sendo analisados em HPLC [METASILAQ C180,46 χ 15 cm, 1 ml/min, 45°C, 214 nM (0,2 A), A = TFA 0,1%, B =TFA 0,1%/ACN 50%. Gradiente = 50% B a 90% B ao longo de 30 minutos].

As purificações são feitas em uma coluna VYDAC C18 de 2,2 χ25 cm em tampão A (TFA 0,1% em água). Um gradiente de 20% a 90% B(TFA 0,1% em acetonitrila) é executado em uma HPLC (Waters) ao longo de120 minutos a 10 ml/minuto, enquanto se monitora o UV a 280 nm (4.OA) ese coletam frações de 1 minuto. As frações apropriadas são combinadas,congeladas e liofilizadas. Os produtos secos são analisados por HPLC (ME-TASIL AQ C18 0,46 χ 15 cm) e espectrometria de massa MALDI.

Os agonistas peptfdicos cíclicos do receptor VPAC2 com umaponte de Iactama que ligam um resíduo de Iisina e um resíduo de ácido as-pártico são preparados protegendo-se seletivamente as cadeias laterais doresíduo de Iisina e do resíduo de ácido aspártico com Aloc e Alila, respecti-vamente. Todos os outros aminoácidos usados na síntese são Fmoc-aminoácidos padronizados protegidos de cadeia lateral t-Butila.

A ciclização pode então ser realizada no suporte sólido imedia-tamente após a síntese de fase sólida do peptídeo. Os grupos de proteçãoAloc e Alila são removidos seletivamente, e a ciclização é feita por ativaçãodo grupo carboxila do ácido aspártico com BOP na presença de DIEA.Preparação de P603 pela química de fase sólida Fmoc:

Aproximadamente 75 mg (50 pMols) de resina de poliestirenoRink Amide AM (Rapp Polymere GmbH, Tubingen1 Alemanha) são coloca-dos em um vaso de reação. Fmoc-Lys-aliloxicarbonil (AIoc) é usado no pri-meiro ciclo sintético da síntese automatizada com o uso de um sintetizadorde peptídeos Rainin Symphony. O alongamento da resina peptídica é feitocomo descrito acima no Exemplo 2. Após o término do alongamento automa-tizado do peptídeo-resina, incluindo acilação de C6-terminal Ν, o grupo deproteção Aloc é removido manualmente com o uso de Tetrakis (trifenilfosfi-na) paládio (O) [100 μΜοΙ] em DCM-acético ácido-piperidina (92:5:3, v/v/v)(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl) por 20 minutos, a 25°C. Essa etapa érepetida duas vezes. A resina desprotegida de aloc é então lavada com DI-EA 5% em DCM e 0,03 M de triidrato de dietilditiocarbamato de sódio (Aldri-ch Chemical Co., Milwaukee, Wl) em DMF. Fmoc-Glu-a-OtBu éster (500pMols; adquirido de NovaBiochem, La Jolla, CA) é incorporado manualmen-te com o uso de DIC (500 pMols) e HOBt (500 pMols) em DMF por 2 horas,a 25°C. Após remoção subseqüente de Fmoc, é incorporado ácido palmítico(500 μΜοl; adquirido de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl) com o uso domesmo método usado para Fmoc-Glu-a-OtBu éster. A clivagem do peptídeoda resina e a purificação são realizadas da forma descrita no Exemplo 2.

Exemplo 3 - Potência in vitro em receptores VPAC2 humanos:

Teste alfa: As células (células CHO-S que expressam estavel-mente receptores VPAC2 humanos) são lavadas no frasco de cultura umavez com PBS. A seguir, as células são enxaguadas com tampão de dissoci-ação sem enzimas. As células dissociadas são removidas. As células sãoentão centrifugadas e lavadas em tampão de estimulação. Para cada pontode dados, são usadas 50.000 células suspensas em tampão de estimulação.A esse tampão, glóbulos receptores de teste Alfa são adicionados juntamen-te com os estímulos. Essa mistura é incubada por 60 minutos. Tampão delise e glóbulos doadores de teste Alfa são adicionados e incubados por 60 a120 minutos. O sinal do teste Alfa (indicativo de níveis de cAMP intracelular)é lido em um instrumento adequado (por exemplo, AIphaQuest de Perkin-Elmer). Etapas que incluem os glóbulos doadores e receptores de teste Alfasão realizadas em luz reduzida. A EC50 para a geração de cAMP é calculadaa partir do sinal bruto, ou é baseada nos níveis absolutos de cAMP determi-nados por uma curva padrão realizada em cada placa. Os resultados paracada agonista são, no mínimo, de duas análises realizadas em uma únicarodada. Para alguns agonistas, os resultados são a média de mais de umarodada. As concentrações de peptídeo testadas são: 10.000, 1.000, 100, 10,3, 1, 0,1, 0,01, 0,003, 0,001, 0,0001 e 0,00001 nM.

DiscoveRx: Uma linhagem de células CHO-S que expressamestavelmente o receptor VPAC2 humano em uma placa de microtitulação de96 poços é semeada com 50.000 células/poço no dia anterior ao ensaio.Permite-se que as células sejam aderidas por 24 horas em 200 μΙ de meiode cultura. No dia do experimento, o meio é removido. Além disso, as célulassão lavadas duas vezes. As células são incubadas em tampão de ensaiomais IBMX por 15 minutos em temperatura ambiente. A seguir, os estímulossão adicionados e são dissolvidos em tampão de ensaio. Os estímulos estãopresentes por 30 minutos. A seguir, o tampão de ensaio é gentilmente remo-vido. O reagente de Iise celular do kit de cAMP DiscoveRx é adicionado. De-pois, é usado o protocolo-padrão para o desenvolvimento do sinal de cAMP,como descrito pelo fabricante (DiscoveRx Inc., USA). Os valores para a ge-ração de cAMP são calculados a partir do sinal bruto, ou são baseados nosníveis absolutos de cAMP determinados por uma curva-padrão realizada emcada placa. As concentrações de peptídeo tipicamente testadas são: 1.000,300, 100, 10, 1, 0,3, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 e 0 nM.

A atividade (EC50 (nM)) para os receptores VPAC2 humanos érelatada na Tabela 1 para os diferentes formatos de ensaio.

Tabela 1. Potência do peptídeo em receptores VPAC2 humanos

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Exemplo 4 - Seletividade:

Ensaios de ligação: são usadas membranas preparadas a partirde uma linhagem estável de células VPAC2 (vide Exemplo 3) ou de célulastransfectadas transitoriamente com VPAC1 ou PAC1 humano. É realizadoum ensaio de ligação de filtro com uso de PACAP-27 marcado com 125I paraVPAC1, VPAC2 e PAC1 como traçador.

Para esse ensaio, as soluções e o equipamento incluem:

- Solução pré-embebida: polietilenoamina 0,5% em água destila-da

- tampão para enxágüe das placas de filtro: 25 mM de HEPESPH 7,4

- Tampão de bloqueio: 25 mM de HEPES pH 7,4; BSA 0,2% semprotease

- Tampão de ensaio: 25 mM de HEPES pH 7,4; BSA 0,5% semprotease

- Placa de diluição e de ensaio: microplaca PS, em forma de "U"

- Placa de filtração: placa "Multiscreen FB Opaque"; filtro de fibrade vidro de 1,0 μΜ Tipo B

A fim de preparar as placas de filtro, a solução pré-embebida éaspirada por filtração a vácuo. As placas são enxaguadas duas vezes com200 μΙ de tampão de enxágüe. São adicionados 200 μΙ de tampão de blo-queio à placa de filtro. A placa de filtro é então incubada com 200 μΙ de solu-ção pré-embebida por 1 hora em temperatura ambiente.

A placa de ensaio é preenchida com 25 μΙ de tampão de ensaio,25 μΙ de membranas (2,5 μς) suspensas em tampão de ensaio, 25 μΙ decomposto (agonista) em tampão de ensaio e 25 μΙ de traçador (cerca de40.000 cpm) em tampão de ensaio. A placa preenchida é incubada por 1hora com agitação.

É feita a transferência da placa de ensaio para a placa de filtro.

O tampão de bloqueio é aspirado por filtração a vácuo e lavado duas vezestampão de enxágüe. São transferidos 90 μΙ da placa de ensaio para a placade filtro. Os 90 μΙ transferidos da placa de ensaio são aspirados e lavadostrês vezes com 200 μΙ de tampão de enxágüe. O suporte plástico é removi-do. Ele é seco por 1 hora a 60 °C. São acrescentados 30 μΙ de Microscint. Éfeita a contagem.

Exemplo 5 - Potência in vitro em receptores VPAC1 e VPAC2 de ratos:

DiscoveRx: células CHO-PO são transfectadas transitoriamentecom DNA de receptor VPAC1 ou VPAC2 de rato com o uso de reagentes detransfecção disponíveis comercialmente (Lipofectamina de Invitrogen). Ascélulas são semeadas em uma densidade de 10.000/poço em uma placa de96 poços, e permite-se que elas cresçam por 3 dias em 200 ml de meio decultura. No 3e dia, o ensaio é realizado.

No dia do experimento, o meio é removido. Além disso, as célu-las são lavadas duas vezes. As células são incubadas em tampão de ensaiomais IBMX por 15 minutos em temperatura ambiente. A seguir, são adicio-nados os estímulos e são dissolvidos em tampão de ensaio. Os estímulosestão presentes por 30 minutos. A seguir, o tampão de ensaio é gentilmenteremovido. O reagente de Iise celular do kit de cAMP DiscoveRx é adiciona-do. Depois, é usado o protocolo-padrão para o desenvolvimento do sinal decAMP, como descrito pelo fabricante (DiscoveRx Inc., USA). Os valores deEC50 para a geração de cAMP são calculados a partir do sinal bruto, ou sãobaseados nos níveis absolutos de cAMP determinados por uma curva-padrão realizada em cada placa. As concentrações de peptídeo tipicamentetestadas são: 1.000, 300, 100, 10, 1, 0,3, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 é 0 nM.

Exemplo 6 - Ensaios in vivo:

Teste de tolerância à glicose intravenosa (IVGTT): ratos Wistarsão colocados em jejum de um dia para o outro e são anestesiados antes doexperimento. Um cateter para coleta de amostras de sangue é inserido nosratos. O agonista é administrado por via subcutânea, normalmente 24 horasantes do ataque com glicose. São coletadas amostras de sangue da artériacarótida/Uma amostra de sangue é retirada imediatamente antes da injeçãode glicose juntamente com o agonista. Após a amostra de sangue inicial,glicose misturada é injetada por via intravenosa (i.v.). É feito um ataque deglicose de 0,5 g/kg de peso corporal, injetando-se um total de 1,5 ml de veí-culo com glicose e agonista por kg de peso corporal. As concentrações depeptídeo são variadas para a produção da dose desejada em pg/kg. Sãocoletadas amostras de sangue em 2, 4, 6 e 10 minutos após a administraçãode glicose. O grupo de animais de controle recebe o mesmo veículo juntocom glicose, mas sem a adição de agonistas. Em alguns casos, foram cole-tadas amostras de sangue 20 e 30 minutos pós-glicose. É adicionada aproti-nina à amostra de sangue (250-500 klU/ml de sangue). O plasma é entãoanalisado quanto à glicose e insulina com o uso de metodologias padronizadas.

O ensaio utiliza um estoque de peptídeo formulado e calibradoem PBS. Normalmente, esse estoque é um estoque pré-diluído de 100 μΜ.No entanto, um estoque mais concentrado, com aproximadamente 1 mg deagonista por ml, é usado. A concentração específica é sempre conhecida. Avariabilidade da resposta máxima ocorre principalmente em função da varia-bilidade da dose de veículo.Os detalhes do protocolo são os seguintes:

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Exemplo 7 - Estudos de estabilidade sérica em ratos:

A fim de determinar a estabilidade de agonistas peptídicos doreceptor VPAC2 em soro de rato, clone Ng 6 de células CHO-VPAC2 (placasde 96 poços/50.000 células/poço e cultura de 1 dia), PBS 1X (Gibco), ospeptídeos para a análise em uma solução de estoque de 100 μΜ, soro derato de um rato Wistar normal sacrificado, aprotinina e um kit de ensaio Dis-coveRx são obtidos. O soro de rato é estocado a 4°C até ser utilizado, e éusado em até duas semanas.

No Dia 0, são preparadas duas alíquotas de 100 μΙ de 10 μΜ depeptídeo em soro de rato por adição de 10 μΙ de estoque de peptídeo a 90 μΙde soro de rato para cada alíquota. São adicionadas 250 klU de aprotinina/ml a uma dessas alíquotas. A alíquota é estocada com aprotinina a 4°C. Aalíquota é estocada sem aprotinina a 37°C. As alíquotas são incubadas por 24 horas.

No 12 Dia, após incubação das alíquotas preparadas no dia 0 por24 horas, é preparado um tampão de incubação contendo PBS + 1,3 mM deCaCI2, 1,2 mM de MgCI2, 2 mM de glicose e 0,5 mM de IBMX. É preparadauma placa com 11 diluições seriais de 3x de peptídeo no soro para a alíquo-ta a 4°C e 37°C para cada peptídeo estudado. São usados 4.000 nM como aconcentração máxima. As placas com células são lavadas duas vezes emtampão de incubação, e as células são incubadas em 50 μΙ de meio de incu-bação por poço por 15 minutos. São transferidos 50 μΙ da solução às célulasda placa preparada com 11 diluições seriais de 3x de peptídeo para a alíquo-ta a 4°C e 37°C para cada peptídeo estudado, com o uso das concentraçõesmáximas que são indicadas pelo teste primário, em duplicata. Essa etapadilui a concentração de peptídeo por um fator de dois. As células são incu-badas em temperatura ambiente por 30 minutos. O sobrenadante é removi-do. São acrescentados 40 μΙ/poço do anticorpo/ tampão extração de Disco-veRx. As células são incubadas na agitadora (300 rpm) por 1 hora. É segui-do o procedimento normal com o kit DiscoveRx. Os padrões de cAMP sãoincluídos na coluna 12. Os valores EC50 são determinados a partir dos dadosdo ensaio de cAMP. A quantidade restante de peptídeo ativo é estimada pe-la fórmula EC50,4c/EC5o, 37c para cada condição.

Tabela 5 Estabilidade estimada de peptídeo após 24 horas em soro de rato a37°C

Agonista Ne % de estabilidade1P603 67

1VaIores >100% podem representar a liberação de peptídeo intato pelo con-jugado de PEG

Exemplo 8 - PEGuilação de aqonistas peptídicos seletivos do receptorVPAC2 com o uso de química baseada em tiol:

Em geral, as reações de PEGuilação são executadas sob condi-ções que permitem a formação de uma ligação tioéter. Especificamente, opH da solução varia de cerca de 4 a 9, e as concentrações de peptídeo quecontém tiol variam de 0,7 a 10 de excesso molar da concentração de PEG-maleimida. As reações de PEGuilação são normalmente executadas emtemperatura ambiente. O agonista peptídico do receptor VPAC2 é então iso-lado usando HPLC de fase reversa ou cromatografia por exclusão de tama-nho (SEC). Os análogos de peptídeo PEGuilado são caracterizados com autilização de RP-HPLC analítica, HPLC-SEC, SDS-PAGE e/ou espectrome-tria de massa MALDI.

Normalmente, uma função tiol é introduzida em ou sobre um a -gonista peptídico seletivo do receptor VPAC2 por adição de uma cisteína ouuma homocisteína ou uma porção que contém tiol em um dos terminais ouem ambos os terminais ou por inserção de uma cisteína ou uma homocisteí-na ou uma porção que contém tiol na seqüência. Agonistas peptídicos quecontêm tiol do receptor VPAC2 são reagidos com 40 kDa, 30 kDa ou 20 kDade PEG-maleimida para a produção de derivados com PEG anexados deforma covalente por meio de uma ligação tioéter.

Exemplo 9 - PEGuilação por meio de acilação na cadeia lateral de lisina:

A fim de obter PEGuilação sítio-específica de agonistas peptídi-cos seletivos do receptor VPAC2, todos os resíduos Lys foram trocados porresíduos Arg, exceto para resíduos Lys onde se deseja PEGuilação. Umamolécula de PEG que pode ser usada é mPEG-SBA-20K (Nektar, Lote N3 :PT-04E-11). A reação de PEGuilação é realizada preferivelmente em tempe-ratura ambiente por 2-3 horas. O peptídeo é purificado por HPLC preparató-ria.

Exemplo 10 - PEGuilação por meio da reação de Pictet-Spenqler

Para que ocorra a PEGuilação por meio da reação de Pictet-Spengler, é necessário um resíduo Trp com sua amina livre para incorporara molécula de PEG no agonista peptídico seletivo do receptor VPAC2. Umaabordagem para que isso seja obtido é o acoplamento de um resíduo Trp nacadeia lateral de Lys. A SAR intensa indica que essa modificação não alteraas propriedades do peptídeo parente em termos de sua potência e seletivi-dade in viíro.

PEG com um aldeído funcional, por exemplo, mPEG2-BUTYRALD-40K (Nektar, USA), é usado para a reação. A PEGuilação sítio-específica envolve a formação de um anel tetracarbolino entre PEG e o pep-tídeo. A PEGuilação é feita em ácido acético glacial em temperatura ambien-te por 1 a 48 horas. Um excesso de 1 a 10 molares do PEG-aldeído é usadona reação. Após a remoção de acético ácido, o agonista peptídico do recep-tor VPAC2 é isolado por RP-HPLC preparatória.

Outras modificações da presente invenção ficarão evidentes pa-ra aqueles versados na técnica, sem se afastar do escopo da invenção.LISTAGEM DE SEQÜENCIA

<110>

<120><130><150><151><160><170><210><211><212><213><220><223><22 0><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>

Eli Lilly e CompanyZhang, LianshanAlsina-Fernandez, Jorge

AGONISTAS PEPTÍDICOS SELETIVOS DO RECEPTOR VPAC2X17364 WOUS 60/743,3662006-02-288

PatentIn versão 3.3 -

1

32PRT

Seqüência artificial

Seqüência sintética: agonista peptídeo do receptor VPAC2

REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO<1)..(1)

Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é His ou dH

REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO(2)..(2)

Xaa é dA, Ser, Vai, Gly, Thr, Leu, dS, Pro, ou Aib

REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

(3)..(3)

Xaa é Asp ou Glu

REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

(4)..(4)

Xaa é Ala, lie, Tyr, Phe, Vai, Thr, Leu, Trp, Gly, dA, Aib, ouNMeA

<22 0>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (5).. (5)

<223> Xaa é Vai, Leu, Phe, He, Thr, Trp, Tyr, dV, Aib, ou NMeV<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (6).. (6)

<223> Xaa é Phe, lie, Leu, Thr, Vai, Trp, ou Tyr

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (8)..(8)

<223> Xaa é Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg, ou Tyr<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (9) .. (9)

<223> Xaa é Asn, Gln, Glu, Ser, Cys, ou K(CO(CH2)2SH)<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (10).. (10)

<223> Xaa é Tyr, Trp, ou Tyr(OMe)<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (12) . . (12)

<223> Xaa é Arg, Lys, hR, Orn, Aib, Ala, Leu, Gln, Phe, ou Cys<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (13).. (13)

<223> Xaa é Leu, Phe, Glu, Ala, Aib, Ser, Cys, ou K(CO(CH2)2SH)

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (14).. (14)<223> Xaa é Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Phe, Gln, Aib, ou Cit<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE EIOLÓGICO

<222> (15)..(15)

<223> Xaa é Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, Orn, Phe, Gln, Aib, K(Ac), Cys,K(W), ou K(CO(CH2)2SH)

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (16)..(16)

<223> Xaa é Gln, Lys, Ala,' Ser, Cys", ou K (CO (CH2) 2SH)<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (17).. (17)

<223> Xaa é Vai, Ala, Leu, He, Met, Nle, Lys, Aib, Ser, Cys,

K(CO(CH2)2SH), ou K(W)<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (18)..(18)

<223> Xaa é Ala, Ser, Cys, ou Abu<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (19)..(19)

<223> Xaa é Ala, Leu, Gly, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), ou Abu<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (20).. (20)

<223> Xaa é Lys, Gln, hR, Arg, Ser, Orn, Ala, Aib, Trp, Thr, Leu, lie,Phe. Tyr, Vai, K(Ac), Cys, ou K(CO(CH2)2SH)

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (21)..(21)

<223> Xaa é Lys, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac), Ser,Cys, K(W), K(CO(CH2)2SH), ou hC

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (22) . . (22)

<223> Xaa é Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, lie, Vai, Tyr(OMe), Ala, Aib, ouSer

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (23).. (23)

<223> - Xaa é Leu,'Phe, Ilè, Ala, Trp, Thr, Vai, Aib, ou Ser<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (24).. (24)

<223> Xaa é Gln, Asn, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), ou K(W)

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (25).. (25)

<223> Xaa é Ser, Asp, Phe, lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Gln, Asn, Tyr,Aib, Glu, Cys, K(CO(CH2 j 2SH), ou hC

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (26)..(26)

<223> Xaa é lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Tyr, Phe, Aib, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH), ou K(W)

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (27).. (27)

<223> Xaa é Lys, hR, Arg, Gln, Orn, ou dK<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (28) .. (28)

<223> Xaa é Asn, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Pro, dK, Cys,K(CO(CH2)2SH), ou K(W)

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (29).. (32)

<223> Qualquer Xaa pode estar presente ou ausente. Se qualquer Xaaestá ausente, o próximo aminoácido a jusante é o próximo amino-ácido na seqüência de peptídeo agonista.

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (29) . . (29)

<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Lys, Ser,

Arg, Asn, hR, Cys, ou Orn

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (30) . . (30)

<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Arg, Lys,Ile, ou hR

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (31)..(31)

<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Tyr, His,

Phe, ou Gln

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (32).. (32)

<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Cys

<400> 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30

<210> 2<211> 32

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintética: agonista peptídeo do receptor VPAC2<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (3) .. (3)

<223> Xaa é Asp ou Glu<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (8)..(8)

<223> Xaa é Asp1 Glu, Ala, Lys, Leu, Arg, ou Tyr<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (9) . . (9)

<223> Xaa é Asn, Gln, Glu, Ser, Cys, ou K(CO(CH2)2SH)<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (10)..(10)

<223> Xaa é Tyr, Trp, ou Tyr(OMe)<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (12)..(12)

<223> Xaa é Arg, Lys, hR, Orn, Aib, Ala, Leu, Gln, Phe, ou Cys<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (13)..(13)

<223> Xaa é Leu, Phe, Glu, Ala, Aib, Ser, Cys, ou K(CO(CH2)2SH)

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (14)..(14)<223> Xaa é Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Phe, Gln, Aib, ou Cit<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (15).. (15)

<223> Xaa é Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, Orn, Phe, Gln, Aib, K(Ac), Cys,K(W), ou K(CO(CH2)2SH

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (16)..(16)

<223> Xaa é Gln, Lys, Ala, Ser, Cys, ou K(CO(CH2)2SH)'<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (17)..(17)

<223> Xaa é Vai, Ala, Leu, He, Met, Nle, Lys, Aib, Ser, Cys,

K (CO (CH2 ) 2 SH) , ou K(W)<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (18)..(18)

<223> Xaa é Ala, Ser, Cys, ou Abu<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (19).. (19)

<223> Xaa é Ala, Leu, Gly, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), ou Abu<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (20)..(20)

<223> Xaa é Lys, Gln, hR, Arg, Ser, Orn, Ala, Aib, Trp, Thr, Leu, lie,Phe, Tyr, Vai, K(Ac), Cys. ou K(CO(CH2)2SH)

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (21)..(21)

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (22).. (22)

<223> Xaa é Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, lie, Vai, Tyr(OMe), Ala, Aib, ouSer

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (23)..(23)

<223> Xaa é Leu, Phe, lie, 'Ala, Trp, Thr, Vai, Aib, ou Ser<22 0>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (24).. (24)

<223> Xaa é Gln, Asn, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), ou K(W)

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (25)..(25)

<223> Xaa é Ser, Asp, Phe, lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Gln, Asn, Tyr,Aib, Glu, Cys, K(CO(CH2)2SH), ou hC

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (26)..(26)

<223> Xaa é lie. Leu, Thr, Vai, Trp, Tyr, Phe, Aib, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH), ou K(W)

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (27).. (27)

<223> Xaa é Lys, hR, Arg, Gln, Orn, ou dK<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (28)..(28)

<223> Xaa é Asn, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Pro, dK, Cys,K(CO(CH2)2SH), OUK(W)

<220><221><222><223>

<220><221><222><223><400>Kis Ser1

Xaa Xaa<210>

REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO(29)..(32)

Qualquer Xaa pode estar presente ou ausente. Se qualquer Xaaestá ausente, o próximo aminoácido a jusante é o próximo amino-ácido na seqüência de peptídeo agonista.

REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

(29)..(29)

Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Lys, Ser,Arg, Asn, hR, Cys, ou Orn

REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

(30)..(30)

Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Arg, Lys,Ile, ou hR

REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

(31)..(31)

Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Tyr, His,Phe, ou Gln

REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

(32).. (32)

Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Cys2

Xaa Ala Val Phe Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30

3<211> 28<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln15 10 15

Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn20 25

<210> 4<211> 27<212> PRT<213> Homo sapiens<220> <221> M0D_RES<222> (27) . . (27)<223> AMIDAÇÃ0<400> 4His Ser Asp Gly Ile Phe Thr 1 5Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu 20<210> 5<211> 37<212> PRT<213> Homo sapiens<220> <221> M0D_RES<222> (37) . . (37)<223> AMIDAÇÃO<400> 5His Ser Asp Gly Ile Phe Thr1 5Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Gln

20 25 30

Arg Val Lys Asn Lys35

<210> 69

PRT

Seqüência artificial

<211><212><213><220><223>

<400>

Seqüência sintética: modificação N-terminal a um agonista doreceptor VPAC2 em que o Arg na posição 9 está ligado à termina-ção N do peptídeo agonista.6

Ser Trp Cys Glu Pro Gly Trp Cys Arg

1

<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222>

7

39PRT

Seqüência artificial

Seqüência sintética: agonista peptídeo do receptor VPAC2 P603

M0D_RES(1).- (1)Acilação C6

M0D_RES(10)..(10)Metóxi

M0D_RES(12)..(12)<223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222>

Orn

MOD_RES(15)..(15)Aib

MOD_RES

(19).. (19)Abu

MOD_RES

(20)..(20)Aib

MOD_RES(21)..(21)Orn

MOD_RES(23) . . (23)Aib

MOD_RES(25) . . (25)Aib

MOD_RES(27) . . (28)Orn

MOD_RES(39) . . (39)<223> Resíduo lisina C-terminal tem um resíduo de ácido glutâmico, queé acilado no grupo alfa-amino com ácido palmítico, preso a ca-deia lateral.

<220><221><222><223><400>

MOD_RES(39)..(39)AMIDAÇÃO

7

His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15

Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Lys35

811PRT

Seqüência artificial

<210><211><212><213><220><223>

<220><223><220><221><222><223>

Seqüência sintética: extensão C-terminal de um agonista peptídeodo receptor VPAC2.

Aminoácido C-terminal pode ser amidado.

M0D_RES(11)..(11)

Resíduo lisina C-terminal tem um resíduo de ácido glutâmico, queé acilado no grupo alfa-amino com ácido palmítico, preso a ca-deia lateral.<400> 8

Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Lys1 5 I0

Claims

1. Agonista peptídico do receptor VPAC2 que compreende umaseqüência da fórmula:Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Thr-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Xaai2-Xaa-I3- Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaai8-Xaaig-Xaa20-Xaa2I-Xaa22- Xa-a23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa2g-Xaa3o-Xaa31-Xaa32Fórmula 1 (ID. DE SEQ. N9:1)em que:Xaa1 é: His1 dH ou está ausente;Xaa2 é: dA, Ser, Vai, Gly, Thr, Leu, dS, Pro ou Aib;Xaa3 é: Asp ou Glu;Xaa4 é: Ala, lie, Tyr, Phe, Vai, Thr, Leu, Trp, Gly, dA, Aib ouNMeA;Xaa5 é: Vai, Leu, Phe, He, Thr, Trp1 Tyr, dV, Aib ou NMeV;Xaa6 é: Phe, lie, Leu, Thr, Vai, Trp ou Tyr;Xaa8 é: Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg ou Tyr;Xaa9 é: Asn, Gln, Glu1 Ser, Cys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa1O é: Tyr, Trp ou Tyr(OMe);Xaa12 é: Arg, Lys, hR, Om, Aib, Ala, Leu, Gln, Phe ou Cys;Xaa13 é: Leu, Phe, Glu, Ala, Aib, Ser, Cys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa14 é: Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn1 Phe, Gln, Aib ou Cit;Xaa15 é: Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, Orn, Phe, Gln, Aib, K(Ac), Cys,K(W) ou K(CO(CH2)2SH);Xaa16 é: Gln1 Lys, Ala, Ser, Cys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa17 é: Vai, Ala, Leu, lie, Met, Nle, Lys, Aib, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa18 é: Ala, Ser, Cys ou Abu;Xaa19 é: Ala, Leu, Gly, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH) ou Abu;Xaa20 é: Lys, Gln, hR, Arg, Ser, Orn, Ala, Aib, Trp, Thr, Leu, lie,Phe, Tyr, Vai, K(Ac), Cys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa21 é: Lys, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac), Ser,Cys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou hC;Xaa22 é: Tyr, Trp, Phe1 Thr, Leu1 lie, Vai, Tyr(OMe), Ala, Aib ouSer;Xaa23 é: Leu, Phe, lie, Ala, Trp, Thr, Vai, Aib ou Ser;Xaa24 é: Gln, Asn, Ser, Cys1 K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa25 é: Ser, Asp, Phe1 lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Gln, Asn, Tyr, Aib,Glu, Cys, K(CO(CH2)2SH) ou hC;Xaa26 é: lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Tyr, Phe, Aib, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa27 é: Lys, hR, Arg, Gln, Orn ou dK;Xaa28 é: Asn, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Pro, dK, Cys,K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa29 é: Lys, Ser, Arg, Asn1 hR, Cys, Orn ou está ausente;Xaa3O é: Arg, Lys, lie, hR ou está ausente;Xaa3I é: Tyr1 His1 Phe, Gln ou está ausente; eXaa32 é: Cys ou está ausente;desde que, se Xaa29, Xaa3o, Xaa3I ou Xaa32 estiver ausente, oaminoácido seguinte presente a jusante seja o aminoácido seguinte na se-qüência do agonista peptídico;e uma extensão no terminal C que compreende a seqüência deaminoácido:GGPSSGAPPPK(E-Cie)em que o aminoácido do terminal C pode ser amidado.

2. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com a rei-vindicação 1 que compreende uma seqüência da fórmula:His-Ser-Xaa3-Ala-Val-Phe-Thr-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Xaa12-Xaai3- Xaa14-Xaais-Xaaie-Xaaiy-Xaaie-Xaai9-Xaa2O-Xaa21-Xaa22- Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa3o-Xaa31-Xaa32Fórmula 2 (ID. DE SEQ. Ne: 2)em que:Xaa3 é: Asp ou Glu;Xaa8 é: Asp, Glu, Ala, Lys, Leu1 Arg ou Tyr;Xaa9 é: Asn1 Gln, Glu, Ser1 Cys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa10 é: Tyr, Trp ou Tyr(OMe);Xaa12 é: Arg1 Lys, hR, Orn1 Aib, Ala, Leu, Gln, Phe ou Cys;Xaa13 é: Leu, Phe, Glu1 Ala, Aib, Ser, Cys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa14 é: Arg1 Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Phe, Gln, Aib ou Cit;Xaa15 é: Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, Orn, Phe, Gln, Aib, K(Ac), Cys,K(W) ou K(CO(CH2)2SH);Xaa-16 é: Gln, Lys, Ala, Ser, Cys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa17 é: Vai, Ala, Leu, lie, Met, Nle, Lys, Aib, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH)OuK(W);Xaa-18 é: Ala, Ser, Cys ou Abu;Xaa19 é: Ala, Leu, Gly1 Ser1 Cys, K(CO(CH2)2SH) ou Abu;Xaa20 é: Lys, Gln, hR, Arg, Ser, Orn, Ala, Aib, Trp, Thr, Leu1 lie,Phe, Tyr, Vai, K(Ac), Cys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa21 é: Lys, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn1 hR, K(Ac), Ser,Cys1K(W)1K(CO(CH2)2SH)OuhC;Xaa22 é: Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, lie, Vai, Tyr(OMe), Ala, Aib ouSer;Xaa23 é: Leu, Phe, lie, Ala, Trp, Thr, Vai, Aib ou Ser;Xaa24 é: Gln, Asn1 Ser1 Cys, K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa25 é: Ser, Asp, Phe, lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Gln, Asn, Tyr, Aib,Glu, Cys, K(CO(CH2)2SH) ou hC;Xaa26 é: lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Tyr, Phe, Aib, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa27 é: Lys, hR, Arg, Gln, Orn ou dK;Xaa28 é: Asn, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn1 hR, Pro, dK, Cys,K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa29 é: Lys1 Ser1 Arg1 Asn, hR, Cys, Orn ou está ausente;Xaa30 é: Arg, Lys1 Ile1 hR ou está ausente;Xaa31 é: Tyr1 His1 Phe, Gln ou está ausente; eXaa32 é: Cys ou está ausente;desde que, se Xaa29l Xaa30l Xaa3I ou Xaa32 estiver ausente, oaminoácido seguinte presente a jusante seja o aminoácido seguinte na se-qüência do agonista peptídico;e uma extensão no terminal C que compreende a seqüência deaminoácido:GGPSSGAPPPK(E-C16)em que o aminoácido do terminal C pode ser amidado.

3. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com qual-quer uma das reivindicações precedentes, em que Xaae β Glu1 Xaag é Gln eXaaio é Tyr(OMe).

4. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com qual-quer uma das reivindicações precedentes, em que Xaai5 é Aib.

5. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com qual-quer uma das reivindicações precedentes, em que Xaa2O é Aib.

6. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com qual-quer uma das reivindicações precedentes, em que Xaa12, Xaa2I, Xaa27 e Xa-a2e são todos Orn.

7. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com qual-quer uma das reivindicações precedentes, em que Xaaig é Abu.

8. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com qual-quer uma das reivindicações precedentes, em que Xaa23 é Aib.

9. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com qual-quer uma das reivindicações precedentes, em que Xaa25 é Aib.

10. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com qual-quer uma das reivindicações precedentes, em que Xaa2g, Xaa3O, Xaa3I e Xa-a32 estão todos ausentes.

11. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com qual-quer uma das reivindicações precedentes, em que o agonista é PEGuilado.

12. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com qual-quer uma das reivindicações precedentes, em que o agonista é cíclico.

13. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com qual-quer uma das reivindicações precedentes, que ainda compreende uma mo-dificação do terminal N no terminal N do agonista peptídico, em que a modi-ficação do terminal N é selecionada de:(a) adição de D-histidina, isoleucina, metionina ou norleucina;(b) adição de um peptídeo que compreende a seqüência Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg (ID. DE SEQ. N2: 6), em que a Arg estáligada ao terminal N do agonista peptídico;(c) adição de C1-C16 alquila opcionalmente substituída com umou mais substituintes selecionados independentemente de arila, C1-Cealcoxi,-NH2, -OH, halogênio e -CF3;(d) adição de -C(O)R1 em que R1 é uma C1-Ci6 alquila opcional-mente substituída com um ou mais substituintes selecionados independen-temente de arila, CrC6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio, -SH e -CF3; uma arilaopcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados inde-pendentemente de C1-C 6 alquila, C2-Ce alquenila, C2-C6 alquimia, C1-C6 al-cóxi, -NH2, -OH, halogênio e -CF3; arila C1-C4 alquila opcionalmente substitu-ída com um ou mais substituintes selecionados independentemente de C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH, halogê-nio e -CF3; -NR2R3 em que R2 e R3 são independentemente hidrogênio, C1-C6 alquila, arila ou arila C1-C4 alquila; -OR4 em que R4 é C1-Ci6 alquila opcio-nalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados indepen-dentemente de arila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio e -CF3, arila opcio-nalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados indepen-dentemente de C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 alcóxi,-NH2, -OH, halogênio e -CF3, arila C1-C4 alquila opcionalmente substituídacom um ou mais substituintes selecionados independentemente de C1-C6alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-Cealcoxi, -NH2, -OH1 halogênio e-CF3; ou 5-pirrolidin-2-ona;(e) adição de -SO2R5 em que R5 é arila, arila C1-C4 alquila ou C1-C16 alquila;(f) formação de um grupo succinimida opcionalmente substituídocom C1-C6 alquila ou -SR6, em que R6 é hidrogênio ou C1-C6 alquila;(g) adição de sulfóxido de metionina;(h) adição de ácido biotinila-6-aminoexanóico (ácido 6-aminocapróico); e(i) adição de -C(=NH)-NH2.

14. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com a rei-vindicação 13 em que a modificação do terminal N é a adição de um gruposelecionado de: acetila, propionila, butirila, pentanoila, hexanoila, metionina,sulfóxido de metionina, 3-fenilpropionila, fenilacetila, benzoíla, norleucina, D-histidina, isoleucina, 3-mercaptopropionila, ácido biotinila-6-aminoexanóico(ácido 6-aminocapróico) e -C(=NH)-NH2.

15. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com a rei-vindicação 14 em que a modificação do terminal N é a adição de acetila ouhexanoila.

16. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com a rei-vindicação 1, que compreende a seqüência de aminoácido:<table>table see original document page 74</column></row><table>

17. Composição farmacêutica que compreende um agonistapeptídico do receptor VPAC2 de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 16 e um ou mais diluentes, veículos e excipientes farmaceutica-mente aceitáveis.

18. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 16 para uso como medicamento.

19. Agonista peptídico do receptor VPAC2 de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 16 para uso no tratamento de diabetes nãodependente de insulina ou diabetes dependente de insulina ou na supressãoda ingestão de alimentos.

20. Uso de um agonista peptídico do receptor VPAC2 como de-findio em qualquer uma das reivindicações 1 a 16 para a fabricação de ummedicamento para o tratamento de diabetes não dependente de insulina oudiabetes dependente de insulina ou para a supressão da ingestão de alimen-tos.

21. Método de tratamento de diabetes não dependente de insuli-na ou diabetes dependente de insulina ou de supressão da ingestão de ali-mentos em um paciente que dele necessite, que compreende a administra-ção de uma quantidade eficaz de um agonista peptídico do receptor VPAC2como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.

22. Composição farmacêutica que contém um agonista peptídicodo receptor VPAC2 como defindio em qualquer uma das reivindicações 1 a16 para o tratamento de diabetes não dependente de insulina ou diabetesdependente de insulina ou para a supressão da ingestão de alimentos.

23. Agonista peptídico do receptor VPAC2 substancialmentecomo aqui descrito com referência aos exemplos.