JP2009529007A - 選択的ｖｐａｃ２受容体ペプチドアゴニスト - Google Patents

Abstract

本発明は、選択的にＶＰＡＣ２受容体を活性化し、糖尿病の治療に有用であるペプチドの提供に関する。

Description

本発明は選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに関する。

特に、本発明は次のアミノ酸配列：ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（Ｅ−Ｃ_１６）を含むＣ末端伸張部分を含む、選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに関する。

２型糖尿病又はインスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は最も一般的な糖尿病であり、糖尿病に罹患する患者の９０％に影響を及ぼす。ＮＩＤＤＭにより、患者体内のβ細胞の機能が低下し、不十分なインスリン産生及び／又はインスリン感受性の減少に至る。ＮＩＤＤＭが制御されない場合、血液中グルコース量が過剰となり、高血糖をもたらす。時間の経過によりさらに深刻な合併症に至ることもあり、それにより腎臓機能不全、心血管障害、視覚の損失、下肢潰瘍化、神経障害及び虚血等が生じうる。ＮＩＤＤＭの治療法としては、様々な経口薬の使用のほかに、食事、運動及び体重管理の改善等が挙げられる。ＮＩＤＤＭに罹患する個体はまず、かかる経口薬を服用することにより、血糖値を制御できる。しかしながら、これらの処置では、ＮＩＤＤＭ患者において、生じるβ細胞の機能の亢進歩的な損失は抑えられず、ゆえに疾患後の段階における血糖値を十分に制御することができない。また、現在利用可能な薬物治療は、ＮＩＤＤＭ患者を、例えば低血糖症、胃腸障害、体液貯留、浮腫及び／又は体重増加等の副作用の危険にさらすこととなる。

下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）及び血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）は、セクレチン及びグルカゴンと同じペプチドファミリーに属する。ＰＡＣＡＰ及びＶＩＰは、ｃＡＭＰ媒介及び他のＣａ^２＋媒介のシグナル伝達経路を介して活性を示すＣＧタンパク結合受容体を通じて動作する。これらの受容体は、ＰＡＣＡＰ嗜好性のタイプ１（ＰＡＣ１）受容体（Ｉｓｏｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．，１１０：２１３−２１７、（２００３）；Ｏｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９６：１５１１−１５２１（１９９３））及び２つのＶＩＰ共有型のタイプ２受容体（ＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２）（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，２１：６１９−６７０（２０００）；Ｈａｍｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ，５０：２６５−２７０（１９９８）；Ｃｏｕｖｉｎｅａｕ， ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：２４７５９−２４７６６（２００３）；Ｓｒｅｅｄｈａｒａｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９３：５４６−５５３（１９９３）；Ｌｕｔｚ， ｅｔ ａｌ．，ＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４５８：１９７−２０３（１９９９）；Ａｄａｍｏｕ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０９：３８５−３９２（１９９５））として公知である。一連のＰＡＣＡＰのアナログはＵＳ６，２４２，５６３及びＷＯ２０００／０５２６０に開示される。

ＰＡＣＡＰは３つの受容体全てに対する顕著な活性化能を有する一方で、ＶＩＰは選択的に２つのＶＰＡＣ受容体を活性化する（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１：１４５３−１４６０（２００２））。両方のＶＩＰ及びＰＡＣＡＰは、それらを静脈注射で提供したとき、ヒトのインスリン分泌を刺激するのみならず、グルカゴン分泌及び肝臓からのグルコース放出を増加させることが知られている（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１０： ４８１−４８４（１９８９）；Ｆｉｌｉｐｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＥＭ，８２：３０９３−３０９８（１９９７））。但し、ＰＡＣＡＰ又はＶＩＰ刺激は結果的には、全体的には血糖症を改善させない。ＰＡＣＡＰ又はＶＩＰによる多くの受容体の活性化は、神経、内分泌腺、心血管、再生機構、筋肉及び免疫系に幅広い生理的影響を及ぼす（Ｇｏｚｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，６：１０１９−１０３４（１９９９））。さらに、ＶＩＰにより誘導されたラットの下痢は、ＶＰＡＣ受容体のうちの１つ（ＶＰＡＣ１）のみにより媒介されることが示唆されている（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２２：１１３９−１１５１（２００１）；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１：１４５３−１４６０（２００２））。加えて、ＶＰＡＣ１及びＰＡＣ１受容体はα細胞及び肝細胞において、発現し、すなわち肝臓からのグルコース放出をもたらす効果に関与するものと考えられる。

エキセンディン４は、Ｇｉｌａ Ｍｏｎｓｔｅｒ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ Ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液中に含まれる物質である（Ｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１１）：７４０２−７４０５（１９９２））。３９のアミノ酸からなるペプチドであり、グルコース依存性のインスリン分泌を促進する活性を有する。具体的なＰＥＧ化エキセンディン及びエキセンジンアゴニストペプチドは、ＷＯ２０００／６６６２９中に記載されている。エキセンディン誘導体（親油性置換基に接着される少なくとも一つのアミノ酸を有する）は、ＷＯ９９／４３７０８に記載されている。

最近の研究では、ＶＰＡＣ２受容体に選択的なペプチドが、胃腸（ＧＩ）における副作用をもたらさず、グルカゴン放出及び肝臓グルコース放出を増加させずに、膵臓からのインスリン分泌を促進できることが示されている（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１：１４５３−１４６０（２００２））。ＶＰＡＣ２受容体に選択的なペプチドは最初は、ＶＩＰ及び／又はＰＡＣＡＰの修飾により同定された（例えばＸｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．，２８１：６２９−６３３（１９９７）；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１：１４５３−１４６０（２００２）及びＷＯ０１／２３４２０；ＷＯ２００４／００６８３９を参照）。

しかしながら、現在までに報告されているＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの多くは効果、選択性及び安定性プロフィールに関して問題があり、それらの臨床的な使用可能性が限られている。さらに、これらのペプチドの多くは、製剤中における当該ポリペプチドの安定性、並びにｉｎ ｖｉｖｏでのこれらのポリペプチドの半減期が短いこと、等の問題から、商業的に利用するための候補としては不適当である。さらに、幾つかのＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストがジペプチジル−ペプチダーゼ（ＤＰＰ−ＩＶ）の作用により不活性となることが確認されている。すなわち短い血清中半減期は、治療薬としてのこれらのアゴニストの使用の妨げとなりうる。したがって、ＮＩＤＤＭ薬剤に関連する現在直面する課題を解決する、新規な治療方法に対するニーズが存在する。

本発明は、ＶＰＡＣ２受容体に選択的であり、高い血糖値が示される場合には膵臓からのインスリン分泌を誘導する、改良された化合物の提供に関する。本発明の化合物は、β細胞の機能を向上させると考えられるペプチドである。これらのペプチドは、ＧＩ副作用又はそれに対応する肝臓からのグルコース放出の増加を伴わずに、インスリン分泌を誘導する生理的効果を有し、さらに公知のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストと比較して、ペプチドの選択性、効力及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ安定性が全体的に向上している。

本発明の第１の態様においては、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストであって、式：

式１（配列番号：１）
［式中、
Ｘａａ_１はＨｉｓ、ｄＨ又は存在せず；
Ｘａａ_２はｄＡ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ｄＳ、Ｐｒｏ又はＡｉｂであり；
Ｘａａ_３はＡｓｐ又はＧｌｕであり；
Ｘａａ_４はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、ｄＡ、Ａｉｂ又はＮＭｅＡであり；
Ｘａａ_５はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ｄＶ、Ａｉｂ又はＮＭｅＶであり；
Ｘａａ_６はＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり；
Ｘａａ_８はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ又はＴｙｒであり；
Ｘａａ_９はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
Ｘａａ_１０はＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ（ＯＭｅ）であり；
Ｘａａ_１２はＡｒｇ、Ｌｙｓ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ又はＣｙｓであり；
Ｘａａ_１３はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
Ｘａａ_１４はＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ又はＣｉｔであり；
Ｘａａ_１５はＬｙｓ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、Ｋ（Ａｃ）、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
Ｘａａ_１６はＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
Ｘａａ_１７はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｎｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
Ｘａａ_１８はＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＡｂｕであり；
Ｘａａ_１９はＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＡｂｕであり；
Ｘａａ_２０はＬｙｓ、Ｇｌｎ、ｈＲ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｏｒｎ、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｋ（Ａｃ）、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
Ｘａａ_２１はＬｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｉｂ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｏｒｎ、ｈＲ、Ｋ（Ａｃ）、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はｈＣであり；
Ｘａａ_２２はＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ（ＯＭｅ）、Ａｌａ、Ａｉｂ又はＳｅｒであり；
Ｘａａ_２３はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｉｂ又はＳｅｒであり；
Ｘａａ_２４はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
Ｘａａ_２５はＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はｈＣであり；
Ｘａａ_２６はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
Ｘａａ_２７はＬｙｓ、ｈＲ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｏｒｎ又はｄＫであり；
Ｘａａ_２８はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ、ｈＲ、Ｐｒｏ、ｄＫ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
Ｘａａ_２９はＬｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ｈＲ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ又は存在せず；
Ｘａａ_３０はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、ｈＲ又は存在せず；
Ｘａａ_３１はＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ又は存在せず；
Ｘａａ_３２はＣｙｓ又は存在しないが；
但し、Ｘａａ_２９、Ｘａａ_３０、Ｘａａ_３１又はＸａａ_３２が存在しない場合、存在する次のアミノ酸の下流はペプチドアゴニスト配列における次のアミノ酸である］
で示される配列；および
アミノ酸配列：
ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（Ｅ−Ｃ_１６）（配列番号：８）
［式中、Ｃ末端アミノ酸はアミド化されてもよい］
を含むＣ末端伸張を含む、アゴニストの提供に関する。

好ましくは、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、式：

式２（配列番号：２）
［式中、
Ｘａａ_３はＡｓｐ又はＧｌｕであり；
Ｘａａ_８はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ又はＴｙｒであり；
Ｘａａ_９はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
Ｘａａ_１０はＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ（ＯＭｅ）であり；
Ｘａａ_１２はＡｒｇ、Ｌｙｓ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ又はＣｙｓであり；
Ｘａａ_１３はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
Ｘａａ_１４はＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ又はＣｉｔであり；
Ｘａａ_１５はＬｙｓ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、Ｋ（Ａｃ）、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
Ｘａａ_１６はＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
Ｘａａ_１７はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｎｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
Ｘａａ_１８はＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＡｂｕであり；
Ｘａａ_１９はＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＡｂｕであり；
Ｘａａ_２０はＬｙｓ、Ｇｌｎ、ｈＲ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｏｒｎ、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｋ（Ａｃ）、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
Ｘａａ_２１はＬｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｉｂ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｏｒｎ、ｈＲ、Ｋ（Ａｃ）、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はｈＣであり；
Ｘａａ_２２はＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ（ＯＭｅ）、Ａｌａ、Ａｉｂ又はＳｅｒであり；
Ｘａａ_２３はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｉｂ又はＳｅｒであり；
Ｘａａ_２４はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
Ｘａａ_２５はＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はｈＣであり；
Ｘａａ_２６はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
Ｘａａ_２７はＬｙｓ、ｈＲ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｏｒｎ又はｄＫであり；
Ｘａａ_２８はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ、ｈＲ、Ｐｒｏ、ｄＫ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
Ｘａａ_２９はＬｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ｈＲ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ又は存在せず；
Ｘａａ_３０はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、ｈＲ又は存在せず；
Ｘａａ_３１はＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ又は存在せず；
Ｘａａ_３２はＣｙｓ又は存在しないが；
但し、Ｘａａ_２９、Ｘａａ_３０、Ｘａａ_３１又はＸａａ_３２が存在しない場合、存在する次のアミノ酸の下流はペプチドアゴニスト配列における次のアミノ酸である］
で示される配列；および
アミノ酸配列：
ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（Ｅ−Ｃ_１６）（配列番号：８）
［式中、Ｃ末端アミノ酸はアミド化されてもよい］
を含むＣ末端伸張を含む。

好ましくは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、式１の配列（配列番号：１）又は式２の配列（配列番号：２）を含み、式中、Ｘａａ_３はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｘａａ_８はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｘａａ_９はＡｓｎ又はＧｌｎであり、Ｘａａ_１０はＴｙｒ又はＴｙｒ（ＯＭｅ）であり、Ｘａａ_１２はＡｒｇ、ｈＲ、Ｌｙｓ又はＯｒｎであり、Ｘａａ_１４はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ｌｙｓ、Ａｌａ又はＬｅｕであり、Ｘａａ_１５はＬｙｓ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ又はＡｒｇであり、Ｘａａ_１６はＧｌｎ又はＬｙｓであり、Ｘａａ_１７はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ又はＮｌｅであり、Ｘａａ_１９はＡｌａ又はＡｂｕであり、Ｘａａ_２０はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ｇｌｎ又はＡｒｇであり、Ｘａａ_２１はＬｙｓ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ、Ａｌａ、Ｇｌｎ又はＡｒｇであり、Ｘａａ_２３はＬｅｕ又はＡｉｂであり、Ｘａａ_２５はＳｅｒ又はＡｉｂであり、Ｘａａ_２７はＬｙｓ、Ｏｒｎ、ｈＲ又はＡｒｇであり、Ｘａａ_２８はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ｈＲ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ又はＰｒｏであり及び／又はＸａａ_２９はＬｙｓ、Ｏｒｎ、ｈＲ又は存在しない。

好ましくは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは式１の配列（配列番号：１）又は式２の配列（配列番号：２）を含み、式中、Ｘａａ_８はＧｌｕであり、Ｘａａ_９はＧｌｎであり、Ｘａａ_１０はＴｙｒ（ＯＭｅ）である。

好ましくは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、式１（配列番号：１）又は式２（配列番号：２）の配列を含み、式中、Ｘａａ_１４又はＸａａ_１５はＡｉｂである。

好ましくは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、式１（配列番号：１）又は式２（配列番号：２）の配列を含み、式中、Ｘａａ_２０又はＸａａ_２１はＡｉｂである。

より好ましくは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、式１（配列番号：１）又は式２（配列番号：２）の配列を含み、式中、Ｘａａ_１５はＡｉｂであり、及び／又はＸａａ_２０はＡｉｂである。

好ましくは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、式１（配列番号：１）又は式２（配列番号：２）の配列を含み、式中、Ｘａａ_１２、Ｘａａ_２１、Ｘａａ_２７及びＸａａ_２８は全てＯｒｎである。

好ましくは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、式１（配列番号：１）又は式２（配列番号：２）の配列を含み、式中、Ｘａａ_１９はＡｂｕである。

好ましくは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、式１（配列番号：１）又は式２（配列番号：２）の配列を含み、式中、Ｘａａ_２３はＡｉｂである。

好ましくは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、式１（配列番号：１）又は式２（配列番号：２）の配列を含み、式中、Ｘａａ_２５はＡｉｂである。

好ましくは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、式１（配列番号：１）又は式２（配列番号：２）の配列を含み、式中、Ｘａａ_３０、Ｘａａ_３１及びＸａａ_３２は存在しない。さらにより好ましくは、Ｘａａ_２９、Ｘａａ_３０、Ｘａａ_３１及びＸａａ_３２は全て存在しない。

好ましくは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはＰＥＧ化される。

ＰＥＧ分子は、本発明の第１の態様に従ってＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの任意の位置において、任意のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）残基に共有結合することができる。

ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト中の任意のＬｙｓ残基は、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）と置換されてもよく、これはＰＥＧ化されてもよい。さらに、ペプチドアゴニストのいかなるＣｙｓ残基も修飾システイン残基（例えばｈＣ）で置換してもよい。修飾Ｃｙｓ残基はＰＥＧ分子に共有結合してもよい。

複数のＰＥＧ分子がある場合、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）及びＫ（Ｗ）のＰＥＧ化の組合せがありうる。２つのＰＥＧ分子を存在させる場合、例えば１つをＬｙｓ残基に結合させ、もう１つをＣｙｓ残基に結合させてもよい。

好ましくは、当該ＰＥＧ分子は分岐状である。あるいは、当該ＰＥＧ分子は直鎖状であってもよい。

好ましくは、当該ＰＥＧ分子は１，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａの分子量である。好ましくは、当該ＰＥＧ分子は１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００及び６０，０００Ｄａのものから選択される。さらに好ましくは、２０，０００、３０，０００、４０，０００又は６０，０００Ｄａのものから選択される。本発明のペプチドアゴニストに共有結合するＰＥＧ分子が２つ存在する場合、各々１，０００〜４０，０００Ｄａであってもよく、好ましくは２０，０００及び２０，０００Ｄａ、１０，０００及び３０，０００Ｄａ、３０，０００及び３０，０００Ｄａ、又は２０，０００及び４０，０００Ｄａの分子量である。

好ましくは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは環状である。

ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、ラクタム架橋により閉環してもよい。ラクタム架橋は残基側鎖のＸａａ_ｎ＋４に対して残基側鎖のＸａａ_ｎが共有結合することにより形成されることが好ましく、ｎは１〜２８である。好ましくは、ｎは１２、２０又は２１である。より好ましくは、ｎは２１である。ラクタム架橋がＡｓｐ又はＧｌｕの残基側鎖に対してＬｙｓ又はＯｒｎの残基側鎖が共有結合して形成されることも好ましい。Ｌｙｓ又はＯｒｎ残基はＤａｂ残基と置換してもよく、この側鎖はＡｓｐ又はＧｌｕの残基側鎖に共有結合してもよい。

あるいは、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、ジスルフィド架橋により閉環してもよい。ジスルフィド架橋は残基側鎖のＸａａ_ｎが残基側鎖のＸａａ_ｎ＋４に対して共有結合することにより形成されることが好ましく、ｎは１〜２８である。好ましくは、ｎは１２、２０又は２１である。より好ましくは、ｎは２１である。ジスルフィド架橋が他のＣｙｓ又はｈＣ残基側鎖に対してＣｙｓ又はｈＣ残基側鎖が共有結合することにより形成されることも好ましい。

あるいは、ラクタム架橋又はジスルフィド架橋は残基側鎖のＸａａ_ｎ＋３に対して残基側鎖のＸａａ_ｎが共有結合することにより形成されてもよく、ｎは１〜２８である。ラクタム架橋又はジスルフィド架橋は、また残基側鎖のＸａａ_ｉ＋７又はＸａａ_ｉ＋８に対して残基側鎖のＸａａ_ｉが共有結合することにより形成されてもよく、ｉは１〜２４である。

ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト配列はさらに、当該ペプチドのＸａａ_１の上流のＮ末端にヒスチジン残基をさらに含んでもよい。

好ましくは、本発明の第１の態様に係るＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、さらにペプチドアゴニストのＮ末端にてＮ末端修飾を有し、ここに、該Ｎ末端修飾は以下から選択される：
（ａ）Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン又はノルロイシンの付加；
（ｂ）配列Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ（配列番号：６）を含むペプチドの付加（ここに、ＡｒｇはペプチドアゴニストのＮ末端に連結する）；
（ｃ）独立してアリール、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよいＣ_１−Ｃ_１６アルキルの付加；
（ｄ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１（ここに、Ｒ^１はＣ_１−Ｃ_１６アルキル（独立してアリール、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよい）；アリール（独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよい）；アリールＣ_１−Ｃ_４アルキル（独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよい）である）；
−ＮＲ^２Ｒ^３（ここに、Ｒ^２及びＲ^３は独立して水素、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アリール又はアリールＣ_１−Ｃ_４アルキルである）；
−ＯＲ^４（ここに、Ｒ^４はＣ_１−Ｃ_１６アルキル（独立してアリール、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよい）、アリール（独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよい）、アリールＣ_１−Ｃ_４アルキル（独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよい）である）；又は
５−ピロリジン−２−オンの付加；
（ｅ）−ＳＯ_２Ｒ^５（ここに、Ｒ^５はアリール、アリールＣ_１−Ｃ_４アルキル又はＣ_１−Ｃ_１６アルキルである）の付加；
（ｆ）任意にＣ_１−Ｃ_６アルキル又は−ＳＲ^６（ここに、Ｒ^６は水素又はＣ_１−Ｃ_６アルキルである）で置換されてもよいスクシニミド基の形成；
（ｇ）メチオニンスルホキシドの付加；
（ｈ）ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）の付加；及び
（ｉ）−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ_２の付加。

好ましくは、Ｎ末端は次から選ばれる基の付加により修飾される。アセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル、メチオニン、メチオニンスルホキシド、３−フェニルプロピオニル、フェニルアセチル、ベンゾイル、ノルロイシン、Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、３−メルカプトプロピオニル、ビオチニル−６‐アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）、及び−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ_２
当該Ｎ末端修飾がアセチル基又はヘキサノイル基の付加であるのが、特に好適である。

当業者であれば、本願明細書に記載したような式１又は式２のペプチド配列、及びＮ末端修飾を様々な組合せで含むＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを、上記の開示に基づいて作製できると認識するであろう。

本発明の第１の態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、以下のアミノ酸配列を含むのが好ましい。

本発明の第２の態様は、本発明の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト及び１つ以上の薬理学的に許容できる希釈剤、担体及び／又は賦形剤を含む、医薬組成物の提供に関する。

本発明の第３の態様は、薬剤として使用するための、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関する。

本発明の第４の態様は、非インスリン依存性糖尿病又はインスリン依存性糖尿病の治療における使用又は摂食の抑制における使用のための、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関する。

本発明の第５の態様は、非インスリン依存性糖尿病もしくはインスリン依存性糖尿病の治療又は摂食抑制のための薬剤の製造のための、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの使用の提供に関する。

本発明のさらに別の態様は、有効量の本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを投与することを含み、必要とする患者における非インスリン依存性糖尿病もしくはインスリン依存性糖尿病を治療し又は摂食を抑制する、方法の提供に関する。

本発明のさらなる態様は、非インスリン依存性糖尿病もしくはインスリン依存性糖尿病を治療し又は摂食を抑制するための本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを含む、医薬組成物の提供に関する。

本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、公知のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストよりも選択性、有効性及び／又は安定性が増強されている。生体内で、Ｃ末端のパルミチン酸基は血清アルブミンと結合し、これにより腎ろ過を妨げ、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの生物学的作用を延長する。

本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、ＰＥＧ化されてもよい。

ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト上の特定の残基への１分子以上のＰＥＧの共有結合により、非ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストと比較して、半減期が長く、クリアランスの減少した、生物学的に活性を有するＰＥＧ化されたＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが得られる。

本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは環状でもよい。

環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは小サイズ／中サイズの直鎖ＶＰＡＣ２ペプチド受容体アゴニストと比較してコンホメーションの可動性が低く、この理由から環状ペプチドは直鎖ペプチドに比べて許容されるコンホメーションの数が少なくなる。環化により直鎖ペプチドのコンホメーションの柔軟さを制約することで受容体結合能は強化され、直鎖ペプチドと比較して選択性が増し、タンパク分解安定性及び生物活性が向上する。

用語「ＶＰＡＣ２」は、本発明のアゴニストが活性化する特定の受容体を指して用いる（Ｌｕｔｚら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４５８巻、１９７−２０３ページ、１９９９年；Ａｄａｍｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｃ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２０９巻、３８５−３９２ページ、１９９５年）。
この用語は、本発明のアゴニストを指すためにも用いる。

本発明の「選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」又は「ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」は、選択的にＶＰＡＣ２受容体を活性化し、インスリン分泌を誘導するペプチドを指す。好ましくは、本発明に係る選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの配列は、２８〜３２の天然発生及び／又は非天然発生のアミノ酸を有し、さらにＣ末端伸張部分を含み、アミノ酸配列：ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（Ｅ−Ｃ_１６）を含む。

「選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」又は「ＰＥＧ化されたＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」は、１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共有結合的に付加した選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト又はその誘導体であり、各ＰＥＧはシステイン又はリジンアミノ酸、又はＫ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）残基に付加する。

「選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」又は「環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」は、ペプチド鎖の２つのアミノ酸の側鎖を連結している共有結合形成によって閉環される選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストである。共有結合形成は、例えば、ラクタム架橋でもよく、ジスルフィド架橋でもよい。

本発明の選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、Ｃ末端伸張を有する。本発明の「Ｃ末端伸張」は、配列ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（Ｅ−Ｃ_１６）を含み、式１（配列番号：１）又は式２（配列番号：２）のペプチド配列のＣ末端に対し、ペプチド結合を介してＣ末端伸張のＮ末端基で連結する。配列ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（Ｅ−Ｃ１６）は、エキセンディン−４（Ｅｘｅｎｄｉｎ−４）のＣ末端配列変異株である。Ｃ末端リジン残基はグルタミン酸残基を有し、これはパルミチン酸でアルファ-アミノ基にてアシル化され、側鎖に付加する。

Ｃ末端伸張部分に関して本願明細書に用いる「に連結」の用語は、式１又は式２のペプチド配列Ｃ末端にアミノ酸又は化学基が付加又は結合することを含む。

適宜、選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはＮ末端修飾を有してもよい。本願明細書に用いる「Ｎ端末修飾」の用語は、ペプチドのＮ末端にアミノ酸若しくは化学基が直接付加若しくは結合して化学基を形成することが包含され、それによりペプチドのＮ末端に窒素原子が導入される。

Ｎ末端修飾には、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの配列への１つ以上の天然又は非天然アミノ酸の付加が包含されてもよく、好ましくは１０アミノ酸以下であり、最も好ましくは１アミノ酸の付加である。Ｎ末端に付加させることができる天然アミノ酸としては、メチオニン及びイソロイシンが挙げられる。Ｎ末端に付加する修飾アミノ酸としてＤ−ヒスチジンを用いてもよい。あるいは、以下のアミノ酸をＮ末端に付加してもよい。配列番号：６：Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ（式中、ＡｒｇがペプチドアゴニストのＮ末端と結合する）。好ましくは、当該Ｎ末端に付加させるいずれのアミノ酸も、ペプチド結合で当該Ｎ末端と結合する。

本発明の用語「に連結」には、Ｎ末端修飾に関して用いる場合、ＶＰＡＣ２受容体アゴニストのＮ末端に直接アミノ酸若しくは化学基を付加若しくは結合させることが包含される。上記のＮ末端修飾の付加は、ペプチド結合を形成させる通常の結合条件下で実施できる。

ペプチドアゴニストのＮ末端基をアルキル基（Ｒ）、好適にはＣ_１−Ｃ_１６アルキル基の付加により修飾し、（Ｒ）ＮＨ−を形成してもよい。

あるいは、ペプチドアゴニストのＮ末端基を式−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１の基の追加により修飾し、式Ｒ^１Ｃ（Ｏ）ＮＨ−のアミドを形成してもよい。式−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１の基の追加は、式Ｒ^１ＣＯＯＨの有機酸との反応により遂行されてもよい。アシル化反応を使用したアミノ酸配列のＮ末端への修飾は、従来技術において、公知である（例えばＧｏｚｅｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ、２７３：１６１−１６７（１９９５）を参照）。式−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１基の付加により、Ｎ末端において、尿素基（国際公開第２００４／０６８３９号、国際公開第０１／２３２４０号パンフレットを参照）又はカルバメート基が形成されてもよい。また、ピログルタミン酸又は６−アミノヘキサン酸を付加することによりＮ末端を修飾してもよい。

ペプチドアゴニストのＮ末端基は、式−ＳＯ_２Ｒ^５の基の追加により修飾してもよく、Ｎ末端基においてスルホンアミド基が形成される。

ペプチドアゴニストのＮ末端をコハク無水物と反応させて修飾し、Ｎ末端でスクシニミド基を形成させてもよい。スクシニミド基によりペプチドのＮ末端に窒素原子が組み込まれる。

あるいは、メチオニンスルホキシド、ビオチニル−６−アミノヘキサン酸、又は−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ_２の付加によりＮ末端を修飾してもよい。−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ_２の付加はグアニジン修飾であり、Ｎ末アミノ酸の末端ＮＨ_２は−ＮＨＣ（＝ＮＨ）−ＮＨ_２となる。

Ｎ末端修飾及びＣ末端伸張部分を含む本発明の大部分の配列中には、標準的な１文字又は３文字表記で表される２０の天然アミノ酸が含まれる。使用する他の表記は、以下の通り定義する。
Ａｃ＝アセチル
Ｃ６＝ヘキサノイル
ｄ＝対応するアミノ酸のＤアイソフォーム（非自然発生）例えば、ｄＡ＝Ｄ−アラニン、ｄＳ＝Ｄ−セリン、ｄＫ＝Ｄ−リジン
ｈＲ＝ホモアルギニン
＝非占有位置
Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸
ＣＨ_２＝メチレン
ＯＭｅ＝メトキシ
Ｎｌｅ＝ノルロイシン
ＮＭｅ＝アミノ酸のアミノ基α位に付加するＮメチル、例えばＮＭｅＡ＝Ｎメチルアラニン、ＮＭｅＶ＝Ｎメチルバリン
Ｏｒｎ＝オルニチン
Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）＝ε−（３’−メルカプトプロピオニル）−リジン
Ｋ（Ｗ）＝ε−（Ｌ−トリプトフィル）−リジン
Ａｂｕ＝α−アミノ−ｎ−酪酸又は２−アミノ酪酸
Ｃｉｔ＝シトルリン
Ｄａｂ＝ジアミノ酪酸
Ｋ（Ａｃ）＝ε−アセチルリジン
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール
ＰＥＧ４０Ｋ＝４０，０００Ｄａ ＰＥＧ分子
ＰＥＧ３０Ｋ＝３０，０００Ｄａ ＰＥＧ分子
ＰＥＧ２０Ｋ＝２０，０００Ｄａ ＰＥＧ分子
Ｋ（Ｅ−Ｃ_１６）＝（ε−（γ−Ｌ−グルタミル（Ｎ−α−パルミトイル））−リジン
式：

＝ラクタム架橋又はジスルフィド架橋

ＶＩＰは、２８のアミノ酸を有する単一配列として天然に存在する。
しかしながら、ＰＡＣＡＰは、アミド化されたカルボキシル基を有する、３８アミノ酸のペプチド（ＰＡＣＡＰ−３８）又は２７アミノ酸のペプチド（ＰＡＣＡＰ−２７）のいずれかとして存在する（Ｍｉｙａｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、１７０：６４３−６４８（１９９０）。ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰ−２７及びＰＡＣＡＰ−３８の配列は以下の通りである：

本願明細書の用語「天然アミノ酸」とは、ヒト遺伝コードによりコード化される２０アミノ酸を意味する（すなわち２０の標準的なアミノ酸）。これらの２０のアミノ酸とは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンである。

「非天然アミノ酸」の例としては、合成アミノ酸及び体内で修飾されたものが挙げられる。これらには、Ｄ−アミノ酸、アルギニン様アミノ酸（例えばホモアルギニン）、及び側鎖に余分のメチレンを有する他のアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、及び修飾アミノ酸（例えばノルロイシン、リジン（イソプロピル）−ここに、リジンの側鎖アミンはイソプロピル基で修飾されている）が挙げられる。またオルニチン、アミノイソ酪酸及び２−アミノブタン酸等のアミノ酸も包含される。

本発明の用語「選択的」とは、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが、他の公知の受容体よりもＶＰＡＣ２受容体との高い選択性を有することを指す。選択性の程度は、ＶＰＡＣ２受容体結合アフィニティ：ＶＰＡＣ１受容体結合アフィニティの比率、及びＶＰＡＣ２受容体結合アフィニティ：ＰＡＣ１受容体結合アフィニティの比率により算出される。なお、結合アフィニティは実施例４にて後述するように算出される。

「インスリン分泌活性」とは、高いグルコース濃度に応答してインスリン分泌を促進する能力のことを指し、これにより細胞によるグルコース取り込みが開始され、血漿中グルコース濃度が減少する。インスリン分泌性活性は公知の方法で評価することができ、例えばＶＰＡＣ２受容体結合活性又は受容体活性化（例えばインスリノーマ細胞系又は小島によるインスリン分泌）を測定する試験、静脈グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）、腹膜内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）、並びに経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）等が挙げられる。インスリン分泌性活性は、ヒトの場合はインスリン濃度又はＣ−ペプチド濃度を測定することによって、日常的に測定する。本発明の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはインスリン分泌性活性を有する。

本発明の「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ効果」とは、細胞ベースのアッセイにおいて、ＶＰＡＣ２受容体を活性化するペプチドの能力の基準のことを指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ効果は「ＥＣ_５０」として表し、それは単一の用量反応実験において、活性上昇の最大に対して５０％の結果を生じさせる化合物の有効濃度を意味する。本発明の場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効果は、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ及びＡｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎの２つの異なるアッセイを使用して算出する。これらのアッセイの詳細は実施例３及び５を参照されたい。これらのアッセイは異なる方法で実施されるものの、得られる結果は通常２つのアッセイ間における相関関係を示す。

「血漿中半減期」という用語は、循環する当該分子の半分が血漿中でクリアランスされるまでにかかる時間のことを指す。血漿中半減期又は半減時間に関して「延長された」又は「長期化された」というときは、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの半減期が、同じ条件下における参照分子（例えば非ＰＥＧ化形態のペプチド又は天然ペプチド）のそれと比較して統計学的に有意に増加していることを意味する。本願明細書において報告する半減期は除去半減期であり、これは除去の最終相の対数線形率に対応する。当業者であれば、半減期は派生パラメータであり、クリアランス及び分布体積の関数であることを認識する。

クリアランスは、生体の薬物除去能の尺度である。例えば薬剤の修飾によりクリアランスが低下した場合、半減期は長期化すると考えられる。しかしながらこの相互関係は、分布量に変化がない場合にのみ正確なものとなる。終末相の対数線形半減期（ｔ_１／２）、クリアランス（Ｃ）及び体積分布（Ｖ）の間の有用な近似関係は、次式により与えられる。

クリアランスとはどれくらいの薬剤が除去されたかを指し示すものではなく、むしろ当該除去によって、薬剤から完全に解放されるべき生体液（例えば血液かプラズマ）の量のことを指す。
クリアランスは単位時間あたりの体積として表される。

本発明で用いる「パーセント（％）配列相同性」とは、配列のアラインメントを取ったとき、それらが同様の位置又は領域において、同様のアミノ酸である（同一か若しくは保存的に置換されている場合）ことを示す場合に用い、その場合、同一若しくは保存的に置換されているアミノ酸とは、元となるタンパクと比較して、当該タンパクの活性又は機能を変えないそれらのことを指す。例えば、各々少なくとも８５％の相同性を有する２つのアミノ酸配列とは、最適なアラインメントで最高３つのギャップを許容した場合、同様の位置において、少なくとも８５％同様（同一若しくは保存的に置換された残基）であることを指すが、但しギャップに関しては、合計１５以下のアミノ酸残基が影響を受けない。

本発明の配列相同性（％）の算出に使用する参照ペプチドを以下に示す。

パーセント配列相同性は、本発明が想定するペプチドとＰ６０３（配列番号：７）等の参照ペプチドとの間で異なる残基数を計測し、その数をとって参照ペプチドのアミノ酸の数（例えばＰ６０３では３９）で割り、結果に１００を乗算して生じる数を１００から減算することにより算出できる。例えば、Ｐ４８７と異なる４つのアミノ酸を有し、３９アミノ酸を有する配列は、９０％の配列相同性を有する（例えば、１００−（（４／３９）×１００））。３９アミノ酸よりも長い配列の場合は、Ｐ４８７配列と異なる残基の数は、上記の算出に供される３９アミノ酸を超える分のアミノ酸を含む。例えば、４０アミノ酸を有し、Ｐ４８７配列の３９アミノ酸とは４つのアミノ酸が異なり、Ｐ４８７配列に存在しないアミノ酸がカルボキシ末端に１つ添加されている場合、Ｐ４８７と異なるアミノ酸は合計５つとなる。すなわち、この配列は８７％の配列相同性（％）を有する（例えば、１００−（（５／３９）×１００））。配列相同性の程度は公知の方法を使用して算出してもよい（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６−７３０（１９８３）及びＭｙｅｒｓ Ｅ．及びＭｉｌｌｅｒ Ｗ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）を参照）。相同性の程度を算出する際に使用できる１つのプログラムとしてはＭｅｇＡｌｉｇｎリップマン−ピアソンの１ペア方法（デフォルトパラメータを使用する）が挙げられ、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｓｙｓｔｅｍの一部としてＤＮＡｓｔａｒ Ｉｎｃ社，１１２８，Ｓｅｌｆｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，５３７１５，ＵＳＡから入手できる。使用できる他のプログラムとしてはＣｌｕｓｔａｌ Ｗが挙げられる。これは、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらによって開発された、ＤＮＡ又はたんぱく質配列用の複数配列整列パッケージである（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２巻、２２号、４６７３−４６８０ページ、１９９４年）。このツールは関連する配列の異種間比較を実行し、配列の保存性を解析するのに有用である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗは、ＤＮＡ又はタンパク用の多目的多数配列整列プログラムである。これは異なる配列における、生物学的に有意義な多数の配列のアラインメントを生じさせる。選択された配列中に存在する、最高にマッチする部分を算出し、相同性、類似性及び相違が視覚可能となるようにそれらを整列させる。進化上の関係は、Ｃｌａｄｏｇｒａｍｓ又はＰｈｙｌｏｇｒａｍｓを観察することにより解析できる。

本発明に係る選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの配列は、ＶＰＡＣ２受容体に対して選択的であり、好ましくはＰ６０３（配列番号：７）と６０％〜７０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜８０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜９０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９７％、９０％〜９５％又は９５％〜９７％の範囲の配列相同性を有する。好ましくは、当該配列はＰ６０３（配列番号：７）と８２％超の配列相同性を有する。好ましくは、当該配列はＰ６０３（配列番号：７）と９０％超の配列相同性を有する。さらに好ましくは、当該配列はＰ６０３（配列番号：７）と９２％超の配列相同性を有する。よりさらに好ましくは、当該配列はＰ６０３（配列番号：７）と９５％又は９７％超の配列相同性を有する。

本願明細書に用いる用語「Ｃ_１−Ｃ_１６アルキル」は、１から１６の炭素原子を有する１価の飽和直鎖、分枝又は環状炭化水素ラジカルであり、環状であるときは３から１６の炭素原子を有する炭化水素を意味する。このように、用語「Ｃ_１−Ｃ_１６アルキル」は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルを含む。Ｃ_１−Ｃ_１６アルキル基は、例えばアリール、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＯＨ、ハロゲン、−ＣＦ_３及び−ＳＨを含む１以上の置換基により適宜置換されてもよい。

本発明の用語「Ｃ_１−Ｃ_６アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を有する１価の飽和した直鎖状、分岐状若しくは環状ラジカルであり、環状であるときは３〜６個の炭素原子を有する炭化水素を意味する。このように、用語「Ｃ_１−Ｃ_６アルキル」は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルを含有する。Ｃ_１−Ｃ_６アルキル基は、１つ以上の置換基により適宜置換されうる。

本発明の用語「Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル」とは、少なくとも１つの二重結合を有し、２〜６個の炭素原子を有する一価の飽和した直鎖状、分岐状若しくは環状ラジカルであり、環状であるときは３〜６個の炭素原子を有する炭化水素を意味する。このように、用語「Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル」は、ビニル、プロパ−２−エニル、３以外のエニル、ペント−４−エニル及びイソプロペニルを含有する。Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル基は、一つ以上の置換基により適宜置換されうる。

本願明細書中で使用される用語「Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル」とは、少なくとも一つの三重結合を有し、２から６の炭素原子を有する１価の直鎖又は分枝炭化水素ラジカルを意味する。このように、用語「Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル」は、プロパ−２−イニル、３以外のイニル及びペント−４−イニルを含有する。Ｃ_２−Ｃ_６アルキニルは、１つ以上の置換基により適宜置換されうる。

本発明の用語「Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ」とは、１〜６個の炭素原子を有し、２価のＯ基を介して置換部位と結合している、１価の非置換の飽和した直鎖状若しくは分岐鎖状の炭化水素基を意味する。このように、用語「Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ」は、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ及びｔｅｒｔ−ブトキシを含有する。Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ基は、１つ以上の置換基により適宜置換されうる。

「ハロ」又は「ハロゲン」という用語はフッ素、塩素、臭素又はヨードを意味する。

用語「アリール」とは、それのみ又は基の一部として使用する場合、フェニル基等の５〜１０員からなる芳香族化合物若しくは複素環式芳香族化合物基、５又は６員からなる単環の複素環式芳香族化合物基（その各員は利用できる置換部位の数によって、１、２、３、４又は５個の置換基で任意に置換されてもよい）、ナフチル基、又は８−、９−又は１０員からなる二環式複素環式芳香族化合物基（によって、任意に置換されてもよいことがありえる）（その各員は利用できる置換部位の数によって、１、２、３、４、５又は６個の置換基で任意に置換されてもよい）のことを指す。アリールのこの定義の中で、適切な代替は、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、アミノ、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＳＨ及びＣＦ_３を含む。

本願明細書中で使用される用語「アリールＣ_１−Ｃ_４アルキル」とは、アリールによって置換されるＣ_１−Ｃ_４アルキル基を意味する。このように、「アリールＣ_１−Ｃ_４アルキル」は、ベンジル、１−フェニルエチル（−メチルベンジル）、２−フェニルエチル、１−ナフタレンメチル又は２−ナフタレンメチルを含む。

用語「ナフチル」は、１−ナフチル及び２−ナフチルを含む。１−ナフチルが好ましい。

本発明の用語「ベンジル」とは、−ＣＨ_２−基を介して置換部位と結合する一価の非置換フェニル基を意味する。

本願明細書の用語「５又は６員の単環式複素環式芳香族基」とは、環中に合計５又は６個の原子を有する単環式芳香族基であって、それらの１〜４個の原子がＮ、Ｏ及びＳから各々独立に選択されるものを意味する。好ましい基は、Ｎ、Ｏ及びＳから各々独立に選択される１又は２個の原子を環中に有してなる。５員の単環式複素環式芳香族化合物基の例としては、ピロリル（またアゾリル基とも呼ばれる）基、フラニル基、チエニル基、ピラゾリル（また１Ｈ−ピラゾリル基及び１，２−ジアゾリル基と呼ばれる）基、イミダゾリル基、オキサゾリル（また１，３−オキサゾリル基と呼ばれる）基、イソキサゾリル（また１，２−オキサゾリル基と呼ばれる）基、チアゾリル（また１，３−チアゾリル基と呼ばれる）基、イソチアゾリル（また１，２−チアゾリル基と呼ばれる）基、トリアゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、テトラゾリル基、オキサトリアゾリル基及びチアトリアゾリル基が挙げられる。６員の単環式複素環式芳香族化合物基の例としては、ピリジニル基、ピリミジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基及びトリアジニル基が挙げられる。

本願明細書中で用いる用語「８、９又は１０員の二環式複素芳香族基」とは、環中に合計８、９又は１０個の原子を有する二環式芳香族基であって、それらの１〜４個の原子がＮ、Ｏ及びＳから各々独立に選択されるものを意味する。好ましい基は、環中に１〜３個の、Ｎ、Ｏ及びＳから各々独立に選択される原子を有する。好適な８員の二環式複素環式芳香族化合物基としては、イミダゾ［２，１−ｂ］［１，３］チアゾリル基、チエノ［３，２−ｂ］チエニル基、チエノ［２，３−ｄ］［１，３］チアゾリル基及びチエノ［２，３−ｄ］イミダゾリル基が挙げられる。適切な９員の二環式複素芳香族基は、インドリル、イソインドリル、ベンゾフラニル（また、ベンゾ［ｂ］フラニルと呼ばれる）イソベンゾフラニル（また、ベンゾ［ｃ］フラニルと呼ばれる）ベンゾチエニル（また、ベンゾ［ｂ］チエニルと呼ばれる）イソベンゾチエニル（また、ベンゾ［ｃ］チエニルと呼ばれる）インダゾリル、ベンズイミダゾリル、１，３−ベンゾオキサゾールイル、１，２−ベンズイソキサゾリル、２，１−ベンズイソキサゾリル、１，３−ベンゾチアゾリル、１，２−ベンゾイソチアゾリル、２，１−ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾールイル、１，２，３−ベンゾオキジアゾールイル、２，１，３−ベンゾオキジアゾールイル、１，２，３−ベンゾチアジアゾールイル、２，１，３−ベンゾチアジアゾールイル、チエノピリジニル、プリニル及びイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを含む。好適な１０員の二環式複素環式芳香族化合物基としては、キノリニル基、イソキノリニル基、シノリニル基、キナゾリニル基、キノキサリニル基、１，５−ナフチリジル基、１，６−ナフチリジル基、１，７−ナフチリジル基及び１，８−ナフチリジル基が挙げられる。

本願明細書に用いる用語「ＰＥＧ」はポリエチレングリコール分子を意味する。典型的な形態において、ＰＥＧは末端ヒドロキシル基を有する直鎖ポリマーであり、式ＨＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＨを有し、ｎは約８から約４０００である。末端の水素原子は保護基（例えばアルキル基又はアルカノール基）で置換されてもよい。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも１つのヒドロキシ基、好ましくは末端ヒドロキシ基を有する。好ましくはこのヒドロキシ基を活性化し、ペプチドと反応させる。本発明に有用な多くの形態のＰＥＧが存在する。従来技術には多数のＰＥＧ誘導体が存在し、本発明の使用に適している。（米国特許第５４４５０９０号、第５９００４６１号、第５９３２４６２号、第６４３６３８６号、第６４４８３６９号、第６４３７０２５号、第６４４８３６９号、第６４９５６５９号、第６５１５１００号、及び第６５１４４９１号、並びにＺａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５，１９９５）を参照されたい。）本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに共有結合するＰＥＧ分子は、特定のタイプに限定されない。ＰＥＧ分子は好ましくは５００〜１０００００Ｄａの分子量である。ＰＥＧは直鎖でも分枝でもよく、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは１、２又は３つのＰＥＧ分子をペプチドに付加している。１、２個のＰＥＧ分子がＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト１分子当たりに存在するのがより好ましいが、複数のＰＥＧ分子がペプチド１分子に存在する場合は、３個以下で存在するのが好ましい。さらに、ＰＥＧ分子の両端をホモ又はヘテロ官能化し、２つ以上のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが架橋されうることを想定する。２つのＰＥＧ分子が存在する場合、当該ＰＥＧ分子は好ましくは各々２００００ＤａのＰＥＧ分子であるか、又は各々３００００ＤａのＰＥＧ分子である。しかしながら、異なる分子量を有するＰＥＧ分子を用いてもよく、例えば１つが１００００ＤａのＰＥＧ分子でもう１つが３００００ＤａのＰＥＧ分子であってもよく、又は１つが２００００ＤａのＰＥＧ分子でもう１つが４００００ＤａのＰＥＧ分子であってもよい。

ＰＥＧ分子は、Ｃｙｓ又はＬｙｓ残基に共有結合的に付加してもよい。ＰＥＧ分子はＬｙｓ残基側鎖（Ｋ（Ｗ））に結合するＴｒｐ残基に共有結合してもよい。あるいは、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）基がＰＥＧ化され、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２Ｓ−ＰＥＧを形成してもよい。ペプチドアゴニストの任意のＬｙｓ残基はＫ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）と置換してもよく、次いでＰＥＧ化されてもよい。さらに、ペプチドアゴニストの任意のＣｙｓ残基は修飾システイン残基（例えばｈＣ）で置換されてもよい。修飾Ｃｙｓ残基はＰＥＧ分子に共有結合してもよい。

本願明細書の用語「ＰＥＧ化」とは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに上記のように１つ以上のＰＥＧ分子が共有結合することを意味する。

本願明細書に用いる用語「ラクタム架橋」とは、共有結合、特に、ペプチドアゴニストの１つのアミノ酸の側鎖アミノ末端をペプチドアゴニストの他のアミノ酸の側鎖カルボキシ末端に連結するアミド結合を意味する。好ましくは、ラクタム架橋は、残基側鎖のＸａａ_ｎを、残基側鎖のＸａａ_ｎ＋４に共有結合的に付加することにより形成され、ｎは１〜２８である。また好ましくは、ラクタム架橋は、Ｌｙｓ又はＯｒｎ残基の側鎖アミノ末端を、Ａｓｐ又はＧｌｕ残基の側鎖カルボキシ末端に共有結合的に付加することにより形成される。

本願明細書に用いる用語「ジスルフィド架橋」とは、ペプチドアゴニストの１つのアミノ酸の側鎖終端で硫黄原子を、ペプチドアゴニストの他のアミノ酸の側鎖終端で硫黄原子に連結する共有結合形成を意味する。好ましくは、ジスルフィド架橋は、残基側鎖のＸａａ_ｎを、残基側鎖のＸａａ_ｎ＋４に共有結合的に付加することにより形成され、ｎは１〜２８である。また好ましくは、ジスルフィド架橋は、Ｃｙｓ又はｈＣ残基の側鎖を、他のＣｙｓ又はｈＣ残基の側鎖に共有結合的に付加することにより形成される。

本発明の好ましい実施例によれば、式１（配列番号：１）又は式２（配列番号：２）のアミノ酸配列（式中、Ｘａａ_３はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｘａａ_８はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｘａａ_９はＡｓｎ又はＧｌｎであり、Ｘａａ_１０はＴｙｒ又はＴｙｒ（ＯＭｅ）であり、Ｘａａ_１２はＡｒｇ、ｈＲ、Ｌｙｓ又はＯｒｎであり、Ｘａａ_１４はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ｌｙｓ、Ａｌａ又はＬｅｕであり、Ｘａａ_１５はＬｙｓ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ又はＡｒｇであり、Ｘａａ_１６はＧｌｎ又はＬｙｓであり、Ｘａａ_１７はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ又はＮｌｅであり、Ｘａａ_１９はＡｌａ又はＡｂｕであり、Ｘａａ_２０はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ｇｌｎ又はＡｒｇであり、Ｘａａ_２１はＬｙｓ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ、Ａｌａ、Ｇｌｎ又はＡｒｇであり、Ｘａａ_２３はＬｅｕ又はＡｉｂであり、Ｘａａ_２５はＳｅｒ又はＡｉｂであり、Ｘａａ_２７はＬｙｓ、Ｏｒｎ、ｈＲ又はＡｒｇであり、Ｘａａ_２８はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ｈＲ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ又はＰｒｏであり、及び／又はＸａａ_２９はＬｙｓ、Ｏｒｎ、ｈＲ又は存在しない）と、Ｃ末端伸張部分（配列：ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（Ｅ−Ｃ_１６）を含む）と、Ｎ末端修飾（ヘキサノイル又はアセチルの付加である）を含むＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関する。

他の本発明の好ましい実施例によれば、式１（配列番号：１）又は式２（配列番号：２）のアミノ酸配列（式中、Ｘａａ_８はＧｌｕであり、Ｘａａ_９はＧｌｎであり、Ｘａａ_１０はＴｙｒ（ＯＭｅ）であり、Ｘａａ_１２はＯｒｎであり、Ｘａａ_１５はＡｉｂであり、Ｘａａ_１９はＡｂｕであり、Ｘａａ_２０はＡｉｂであり、Ｘａａ_２１はＯｒｎであり、Ｘａａ_２３はＡｉｂであり、Ｘａａ_２５はＡｉｂであり、Ｘａａ_２７はＯｒｎであり、及び／又はＸａａ_２８はＯｒｎである）と、Ｃ末端伸張部分（配列：ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（Ｅ−Ｃ_１６）を含む）と、Ｎ末端修飾（当該修飾はヘキサノイル又はアセチルの付加である）を含むＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関する。

さらに別の本発明の好ましい実施例によれば、式２（配列番号：２）のアミノ酸配列と、Ｃ末端伸張部分（配列：ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（Ｅ−Ｃ_１６）を含む）と、Ｎ末端修飾部分（当該修飾はヘキサノイル又はアセチルの付加である）を含むＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが提供に関する。

本発明は、配列：ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（Ｅ−Ｃ_１６）を含むＣ末端伸張が式１又は式２によるペプチド配列に付加することにより、このペプチドを保護し、並びに活性、選択性及び／又は効力を強化する特徴を提供することを見出すことに基づく。例えば、Ｃ末端伸張部分はペプチドの螺旋構造を安定させ、酵素の裂開を受けやすいＣ末端付近の部位を安定化する場合がある。さらにまた、本願明細書に開示のＣ末端伸張ペプチドは、ＶＰＡＣ２受容体に対してより選択的であり、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰ及び他の公知のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストよりも強力である。

タンパクのＰＥＧ化により、治療用にペプチド又はタンパクを使用することに付随する、多くの薬理学的、及び毒物的／免疫学的な課題が解決できる。しかしながら、個々のペプチドによっては、ＰＥＧ化されたペプチドの形態が、非ＰＥＧ化されたペプチドの形態と比較して生物活性が顕著に損なわれる場合もありうる。

ＰＥＧ化タンパクの生物活性は、例えば以下のような要因の影響を受ける。
ｉ）ＰＥＧ分子のサイズ、
ｉｉ）特定の付加部位、
ｉｉｉ）修飾の程度、
ｉｖ）好ましくない結合条件、
ｖ）付加にリンカーを用いるか否か、又はポリマーは直接付加するか否か、
ｖｉ）有害副産物の発生、
ｖｉｉ）活性ポリマーにより与えられるダメージ、又は
ｖｉｉｉ）電荷の保持。
例えば、サイトカインのＰＥＧ化により、ＰＥＧ化が有しうる効果が示される。使用する結合反応によっては、サイトカインのポリマー修飾により生理活性が劇的に低下する結果となった。
［Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｇ．Ｅ．ら、「サイトカイン及び他の治療タンパク及びペプチドのＰＥＧ化：結合技術の生物学的最適化の重要性」、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｈｅｍ．、６８巻、１−１８ページ、１９９８年］
ＰＥＧ化ペプチドの生物活性を維持することは、タンパクの場合よりも多くの課題を含む。ペプチドはタンパクよりも低分子であるため、ＰＥＧ化による修飾は生物活性により大きな影響を及ぼすことが考えられる。

本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、１つ以上のＰＥＧ分子の共有結合的付加により修飾されうる。ＰＥＧ化ペプチドは、タンパク分解及び腎クリアランスがより低速になるため、一般に薬物動態学的なプロフィールが改善される。ＰＥＧ化によりＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの見かけのサイズは増加し、そのため腎臓濾過が減少し、生体内分布が変化する。ＰＥＧ化により、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト中の抗原性エピトープは遮蔽され、これにより再網内皮性クリアランス及び免疫系による認識が低下し、さらにＤＰＰ−ＩＶ等のタンパク分解酵素による分解が低下する。

低分子の生物活性ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに１以上のＰＥＧ分子が共有結合的に付加すると、例えば、固有の２次構造及び生理活性コンホメーションを不安定化することにより、このアゴニストが好ましくない影響を発揮する危険性が問題提起され、これによりこのアゴニストは治療薬としての使用に不適切となる。ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト上の特定の残基に１以上のＰＥＧ分子が共有結合的に付加すると、非ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストと比較して、半減期が長く、クリアランスの低下した、生物活性を有するＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが得られる。

ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト内のＰＥＧ化可能部位を決定するため、セリンのスキャニングを実施した。Ｓｅｒ残基をペプチドの特定の部位で置換し、Ｓｅｒ修飾されたペプチドに関し、それによる効果及び選択性を試験する。あるＳｅｒ置換による薬剤の効果に対する影響が最小であり、当該Ｓｅｒ修飾ペプチドがＶＰＡＣ２受容体に選択的である場合、そのＳｅｒ残基をさらにＣｙｓ又はＬｙｓ残基で置換し、その部分を直接的又は間接的なＰＥＧ化部位として用いる。間接的な残基のＰＥＧ化とは、ＰＥＧ化部位の残基と結合する化学基又は残基をＰＥＧ化することを指す。Ｌｙｓの間接的ＰＥＧ化は、Ｋ（Ｗ）及びＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）のＰＥＧ化を含有する。

本願明細書に記載の本発明は、ＶＰＡＣ２に１以上のＰＥＧ分子を共有結合的に付加しうる受容体ペプチドアゴニスト又はその誘導体を提供し、各ＰＥＧはペプチドアゴニスト内のＣｙｓ又はＬｙｓアミノ酸、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）に付加してもよい。ＰＥＧ化により、選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの半減期は長期化され、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３、５、７、１０、１５、２０又は２４時間、最も好ましくは少なくとも４８時間の除去半減期を有するＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが得られる。ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのクリアランス値は、好ましくは２００ｍｌ／ｈ／ｋｇ以下、より好ましくは、１８０、１５０、１２０、１００、８０、６０ｍｌ／ｈ／ｋｇ以下、最も好ましくは５０、４０又は２０ｍｌ／ｈ／ｋｇ未満である。

野生型ＶＩＰ領域は位置８のアスパラギン酸から位置２６のイソロイシンまでαヘリックス構造を有する。ペプチドの螺旋構造が増加すると効力及び選択性が強化され、同時に酵素的分解への防御が増す。Ｃ末端伸張を用いて、ペプチドの螺旋構造を強化することができる。加えて、螺旋表面の２つのアミノ酸側鎖を連結する、例えばラクタム架橋のような共有結合を導入することも、ペプチドの螺旋構造を強化する。

さらに、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＮ末端修飾により、薬効の強化及び／又はＤＰＰ−ＩＶ裂開に対する安定化が得られることを見出した。

ＶＩＰ及び幾つかの公知のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは様々な酵素による分解を受けやすいため、インビボでは短い半減期を有する。ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの様々な酵素切断部位は後述する。切断部位は、ＶＩＰのアミノ酸位と関連して述べ（配列番号：３）、本願明細書において強調される配列に適用できる。

酵素ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によるペプチドアゴニストの切断は、位置２（ＶＩＰのセリン）と位置３（ＶＩＰのアスパラギン酸）の間に生じる。本発明のアゴニストは、Ｎ末端修飾の付加により、この領域におけるＤＰＰ−ＩＶによる切断に対してより安定になる。ＤＰＰ−ＩＶによる切断に対する安定性を改善できるＮ末端修飾の例としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ペンタノイル基、ヘキサノイル基、メチオニン、メチオニンスルホキシド、３−フェニルプロピオニル基、フェニルアセチル基、ベンゾイル基、ノルロイシン、Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、３−メルカプトプロピオニル基、ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）及び−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ_２の付加が挙げられる。Ｎ末端修飾がアセチル基又はヘキサノイル基の付加であるのがより好ましい。

野生型ＶＩＰ中のキモトリプシン切断部位は、アミノ酸１０と１１（チロシン及びトレオニン）の間、及びアミノ酸２２と２３（チロシン及びロイシン）の間に存在する。位置１０及び／又は１１及び位置２２及び／又は２３における置換により、これらの部位でのペプチドの安定性が改善されうる。例えば、位置１０及び／又は２２チロシンをＴｙｒ（ＯＭｅ）に置換することにより安定性が向上しうる。例えば、位置２１及び２５でアミノ酸側鎖を連結するラクタム架橋により、２２−２３部位を切断から保護しうる。

野生型ＶＩＰ中のトリプシン切断部位は、位置１２と１３のアミノ酸の間に存在する。特定のアミノ酸置換（例えば位置１２におけるオルニチン、及び位置１３におけるアミノイソ酪酸）によっては、この部位でのペプチド切断に対する感受性が減少する。

野生型ＶＩＰ、及び公知の多数のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストにおいては、塩基性アミノ酸である位置１４と１５の間、及び位置２０と２１の間に切断部位が存在する。本発明の選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、これらの部位が置換されているため、ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク分解に対する安定性が改善されている。これらの部位の好ましい置換により、トリプシン様酵素（トリプシンを含む）によるペプチド切断に対する感受性が減少する。例えば、位置１５のアミノイソ酪酸、位置２０のアミノイソ酪酸及び位置２１のオルニチンによる置換は、安定性の向上につながりうるため全て好ましい。

切断部位はまた、野生型ＶＩＰのアミノ酸位置２５と２６の間にも存在する。この切断部位は、位置２６で位置２５及び／又はアミノ酸でアミノ酸の代替で、完全に、又は部分的に脱離されることができる。

ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト中の、アミノ酸位置２７、２８、２９、３０及び３１を含む領域もまた酵素分解を受けやすい。Ｃ末端伸張部分の付加により、ペプチドアゴニストが神経エンドペプチターゼ（ＮＥＰ）に対してより安定になる場合があり、ＶＰＡＣ２受容体に対する選択性が向上する場合もある。この領域はまたトリプシン様の酵素による攻撃を受けやすい。それが生じる場合には、ペプチドアゴニストは更なるカルボキシプチダーゼ活性によりそのＣ末端伸張部分を喪失し、当該ペプチドが不活性な形態となりうる。この部位の分割に対する抵抗は、オルニチンを有する位置２７、２８及び／又は２９でアミノ酸を置換することによって増加することができる。

選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは様々なペプチダーゼによる分解抵抗性を有するが、それ以外にも、本発明の選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２ペプチド受容体アゴニストは、公知の幾つかのペプチドと比較して、ＶＰＡＣ２受容体に対する選択性を有し、薬理効果が強化され、及び／又は安定性が向上したペプチドであるという側面を有する。

好ましくは、選択的非ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、２ｎＭ未満の半有効濃度値ＥＣ_５０値を有する。より好ましくは、ＥＣ_５０値は１ｎＭ未満である。さらにより好ましくは、ＥＣ_５０は０．５ｎＭ未満である。なおより好ましくは、ＥＣ_５０は０．１ｎＭ未満である。好ましくは、選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは２００ｎＭ未満のＥＣ_５０値を有する。より好ましくは、ＥＣ_５０値は５０ｎＭ未満である。さらにより好ましくは、ＥＣ_５０値は３０ｎＭ未満である。なおより好ましくは、ＥＣ_５０値は１０ｎＭ未満である。

実施例４において、ＶＰＡＣ１受容体結合親和性に対するＶＰＡＣ２受容体結合親和性の比として、及び、ＰＡＣ１受容体結合親和性に対するＶＰＡＣ２受容体結合親和性の比として、選択性を計測するアッセイを記載する。好ましくは、本発明のアゴニストは、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１受容体の場合と比較して、ＶＰＡＣ２受容体に対する親和性が少なくとも５０倍高い選択性比率を有する。より好ましくは、このＶＰＡＣ２に対する親和性は、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１に対するよりも少なくとも１００倍高い。さらに好ましくは、このＶＰＡＣ２に対する親和性は、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１に対するより少なくとも２００倍高い。よりさらに好ましくは、このＶＰＡＣ２に対する親和性は、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１に対するより少なくとも５００倍高い。よりさらに好ましくは、このＶＰＡＣ２に対する親和性は、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１に対するより少なくとも１０００倍高い。

本発明で用いる「選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」には、本願明細書に記載の当該アゴニストの薬理学的に許容できる塩も包含される。本発明の選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、多くの酸性基、塩基性基及びそれらの両方の官能基を有するため、多くの無機塩基、並びに無機及び有機酸のいずれとも反応して塩を形成する。酸性付加塩の形成に通常使用される酸としては、塩酸、臭化水素、ヨウ素化水素、硫酸、リン酸等の無機酸、並びにｐ−トルエンスルホン酸、メタン硫酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸が挙げられる。かかる塩の例としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、モノリン酸水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸、フマル酸エステル、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオン酸塩、ヘキシン−１，６−ジオン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、フェニル酢酸、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩、キシレンスルホン酸塩等が挙げられる。

塩基付加塩としては、無機塩基（例えばアンモニウム、又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）に由来するものが挙げられる。本発明の塩の調製に有用なかかる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム等が挙げられる。

本発明の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、好ましくは医薬組成物として製剤化される。標準的な製剤技術として、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載の方法を採用してもよい。本発明の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、舌下、局所、経口、経真皮、鼻腔内、肺内投与用に処方してもよく、又は非経口投与用に処方してもよい。

非経口投与としては、例えば筋肉内、静脈内、皮下、皮内、腹膜内投与等の全身投与が挙げられる。選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを、医薬組成物の一部として、薬理学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて患者に投与し、ＮＩＤＤＭ又は以下に記載するような障害を治療できる。当該医薬組成物は溶液状であってもよく、又は非経口投与する場合には、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの懸濁液、又は二価の金属陽イオン（例えば亜鉛）と錯体を形成したＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの懸濁液としてもよい。適切な薬剤担体は、ペプチド又はペプチド誘導体と相互作用しない不活性成分を含有してもよい。非経口投与用の適切な薬剤担体としては、例えば滅菌した水、生理食塩水、静菌食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍＬでベンジルアルコールを含有する食塩水）、リン酸緩衝食塩水（ハンクス溶液）、乳酸リンガー液等が挙げられる。適切な賦形剤の若干の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール及びマンニトールが挙げられる。

本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、その血漿中濃度が長期間有効な濃度範囲内に維持されるように製剤化してもよい。ペプチド薬の有効な経口輸送を妨げる主な障害としては、酸及び酵素によるペプチドの分解による弱い生物学的利用能、上皮膜による弱い吸収、及び消化管の酸性ｐＨ環境への暴露後のペプチドの不溶性化が挙げられる。本発明が想定する当該ペプチドを経口輸送する様々なシステムは当業に公知である。例えば、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストをマイクロカプセル中に封入し、さらに経口輸送することが可能である。例えば、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、充填材として市販されている、生物学的適合性を有する、生物分解性ポリマー、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）−ＣＯＯＨ及びオリーブ油から構成されるマイクロカプセルに封入できる（Ｊｏｓｅｐｈら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４３：１３１９−１３２８（２０００）を参照）。Ａｌｋｅｒｍｅｓ社製Ｍｅｄｉｓｏｒｂ（登録商標）及びＰｒｏｌｅａｓｅ（登録商標）等の市販生分解性ポリマー等の他のタイプのマイクロカプセル技術も用いうる。Ｍｅｄｉｓｏｒｂ（登録商標）ポリマーは任意のラクチド異性体から調製しうる。ラクチド：グリコリド比率は０：１００〜１００：０の間で変化させることができ、幅広い範囲のポリマー特性となりうる。これにより、数週から数か月にわたる再吸収時間を有する輸送システム及びインプラント可能手段の設計が可能となる。またＥｍｉｓｐｈｅｒｅが、ペプチド及びタンパクの経口輸送技術に関する記事として多数報告されている。例えば、Ｌｅｏｎｅ−ｂａｙらの国際公開第９５／２８８３８号が挙げられ、そこでは修飾アミノ酸を含有する特異的な担体により吸収を促進する技術に関して開示している。

本願明細書に記載の選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、多種の疾患及び症状を有する患者の治療に使用できる。本発明に包含されるアゴニストは、ＶＰＡＣ２受容体と呼ばれる受容体において、それらの生物学的効果を及ぼす。ゆえに、ＶＰＡＣ２受容体刺激、又はＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの投与に有利に反応する疾患及び／又は症状を有する患者は、本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２アゴニストにより治療されうる。これらの患者は「ＶＰＡＣ２アゴニストでの治療を必要とする」、又は「ＶＰＡＣ２受容体刺激を必要とする」と称される。

本発明の選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、１型及び２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病又はＮＩＤＤＭ）を含む糖尿病治療に使用してもよい。このアゴニストは、ＮＩＤＤＭが進行する危険性を有する患者に対して、ＶＰＡＣ２受容体アゴニストを用いて予防的処置を行ってもよい。当該治療は、糖尿病及び糖尿病合併症の発症を遅延させうる。本発明のアゴニストで処置することができる更なる患者としては、耐糖能の異常（ＩＧＴ）（Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２２（Ｓｕｐｐ．１）：Ｓ５，１９９９）、又は空腹時血糖異常（ＩＦＧ）（Ｃｈａｒｌｅｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４０：７９６，１９９１）を有する患者であって、体重が、患者の身長及び体格における標準体重より約２５％高い患者、ＮＩＤＤＭに罹患する親を１人でも有する患者、妊娠糖尿病に罹患した患者及び例えば内因性インスリン分泌の減少から生じる代謝性障害を有する患者が挙げられる。選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを用いて、耐糖能異常を有する患者の症状のＮＩＤＤＭへの発展の防止、膵臓β−細胞の悪化の防止、β−細胞増殖の誘導、β−細胞機能の改善、休止中のβ−細胞の活性化、β−細胞への細胞分化、β−細胞複製の刺激及びβ−細胞アポトーシスの阻害等が可能となる。本発明の方法において、本発明のアゴニストを使用して治療若しくは予防できる疾患及び症状としては：若年性糖尿病（ＭＯＤＹ）（Ｈｅｒｍａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４３：４０，１９９４）、成人の潜在性自己免疫疾患（ＬＡＤＡ）（Ｚｉｍｍｅｔら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｄ．１１：２９９，１９９４）、妊娠糖尿病（Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４０：１９７，１９９１）、代謝性エックス症候群、異脂肪血症、高血糖、高インスリン血症、高トリグリセリド血症及びインスリン抵抗等が挙げられる。

本発明の選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、糖尿病の第２の原因の治療にも使用できる（Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２２（Ｓｕｐｐ．ｌ）：Ｓ５，１９９９）。かかる第２の原因としては、グルココルチコイド過剰、成長ホルモン過剰、クロム親和性細胞腫及び薬物性糖尿病が挙げられる。糖尿病を誘導しうる薬剤としては、限定されないがピリミニル、ニコチン酸、グルココルチコイド、フェニトイン、甲状腺ホルモン、β−アドレナリン作動薬、α−インターフェロン及びＨＩＶ感染治療薬等が挙げられる。

本発明の選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、食物摂取の抑制及び肥満の治療に効果的である。

本発明の選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはまた、アテローム硬化型疾患、高脂血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬ濃度、高血圧、原発性肺高血圧症、心血管疾患（アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病及び冠状動脈疾患を含む）、脳血管疾患及び末梢性血管疾患等の障害の予防若しくは治療、並びに、狼瘡、多嚢胞性卵巣症候群、発癌及び過形成の治療、男性及び女性の生殖障害、性的障害、潰瘍、睡眠障害、脂質及び炭水化物の代謝障害、体内時計の機能不全、成長障害、エネルギーホメオスタシスの障害、自己免疫疾患等の免疫疾患（例えば全身エリテマトーデス）、並びに急性及び慢性炎症性疾患、慢性関節リウマチ及び感染性ショック等の治療に効果的である。

本発明の選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはまた、例えば脂質蓄積細胞への細胞分化、インスリン感受性及び血糖値の調節に関連する生理的障害の治療に有用である。それらは例えば膵臓β細胞の不全、インスリン分泌腫瘍の形成及び／又は自己免疫低血糖症（インスリンに対する自己抗体、インスリン受容体に対する自己抗体若しくは膵臓β細胞を活性化する自己抗体による）、アテローム動脈硬化性斑、炎症性反応、発癌、過形成、脂肪細胞遺伝子発現、脂肪細胞分化、膵臓β細胞質量の減少、インスリン分泌、インスリンに対する組織感度、脂肪肉腫細胞増殖、多嚢胞性卵巣の疾患、慢性無排卵、高アンドロゲン症、プロゲステロン産生、ステロイド合成、細胞内の酸化還元ポテンシャル及び酸化ストレスの形成をもたらすマクロファージの分化、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）産生、γグルタミルペプチド転移酵素、カタラーゼ、血漿中トリグリセリド、ＨＤＬ及びＬＤＬコレステロール濃度の上昇等が関与する。

さらに、本発明の選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは喘息の治療（Ｂｏｌｉｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ３７：５７−６６（１９９５）、米国特許第５６７７４１９号、ポリペプチドＲ３ＰＯがモルモット気管平滑筋を弛緩させる活性を有することを示す）、低血圧誘導（ＶＩＰは喘息の患者における低血圧、心搏急速及びほてりを誘導する（Ｍｏｒｉｃｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ７：２７９−２８０（１９８６）、Ｍｏｒｉｃｅら、Ｌａｎｃｅｔ ２：１２２５−１２２７（１９８３））、男性の生殖器障害の治療（Ｓｉｏｗら、Ａｒｃｈ．Ａｎｄｒｏｌ．４３（１）：６７−７１（１９９９））、抗アポトーシス／神経保護薬としての使用（Ｂｒｅｎｎｅｍａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：２０７−１２（１９９８））、虚血の間の心臓保護（Ｋａｌｆｉｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１２６８（２）：９５２−８（１９９４）、Ｄａｓ，ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：２９７−３０８（１９９８））、体内時計及びそれに関連する障害の調節（Ｈａｍａｒら、Ｃｅｌｌ １０９：４９７−５０８（２００２）、Ｓｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：１１５７５−８０，（２０００））、及び抗潰瘍薬としての使用（Ｔｕｎｃｅｌら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：３０９−２２，（１９９８））に供することができる。

選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの「有効量」とは、ＶＰＡＣ２受容体刺激を必要とする患者に投与したときの、許容できない副作用を引き起こすことなく、所望の治療的及び／又は予防的効果をもたらす量のことを指す。「所望の治療的効果」には、以下の１つ以上が含まれる：１）疾患又は症状に関連する徴候の改善、２）疾患又は症状を伴う症状発現の遅延、３）治療を行わない場合と比較した寿命の長期化、及び４）治療を行わない場合と比較した生活の質の改善。例えば、ＮＩＤＤＭの治療用のＶＰＡＣ２アゴニストの「有効量」とは、治療を行わない場合よりも血液グルコース濃度がより顕著に制御される量のことを指し、それにより、結果的に糖尿病による合併症（例えば網膜症、神経障害又は腎臓病）の発症が遅延される。ＮＩＤＤＭの予防用の選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの「有効量」とは、処置を行わない場合と比較して、抗血糖剤（例えばスルホニル尿素、チアゾリジンジオン、インスリン及び／又はビスグアニジン）による治療が必要となる高血糖の発症を遅延させる量のことを指す。

患者に投与される選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの「有効量」は、疾患のタイプ及び重症度、並びに患者の特徴（例えば健康状態、年齢、性別、体重及び薬剤に対する許容度）にも依存する。患者の血液グルコースの正常化に効果的な選択的ＶＰＡＣ２ペプチド受容体アゴニストの投与量は、限定されないが、患者の性別、体重及び年齢、血糖値の制御不能の重症度、投与経路及び生物学的利用能、ペプチドの薬物動態プロフィール、薬効及び製剤化のタイプ等の多くの要因に依存する。

本発明の選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの典型的な投与量範囲は、約１μｇ／日〜約５０００μｇ／日にわたる。好ましくは、投与量は約１μｇ／日〜約２５００μｇ／日、より好ましくは約１μｇ／日〜約１０００μｇ／日にわたる。さらに好ましくは、投与量は約５μｇ／日〜約１００μｇ／日にわたる。さらに好ましい投与量範囲は、約１０μｇ／日〜約５０μｇ／日である。最も好ましくは、投与量は約２０μｇ／日である。

「患者」とは哺乳類であり、好ましくはヒトであるが、それ以外の動物、例えばコンパニオンアニマル（例えばイヌ、ネコ等）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）及び実験動物（例えばラット、マウス、モルモット等）であってもよい。

本発明の選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、固相ペプチド合成等の標準的な方法を用いて調製できる。例えば、ペプチド合成装置としてＲａｉｎｉｎ−ＰＴＩ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｔｕｃｓｏｎ社製、米国アリゾナ州）等が市販されている。固相合成用の試薬は、例えばＧｌｙｃｏｐｅｐ社（シカゴ、米国イリノイ州）から市販されている。固相ペプチド合成装置を製造業者の指示に従って使用し、干渉基を保護し、反応させるアミノ酸を保護し、カップリングさせ、デカップリングさせ、未反応アミノ酸をキャッピングすることができる。

典型的には、α−Ｎ保護されたアミノ酸と、樹脂上で伸長するペプチド鎖上のＮ末端アミノ酸を、室温で、不活性溶媒（ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン又はメチレンクロライド）中で、カップリング剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び塩基、例えばジイソプロピルエチルアミンの存在下でカップリングさせる。α−Ｎ保護基を、トリフルオロ酢酸又はピペリジン等の試薬を使用して、得られるペプチド樹脂から除去し、さらにペプチド鎖に付加させる次の所望のＮ保護アミノ酸を用いてカップリング反応を反復する。適切なアミン保護基は公知であり、例えばＧｒｅｅｎ及びＷｕｔｓ、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９１に記載されている。例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）基及びフルオロエニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基が挙げられる。

選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、適切な側鎖保護基を有するｔ−ブトキシカルボニル−又はフロロエニルメトキシカルボニル−α−アミノ酸を使用する標準的な自動固相合成プロトコルを使用して合成できる。合成終了後、例えばα−アミノ基を以下のものと反応させることによりＮ末端修飾を行ってもよい：（ｉ）活性エステル（α−Ｎ保護アミノ酸の導入に関する上記と同様のプロトコルを使用）、（ｉｉ）アルデヒド（還元剤の存在下（還元的アミノ化方法））、及び（ｉｉｉ）グアニド化（ｇｕａｎｉｄａｔｉｏｎ）試薬。さらに、標準的なフッ化水素又はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いた側鎖の同時脱保護方法を用いて固相担体からペプチドを分離させる。さらに粗ペプチドを、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラムによる逆相クロマトグラフィを使用して、０．１％ ＴＦＡ中のアセトニトリル勾配により精製する。アセトニトリルを除去するため、０．１％のＴＦＡ、アセトニトリル及び水を含有する溶液からペプチドを凍結乾燥させる。分析用逆相クロマトグラフィにより純度を検定できる。質量分析によりペプチドのアイデンティティを解析できる。中性ｐＨの水性バッファ中にペプチドを溶解させることができる。

また本発明のペプチドアゴニストは、真核生物及び原核細胞宿主を使用し、公知の組換え方法により調製してもよい。

ペプチドを調製、精製した後、少なくとも１分子のＰＥＧを、Ｃｙｓ若しくはＬｙｓ残基、Ｋ（Ｗ）若しくはＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）、又はカルボキシ末端アミノ酸に共有結合させて修飾する。ＰＥＧと共有結合したペプチドの調製方法として、多様な手法が従来技術において公知であり、本発明に使用する方法は特に限定されない（ＲｏｂｅｒｔｓＭ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４：４５９−４７６，２００２）の報告等を参照）。

使用可能なＰＥＧ分子の例としては、メトキシ−ＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋ（２つに分かれたＰＥＧマレイミド（Ｎｅｋｔａｒ社製、ハンツヴィル、アラバマ）が挙げられる。他の例としては、バルクｍＰＥＧ−ＳＢＡ−２０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ社製）、ｍＰＥＧ２−ＡＬＤ−４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ社製）及びメトキシ−ＰＥＧ−ＭＡＬ−３０Ｋ（Ｄｏｗ社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを調製するための１つの方法として、ＰＥＧ−マレイミドを使用してＰＥＧを直接ペプチドのチオール基に結合させる方法が挙げられる。チオール官能基の導入は、上記の位置でペプチド上若しくはペプチド内にＣｙｓ又はｈＣ残基を付加若しくは挿入することにより実施できる。また、例えばメルカプトプロピオン酸等のチオール含有酸を用いるリジン−アミノ基のアシル化により、ペプチド側鎖上にチオール官能基を導入することもできる。本発明に係るＰＥＧ化方法では、マイケル付加を利用して安定なチオエーテルリンカーを形成させる。反応は非常に特異的であり、他の官能基の存在下、穏やかな条件下で生じる。ＰＥＧマレイミドが、良く知られた、生理活性なＰＥＧ−タンパクコンジュゲートの調製用の反応性ポリマーとして用いられている。好ましくは、当該方法では、チオール含有ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの過剰量（好ましくはＰＥＧマレイミドに対して１〜１０モルの過剰）を用いて反応を完了させる。好ましくは１０分〜４０時間、室温で、ｐＨ４．０〜９．０において、反応を実施する。過剰の非ＰＥＧ化チオール含有ペプチドは、従来技術の分離方法によって、ＰＥＧ化生成物から容易に分離できる。ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは好ましくは逆相ＨＰＬＣ又は限外除外クロマトグラフィを使用して単離された状態である。ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＰＥＧ化に必要な特異的な条件を実施例８に示す。システインのＰＥＧ化は、ＰＥＧマレイミド又は二分枝のＰＥＧマレイミドを用いて実施できる。

ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストをＰＥＧ化する代替法には、ＰＥＧ−スクシンイミジル誘導体を用いてリジン残基をＰＥＧ化することが挙げられる。部位特異的ＰＥＧ化のため、ＰＥＧ化に用いないＬｙｓ残基をＡｒｇ残基で置換する。

他のＰＥＧ化方法は、Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ反応を経由する方法である。この方法では、ＶＰＡＣ２受容体に選択的なペプチド上にＰＥＧ分子を導入するために、遊離アミン基を有するＴｒｐ残基が必要となる。これを実施するための１つのアプローチとしては、固相合成の間に、Ｌｙｓ側鎖のアミン基に対してアミド結合を介して部位特異的にＴｒｐ残基を導入する方法が挙げられる（実施例１０を参照）。

ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの環化は、溶液中、又は固体担体上で実施しうる。固体担体上の環化は、ペプチドの固相合成に引き続いて直ちに実行されうる。これは、環化において共有結合的に連結されるアミノ酸の選択性又は直交的保護を含む。

以下、本発明のさまざまな好適な特徴及び実施形態を、次の非限定的な実施例に関して記載する。

＜実施例１＞固相化ｔ−Ｂｏｃによる選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの調製：
約０．５〜０．６ｇ（０．３８〜０．４５ｍｍｏｌｅ）のＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）−ＰＡＭ樹脂を、標準的な６０ｍＬ反応容器中に添加した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＡＢＩ４３０Ａペプチド合成装置を用いてダブルカップリングを実施した。以下の側鎖被保護アミノ酸（Ｂｏｃアミノ酸の２ｍｍｏｌｅカートリッジ）をＭｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｆｉｓｈｅｒｓ、米国インディアナ州）から購入し、合成に用いた。

Ａｒｇ−トシル（Ｔｏｓ）Ａｓｐ−シクロヘキシルエステル（ＯｃＨｘ）Ａｓｐ−９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）Ｃｙｓ−ｐ−メチルベンジル（ｐ−ＭｅＢｚｌ）Ｇｌｕ−シクロヘキシルエステル（ＯｃＨｘ）ヒスチジン−ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）Ｌｙｓ−２−クロロベンジルオキシカルボニル（２Ｃｌ−Ｚ）Ｌｙｓ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）Ｏｒｎ−２−クロロベンジルオキシカルボニル（２Ｃｌ−Ｚ）Ｓｅｒ−Ｏ−ベンジルエーテル（ＯＢｚｌ）トレオニン−Ｏ−ベンジルエーテル（ＯＢｚｌ）Ｔｒｐ−ホルミル（ＣＨＯ）Ｔｙｒ−２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２Ｂｒ−Ｚ）Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）ＰＡＭ樹脂及びＭＢＨＡ樹脂。
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ＤＭＦ中の０．５Ｍのヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びジクロロメタン中の０．５Ｍのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）をＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、米国カリフォルニア州）から購入した。
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ−Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ）及びジクロロメタン（ＤＣＭ−Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）をＭａｙｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（インディアナポリス、米国インディアナ州）から購入した。
ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフロロホスファート（ＢＯＰ）は、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ（サンディエゴ、米国カリフォルニア州）から得た。

対称な無水物又はＨＯＢｔエステルを使用して標準的なダブルカップリングを実施し、両方ともＤＣＣを使用して形成させた。合成終了後、Ｎ末端Ｂｏｃ基を除去し、Ｔｒｐが配列中に存在する場合にはペプチジル樹脂を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理し、Ｔｒｐ側鎖を脱ホルミル化した。Ｎ末端アシル化のため、４倍過剰の対応する酸の対称無水物をペプチド樹脂に添加した。ＤＣＭ中でジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を活性化させ、対称無水物を調製した。４時間反応させ、ニンヒドリン試験によりモニターした。ＤＣＭで洗浄した後、樹脂をＴＥＦＬＯＮ製の反応容器へ移し、真空乾燥させた。

反応容器をＨＦ（フッ化水素）装置（Ｐｅｎｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）に取り付け、開裂反応を実施させた。ｇ／樹脂当たり１ｍＬのｍ−クレゾールを添加し、１０ｍＬのＨＦ（ＡＧＡ社製、インディアナポリス、ＩＮ）を予め冷却された容器中で凝縮させた。メチオニンが存在する場合は、樹脂ｇ当たり１ｍＬのＤＭＳを添加した。アイスバス中で１時間反応液を撹拌した。真空内でＨＦを除去した。エチルエーテル中に残余物を懸濁させた。固体を濾過し、エーテルで洗浄した。各ペプチドを酢酸水溶液で抽出し、凍結乾燥又は逆相カラム上へ直接ロードした。

バッファＡ（水の０．１％のＴＦＡ）を用い、２．２×２５ｃｍのＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラムで精製した。ＨＰＬＣ（水）で、１０ｍＬ／分で１２０分、Ａの２０％〜９０％のＢ（アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ）の勾配とし、２８０ｎｍ（４．０Ａ）でＵＶをモニターしながら、１分間ずつに分けてフラクションを回収した。適当なフラクションを混合し、凍結乾燥した。ＨＰＬＣ（０．４６×１５ｃｍのＭＥＴＡＳＩＬ ＡＱ Ｃ１８）及びＭＡＬＤＩ質量分析により、乾燥生成物を分析した。

リジン残基及びアスパラギン酸残基を連結するラクタム架橋を有する環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、Ｆｍｏｃ及びＦｍでリジン及びアスパラギン酸の側鎖を選択的に保護することにより調製した。合成に用いた他の全てのアミノ酸は、標準的なベンジル側鎖保護したＢｏｃ‐アミノ酸である。次いで、ペプチド固相合成に続き、直ちに固体担体上にて環化を実施してもよい。Ｆｍｏｃ及びＦｍ保護基は選択的に取り除かれ、ＤＩＥＡ存在下においてＢＯＰでアスパラギン酸カルボキシル基を活性化することにより、環化を実施した。反応は２４時間進行させ、ニンヒドリン試験によりモニターした。

＜実施例２＞固相ＦＭｏｃを用いた選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの調製：
約１１４ｍｇ（５０ｍｍｏｌｅ）のＦＭＯＣＳｅｒ（ｔＢｕ）ＷＡＮＧ樹脂（ＧｌｙｃｏＰｅｐ社製、シカゴ、米国イリノイ州）を各反応容器に添加した。Ｒａｉｎｉｎ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて合成を実施した。７５ｍｇ（５０μｍｏｌｅ）のＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＡＭ樹脂（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ．Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）を使用してＣ末端アミドを有するアナログを調製した。

以下のＦＭＯＣアミノ酸を、ＧｌｙｃｏＰｅｐ社（シカゴ、米国イリノイ州）及びＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、米国カリフォルニア州）から購入した。
Ａｒｇ−２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ−トリチル（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ−β−ｔ−ブチルエステル（ｔＢｕ）、Ｇｌｕ−δ−ｔ−ブチルエステル（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ−トリチル（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ−トリチル（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒｔ−ブチルエーテル（ＯｔＢｕ）、Ｔｈｒ−ｔ−ブチルエーテル（ＯｔＢｕ）、Ｔｒｐ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ−ｔ−ブチルエーテル（ＯｔＢｕ）。

溶媒のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ−Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ）、Ｎメチルピロリドン（ＮＭＰ−Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ−Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）は、Ｍａｙｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（インディアナポリス、米国イリノイ州）から購入した。

ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）及びピペリジン（Ｐｉｐ）は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ミルウォーキー、米国ウィスコンシン州）から購入した。ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフロロホスファート（ＢＯＰ）は、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ（サンディエゴ、ＣＡ）から得た。

全てのアミノ酸を、ＤＭＦで０．３Ｍとなるように溶解させた。２０％のＰｉｐ／ＤＭＦを使用して２０分間脱保護した後、ＤＩＣ／ＨＯＢｔで活性化させてカップリングを３時間実施した。脱保護及びカップリングの後、各樹脂をＤＭＦで洗浄した。最後のカップリング及び脱保護の後、ペプチジル樹脂をＤＣＭで洗浄し、反応容器中で真空乾燥させた。Ｎ末端アシル化のため、４倍過剰の対応する酸の対称無水物をペプチド樹脂に添加した。ＤＣＭ中でジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を活性化させ、対称無水物を調製した。４時間反応させ、ニンヒドリン試験によりモニターした。ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄した後、真空乾燥させた。

開裂反応液を、１０ｍＬのＴＦＡ中に０．２ｍＬのチオアニソール、０．２ｍＬのメタノール、０．４ｍＬのトリイソプロピルシランを含有する開裂カクテル（全てＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ミルウォーキー、ＷＩから購入）と２時間混合させた。Ｃｙｓが配列中に存在する場合、２％のエタンジチオールを添加した。ＴＦＡ濾過液を４０ｍＬのエチルエーテルに添加した。沈殿物を２０００回転／分で２分遠心分離した。上澄みをデカントした。ペレットを４０ｍＬのエーテル中に再懸濁し、再度遠心分離し、再度デカントし、窒素下さらに真空下において、乾燥させた。

各生成物０．３〜０．６ｍｇを、１ｍＬの０．１％のＴＦＡ／アセトニトリル（ＡＣＮ）に溶解させ、２０μＬをＨＰＬＣ［０．４６×１５ｃｍのＭＥＴＡＳＩＬ ＡＱ Ｃ１８、１ｍＬ／分、４５℃、２１４ｎＭ（０．２Ａ）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、勾配＝５０％ Ｂ〜９０％ Ｂ、３０分］により分析した。

バッファＡ（水の０．１％のＴＦＡ）を用い、２．２×２５ｃｍのＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラムで精製した。ＨＰＬＣ（水）で、１０ｍＬ／分で１２０分、Ａの２０％〜９０％のＢ（アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ）の勾配とし、２８０ｎｍ（４．０Ａ）でＵＶをモニターしながら、１分間ずつに分けてフラクションを回収した。適当なフラクションを混合し、凍結乾燥した。ＨＰＬＣ（０．４６×１５ｃｍのＭＥＴＡＳＩＬ ＡＱ Ｃ１８）及びＭＡＬＤＩ質量分析により、乾燥生成物を分析した。

リジン残基及びアスパラギン酸残基を連結するラクタム架橋を有する環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、それぞれ、Ａｌｏｃ及びＡｌｌｙｌでリジン残基及びアスパラギン酸残基の側鎖を選択的に保護することにより調製した。合成に用いた他の全てのアミノ酸は、標準的なｔ−ブチル側鎖保護されたＦｍｏｃ−アミノ酸である。

次いで、ペプチド固相合成に続き、直ちに固体担体上にて環化を実施してもよい。Ａｌｏｃ及びＡｌｌｙｌ保護基は選択的に取り除かれ、ＤＩＥＡ存在下においてＢＯＰでアスパラギン酸カルボキシル基を活性化することにより、環化を実施した。

（固相ＦｍｏｃによるＰ６０３の調製）
ポリスチレンＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＡＭ樹脂（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ社、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）約７５ｍｇ（５０ｍｏｌ）を反応器に入れた。ＲａｉｎｉｎＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用い、自動合成の第１サイクルにＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−アリルオキシカルボニル（Ａｌｏｃ）を使用した。ペプチド樹脂の伸長は、前述の実施例２のように実施した。Ｃ_６−Ｎ末端基アシル化を含むペプチド−樹脂の自動伸長の完了後に、２５℃で２０分間、ＤＣＭ−酢酸−ピペリジン（９２：５：３（ｖ／ｖ／ｖ））（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、米国ウィスコンシン州）中、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）［１００ｍｏｌ］を使用して、手操作でＡｌｏｃ保護基を除去した。このステッを２回繰り返した。次いで、Ａｌｏｃ保護基を外した樹脂をＤＣＭ中５％ＤＩＥＡ及びＤＭＦ中０．０３Ｍジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、米国ウィスコンシン州）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−−ＯｔＢｕエステル（５００ｍｏｌ、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、ラホーヤ、米国カリフォルニア州から購入）は、２５℃で２時間、ＤＭＦ中ＤＩＣ（５００ｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（５００ｍｏｌ）を用いて、手操作で取り込んだ。次いでＦｍｏｃを除去した後、パルミチン酸（５００ｍｏｌ； Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、米国ウィスコンシン州から購入）をＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−α−ＯｔＢｕエステルと同じ方法を用いて取り込んだ。樹脂からのペプチド切断及び精製は、実施例２に記載のように実施した。

＜実施例３＞ヒトＶＰＡＣ２受容体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効果：ＡｉｐｈａＳｃｒｅｅｎ：
細胞（ヒトＶＰＡＣ２受容体を安定に発現するＣＨＯ−Ｓセル）を、培養フラスコ中、ＰＢＳを用いて１回洗浄した。次に酵素フリーの分散バッファを用いて細胞をリンスした。分散させた細胞を回収した。次に細胞をスピンダウンし、刺激バッファで洗浄した。データポイントごとに、刺激バッファ中に懸濁させた５０，０００細胞を用いた。このバッファに、Ａｌｐｈａスクリーンアクセプタビーズを、当該刺激と共に添加した。この混合物を６０分間インキュベートした。溶解バッファ及びＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎドナービーズを添加し、６０〜１２０分間インキュベートした。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎのシグナル（細胞内ｃＡＭＰ濃度を表す）を、適切な計測装置（例えばＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製ＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ）で測定した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎのドナー及びアクセプタビーズを扱う処理は減光下で実施した。ｃＡＭＰ生成におけるＥＣ_５０は、シグナルから直接算出したか、又は各プレートで作成した標準曲線により定義される絶対的なｃＡＭＰ濃度に基づいて算出した。各アゴニストの結果は、１度のランにおいて、行った最低限２つの分析値から算出した。若干のアゴニストの場合、１つ以上のランにおける結果の平均として算出した。テストされたペプチド濃度は、以下の通りである：試験したペプチド濃度は、１００００、１０００、１００、１０、３、１、０．１、０．０１、０．００３、０．００１、０．０００１及び０．００００１ｎＭである。

（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）
９６ウェルマイクロタイタープレート中で安定にヒトＶＰＡＣ２受容体を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞系を、アッセイ前日に５０，０００細胞／ウェルで播種した。２００μＬの培地中で２４時間細胞をインキュベートした。実験日に培地を除去した。さらに細胞を２度洗浄した。室温で、１５分間、アッセイバッファ＋ＩＢＭＸ中で細胞をインキュベートした。その後、刺激を添加し、アッセイバッファ中に溶解させた。３０分間にわたり刺激した。次にアッセイバッファを穏やかに除去した。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ ｃＡＭＰキット中の細胞溶解試薬を添加した。その後、製造業者の指示に従い、ｃＡＭＰシグナルの検出に関する標準的なプロトコルを実施した（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社、米国）。ｃＡＭＰ生成におけるＥＣ_５０は、シグナルから直接算出したか、又は各プレートで作成した標準曲線により定義される絶対的なｃＡＭＰ濃度に基づいて算出した。典型的な試験ペプチド濃度は、１００００、３００、１００、１０、１、０．３、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１及び０ｎＭである。

第１表に、様々なアッセイフォーマットによる、ヒトＶＰＡＣ２受容体の活性（ＥＣ_５０（ｎＭ））を示す。
第１表．ヒトＶＰＡＣ２受容体におけるペプチド効力

＜実施例４＞選択性：
結合アッセイ：安定なＶＰＡＣ２細胞系（実施例３を参照）、又はヒトＶＰＡＣ１又はＰＡＣ１で一時的にトランスフェクションした細胞から調製した細胞膜を用いた。トレーサーとしてＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２及びＰＡＣ１について１２５Ｉ標識ＰＡＣＡＰ−２７を使用して、フィルタ結合アッセイを実施した。

このアッセイに用いる溶液及び装置は以下の通りである。
事前浸漬溶液：Ａｑｕａ ｄｅｓｔ中の０．５％のポリエチレンアミン
フィルタプレートのフラッシュのためのバッファ：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４
ブロッキングバッファ：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）；０．２％プロテアーゼフリーＢＳＡ
アッセイバッファ：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）；０．５％プロテアーゼフリーＢＳＡ
希釈及びアッセイプレート：ＰＳ−Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、Ｕ型
濾過プレート：Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＦＢ Ｏｐａｑｕｅ Ｐｌａｔｅ；１．０μＭ タイプＢグラスファイバーフィルタ。

フィルタプレートの調製のため、減圧濾過によって、事前浸漬溶液を吸引除去した。２００μＬのフラッシュバッファを用いてプレートを２度洗浄した。２００μＬのブロッキングバッファをフィルタプレートに添加した。次にフィルタプレートを、室温で１時間、２００μＬの事前浸漬溶液でインキュベートした。

アッセイプレートを、２５μＬアッセイバッファ、アッセイバッファの中に懸濁した２５μＬ（２．５μｇ）の膜、アッセイバッファ中のアゴニスト２５μＬ、及びアッセイバッファ中のトレーサー（約４００００ｃｐｍ）２５μＬで満たした。満たされたプレートを振とうしながら１時間インキュベートした。

アッセイプレートからフィルタプレートへの移動を行わせた。ブロッキングバッファを減圧濾過により吸引除去し、フラッシュバッファで２回洗浄した。アッセイプレートからフィルタプレートへ９０μＬを移した。アッセイプレートから移した９０μＬを吸引し、２００μＬのフラッシュバッファで３回洗浄した。プラスチック製の支持体を除去した。６０℃で１時間乾燥させた。３０μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔを添加した。カウントを実施した。

＜実施例５＞ラットＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２受容体におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ効果：
（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）
市販のトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を使用して、ラットＶＰＡＣ１又はＶＰＡＣ２受容体ＤＮＡにより、ＣＨＯ−ＰＯ細胞をトランジェントにトランスフェクションした。９６ウェルプレートに１０，０００／ウェルの密度で細胞を播種し、２００ｍＬの培地で３日間成長させた。３日目にアッセイを実施した。

実験日に培地を除去した。さらに細胞を２度洗浄した。室温で、１５分間、アッセイバッファ＋ＩＢＭＸ中で細胞をインキュベートした。その後、刺激を添加し、アッセイバッファ中に溶解させた。３０分間にわたり刺激した。次にアッセイバッファを穏やかに除去した。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ ｃＡＭＰキット中の細胞溶解試薬を添加した。その後、製造業者の指示に従い、ｃＡＭＰシグナルの検出に関する標準的なプロトコルを実施した（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社、米国）。ｃＡＭＰ生成におけるＥＣ_５０は、シグナルから直接算出したか、又は各プレートで作成した標準曲線により定義される絶対的なｃＡＭＰ濃度に基づいて算出した。典型的な試験ペプチド濃度は、１００００、３００、１００、１０、１、０．３、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１及び０ｎＭである。

＜実施例６＞ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ：静脈ブドウ糖負荷試験（ＩＶＧＴＴ）
通常のウィスターラットを一晩絶食させ、実験前に麻酔した。血液サンプリング用カテーテルをラットに挿入した。アゴニストを皮下投与し、通常グルコース投与の２４時間前に曝露した。血液サンプルを頸動脈から採取した。血液サンプルは、アゴニスト投与後のグルコース注入の直前に採血した。第一の採血の後、グルコース混合液を静脈内（ｉ．ｖ．）に注射した。ｋｇ体重当たりグルコース＋アゴニストを有する担体を合計１．５ｍＬ注入した（０．５ｇ／ｋｇ体重によるグルコース投与となる）。望ましい投与量を決定するため、ペプチド濃度をμｇ／ｋｇ単位で変化させた。グルコース投与の２、４、６及び１０分後に血液サンプルを採血した。アゴニストを含まない、グルコースのみを含む同じ担体を投与する群を対照動物群とした。幾つかの場合、グルコース投与後２０及び３０分における血液サンプルを採血した。アプロチニンを血液サンプルに添加（２５０〜５００ｋＩＵ／ｍＬ血液）した。次に標準的な方法を使用して血漿中のグルコース及びインスリンレベルを分析した。

アッセイでは、ＰＢＳ中の調製及び補正されたペプチドストックを使用した。通常、このストックは１００μＭストックとして希釈する。しかしながら、約１ｍｇ／ｍＬでアゴニストを含有する、さらに濃縮されたストックを用いた。それぞれの濃度を常時測定した。最大応答の変動性は、担体投与量の変動性に大部分起因する。プロトコルの詳細を以下に示す。

＜実施例７＞ラット血清における安定性試験：
ラット血清中におけるＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストペプチドの安定性を解析するため、ＣＨＯ−ＶＰＡＣ２細胞クローン＃６（９６ウェルプレート／５０，０００細胞／ウェル、１日インキュベート）、ＰＢＳ １×（Ｇｉｂｃｏ社製）、１００μＭの分析用ストック液（上記）、と殺した通常のウィスターラットから採取したラット血清、アプロチニン及びＤｉｓｃｏｖｅＲｘアッセイキットを準備した。
ラット血清は使用前まで４℃で保存し、２週以内に用いた。

０日目に、９０μＬのラット血清及び１０μＬのペプチドストック液を混合し、１０μＭペプチド／ラット血清の１００μＬアリコートを２本調製した。２５０ｋＩＵ アプロチニン／ｍＬを、これらのアリコートのうちの１つに添加した。アプロチニンを含有するアリコートを４℃で保存した。アプロチニンを含有しないアリコートを３７℃で保存した。アリコートは２４時間インキュベートした。

１日目に、０日目に調製したアリコートの２４又は７２時間のインキュベーション後、インキュベートバッファ（ＰＢＳ＋１．３ｍＭのＣａＣｌ_２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ_２、２ｍＭのグルコース及び０．２５ｍＭのＩＢＭＸを含有）を調製した。４℃及び３７℃アリコートにおいて、ペプチドを１１回の５倍連続希釈のプレートを作製し、ペプチドごとに試験した。４０００ｎＭを最大濃度として用いた。セルを有するプレートをインキュベートバッファで２回洗浄し、ウェル当たり５０μＬのインキュベーション培地でセルを１５分間インキュベートした。最初のスクリーニングにより示された最大濃度を用いて、試験されるペプチドごとの４℃及び３７℃アリコートにおける、ペプチドの１１回の５倍連続希釈により調製したプレートの細胞へ、ウェル当たり５０μＬで溶液を移した（２回試験を実施）。この処理によりペプチド濃度が２倍に希釈される。室温で３０分間細胞をインキュベートした。上澄みを除去した。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ抗体／抽出バッファを４０μＬ／ウェルで添加した。シェーカ（３００回転／分）で１時間、細胞をインキュベートした。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘキットを用いて通常の操作を行った。ｃＡＭＰスタンダードをカラム１２に添加した。ｃＡＭＰアッセイデータからＥＣ_５０値を測定した。残留している活性化ペプチドの量を、各条件ごとに式ＥＣ_{５０，４℃}／ＥＣ_{５０，３７℃}により推定した。
第５表：３７℃のラット血清中における、２４時間後の推定ペプチド安定性

^１値＞１００％は、ＰＥＧコンジュゲートからの完全なペプチドの遊離とする。

＜実施例８＞チオールベースによる、選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＰＥＧ化：
ＰＥＧ化反応は通常、チオエーテル結合が形成されうる条件下で実施する。具体的には、溶液のｐＨは約４〜９、チオール含有ペプチド濃度はＰＥＧマレイミド濃度の０．７〜１０モル過剰である。ＰＥＧ化反応は通常室温で行う。次にＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを逆相ＨＰＬＣ又は限外除外クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用して単離する。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はＭＡＬＤＩ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙを使用して、ＰＥＧ化ペプチドアゴニストを解析する。

通常、チオール官能基を選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト中又は上に導入する場合、片方又は両方の末端に、システイン若しくはホモシステイン若しくはチオール含有部分を添加することにより、又はシステイン若しくはホモシステイン若しくはチオール含有部分を配列中に挿入することによって実施する。チオール含有ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを４０ｋＤａ、３０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＧ−マレイミドと反応させ、チオエーテル結合により共有結合したＰＥＧ含有誘導体を調製する。

＜実施例９＞リジンの側鎖上へのアシル化を経たＰＥＧ化：
選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの部位特異的なＰＥＧ化を実施するため、ＰＥＧ化しようとするＬｙｓ残基以外の全てのＬｙｓ残基をＡｒｇ残基に置換する。使用できるＰＥＧ分子はｍＰＥＧ−ＳＢＡ−２０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ社製、Ｌｏｔ＃：ＰＴ−０４Ｅ−１１）である。好ましくは室温で２〜３時間ＰＥＧ化反応を実施する。調製用ＨＰＬＣによりペプチドを精製する。

＜実施例１０＞ピクテ−シュペングラー反応を経たＰＥＧ化：
ピクテ−シュペングラー反応を経たＰＥＧ化を実施するには、遊離アミン基を有するＴｒｐを用いて、残基選択的にＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト上にＰＥＧ分子を導入する必要がある。これを達成する１つのアプローチとしては、Ｔｒｐ残基をＬｙｓ残基の側鎖上へカップリングさせる。広いＳＡＲは、この修飾によっても、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効果及び選択性に関して親ペプチドの特性を変化させないことを示す。

官能性アルデヒド（例えばｍＰＥＧ２−ＢＵＴＹＲＡＬＤ−４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、米国）を有するＰＥＧを反応に使用した。部位特異的なＰＥＧ化により、ＰＥＧとペプチドとの間のテトラカルボリン環の形成がなされた。室温で１〜４８時間、氷酢酸中でＰＥＧ化を実施した。１〜１０モル過剰のＰＥＧアルデヒドを反応に用いた。酢酸の除去後、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを調製用ＲＰ−ＨＰＬＣにより単離した。

当業者であれば、本発明の範囲内における本発明の様々な修飾を容易に想起できるであろう。

Claims (23)

1. ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストであって、式：
   

   

   式１（配列番号：１）
   ［式中、
   Ｘａａ_１はＨｉｓ、ｄＨ又は存在せず；
   Ｘａａ_２はｄＡ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ｄＳ、Ｐｒｏ又はＡｉｂであり；
   Ｘａａ_３はＡｓｐ又はＧｌｕであり；
   Ｘａａ_４はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、ｄＡ、Ａｉｂ又はＮＭｅＡであり；
   Ｘａａ_５はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ｄＶ、Ａｉｂ又はＮＭｅＶであり；
   Ｘａａ_６はＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり；
   Ｘａａ_８はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ又はＴｙｒであり；
   Ｘａａ_９はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
   Ｘａａ_１０はＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ（ＯＭｅ）であり；
   Ｘａａ_１２はＡｒｇ、Ｌｙｓ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ又はＣｙｓであり；
   Ｘａａ_１３はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
   Ｘａａ_１４はＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ又はＣｉｔであり；
   Ｘａａ_１５はＬｙｓ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、Ｋ（Ａｃ）、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
   Ｘａａ_１６はＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
   Ｘａａ_１７はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｎｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
   Ｘａａ_１８はＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＡｂｕであり；
   Ｘａａ_１９はＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＡｂｕであり；
   Ｘａａ_２０はＬｙｓ、Ｇｌｎ、ｈＲ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｏｒｎ、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｋ（Ａｃ）、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
   Ｘａａ_２１はＬｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｉｂ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｏｒｎ、ｈＲ、Ｋ（Ａｃ）、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はｈＣであり；
   Ｘａａ_２２はＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ（ＯＭｅ）、Ａｌａ、Ａｉｂ又はＳｅｒであり；
   Ｘａａ_２３はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｉｂ又はＳｅｒであり；
   Ｘａａ_２４はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
   Ｘａａ_２５はＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はｈＣであり；
   Ｘａａ_２６はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
   Ｘａａ_２７はＬｙｓ、ｈＲ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｏｒｎ又はｄＫであり；
   Ｘａａ_２８はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ、ｈＲ、Ｐｒｏ、ｄＫ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
   Ｘａａ_２９はＬｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ｈＲ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ又は存在せず；
   Ｘａａ_３０はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、ｈＲ又は存在せず；
   Ｘａａ_３１はＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ又は存在せず；
   Ｘａａ_３２はＣｙｓ又は存在しないが；
   但し、Ｘａａ_２９、Ｘａａ_３０、Ｘａａ_３１又はＸａａ_３２が存在しない場合、存在する次のアミノ酸の下流はペプチドアゴニスト配列における次のアミノ酸である］
   で示される配列；および
   アミノ酸配列：
   ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（Ｅ−Ｃ_１６）
   ［式中、Ｃ末端アミノ酸はアミド化されてもよい］
   を含むＣ末端伸張を含む、アゴニスト。
2. 式：
   

   

   式２（配列番号：２）
   ［式中、
   Ｘａａ_３はＡｓｐ又はＧｌｕであり；
   Ｘａａ_８はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ又はＴｙｒであり；
   Ｘａａ_９はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
   Ｘａａ_１０はＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ（ＯＭｅ）であり；
   Ｘａａ_１２はＡｒｇ、Ｌｙｓ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ又はＣｙｓであり；
   Ｘａａ_１３はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
   Ｘａａ_１４はＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ又はＣｉｔであり；
   Ｘａａ_１５はＬｙｓ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、Ｋ（Ａｃ）、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
   Ｘａａ_１６はＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
   Ｘａａ_１７はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｎｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
   Ｘａａ_１８はＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＡｂｕであり；
   Ｘａａ_１９はＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＡｂｕであり；
   Ｘａａ_２０はＬｙｓ、Ｇｌｎ、ｈＲ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｏｒｎ、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｋ（Ａｃ）、Ｃｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）であり；
   Ｘａａ_２１はＬｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｉｂ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｏｒｎ、ｈＲ、Ｋ（Ａｃ）、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はｈＣであり；
   Ｘａａ_２２はＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ（ＯＭｅ）、Ａｌａ、Ａｉｂ又はＳｅｒであり；
   Ｘａａ_２３はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｉｂ又はＳｅｒであり；
   Ｘａａ_２４はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
   Ｘａａ_２５はＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はｈＣであり；
   Ｘａａ_２６はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
   Ｘａａ_２７はＬｙｓ、ｈＲ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｏｒｎ又はｄＫであり；
   Ｘａａ_２８はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ、ｈＲ、Ｐｒｏ、ｄＫ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり；
   Ｘａａ_２９はＬｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ｈＲ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ又は存在せず；
   Ｘａａ_３０はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、ｈＲ又は存在せず；
   Ｘａａ_３１はＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ又は存在せず；
   Ｘａａ_３２はＣｙｓ又は存在しないが；
   但し、Ｘａａ_２９、Ｘａａ_３０、Ｘａａ_３１又はＸａａ_３２が存在しない場合、存在する次のアミノ酸の下流はペプチドアゴニスト配列における次のアミノ酸である］
   で示される配列；および
   アミノ酸配列：
   ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（Ｅ−Ｃ_１６）
   ［式中、Ｃ末端アミノ酸はアミド化されてもよい］
   を含むＣ末端伸張を含む、請求項１記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
3. Ｘａａ_８がＧｌｕであり、Ｘａａ_９がＧｌｎであり、Ｘａａ_１０がＴｙｒ（ＯＭｅ）である、先の請求項のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
4. Ｘａａ_１５がＡｉｂである、先の請求項のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
5. Ｘａａ_２０がＡｉｂである、先の請求項のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
6. Ｘａａ_１２、Ｘａａ_２１、Ｘａａ_２７及びＸａａ_２８が全てＯｒｎである、先の請求項のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
7. Ｘａａ_１９がＡｂｕである、先の請求項のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
8. Ｘａａ_２３がＡｉｂである、先の請求項のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
9. Ｘａａ_２５がＡｉｂである、先の請求項のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
10. Ｘａａ_２９、Ｘａａ_３０、Ｘａａ_３１及びＸａａ_３２が全て存在しない、先の請求項のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
11. アゴニストがＰＥＧ化されている、先の請求項のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
12. アゴニストが環状である、先の請求項のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
13. さらにペプチドアゴニストのＮ末端にてＮ末端修飾を有する、先の請求項のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストであって、該Ｎ末端修飾が以下から選択される、アゴニスト：
    （ａ）Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン又はノルロイシンの付加；
    （ｂ）配列Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ（配列番号：６）を含むペプチドの付加（ここに、ＡｒｇはペプチドアゴニストのＮ末端に連結する）；
    （ｃ）独立してアリール、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよいＣ_１−Ｃ_１６アルキルの付加；
    （ｄ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１（ここに、Ｒ^１はＣ_１−Ｃ_１６アルキル（独立してアリール、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよい）；アリール（独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよい）；アリールＣ_１−Ｃ_４アルキル（独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよい）である）；
    −ＮＲ^２Ｒ^３（ここに、Ｒ^２及びＲ^３は独立して水素、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アリール又はアリールＣ_１−Ｃ_４アルキルである）；
    −ＯＲ^４（ここに、Ｒ^４はＣ_１−Ｃ_１６アルキル（独立してアリール、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよい）、アリール（独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよい）、アリールＣ_１−Ｃ_４アルキル（独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ_３から選択される１以上の置換基で任意に置換されてもよい）である）；又は
    ５−ピロリジン−２−オンの付加；
    （ｅ）−ＳＯ_２Ｒ^５（ここに、Ｒ^５はアリール、アリールＣ_１−Ｃ_４アルキル又はＣ_１−Ｃ_１６アルキルである）の付加；
    （ｆ）任意にＣ_１−Ｃ_６アルキル又は−ＳＲ^６（ここに、Ｒ^６は水素又はＣ_１−Ｃ_６アルキルである）で置換されてもよいスクシニミド基の形成；
    （ｇ）メチオニンスルホキシドの付加；
    （ｈ）ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）の付加；及び
    （ｉ）−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ_２の付加。
14. Ｎ末端修飾がアセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル、メチオニン、メチオニンスルホキシド、３−フェニルプロピオニル、フェニルアセチル、ベンゾイル、ノルロイシン、Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、３−メルカプトプロピオニル、ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）及び−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される基の付加である、請求項１３記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
15. Ｎ末端修飾がアセチル又はヘキサノイルの付加である、請求項１４記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
16. 以下のアミノ酸配列：
    

    

    を含む、請求項１記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
17. 請求項１から１６のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト、並びに１以上の薬理学的に許容できる希釈剤、担体及び賦形剤を含む、医薬組成物。
18. 薬剤としての使用のための、請求項１から１６のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
19. 非インスリン依存性糖尿病もしくはインスリン依存性糖尿病の治療、又は摂食抑制における使用のための、請求項１から１６のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
20. 非インスリン依存性糖尿病もしくはインスリン依存性糖尿病の治療、又は摂食抑制のための医薬の製造のための、請求項１から１６のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの使用。
21. 薬理学的有効量の請求項１から１６のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを投与することを含む、必要とする患者における非インスリン依存性糖尿病もしくはインスリン依存性糖尿病の治療、又は摂食抑制の方法。
22. 非インスリン依存性糖尿病もしくはインスリン依存性糖尿病の治療、又は摂食抑制のための、請求項１から１６のいずれか１項に記載のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを含む、医薬組成物。
23. 本明細書実施例に実質的に記載されている、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。