JP4249025B2 - ドライアイおよびドライアイを伴う疾病の治療剤 - Google Patents
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Description
本発明はドライアイおよびドライアイを伴う疾病の治療剤に関する。
背景技術
涙液は正常な視覚機能を維持するために重要な役割を果たしている。涙液は角結膜の表面を覆い、その湿潤性を保つとともに、角膜表面の微絨毛による陥凹を涙液が満たして表面を平滑にするので鮮明な像を得ることが可能となる。また、角結膜の上皮細胞は活発に代謝を行ない、その最表面から不要となった細胞や代謝産物が脱落排出されているが、涙液はそれらを洗い流す一方で、必要な酸素や栄養分を供給している。さらに、涙液は角結膜表面に混入した異物を洗い流し、外界から進入したウイルス、細菌、真菌などに対しては涙液の静菌作用によって感染防御の役割を担っている。また、眼瞼と角結膜との間の滑液として瞬目や眼球運動がスムーズに行われるにように働いている。このように涙液は角結膜表面にわずかな薄膜を形成する微量の液体であるが、さまざまの精巧な仕組みにより角膜の透明性や恒常性の維持に欠かすことができないものである。
涙液の分泌障害により角結膜表面に異常を生じた状態を一般にドライアイというが、ドライアイによる角結膜障害が起こった場合、人工涙液の補給、ヒアルロン酸などの保湿性の高い粘弾性物質の点眼、眼表面を湿潤に保って乾燥症状の軽減を図るドライアイ用眼鏡の使用などが処置されている。しかしながら、これらの対症療法によって症状を軽減することはできるが、根本的に治療するための原因療法とはならない。涙液には先に述べたようにその本来の機能によりドライアイによる角結膜障害を治癒する効果があると考えられるので、涙腺に直接作用し、涙液分泌を促進する化合物を創製することは、ドライアイおよびドライアイを伴なう疾病に対して有用な治療剤となることが期待される。
涙腺は副交感神経および交感神経により支配されており、前者が優勢である。副交感神経はアセチルコリンとVIP(血管作動性腸管ペプチド;Vasoactive Intestinal Peptide)を分泌し、一方、交感神経はノルエピネフリンとニューロペプチドYを分泌する。主としてアセチルコリン、ノルエピネフリンおよびVIPが涙腺を刺激する(Dartt DA et al.,Adv Exp Med Biol 438:113−121,1998年)。アセチルコリンはムスカリン性コリン作動性経路を活性化し、涙液分泌にも関与することが示されている(Nakamura M et al.,Curr Eye Res 16:614−619,1997年)。ノルエピネフリンはアドレナリンαおよびβ受容体に結合する交感神経作動性アミンであり、α1アドレナリン受容体を介して涙液タンパク質を分泌させる(Dartt DA,Curr Eye Res 8:619−636,1989年)。VIPは消化管や血管の平滑筋を弛緩させる多彩な生物学的活性を有するペプチドであり、このVIPの受容体が涙腺に存在し(Hodges RR et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci 38:610−619,1997年)、実際に涙腺からのタンパク質分泌を促進させることが報告されている(Dartt DA et al.,Am J Physiol 247:G502−509,1984年)。
以上、ムスカリン、ノルエピネフリンあるいはVIPなどの受容体が涙腺に分布すること、さらに涙液分泌との関係が示されてきたが、これらの生理活性成分は涙液分泌促進作用に基づくドライアイの予防治療剤として、いまだ実用化されていないのが現状である。VIPについては、局所投与することにより涙液分泌を促進させる方法が米国特許第4745100号に開示されているが、それにはVIP誘導体については何ら具体的に記載されていない。また、VIP誘導体として優れた気管支拡張作用および消化管運動抑制作用を示すペプチドが、それぞれ特開平8−333276号および特開2001−151799号に開示されているが、これらには涙液分泌やドライアイに関する記載は一切認められない。
発明の目的
本発明の目的は、涙液分泌を促進させることにより、ドライアイおよびドライアイを伴なう疾病の治療剤を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、VIPのもつ涙液分泌促進作用に注目して鋭意探究を重ねた結果、特開平8−333276号や特開2001−151799号に示されるVIP誘導体が優れた涙液分泌促進作用を有することを見出し、さらに研究を進めて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
(1)一般式(I)
H−His−Ser−Asp−Ala−Val−Phe−Thr−Asp−Asn−Tyr−Thr−Arg−Leu−Arg−X1−Gln−X2−Ala−Val−X3−X4−Tyr−Leu−X5−X6 (I)
(式中、X1、X3およびX4は、それぞれLysまたはArg;X2はMet、LeuまたはnLeu;X5は化学結合、Asn、Asn−Ser、Asn−Ser−Ile、Asn−Ser−Ile−LeuまたはAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7(X7は化学結合、Gly、Gly−Lys、Gly−Lys−Arg、Gly−ArgまたはGly−Arg−Argを示す。);X6は−OHまたは−NH2を示すが、X1、X3およびX4がLys,X5がAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7、X7が化学結合、X6が−NH2の時は、X2はLeuまたはnLeuを示す。)で表されるペプチドまたはその製薬学的に許容される塩を含有するドライアイまたはドライアイを伴う疾病の治療剤;
(2)一般式(I)において、X5がAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7であり、X7がGly、Gly−Lys、Gly−Lys−Arg、Gly−ArgまたはGly−Arg−Argである前記(1)記載の治療剤;
(3)一般式(I)において、X5が化学結合、Asn、Asn−Ser、Asn−Ser−Ile、Asn−Ser−Ile−LeuまたはAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7(X7は化学結合)である前記(1)記載の治療剤;
(4)一般式(I)において、X1、X3およびX4がArg、X2がLeu、X5がAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7、X7がGly−Arg−Arg、X6が−NH2である前記(1)記載の治療剤;
(5)一般式(I)において、X1、X3およびX4がLys、X2がLeu、X5が化学結合、X6が−NH2である前記(1)記載の治療剤;
(6)眼局所投与剤である前記(1)〜(5)のいずれかに記載の治療剤;
(7)眼局所投与剤が点眼剤である前記(6)記載の治療剤;
(8)一般式(I)
H−His−Ser−Asp−Ala−Val−Phe−Thr−Asp−Asn−Tyr−Thr−Arg−Leu−Arg−X1−Gln−X2−Ala−Val−X3−X4−Tyr−Leu−X5−X6 (I)
(式中、X1、X3およびX4は、それぞれLysまたはArg;X2はMet、LeuまたはnLeu;X5は化学結合、Asn、Asn−Ser、Asn−Ser−Ile、Asn−Ser−Ile−LeuまたはAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7(X7は化学結合、Gly、Gly−Lys、Gly−Lys−Arg、Gly−ArgまたはGly−Arg−Argを示す。);X6は−OHまたは−NH2を示すが、X1、X3およびX4がLys、X5がAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7、X7が化学結合、X6が−NH2の時は、X2はLeuまたはnLeuを示す。)で表されるペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および製剤上許容される担体を含有するドライアイまたはドライアイを伴う疾病の治療用医薬組成物;
(9)一般式(I)において、X5がAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7であり、X7がGly、Gly−Lys、Gly−Lys−Arg、Gly−ArgまたはGly−Arg−Argである前記(8)記載の医薬組成物;
(10)一般式(I)において、X5が化学結合、Asn、Asn−Ser、Asn−Ser−Ile、Asn−Ser−Ile−LeuまたはAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7(X7は化学結合)である前記(8)記載の医薬組成物;
(11)一般式(I)において、X1、X3およびX4がArg、X2がLeu、X5がAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7、X7がGly−Arg−Arg、X6が−NH2である前記(8)記載の医薬組成物;
(12)一般式(I)において、X1、X3およびX4がLys、X2がLeu、X5が化学結合、X6が−NH2である前記(8)記載の医薬組成物;
(13)眼局所投与用組成物である前記(8)〜(12)のいずれかに記載の医薬組成物;
(14)眼局所投与用組成物が点眼剤である前記(13)記載の医薬組成物;
(15)ドライアイまたはドライアイを伴う疾病の治療用医薬を製造するための一般式(I)
H−His−Ser−Asp−Ala−Val−Phe−Thr−Asp−Asn−Tyr−Thr−Arg−Leu−Arg−X1−Gln−X2−Ala−Val−X3−X4−Tyr−Leu−X5−X6 (I)
(式中、X1、X3およびX4は、それぞれLysまたはArg;X2はMet、LeuまたはnLeu;X5は化学結合、Asn、Asn−Ser、Asn−Ser−Ile、Asn−Ser−Ile−LeuまたはAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7(X7は化学結合、Gly、Gly−Lys、Gly−Lys−Arg、Gly−ArgまたはGly−Arg−Argを示す。);X6は−OHまたは−NH2を示すが、X1、X3およびX4がLys、X5がAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7、X7が化学結合、X6が−NH2の時は、X2はLeuまたはnLeuを示す。)で表されるペプチドまたはその製薬学的に許容される塩の使用;
(16)一般式(I)において、X5がAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7であり、X7がGly、Gly−Lys、Gly−Lys−Arg、Gly−ArgまたはGly−Arg−Argである前記(15)記載の使用;
(17)一般式(I)において、X5が化学結合、Asn、Asn−Ser、Asn−Ser−Ile、Asn−Ser−Ile−LeuまたはAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7(X7は化学結合)である前記(15)記載の使用;
(18)一般式(I)において、X1、X3およびX4がArg、X2がLeu、X5がAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7、X7がGly−Arg−Arg、X6が−NH2である前記(15)記載の使用;
(19)一般式(I)において、X1、X3およびX4がLys、X2がLeu、X5が化学結合、X6が−NH2である前記(15)記載の使用;
(20)医薬が眼局所投与用医薬である前記(15)〜(19)のいずれかに記載の使用;
(21)眼局所投与用医薬が点眼剤である前記(20)記載の使用;
(22)一般式(I)
H−His−Ser−Asp−Ala−Val−Phe−Thr−Asp−Asn−Tyr−Thr−Arg−Leu−Arg−X1−Gln−X2−Ala−Val−X3−X4−Tyr−Leu−X5−X6 (I)
(式中、X1、X3およびX4は、それぞれLysまたはArg;X2はMet、LeuまたはnLeu;X5は化学結合、Asn、Asn−Ser、Asn−Ser−Ile、Asn−Ser−Ile−LeuまたはAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7(X7は化学結合、Gly、Gly−Lys、Gly−Lys−Arg、Gly−ArgまたはGly−Arg−Argを示す。);X6は−OHまたは−NH2を示すが、X1、X3およびX4がLys,X5がAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7、X7が化学結合、X6が−NH2の時は、X2はLeuまたはnLeuを示す。)で表されるペプチドまたはその製薬学的に許容される塩の有効量をドライアイまたはドライアイを伴う疾病の治療を必要とする温血動物に投与することを特徴とするドライアイまたはドライアイを伴う疾病の治療方法;
(23)一般式(I)において、X5がAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7であり、X7がGly、Gly−Lys、Gly−Lys−Arg、Gly−ArgまたはGly−Arg−Argである前記(22)記載の治療方法;
(24)一般式(I)において、X5が化学結合、Asn、Asn−Ser、Asn−Ser−Ile、Asn−Ser−Ile−LeuまたはAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7(X7は化学結合)である前記(22)記載の治療方法;
(25)一般式(I)において、X1、X3およびX4がArg、X2がLeu、X5がAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7、X7がGly−Arg−Arg、X6が−NH2である前記(22)記載の治療方法;および
(26)一般式(I)において、X1、X3およびX4がLys、X2がLeu、X5が化学結合、X6が−NH2である前記(22)記載の治療方法を提供するものである。
発明の詳細な説明
本発明のドライアイおよびドライアイを伴なう疾病の治療に用いられるVIP誘導体は、一般式(I)で示されるペプチドであり、X1、X3およびX4はLysまたはArgである。X2はMet、LeuまたはnLeuであるが、Leuがより好ましい。X5は化学結合、Asn、Asn−Ser、Asn−Ser−Ile、Asn−Ser−Ile−LeuまたはAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7をとりうるが、好ましくは化学結合またはAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7である。X5がAsn−Ser−Ile−Leu−Asn−X7の時、X7は化学結合、Gly、Gly−Lys、Gly−Lys−Arg、Gly−ArgまたはGly−Arg−Argであるが、Gly−Arg−Argが最も好ましい。X6は−OHまたは−NH2であるが、−NH2がより好ましい。
本発明の一般式(I)のVIP誘導体の代表例としては、例えば、表1の1〜25のペプチド(各々ペプチド1〜25と称する)などが挙げられる。これらは後記配列表の配列番号1〜25に対応するペプチドである。とりわけ、ペプチド5およびペプチド15が有利に使用される。
ペプチド1〜25(配列表に示した配列番号1〜25に対応する)
H−His−Ser−Asp−Ala−Val−Phe−Thr−Asp−Asn−Tyr−Thr−Arg−Leu−Arg−X1−Gln−X2−Ala−Val−X3−X4−Tyr−Leu−X5(−X7)−X6 (I)
一般式(I)の化合物の製薬学的に許容される塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩;トリメチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N−ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基との塩;塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩;ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩;およびタンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の重合酸との塩などが挙げられる。
一般式(I)のVIP誘導体は、例えば、特開平8−333276号、特開平9−100237号、特開平11−100399号、特開2001−151799号、特開2001−226284号に示されるように、公知のペプチド合成の定法にしたがって合成できる。
一般式(I)のVIP誘導体は以下の特性を有する。
まず第一に、生体内における分子の安定性が高い。ペプチドおよび蛋白は生体内においてペプチダーゼによって速やかに代謝されるが、本発明で使用されるVIP誘導体の中で塩基性を高めたペプチドは代謝に対して抵抗性を示す。すなわち、VIPを構成するアミノ酸のうち、15番目、20番目および21番目のリジンの1つ以上をアルギニンに置換し、さらに、C末端側にグリシン残基に続いてリジンまたはアルギニン等の塩基性アミノ酸を付加することにより塩基性が高まるので、生体内に極めて多く存在する酸性多糖類と強い親和性を示す。この性質により、生体内においてトリプシンなどのエンドペプチダーゼによる分解に対する抵抗性が高まっている。例えば、ペプチド5を用いたトリプシン消化試験において、コンドロイチン硫酸存在下でVIPよりも高い残存率を示している(試験例1)。この傾向は気管支肺胞洗浄液を用いたペプチド消化試験においてより明瞭に示され、90分後のペプチド5の残存率は、VIPのそれの約1.8倍である(試験例2)。以上のような生体内における優れた安定性により、これら高塩基性のVIP誘導体は薬理作用が長く持続する。また、眼局所に適用する場合、点眼後に酵素分解を受けにくい点眼製剤として使用できる。例えば、ペプチド5の点眼はVIPよりも涙液分泌促進作用が長く持続することが試験例5に示される。
また、VIPを構成するアミノ酸残基の中で17番目のメチオニンは酸化されやすいが、この箇所がロイシンまたはノルロイシンに置換されたVIP誘導体は酸化に対して抵抗性を示す。したがって、本発明で使用されるVIP誘導体の中で17位ロイシン置換ペプチドは酸化されにくく、安定な点眼液として使用できる。
本発明においては、一般式(I)のVIP誘導体またはその製薬学的に許容される塩(以下、「VIP誘導体」と略記することがある)はドライアイおよびドライアイを伴なう疾病の治療剤(以下、「ドライアイ治療剤」と略記することがある)として全身的または局所的に投与される。全身的には非経口的(静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射など注射剤として、また、坐剤として投与される)および経口的に投与される。局所的には皮膚、眼局所などに投与される。
製剤形態として、非経口的に投与される製剤としては、注射剤、坐剤などが挙げられる。注射剤として処方される場合、例えば、溶剤(注射用蒸留水など)、安定化剤(エデト酸ナトリウムなど)、等張化剤(塩化ナトリウム、グリセリンおよびマンニトールなどの糖アルコールなど)、pH調整剤(塩酸、クエン酸、水酸化ナトリウムなど)、懸濁化剤(メチルセルロースなど)を用いることができ、坐剤として処方される場合、例えば、坐剤基剤(カカオ脂、マクロゴールなど)などを適宜に選択して使用することができる。
経口的に投与される製剤としては、例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤およびエアゾール剤などが挙げられる。製剤が粉末、顆粒、錠剤などとして処方される場合、固形製剤を処方するのに好適な任意の製薬担体、例えば、賦形剤(澱粉、ブドウ糖、果糖、白糖など)、滑沢剤(ステアリン酸マグネシウムなど)、崩壊剤(澱粉、結晶セルロースなど)、結合剤(澱粉、アラビアゴムなど)などを用いることができ、コーティング剤(ゼラチン、白糖など)でコーティングされていてもよい。また、製剤がシロップや液剤として処方される場合、例えば、安定剤(エデト酸ナトリウムなど)、懸濁化剤(アラビアゴム、カルメロースなど)、矯味剤(単シロップ、ブドウ糖など)、芳香剤などを適宜に選択して使用することができる。
局所用製剤としては、例えば、軟膏、クリーム剤、ローション剤、点鼻剤および眼局所用剤などが挙げられ、眼局所用剤がより好ましい。眼局所用剤としては点眼剤、眼軟膏剤あるいは徐放製剤などが挙げられ、点眼剤がより好ましい。これら局所用製剤には、本発明のVIP誘導体に加えて、例えば、軟膏基剤(ワセリン、ラノリンなど)、溶剤(生理食塩水、精製水など)、安定剤(エデト酸ナトリウム、クエン酸など)、湿潤剤(グリセリンなど)、乳化剤(ポリビニルピロリドンなど)、懸濁化剤(ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、メチルセルロースなど)、界面活性剤(ポリソルベート80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など)、保存剤(塩化ベンザルコニウム、パラベン類、クロロブタノールなど)、緩衝剤(ホウ酸、ホウ砂、酢酸ナトリウム、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤など)、等張化剤(塩化ナトリウム、グリセリン、マンニトールなど)、pH調整剤(塩酸、水酸化ナトリウムなど)などの公知の化合物を適宜に選択して使用することができる。
また、眼局所用の徐放製剤としては、コラーゲン等のゲル成形物、ポリ乳酸等の生体分解性高分子等により成形された眼内埋込み製剤や強膜プラグ、あるいは生体非分解性の眼内埋込み製剤などを使用できる。
一般にペプチド類がガラスあるいは樹脂容器に吸着するのを防止する目的で吸着防止成分を利用することができる。ここで利用される吸着防止成分は、保存容器の壁面に疎水結合して吸着を防止する化合物であり、より詳しくは分子内に疎水基を有し、かつ界面活性作用を有する化合物や、陰イオン荷電蛋白質である。前者の例としては、ポリオキシエチレンアルコールエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等が挙げられ、後者の陰イオン荷電蛋白質の例としてはゼラチン、アルブミン、ポリゲニン等が挙げられる。ゼラチンとしては日局精製ゼラチン等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。吸着防止成分としてのゼラチン類は,1種または2種以上を併用して用いてもよい。また、アルブミンとしては、ヒトに対する抗原性のないものが挙げられ、その濃度は、通常、0.01〜50w/v%程度、好ましくは0.1〜2.0w/v%程度配合するのがよい。吸着防止成分とペプチド類とを溶解する溶媒としては、注射剤用の溶媒として生理学的に許容されるものであれば、いかなるものをも使用することができるが、好ましいものとしては例えば日局注射用水、生理食塩水などが挙げられる。その他に、容器内壁にシリコンコート等の加工を施すことによっても吸着防止の効果を上げることができる。
本発明のドライアイ治療剤を温血動物(ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、サル、ヒトなどの哺乳動物やハト、ニワトリ、七面鳥などの鳥類)に投与することにより、涙液の分泌が促進される。本発明のドライアイ治療剤を成人患者に投与する場合、一回あたりの投与量はVIP誘導体として、注射剤では通常0.00001〜100mg、好ましくは0.0001〜0.1mgであり、経口投与では通常0.1〜500mg、好ましくは1〜20mgである。また、成人患者の眼に局所的に適用する場合には、通常、VIP誘導体を0.001〜3.0w/v%、好ましくは0.01〜0.5w/v%に含有する点眼液を、1回20〜50μl、1日1〜8回点眼するのがよい。
本発明のドライアイ治療剤には、目的と必要に応じて、VIP誘導体に他のドライアイ治療用成分を適宜組合わせて含有させることもできる。また、本発明の目的に反しない限り、他の薬効成分と組合せて使用できる。
本発明のドライアイ治療剤は、例えば、涙液減少症、眼乾燥症、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎、スティーブンス−ジョンソン症候群、VDT(Visual Display Terminal)作業に関連したドライアイ等のドライアイの治療に用いられる。さらに、角結膜上皮障害、角膜上皮糜爛、角膜潰瘍、眼瞼縁炎、眼類天疱瘡、春季カタル、アレルギー性結膜炎などドライアイを伴なう疾病の治療剤としても有用である。
実施例
以下に、合成例、製剤例および試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の合成例で用いた略称の意味は以下の通りである。
MBHA:pメチルベンズヒドリルアミン
MeOH:メタノール
Boc:t−ブトキシカルボニル基
TFA:トリフルオロ酢酸
TEA:トリエチルアミン
Cl2−Bzl:ジクロロベンジル基
Cl−Z:クロロベンジルオキシカルボニル基
Xan:キサンチル基
Tos:p−トルエンスルホニル基
Bzl:ベンジル基
OcHex:O−シクロヘキシル基
Bom:ベンジルオキシメチル基
DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド
(合成例1)ペプチド5の製造
配列番号5に示すアミノ酸配列を有するペプチド5をペプチド固相合成の常法に従い製造した。
MBHA樹脂 HCl塩(polystyrene−1% divinylbenzene共重合体、100〜200メッシュ)をマニュアル合成用反応槽(ガラス製、φ6.0x29.5cm)に加え、樹脂容量の2〜3倍量のMeOHで攪拌洗浄し、次いでCH2Cl2(樹脂容量の2−3倍量)で攪拌洗浄して樹脂を膨潤させた。10%トリエチルアミン/CH2Cl2にて中和反応を行い、C末端アミノ酸に相当するBoc−Arg(Tos)−OHを樹脂の約2倍当量用い、DCCおよびN−hydroxybenzotriazoleを加えて縮合反応を行った。約2時間の反応(攪拌下)後、MeOHおよびCH2Cl2にて洗浄し、カイザー試験にてα−アミノ基の消失を確認後、50%TFA/CH2Cl2にて30分間処理して脱保護を行った。次いで10% TEA/CH2Cl2にて中和し、MeOHおよびCH2Cl2にて再洗浄後、再びカイザー試験を実施して脱保護反応の確認を行った。確認後はC末より2番目のBoc−Arg(Tos)−OHのカップリングを行うため、同様の工程を繰り返した。その後、Boc−Gly−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Ile−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド5に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Leu−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−Ile−Leu−Asn−Gly−Arg(Tos)−Arg(Tos)−MBHAを得た。
ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素100mLを加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィー(10%アセトニトリルと50%アセトニトリルの間でのステップワイズグラジエント)により精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド5を得た。
(合成例2)ペプチド15の製造
配列番号15に示すアミノ酸配列を有するペプチド15を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した.すなわちMBHA樹脂に対してBoc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド15に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Lys(Cl−Z)−Gln−Leu−Ala−Val−Lys(Cl−Z)−Lys(Cl−Z)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−MBHAを得た。
ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素100mLを加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィー(10%アセトニトリルと50%アセトニトリルの間でのステップワイズグラジエント)により精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド15を得た。
(合成例3)ペプチド16の製造
配列番号16に示すアミノ酸配列を有するペプチド16を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Leu−OH、Boc−Ile−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH,Boc−Ala−OH、Boc−Met−OH,Boc−Gln(Xan)−OH,Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド16に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Met−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−Ile−Leu−MBHAを得た。
ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素100mLを加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィー(10%アセトニトリルと50%アセトニトリルの間でのステップワイズグラジエント)により精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド16を得た。
(合成例4)ペプチド17の製造
配列番号17に示すアミノ酸配列を有するペプチド17を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Ile−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH,Boc−Ala−OH、Boc−Met−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH,、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド17に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Met−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−Ile−MBHAを得た。
ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素100mLを加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィー(10%アセトニトリルと50%アセトニトリルの間でのステップワイズグラジエント)により精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド17を得た。
(合成例5)ペプチド18の製造
配列番号18に示すアミノ酸配列を有するペプチド18を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Met−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド18に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Met−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−MBHAを得た。
ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素100mLを加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィー(10%アセトニトリルと50%アセトニトリルの間でのステップワイズグラジエント)により精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド18を得た。
(合成例6)ペプチド19の製造
配列番号19に示すアミノ酸配列を有するペプチド19を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Met−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド19に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Met−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−MBHAを得た。
ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素100mLを加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィー(10%アセトニトリルと50%アセトニトリルの間でのステップワイズグラジエント)により精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド19を得た。
(合成例7)ペプチド20の製造
配列番号20に示すアミノ酸配列を有するペプチド20を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Met−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド20に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Met−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−MBHAを得た。
ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素100mLを加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィー(10%アセトニトリルと50%アセトニトリルの間でのステップワイズグラジエント)により精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド20を得た。
(合成例8)ペプチド21の製造
配列番号21に示すアミノ酸配列を有するペプチド21を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Leu−OH、Boc−Ile−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い。ペプチド21に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Leu−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−Ile−Leu−MBHAを得た。
ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素100mLを加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィー(10%アセトニトリルと50%アセトニトリルの間でのステップワイズグラジエント)により精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド21を得た。
(合成例9)ペプチド22の製造
配列番号22に示すアミノ酸配列を有するペプチド22を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Ile−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド22に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Leu−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−Ile−MBHAを得た。
ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素100mLを加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィー(10%アセトニトリルと50%アセトニトリルの間でのステップワイズグラジエント)により精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド22を得た。
(合成例10)ペプチド23の製造
配列番号23に示すアミノ酸配列を有するペプチド23前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH,Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド23に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Leu−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−MBHAを得た。
ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素100mLを加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィー(10%アセトニトリルと50%アセトニトリルの間でのステップワイズグラジエント)により精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド23を得た。
(合成例11)ペプチド24の製造
配列番号24に示すアミノ酸配列を有するペプチド24を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド24に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Leu−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−MBHAを得た。
ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素100mLを加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィー(10%アセトニトリルと50%アセトニトリルの間でのステップワイズグラジエント)により精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド24を得た。
(合成例12)ペプチド25の製造
配列番号25に示すアミノ酸配列を有するペプチド25を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド25に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Leu−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−MBHAを得た。
ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素100mLを加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィー(10%アセトニトリルと50%アセトニトリルの間でのステップワイズグラジエント)により精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド25を得た。
(合成例13)ペプチド1の製造
配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチド1を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Gly−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Ile−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド1に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Leu−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−Ile−Leu−Asn−Gly−MBHAを得た。ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド1を得た。
(合成例14)ペプチド2の製造
配列番号2に示すアミノ酸配列を有するペプチド2を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Gly−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Ile−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH,Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド2に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Leu−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−Ile−Leu−Asn−Gly−Lys(Cl−Z)−MBHAを得た。ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド2を得た。
(合成例15)ペプチド3の製造
配列番号3に示すアミノ酸配列を有するペプチド3を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Arg(Tos)−OH、Boc−Gly−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Ile−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH,Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド3に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Leu−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−Ile−Leu−Asn−Gly−Arg(Tos)−MBHAを得た。ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド3を得た。
(合成例16)ペプチド4の製造
配列番号4に示すアミノ酸配列を有するペプチド4を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Arg(Tos)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Gly−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH,Boc−Ile−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド4に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Leu−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−Ile−Leu−Asn−Gly−Lys(Cl−Z)−Arg(Tos)−MBHAを得た。ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド4を得た。
(合成例17)ペプチド6の製造
配列番号6に示すアミノ酸配列を有するペプチド6を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、PAM樹脂に対してBoc−Arg(Tos)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Gly−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Ile−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド6に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Leu−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−Ile−Leu−Asn−Gly−Lys(Cl−Z)−Arg(Tos)−PAMを得た。ここで得られた保護ペプチド−PAM樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド6を得た。
(合成例18)ペプチド7の製造
配列番号7に示すアミノ酸配列を有するペプチド7を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、PAM樹脂に対してBoc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Ile−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Met−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド7に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Met−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−Ile−Leu−Asn−PAMを得た。ここで得られた保護ペプチド−PAM樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド7を得た。
(合成例19)ペプチド8の製造
配列番号8に示すアミノ酸配列を有するペプチド8を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Leu−OH、Boc−Ile−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Met−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド8に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Met−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−Ile−Leu−MBHAを得た。ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド8を得た。
(合成例20)ペプチド9の製造
配列番号9に示すアミノ酸配列を有するペプチド9を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Ile−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Met−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド9に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Met−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−Ile−MBHAを得た。ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド9を得た。
(合成例21)ペプチド10の製造
配列番号10に示すアミノ酸配列を有するペプチド10を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Met−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド10に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Met−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−MBHAを得た。ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド10を得た。
(合成例22)ペプチド11の製造
配列番号11に示すアミノ酸配列を有するペプチド11を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Met−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド11に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Met−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−MBHAを得た。ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド11を得た。
(合成例23)ペプチド12の製造
配列番号12に示すアミノ酸配列を有するペプチド12を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Met−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド12に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Met−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−MBHAを得た。ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド12を得た。
(合成例24)ペプチド13の製造
配列番号13に示すアミノ酸配列を有するペプチド13を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Ser(Bzl)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド13に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Leu−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−Ser(Bzl)−MBHAを得た。ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド13を得た。
(合成例25)ペプチド14の製造
配列番号14に示すアミノ酸配列を有するペプチド14を前記ペプチド5の製造方法と同様に合成した。すなわち、MBHA樹脂に対してBoc−Asn(Xan)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Gln(Xan)−OH、Boc−Lys(Cl−Z)−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Leu−OH、Boc−Arg(Tos)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Tyr(Cl2−Z)−OH、Boc−Asn(Xan)−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Thr(Bzl)−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Val−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asp(OcHex)−OH、Boc−Ser(Bzl)−OH、そしてBoc−His(Bom)−OHの順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド14に相当する保護ペプチド樹脂;His(Bom)−Ser(Bzl)−Asp(OcHex)−Ala−Val−Phe−Thr(Bzl)−Asp(OcHex)−Asn−Tyr(Cl2−Bzl)−Thr(Bzl)−Arg(Tos)−Leu−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Gln−Leu−Ala−Val−Arg(Tos)−Arg(Tos)−Tyr(Cl2−Bzl)−Leu−Asn−MBHAを得た。ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂にアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行い、ペプチド14を得た。
(製剤例1)用時溶解型点眼剤1
ペプチド5 2g
塩化ナトリウム 0.9g
ホウ酸 0.1g
ホウ砂 適量(pH7.8)
塩化ベンザルコニウム 0.005g
エデト酸ナトリウム 0.02g
精製水 全量100mL
ペプチド5を5g、精製水100mLに溶解し、メンブランフィルター(0.45μm)でろ過する。この溶液を5mLの点眼容器に2mLづつ分注し、凍結乾燥する。精製水約80mLに塩化ナトリウム0.9g、ホウ酸0.1g、塩化ベンザルコニウム0.005gおよびエデト酸ナトリウム0.02gを溶解し、ホウ砂でpHを7.8に調整した後、全量を精製水で100mLとする。この溶液をメンブランフィルター(0.45μm)でろ過し、5mLアンプルに分注し密封し溶解溶液とする。用時、溶解溶液を点眼容器に注入し点眼剤とする。
(製剤例2)用時溶解型点眼剤2
ペプチド15 0.1g
マンニトール 5g
ホウ酸 0.1g
ホウ砂 適量(pH7.8)
塩化ベンザルコニウム 0.005g
エデト酸ナトリウム 0.02g
精製水 全量100mL
ペプチド15を0.25g、マンニトール12.5gを精製水100mLに溶解し、メンブランフィルター(0.45μm)でろ過する。この溶液を5mLの点眼容器に2mLづつ分注し、凍結乾燥する。精製水約80mLにホウ酸0.1g、塩化ベンザルコニウム0.005gおよびエデト酸ナトリウム0.02gを溶解し、ホウ砂でpHを7.8に調整した後、全量を精製水で100mLとする。この溶液をメンブランフィルター(0.45μm)でろ過し、5mLアンプルに分注し密封し溶解溶液とする。用時、溶解溶液を点眼容器に注入し点眼剤とする。
(製剤例3)一剤性点眼剤1
ペプチド5 0.1g
ホウ酸 0.7g
ホウ砂 適量(pH7.7)
塩化ナトリウム 0.5g
エデト酸ナトリウム 0.05g
塩化ベンザルコニウム 0.005g
精製水 全量100mL
精製水約80mLに塩化ナトリウム、ホウ酸、エデト酸ナトリウムおよび塩化ベンザルコニウムを加えて溶かし、ホウ砂を加えpHを7.7に調整する。この液にペプチド5を添加し溶解させた後、精製水を加え全量100mLとし、点眼剤を調製する。
(製剤例4)一剤性点眼剤2
ペプチド15 0.5g
塩化ナトリウム 0.9g
リン酸2水素ナトリウム・2水和物 0.1g
塩化ベンザルコニウム 0.005g
0.1N水酸化ナトリウム 適量(pH7.2)
精製水 全量100mL
精製水約80mLに塩化ナトリウム、リン酸2水素ナトリウム・2水和物および塩化ベンザルコニウムを加えて溶かし、0.1N水酸化ナトリウムを加えpHを7.2に調整する。この液にペプチド15を添加し溶解させた後、精製水を加え全量100mLとし、点眼剤を調製する。
(製剤例5)注射剤1
ペプチド5(1.0mg)、塩化ナトリウム200mgおよびゼラチン300mgを注射用水に溶解する。これにpH調整剤を適量加えてpH7.4になるようにし、注射用水で全量20mLとし、無菌濾過後、ガラス製アンプルに2mLずつ分注充填する。
(製剤例6)注射剤2
ペプチド15(1.0mg)、塩化ナトリウム200mgおよびアルブミン250mgを注射用水に溶解する。これにpH調整剤を適量加えてpH7.4になるようにし、注射用水で全量20mLとし、無菌濾過後,ガラス製アンプルに2mLずつ分注充填する。
(試験例1)トリプシンによる消化試験
コンドロイチン硫酸共存下、トリプシンによる消化におけるペプチド5の高塩基性化による効果を検討した。
1)試験方法
VIPおよびペプチド5の溶液(1mg/mL)100μLに0.2M Tris−HCl緩衝液(pH7.5)に溶解したコンドロイチン硫酸溶液(pH7.5,100μg/mL)400μLを添加した。この溶液100μLに対してトリプシン0.5mUを加え、37℃で180分インキュベートし、その後、HPLCにて未分解のペプチド量を測定した。
2)結果
コンドロイチン硫酸共存下のトリプシンによる消化において、VIPの残存率は75%であったのに対して、ペプチド5のそれは89%と高かった。この結果は、本ペプチドと酸性多糖類が相互作用することにより酵素分解に対して抵抗性を示すことを示唆する。
(試験例2)気管支肺胞洗浄液による消化試験
気管支肺胞洗浄液による消化に対するペプチド5の高塩基性化による効果を検討した。
1)試験方法
VIPおよびペプチド5を0.2%Tris−HCl緩衝液(pH7.4)に溶解し(1.1mg/mL)、これに気管支肺胞洗浄液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)を添加した。BALFは8〜9週齢の正常SD雄性ラット(約350g)を麻酔下に5mLの生理食塩水を気管内に注入・回収し、この操作を計3回繰り返して得た。BALF0.5mLにサンプル溶液0.05mLを加えて37℃で90分間反応させた後、未分解のペプチド量をHPLCにて測定した。
2)結果
BALFによる消化試験において、VIPの残存率は45.5%であったのに対して、ペプチド5の残存率は80.0%であり、VIPに比べて約1.8倍の残存率を示した。この結果は、本ペプチドが生体内において優れた安定性を示すことを示唆する。
(試験例3)摘出涙腺からのタンパク分泌促進作用
ウサギ摘出涙腺にVIP、ペプチド5または15を処置し、分泌されるタンパク質量の増加に及ぼすこれらペプチドの薬理効果を検討した。
1)被験溶液の調製
a)塩化ナトリウム(137.92g)、塩化カリウム(7.01g)、塩化カルシウム・2水和物(3.53g)および塩化マグネシウム・6水和物(1.2g)に精製水を加え、全量を1000mLとした(溶液1)。また、リン酸2水素カリウム(8.17g)に精製水を加え、全量を500mLとした(溶液2)。精製水900mLに溶液1(50mL)および溶液2(10mL)を加え、グルコース2.07gおよび炭酸水素ナトリウム2.1gを溶解し、全量を1000mL(pH約7.4)とし、これを培養液とした。培養液には95%酸素および5%二酸化炭素の混合ガスを通気した。
b)培養液にVIP、ペプチド5またはペプチド15を10−4Mの濃度になるように溶解し、これを被験溶液とした。
2)涙腺切片標品の作製
雄性日本白色ウサギに全身麻酔を施し、腹大動脈より灌流液(116mM塩化ナトリウム、5.4mM塩化カリウムを含む)を灌流し、主涙腺組織を摘出して脂肪結合組織を除去した後、2等分した(1片は約40mg)。この涙腺組織切片を各ウェルに培養液0.5mLを満たした24ウェルプレートに移し、37℃でインキュベーションした。20分毎に3回培養液を交換して合計60分間置き、定常状態の涙腺切片標品とした。
3)実験方法
a)定常状態にした切片標品を用い、新たな培養液0.5mLと交換し、37℃で20分間インキュベーションした。この培養液を採取し、タンパク質染色試薬(DC Protein assay reagent,Bio Rad)を加えタンパク質量を測定し、湿重量1mg当たりのタンパク質分泌量に換算した。この時のタンパク質量をタンパク質分泌率100%とし、処置前の分泌率とした。
b)a)におけるインキュベーション後の切片標品の培養液を被験溶液0.5mLと交換し、20分間隔で合計5回、交換・採取した。採取した液にタンパク質染色試薬を加えてタンパク質量を測定した。対照群の切片標品は培養液を同様に交換してタンパク質量を測定した。
4)結果
実験結果を図1に示した。縦軸は摘出涙腺からのタンパク質分泌率(%)を、横軸は各被験溶液の処置時間(分)を示す。VIP、ペプチド5およびペプチド15を処置すると、タンパク質分泌率は処置時間0〜40分の間、対照群に比べて有意に増加した(n=5、平均値±標準誤差、*;p<0.05、**;p<0.01、Dunnettの検定)。すなわち、ペプチド5および15はVIPとともに優れたタンパク質分泌促進作用を有していることが明らかとなった。
(試験例4)点眼による涙液分泌促進作用(1)
ウサギにペプチド5または15を点眼し、分泌された涙液量を測定することにより、涙液分泌量の増加に及ぼすこれらペプチドの薬理効果を検討した。
1)溶液の調製
塩化ナトリウム(0.9g)、リン酸2水素ナトリウム・2水和物(0.1g)に精製水を加え、全量を100mLとした。さらに適量の水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH7.0に調整し、これを基剤とした。基剤にペプチド5を0.1w/v%に、ペプチド15を2.0w/v%になるように溶解し、被験溶液を調製した。
2)実験方法
涙液量の測定はシルマーテストにて実施した。日本白色ウサギに被験溶液50μLを1回点眼投与し、点眼前および点眼10分後の涙液分泌量を測定した。涙液量測定5分前に0.4w/v%塩酸オキシブプロカイン(アネロカールTM点眼液、千寿製薬(株))10μLを点眼して局所麻酔を施した。濾紙を用いて下眼瞼結膜嚢内の涙液を拭き取った後、シルメル試験紙(昭和薬品化工(株))を使用し、1分間の涙液分泌量を測定した。
3)結果
実験結果を表2に示した。ウサギに1回点眼することにより涙液分泌量は、ペプチド5溶液点眼では有意に増加し(*;p<0.01、対応のあるt検定)、また、ペプチド15溶液点眼では統計的に有意差は認められなかったものの、増加傾向を示した(p=0.13、対応のあるt検定)。
すなわち、ペプチド5および15は優れた涙液分泌促進作用を有していることが明らかとなった。
(試験例5)点眼による涙液分泌促進作用(2)
試験例4と同様にペプチド5を点眼し分泌された涙液分泌量を測定した。本試験では涙液分泌量を経時的に測定し、VIPと効果を比較した。
1)溶液の調製
溶液の調製は試験例4と同様に行ない、VIPおよびペプチド5を0.1w/v%になるように基剤に溶解し、被験溶液を調製した。
2)実験方法
日本白色ウサギに基剤または被験溶液50μLを1回点眼投与し、点眼前、点眼10分、20分、30分、60分、120分後の涙液分泌量を測定した。涙液分泌量の測定は試験例4と同様に行なった。
3)結果
点眼後の涙液分泌量の変化を図2に示した。縦軸は涙液分泌量(シルマー値:mm/分)の点眼前との差(増加分)を示す。横軸は時間経過(分)を示す。VIPおよびペプチド5の点眼により点眼10分後に基剤点眼の対照群に比較して有意に増加した(n=8、平均値±標準誤差、*;p<0.05、**;p<0.01、パラメトリックDunnett型多重比較検定)。点眼後120分までの涙液分泌量増加分の積算値(AUC値=Δシルマー値×分)を表3に示した。AUC値はペプチド5点眼群>VIP点眼群>対照群の順であり、ペプチド5点眼群は対照群に対して有意に高値を示した(*;p<0.05)。一方、VIP点眼群は対照群に対して有意差は認められなかった(p=0.38)。すなわち、ペプチド5はVIPに比べて優れた涙液分泌促進作用を有していることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
以上の結果より、本発明のVIP誘導体は優れた涙液分泌促進作用を有し、ドライアイおよびドライアイを原因とする疾患の治療剤として有用であることを示す。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1 ウサギ摘出涙腺にVIP、ペプチド5またはペプチド15を作用させた時の涙腺よりのタンパク質分泌率を示す。
図2 ウサギにVIPまたはペプチド5を1回点眼した時の涙液分泌量(シルマー値)の増加分を経時的に示す。
Claims (10)
- 一般式(I)
H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-X1-Gln-X2-Ala-Val-X3-X4-Tyr-Leu-X5-X6 (I)
(式中、X1、X3およびX4は、それぞれ Lys または Arg;X2は Leu ;X5 は 化学結合 または Asn-Ser-Ile-Leu-Asn- X 7 (X7 は Gly-Arg-Argを示す。); X6 は -NH 2 を示す。) で表されるペプチドまたはその製薬学的に許容される塩を含有するドライアイまたはドライアイを伴う疾病の治療剤。 - 一般式(I)において、 X 1 、X 3 およびX 4 が Arg 、X 5 が Asn-Ser-Ile-Leu-Asn- X 7 である請求項1記載の治療剤。
- 一般式(I)において、 X 1 、X 3 およびX 4 が Lys 、X 5 が化学結合、 である請求項1記載の治療剤。
- 眼局所投与剤である請求項1〜3のいずれか1項に記載の治療剤。
- 眼局所投与剤が点眼剤である請求項4記載の治療剤。
- 一般式 ( I )
H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg- X 1 -Gln- X 2 -Ala-Val- X 3 - X 4 -Tyr-Leu- X 5 - X 6 ( I )
( 式中、X 1 、X 3 およびX 4 は、それぞれ Lys または Arg ;X 2 は Leu ;X 5 は 化学結合 または Asn-Ser-Ile-Leu-Asn- X 7 ( X 7 は Gly-Arg-Arg を示す。 ) ; X 6 は -NH 2 を示す。 ) で表されるペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および製剤上許容される担体を含有するドライアイまたはドライアイを伴う疾病の治療用医薬組成物。 - 一般式 ( I ) において、 X 1 、X 3 およびX 4 が Arg 、X 5 が Asn-Ser-Ile-Leu-Asn- X 7 である請求項6記載の医薬組成物。
- 一般式 ( I ) において、 X 1 、X 3 およびX 4 が Lys 、X 5 が化学結合 である請求項6記載の医薬組成物。
- 眼局所投与用組成物である請求項6〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 眼局所投与用組成物が点眼剤である請求項9記載の医薬組成物。
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