JP2001151799A - 新規ペプチド及びそれを含有する消化管運動抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 配列番号１に記載のアミノ酸配列におい
て、そのＮ末端から少なくとも23残基までのアミノ酸配
列（但し、１位のHisは欠失していてもよく、；Ｃ末端
側は-OH、-NH₂のどちらでもよい。）からなり、かつ、
消化管運動抑制作用を有するペプチド、ならびに該ペプ
チドまたはそれらの薬学的に許容される塩を有効成分と
して含有する、消化管運動抑制剤。 【効果】 本発明によれば、胃蠕動運動の抑制作用を有
し、臨床上の副作用を起こさない安全性の高い消化管運
動抑制剤が提供される。本発明の消化管運動抑制剤は、
消化管検査・胃腸Ｘ線検査・腹部ＭＲＩ検査・内視鏡検
査などのの検査前の処置に有効であるほか、液剤として
も提供できるので簡便に使用でき、かつ経済的である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規ペプチド、そ
の薬学的に許容される塩、これらを有効成分として含有
する消化管運動抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】グルカゴンは消化管粘膜のグルカゴン分
泌細胞から分泌される29個のアミノ酸残基からなるペプ
チドである。グルカゴンは、アドレナリン様のグリコー
ゲン分解及び糖新生の促進 [Sutherland, E.W., Pharma
c.Rev., 12, 265〜299 (1960)]作用を有しており、膵臓
のグルカゴンと同じく血糖を上昇させる。また、グルカ
ゴンは、インスリン・成長ホルモン・カテコールアミン
などのホルモンの分泌を促進させることが知られてい
る。

【０００３】グルカゴンはそのＮ末端側、詳しくは、Ｎ
末端から21個までのアミノ酸残基からなる部分に、生理
的活性である血糖上昇作用を除く、いわゆる薬理的活性
を有しているとされているが、その一つとして胃平滑の
筋弛緩作用がある [Jorgensen, A., Endocrinology, 12
1, 704 〜713 (1987)；Frandsen,E.K., J.Biol.Chem.,
260, 7581〜7584 (1985)]。従って、グルカゴンは、上
記のような内分泌系に与える様々な作用により、成長ホ
ルモン分泌機能検査や肝型糖原病検査などに利用される
ほか、胃平滑筋弛緩作用及び胃酸分泌の抑制作用によ
り、消化管運動抑制剤として利用されている。

【０００４】消化管運動抑制剤は、消化管のＸ線及び内
視鏡検査の前処置剤として投与されるもので、胃の蠕動
運動を抑制する作用を有する。従来より、消化管運動抑
制剤として主に臭化ブチルスコポラミンやグルカゴンが
用いられているが、臭化ブチルスコポラミン製剤は、抗
コリン剤として全身のムスカリン性受容体に作用するた
め、心悸亢進、排尿障害、遠近調節障害などの副作用が
出現することがあり、被験者が心疾患、緑内障、前立腺
肥大などを有している場合はその使用は困難であった。
一方、グルカゴンは、上記副作用がなく安全性面で優れ
ているが、非常に活性が低いため高濃度の薬物量が必要
となる。そのため、本来の機能であるグリコーゲンの分
解及び糖新生の促進作用により、急激に血糖値を上昇さ
せる可能性がある。また、現在グルカゴンはそのアミノ
酸残基数の関係で製造コストがかかりすぎていること
や、また前記の通り、活性が低い関係で高投与量が必要
であることから経済的ではない。さらに、グルカゴンは
液剤としては不安定であるため、凍結乾燥品として市販
され、用時溶解して使用されているので医療現場におけ
る操作が煩雑である。従って、これまで使用されている
消化管運動抑制剤は、胃平滑筋に対する弛緩作用はあっ
ても、安全性、製造コスト面、簡便性において必ずしも
満足ができるものはない。

【０００５】一方、グルカゴンスーパーファミリーと呼
ばれるグルカゴンと相同性の高いアミノ酸配列を有する
ペプチドとして、ＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド；Vo
soactive Intestinal Peptide)、ＰＡＣＡＰ（下垂体ア
デニレートイクラーゼ活性化ペプチド; Pituitary Aden
ylate Cyclase Activating Polypeptide) などが知られ
ている。ＶＩＰは脳−腸管ペプチドと呼ばれ [S.I.Sai
d, Science., 169, 1217 (1970)]、全身に広く存在し、
血流増加作用など多くの生理作用が報告されている(特
開昭63-179892)。セクレチンは膵外分泌を刺激し、胃酸
分泌 [K.Shiratori, Dig.Dis.Sci., 37, 397-402 (199
2)]やガストリン遊離 [W.Y.Chey, Am J Physiol.,240,
G239-G244 (1981)]を抑制する消化管ホルモンである。
ＰＡＣＡＰは下垂体培養細胞のアデニレートサイクラー
ゼの活性化を指標として発見され、ＰＡＣＡＰ３８と、
ＰＡＣＡＰ２７の２種類がある [A.Miyata, Biochem.Bi
ophys.Res.Commun., 164, 567 (1989)]。これらのペプ
チドは、その前駆体のペプチド構造も似ており、さらに
シグナル配列、活性ペプチド部分が別々のエクソンにあ
るなど、遺伝子構造も類似している。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、胃平滑筋に
対する弛緩作用を有しつつ、臨床上副作用がなく、安全
にかつ簡便に使用できる消化管運動抑制剤を提供するこ
とにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明らは、上記課題を
解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、グルカゴンファミ
リーに属するペプチドについて優れた胃平滑筋弛緩抑制
作用があること、さらには、当該ペプチドのＣ末端より
アミノ酸を順次欠失させたペプチド断片が、胃平滑筋弛
緩作用を有しつつ、かつ臨床上副作用となる血管作動性
作用もないことを見出し、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、配列番号１に記載の
アミノ酸配列において、そのＮ末端から少なくとも23残
基までのアミノ酸配列（但し、１位のHisは欠失してい
てもよく、；Ｃ末端側は-OH、-NH₂のどちらでもよ
い。）からなり、かつ、消化管運動抑制作用を有するペ
プチドである。本発明はまた、上記ペプチドまたはそれ
らの薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、
消化管運動抑制剤である。以下、本発明を詳細に説明す
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明のペプチドは公知のペプチ
ド合成の常法に従って合成できる。例えば「ザ．ペプチ
ド(The Peptides)」第1巻(1966年) [Schreder and Luhk
e 著、Academic Press, New York, U.S.A.] 、あるいは
「ペプチド合成」［泉屋ら著、丸善株式会社(1975年)］
の記載に従い、具体的には、アジド法、酸クロライド
法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エス
テル法（P-ニトロフエニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシ
コハク酸イミドエステル法、シアノメチルエステル法な
ど）、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボイミダ
ゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ−アディティブ（ＨＯＮ
Ｂ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕ）法など、各種の方法により合
成することができる。これらの方法は、固相合成及び液
相合成のいずれにも適用できる。

【００１０】本発明においては、上記のような一般的な
ポリペプチドの合成法に従って、例えば末端アミノ酸に
順次１個ずつアミノ酸を縮合させるいわゆるステップワ
イズ法によって、または数個のフラグメントに分けてカ
ップリングさせていく方法によって製造される。例えば
ステップワイズ法による固相合成は、例えばメリフィー
ルド（Merrifield.R.B.)の方法 [Solid phase peptide
synthesis, J.Amer.Chem.Soc., 85, 2149-2159 (1963)]
に従い、以下のようにして行うことができる。まず、Ｃ
末端アミノ酸（アミノ基を保護したもの）をそのカルボ
キシル基によって不溶性樹脂に結合させ、その後、該Ｃ
末端アミノ酸のアミノ基の保護基を除去する。次いで、
得られたこの遊離の反応性アミノ基に、目的とするペプ
チドのアミノ酸配列に従って、アミノ基を保護したアミ
ノ酸の反応性カルボキシル基を縮合反応により順次結合
させる。このようにして一段階ずつ全配列を合成した
後、ペプチドを不溶性樹脂からはずす。

【００１１】上記の固相合成において用いられる不溶性
樹脂は、反応性カルボキシル基との結合性を有するもの
であればいずれをも使用でき、例えばベンズヒドリルア
ミン樹脂（BHA樹脂）、クロルメチル樹脂、オキシメチ
ル樹脂、アミノメチル樹脂、メチルベンズヒドリル樹脂
（MBHA樹脂）、４−アミノメチルフェノキシメチル樹
脂、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂、４−
オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂などが挙げ
られる。

【００１２】また、α−アミノ基の保護基として９−フ
ルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc)を使用す
る場合は４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂な
ど、トリフルオロ酢酸(TFA)によって樹脂から脱離でき
るものがよく、ｔ−ブトキシカルボニル基(Boc)を使用
する場合は４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル
樹脂（PAM樹脂）など、フッ化水素などによって樹脂か
ら脱離できるものがよい。樹脂1g当りペプチド濃度は0.
5mmole以下とすることが好ましい。

【００１３】上記の方法においては、アミノ酸のペプチ
ド結合に関与するアミノ基への保護基の結合及び該保護
基の脱離、ならびにアミノ酸のペプチド結合に関与する
カルボキシル基の活性化が必要である。アミノ基の保護
基として、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、
ｔ−ブトキシカルボニル（Boc）、ｔ−アミノオキシカ
ルボニル（Aoc）、イソボニルオキシカルボニル、p-メ
トキシベンジルオキシカルボニル、２−クロル−ベンジ
ルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、
トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、o-ニト
ロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフイノチオイ
ルなどの基が挙げられる。

【００１４】また、アミノ酸の中で、側鎖に官能基を有
するもの、例えばHis、Tyr、Thr、Lys、Asp、Arg及びSe
rは、その側鎖の官能基を保護しておくのが好ましい。
官能基の保護は、通常用いられている方法で、下記のよ
うな通常の保護基を結合させることにより行われ、反応
終了後、該保護基は脱離される。Hisのイミノ基の保護
基としては、例えばベンジルオキシメチル（Bom）、p-
トルエンスルホニル（Tos)、ベンジル（Bzl）、ベンジ
ルオキシカルボニル（Ｚ）、トリチル基などが挙げられ
る。

【００１５】Ser及びThrの水酸基は、例えばエステル化
またはエーテル化によって保護することができるが、こ
の保護は必須ではない。エステル化に適する基として
は、アセチルなどの低級アルカノイル基、ベンゾイルな
どのアロイル基、ベンゾイルオキシカルボニル、エチル
オキシカルボニルなどの炭酸から誘導される基などが挙
げられる。またエーテル化に適する基としては、ベンジ
ル（Bzl）、テトラヒドロピラニル、tert−ブチル基な
どが挙げられる。

【００１６】Tyrの水酸基の保護基としては、例えばベ
ンジル（Bzl）、ブロモベンジルオキシカルボニル（Br-
Z) 、ジクロロベンジル（Cl₂-Bzl) 、ベンジルオキシカ
ルボニル（Ｚ）、アセチル、p-トルエンスルホニル（To
s)基などが挙げられる。Lysのアミノ基の保護基として
は、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、クロロベ
ンジルオキシカルボニル（Cl-Z) 、ジクロロベンジル
（Cl₂-Bzl)、ｔ−ブトキシカルボニル基（Boc）、p-ト
ルエンスルホニル（Tos）基などが挙げられる。

【００１７】Argのグアニジノ基の保護基としては、例
えばp-トルエンスルホニル（Tos）、ニトロ、ベンジル
オキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−アミルオキシカルボニル
（Aoc）基などが挙げられる。Aspのカルボキシル基の保
護は、例えばベンジルアルコール、メタノール、エタノ
ール、tert−ブタノール、シクロヘキシル(cHex)などに
よるエステル化により行われる。

【００１８】その他のアミノ酸の保護基として、Trpの
インドリル基の保護基としては、例えばホルミル、カル
ボベンゾキシル、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼ
ンスルホニル、2,2,2-トリクロロエチルオキシカルボニ
ルなどが挙げられるが、この保護は必須ではない。Met
のチオメチル基の保護基としては予めメチルスルホキシ
ドにしておき、後に還元する方法があるが、この保護は
必須ではない。

【００１９】一方、カルボキシル基の活性化は、従来公
知の方法にて行うことができ、用いられる試薬なども公
知のものから適宜選択しえる。例えば、カルボキル基の
活性化は、該カルボキシル基と種々の試薬とを反応さ
せ、対応する酸クロライド、酸無水物または混合酸無水
物、アジド、活性エステル（ペンタクロロフェノール、
p-ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、
Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−
５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等との
エステル）などを形成させることにより行う。

【００２０】上記の固相における反応性アミノ基と反応
性カルボキシル基との縮合反応（ペプチド結合形成反
応）に用いる溶媒としては、ペプチド結合形成に使用で
きるものであればいずれでもよい。例えば無水または含
水のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホ
キシド（DMSO）、ピリジン、クロロホルム、ジオキサ
ン、ジクロロメタン（DCM)、テトラヒドロフラン（TH
F)、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチル
リン酸トリアミド（HMPA)などを単独で、あるいは２種
以上の混合溶媒として使用することができる。また、上
記縮合反応は、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボ
キシイミド（DCC)、カルボジイミダゾールなどのカルボ
ジイミド試薬やテトラエチルピロホスフェイト、ベンゾ
トリアゾール−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホ
スホニウムヘキサフルオロリン化物塩（Bop試薬）など
の存在下に行うこともできる。

【００２１】得られたペプチドは、通常の方法に従い脱
塩、精製することができる。例えば、DEAE−セルロース
などのイオン交換クロマトグラフィー、セファデックス
LH-20 、セファデックスG-25 などの分配クロマトグラ
フィー、シリカゲルなどの順相クロマトグラフィー、OD
S−シリカゲルなどの逆相クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィーなどが挙げられる。上記のように
して得られた精製ペプチドは、各種の酸を用いて、所望
により薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、塩酸
塩、リン酸塩などにすることが出来る。

【００２２】本発明のペプチド及びその塩は、胃に対す
る平滑筋抑制作用を有する。従って、消化管検査・胃腸
Ｘ線検査・腹部ＭＲＩ検査・内視鏡検査などの検査前に
消化管運動抑制剤として投与すれば、胃蠕動運動を抑制
することができる。本発明のペプチド及びその塩は、そ
のまま投与することができるが、一般には公知の方法に
より薬学的に許容される種々の担体その他の成分と混合
して、液状、固体状の経口製剤または非経口製剤として
投与される。本発明のペプチドの投与量は、使用（検
査）目的、被験者の年齢、体重、投与方法などにより適
宜決定されるが、例えば胃腸Ｘ線検査前に筋肉内注射を
行う場合、一回検査あたり、注射薬として2ug〜10ng/kg
体重程度を使用することが好ましい。

【００２３】

【実施例】以下に本発明を実施例を挙げてより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。なお、実施例において合成した各ペプチドの高速液
体クロマトグラフィー（HPLC) 及びアミノ酸分析条件は
以下の通りである。

【００２４】・高速液体クロマトグラフィー（HPLC) 高速液体クロマトグラフィーはLC-Module-1 （日本ウォ
ーターズ・リミテッド社製）を用いて分析を行った。 （HPLC分析条件） カラム： TSK-gel ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒： Ａ 0.1% TFA Ｂ アセトニトリル/0.1% TFA 溶媒Ｂを20％から60％に毎分１％変化させる直線勾配グラジェント 流 速：1mL/min 検出波長：220nm ・アミノ酸分析 アミノ酸分析条件は、6N-HCl 0.1%フェノール含有）中
で 110℃、20時間の加水分解反応を行った後に、日立ア
ミノ酸分析Ｌ−8500型（日立製作所社製）によって分析
した。

【００２５】〔実施例１〕 ペプチドの合成（１） (1) ペプチド１の製造 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチド１を製
造した。

【００２６】固相合成装置として Milligen Bioreserch
社製ペプチドシンセサイザー 9600を用いて固相合成を
行った。まず、MBHA樹脂（ペプチド研究所社製、アミノ
基0.57 mmol/g）1gを出発原料としてDCM 20ml（２
回）、50％TFA含有DCM溶液 30ml（30分）、イソプロピル
アルコール 20ml （１回）、 MeOH 20ml （２回）、10％
TEA含有DCM 20ml（２回）、MeOH 20ml （２回）、DCM 2
0ml（２回）の順に攪拌下処理し、各々の処理後濾過し
た。

【００２７】これにアミノ酸順序28番目のBoc-Asn(Xan)
-OH 2mmole 、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)
2mmole、DCM 10ml及びDMF 2mlを加えて攪拌し、さらにD
CC(1M-DCM溶液）1.5mlを加えて２時間反応させた。反応
液を濾過した後、MeOH 20ml（２回）、DCM 20ml（２
回）の順に攪拌下処理し、各々の処理後濾過した。さら
に、Boc-Asn(Xan)-OH ２mmole、HOBt 2mmole、DCM 10ml
及びDMF 2mlを加えて攪拌し、DCC(1M-DCM溶液）0.8mlを
加えて１時間反応させた。反応液を濾過した後、MeOH 2
0ml（２回）、DCM 20ml（２回）の順に攪拌下処理し、
各々の処理後濾過して、Boc-Asn(Xan)-MBHA樹脂を得
た。なお、未反応のMBHA樹脂は、20％無水酢酸含有DCM
溶液10mlを加えて５分間攪拌し、濾過後MeOH 20ml （２
回）、DCM 20ml（２回）の順に攪拌下処理し、各々の処
理後濾過して副反応が進まないようにした。

【００２８】次に、得られたBoc-Asn(Xan)-MBHA樹脂を
50％TFA含有DCM溶液 30ml（30分）、イソプロピルアルコ
ール 20ml（１回）、MeOH20ml（２回）、10％TEA含有DCM
20ml（２回）、MeOH 20ml（２回）、DCM 20ml（２回）
の順に攪拌下処理し、各々の処理後濾過した。これにア
ミノ酸順序27番目のBoc-Leu-OH 2mmole、HOBt 2mmole、
DCM 10ml及びDMF 2mlを加えて攪拌し、さらにDCC(1M-DC
M溶液）1.5mlを加えて２時間反応させた。反応液を濾過
した後、MeOH 20ml（２回）、DCM 20ml（２回）の順に
攪拌下処理し、各々の処理後濾過してBoc-Leu-Asn(Xan)
-MBHA樹脂を得た。

【００２９】なお、未反応の Asn-MBHA樹脂は、20％無
水酢酸含有DCM溶液 10mlを加えて５分間攪拌し、濾過後
MeOH 20ml（２回）、DCM20ml（２回）の順に攪拌下処理
し、各々の処理後濾過して副反応が進まないようにし
た。以下、次に示す保護アミノ酸を用いて順次 26番目
から１番目までのアミノ酸をカップリングした。

【００３０】

【表１】

【００３１】この様にして、下記式： His(Bom)-Ser(Bz)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-A
sp(OcHex)-Asn(Xan)-Tyr(Br-Z)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu
-Arg(Tos)-Lys(Cl₂Z)-Gln(Xan)-Met-Ala-Val-Lys(Cl₂Z)
-Lys(Cl₂Z)-Tyr(Br-Z)-Leu-Asn(Xan)-Ser(Bz)-Ile-Leu-
Asn(Xan)-MBHA樹脂 5.09gを得た。

【００３２】ここで得られた保護ペプチド−MBHA樹脂
5.0ｇにアニソール 7.5ml、1,2-エタンジチオール 7.5m
lを加え、さらに無水フッ化水素 60mlを加えて０℃で１
時間撹拌した。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去
後、残査をエーテルで洗浄し、これに 10％酢酸 125ml
を加えてペプチドを抽出した。抽出液を以下に示す条件
で逆相カラムクロマトグラフィーにより精製後、さらに
分取用高速液体クロマトグラフィーを用いたイオン交換
クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーにより
精製した。

【００３３】逆相カラムクロマトグラフィー カラム：ODS −1022TT（30×420mm） 流 速：5 ml/min

【００３４】イオン交換クロマトグラフィー（分取用高
速液体クロマトグラフィー） カラム：TSK GEL SP-5PW（21.5×150mm） 溶 媒：35％イソプロピルアルコール／50mM酢酸緩衝液
（pH 5.3） 流 速：5 ml/min

【００３５】逆相カラムクロマトグラフィー（分取用高
速液体クロマトグラフィー） カラム：TSK GEL ODS-120T（21.5×300mm） 溶 媒：30% アセトニトリル／0.1% TFA 流 速：10ml/min

【００３６】得られた溶出液を凍結乾燥し，配列番号１
のアミノ酸配列を有する精製ペプチド１（Ｃ末端は−Ｎ
Ｈ₂)を得た。この精製ペプチドの収量、高速液体クロマ
トグラフィー(HPLC)の保持時間、アミノ酸分析結果を下
記に示す。 ・収量160mg ・HPLCの保持時間：18.98分 ・アミノ酸分析 Asx(5) 4.95, Thr(2) 1.90, Ser(2) 1.87, Glx(1) 1.0
0, Ala(2) 1.95,Val(2) 1.94, Met(1) 0.60, Leu(3) 2.
99, Tyr(2) 1.96, Phe(1) 0.95,His(1) 0.97, Arg(2)
2.07, Ile(1) 0.97 Lys(3) 2.98

【００３７】(2) ペプチド２の製造 (1) と同様の方法で、配列番号３に示すアミノ酸配列を
有する精製ペプチド２（Ｃ末端は−ＮＨ₂)を得た。この
精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグラフィー(HPL
C)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に示す。 ・収量103.3mg ・HPLCの保持時間：16.34分 ・アミノ酸分析 Asx(3) 2.98, Thr(1) 0.95, Ser(3) 2.65, Glx(2) 2.0
5, Ala(3) 2.99,Val(3) 2.92, Met(1) 0.60, Leu(2) 2.
02, Tyr(4) 3.94, Phe(1) 0.95,His(1) 1.00, Arg(4)
3.95, Ile(1) 0.94, Lys(7) 6.93 Gly(2) 2.00,

【００３８】(3) ペプチド３の製造 (1)と同様の方法で、配列番号４に示すアミノ酸配列を
有する精製ペプチド３（Ｃ末端は−ＮＨ₂)を得た。この
精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグラフィー(HPL
C)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に示す。 ・収量102.5mg ・HPLCの保持時間：20.23分 ・アミノ酸分析 Ａｓｘ（２） １．９６， Ｔｈｒ（１） ０．８９，
Ｓｅｒ（３） ２．２４， Ｇｌｘ（１） １．０
３， Ａｌａ（３） ３．１１，Ｖａｌ（２） ２．０
６， Ｍｅｔ（１） ０．９７， Ｌｅｕ（２） ２．
１２， Ｔｙｒ（３） ３．０６， Ｐｈｅ（１）
０．９８，Ｈｉｓ（１） ０．９５， Ａｒｇ（２）
０．９７， Ｉｌｅ（１） ０．９４， Ｌｙｓ（３）
３．０４ Ｇｌｙ（１） ０．９７，

【００３９】〔実施例２〕 ペプチドの合成（２） （１） ペプチド４の製造 MBHA樹脂の代わりに、4-オキシメチルフェニルアセタミ
ドメチル樹脂を使用する以外は、実施例１(1) と同様の
方法で、配列番号５に示すアミノ酸配列を有する精製ペ
プチド４（Ｃ末端は−ＯＨ）を得た。この精製ペプチド
の収量、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の保持時
間、アミノ酸分析結果を下記に示す。 ・収量78.8mg ・HPLCの保持時間：18.10 ・アミノ酸分析 Asx(5) 4.95, Thr(2) 1.90, Ser(2) 1.87, Glx(1) 1.0
0, Ala(2) 1.95,Val(2) 1.94, Met(1) 0.60, Leu(3) 2.
99, Tyr(2) 1.96, Phe(1) 0.95,His(1) 0.97, Arg(2)
2.07, Ile(1) 0.97, Lys(3) 2.98

【００４０】(2) ペプチド５の製造 実施例１(1) と同様の方法で、配列番号６に示すアミノ
酸配列を有する精製ペプチド５（Ｃ末端は−ＮＨ₂)を得
た。この精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグラフ
ィー(HPLC)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に示
す。 ・収量78.8mg ・HPLCの保持時間：19.16 ・アミノ酸分析 Asx(4) 3.95, Thr(2) 1.90, Ser(2) 1.87, Glx(1) 1.0
0, Ala(2) 1.95,Val(2) 1.94, Met(1) 0.60, Leu(3) 2.
98, Tyr(2) 1.96, Phe(1) 0.95,His(1) 0.97, Arg(2)
2.07, Ile(1) 0.97, Lys(3) 2.98

【００４１】(3) ペプチド６の製造 実施例１(1) と同様の方法で、配列番号７に示すアミノ
酸配列を有する精製ペプチド６（Ｃ末端は−ＮＨ₂)を得
た。この精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグラフ
ィー(HPLC)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に示
す。 ・収量78.8mg ・HPLCの保持時間：15.58 ・アミノ酸分析 Asx(4) 3.95, Thr(2) 1.90, Ser(2) 1.87, Glx(1) 1.0
0, Ala(2) 1.95,Val(2) 1.94, Met(1) 0.60, Leu(2) 1.
99, Tyr(2) 1.96, Phe(1) 0.95,His(1) 0.97, Arg(2)
2.07, Ile(1) 0.97, Lys(3) 2.98

【００４２】(4) ペプチド７の製造 実施例１(1) と同様の方法で、配列番号８に示すアミノ
酸配列を有する精製ペプチド７（Ｃ末端は−ＮＨ₂)を得
た。この精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグラフ
ィー(HPLC)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に示
す。 ・収量78.8mg ・HPLCの保持時間：19.32 ・アミノ酸分析 Asx(4) 3.95, Thr(2) 1.90, Ser(2) 1.87, Glx(1) 1.0
0, Ala(2) 1.95,Val(2) 1.94, Met(1) 0.60, Leu(2) 1.
99, Tyr(2) 1.96, Phe(1) 0.95,His(1) 0.97, Arg(2)
2.07, Lys(3) 2.99

【００４３】(5) ペプチド８の製造 実施例１(1) と同様の方法で、配列番号９に示すアミノ
酸配列を有する精製ペプチド８（Ｃ末端は−ＮＨ₂)を得
た。この精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグラフ
ィー(HPLC)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に示
す。 ・収量78.8mg ・HPLCの保持時間：13.54 ・アミノ酸分析 Ａｓｘ（４） ３．９６， Ｔｈｒ（２） １．９０，
Ｓｅｒ（１） ０．８７， Ｇｌｘ（１） １．０
０， Ａｌａ（２） １．９５，Ｖａｌ（２） １．９
５， Ｍｅｔ（１） ０．６５， Ｌｅｕ（２） １．
９９， Ｔｙｒ（２） １．９５， Ｐｈｅ（１）
０．９５，Ｈｉｓ（１） ０．９７， Ａｒｇ（２）
２．０７， Ｌｙｓ（３） ２．９９

【００４４】（６） ペプチド９の製造 実施例１(1) と同様の方法で、配列番号１０に示すアミ
ノ酸配列を有する精製ペプチド９（Ｃ末端は−ＮＨ₂)を
得た。この精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグラ
フィー(HPLC)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に示
す。 ・収量78.8mg ・HPLCの保持時間：14.22 ・アミノ酸分析 Asx(3) 2.98, Thr(2) 1.90, Ser(1) 0.87, Glx(1) 1.0
0, Ala(2) 1.95,Val(2) 1.95, Met(1) 0.65, Leu(2) 1.
99, Tyr(2) 1.95, Phe(1) 0.95,His(1) 0.97, Arg(2)
2.07, Lys(3) 2.97

【００４５】(7) ペプチド１０の製造 実施例１(1) と同様の方法で、配列番号１１に示すアミ
ノ酸配列を有する精製ペプチド１０（Ｃ末端は−ＮＨ₂)
を得た。この精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグ
ラフィー(HPLC)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に
示す。 ・収量78.8mg ・HPLCの保持時間：12.47 ・アミノ酸分析 Asx(3) 2.99, Thr(2) 1.90, Ser(1) 0.87, Glx(1) 1.0
0, Ala(2) 1.95,Val(2) 1.95, Met(1) 0.66, Leu(1) 1.
00, Tyr(2) 1.95, Phe(1) 0.95,His(1) 0.97, Arg(2)
2.07, Lys(3) 2.96

【００４６】(8) ペプチド１１の製造 実施例１(1) と同様の方法で、配列番号１２に示すアミ
ノ酸配列を有する精製ペプチド１１（Ｃ末端は−ＮＨ₂)
を得た。この精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグ
ラフィー(HPLC)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に
示す。 ・収量78.8mg ・HPLCの保持時間：１９．７４ ・アミノ酸分析 Ａｓｘ（５） ４．９５， Ｔｈｒ（２） １．９０，
Ｓｅｒ（２） １．８７， Ｇｌｘ（１） １．０
０， Ａｌａ（２） １．９５，Ｖａｌ（２） １．９
５， Ｍｅｔ（１） ０．６５， Ｌｅｕ（３） ３．
００， Ｔｙｒ（２） １．９６， Ｐｈｅ（１）
０．９５，Ａｒｇ（２） ２．０４， Ｉｌｅ（１）
０．９８， Ｌｙｓ（３） ２．９８

【００４７】(9) ペプチド１２の製造 実施例１(1) と同様の方法で、配列番号１３に示すアミ
ノ酸配列を有する精製ペプチド１２（Ｃ末端は−ＮＨ₂)
を得た。この精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグ
ラフィー(HPLC)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に
示す。 ・収量78.8mg ・HPLCの保持時間：18.10 ・アミノ酸分析 Asx(4) 3.95, Thr(2) 1.90, Ser(2) 1.87, Glx(1) 1.0
0, Ala(2) 1.95,Val(2) 1.94, Met(1) 0.60, Leu(2) 1.
99, Tyr(2) 1.96, Phe(1) 0.95,Arg(2) 2.07, Lys(3)
2.98

【００４８】(10) ペプチド１３の製造 実施例１(1) と同様の方法で、配列番号１４に示すアミ
ノ酸配列を有する精製ペプチド１３（Ｃ末端は−ＮＨ₂)
を得た。この精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグ
ラフィー(HPLC)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に
示す。 ・収量78.8mg ・HPLCの保持時間：18.10 ・アミノ酸分析 Asx(4) 3.95, Thr(2) 1.90, Ser(2) 1.87, Glx(1) 1.0
0, Ala(2) 1.95,Val(2) 1.95, Leu(3) 3.00, Tyr(2) 1.
96, Phe(1) 0.95, His(1) 0.97,Arg(2) 2.06, Lys(3)
2.98

【００４９】(11) ペプチド１４の製造 実施例１(1) と同様の方法で、配列番号１５に示すアミ
ノ酸配列を有する精製ペプチド１４（Ｃ末端は−ＮＨ₂)
を得た。この精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグ
ラフィー(HPLC)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に
示す。 ・収量75.4mg ・HPLCの保持時間：14.58 ・アミノ酸分析 Asx(4) 3.98, Thr(2) 1.98, Ser(1) 0.66, Glx(1) 1.0
1, Ala(2) 1.99,Val(2) 1.92, Leu(3) 3.01, Tyr(2) 1.
85, Phe(1) 0.90, Lys(3) 2.93,His(1) 0.99, Arg(2)
2.01

【００５０】(12) ペプチド１５の製造 実施例１(1) と同様の方法で、配列番号１６に示すアミ
ノ酸配列を有する精製ペプチド１５（Ｃ末端は−ＮＨ₂)
を得た。この精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグ
ラフィー(HPLC)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に
示す。 ・収量75.0mg ・HPLCの保持時間：15.26 ・アミノ酸分析 Asx(4) 3.98, Thr(2) 1.98, Ser(1) 0.66, Glx(1) 1.0
1, Ala(2) 1.99,Val(2) 1.92, Leu(3) 3.01, Tyr(2) 1.
85, Phe(1) 0.90, Lys(3) 2.93,His(1) 0.99, Arg(2)
2.01

【００５１】(13) ペプチド１６の製造 実施例１(1) と同様の方法で、配列番号１７に示すアミ
ノ酸配列を有する精製ペプチド１６（Ｃ末端は−ＮＨ₂)
を得た。この精製ペプチドの収量、高速液体クロマトグ
ラフィー(HPLC)の保持時間、アミノ酸分析結果を下記に
示す。 ・収量74.4mg ・HPLCの保持時間：15.23 ・アミノ酸分析 Asx(2) 1.99, Thr(1) 0.90, Ser(3) 2.60, Glx(1) 1.0
0, Gly(1) 0.99Ala(1) 1.01, Val(1) 0.99, Met(1) 0.6
0, Ile(1) 1.02, Leu(1) 1.03,Tyr(3) 3.96, Phe(1) 0.
95, His(1) 0.97, Arg(2) 2.04, Lys(3) 2.98

【００５２】〔試験例１〕 胃平滑筋弛緩試験（１） 上記実施例１で得られた精製ペプチド１〜３とグルカゴ
ン（対照）について下記の方法で、マウス胃平滑筋弛緩
作用の効果を評価した。マウスは雄のICRマウスを9週齢
ので購入し、１週間の予備飼育後、10〜18週齢に渡り使
用した。頸椎脱臼処理後、直ちに開腹し胃を全摘出、生
理食塩水にて胃内部を十分に洗浄し、標本とした。出来
上がった標本を内容量20mLのマグヌス槽（容量20mL、温
度37℃、荷重2.0g、95% CO₂ ＋5% CO₂ 通気下：理研開
発）内に懸垂した。生理的溶液としてKrebs-Henseleit
Buffer Modified（SIGMA）溶液を使用した。反応はアン
プRMP-6004(日本光電)を介してレコーダーR-64M （理化
電機）上に描記した。

【００５３】実験は標本をマグヌス装置にセットして、
ベースラインが安定した後、カルバコール溶液（添加濃
度6×10^-3M）を100μL添加した。10分後に精製ペプチド
の試料溶液（添加濃度2×10^-4M）を100μL添加し、標本
の弛緩作用を観察した。カルバコール添加前の平滑筋の
収縮の度合いを0％、カルバコール添加10分後の平滑筋
の収縮の度合いを100％として、各試料溶液を添加した
ときの平滑筋の最大収縮抑制率を求めた。表２に、精製
ペプチド１〜３及びグルカゴンの最終濃度10^-6M （添加
濃度は２×10^-4Ｍ）におけるマウス胃平滑筋の最大収縮
抑制率を示す。

【００５４】

【表２】

【００５５】いずれのペプチドもグルカゴンよりも優れ
た収縮抑制率を示した。ところが、最も強い弛緩作用が
確認されたペプチド１は、血管作動性が強く、血管が拡
張することによって血流量が増加し、脈拍増加、血圧変
動、ほてりなどの弊害が起こる可能性があり、臨床上副
作用が懸念される。そこで、ペプチド１のＣ末端からい
くつかのアミノ酸を欠失させたアミノ酸について、胃平
滑筋弛緩作用に併せて血管作動性作用についても検討し
た。

【００５６】〔試験例２〕 胃平滑筋弛緩試験（２） 上記実施例２で得られた精製ペプチド４〜１６について
試験例１と同様の方法でマウス胃平滑筋弛緩作用の効果
を評価した。また、下記の方法でラット頚動脈血流量に
対する作用を評価した。実験動物にはslc:Wistarラット
を用いた。動物を麻酔下で仰臥位に固定し、咽頭部を切
開し頚動脈を露出し、血流測定用プローブを固定した。
血流量は超音波トランジットタイム血流量計(トランソ
ニックシステムジャパン）を用いて測定した。血流の増
加作用は血流量計に接続したアンプAG-621G（日本光
電）を介して、MacLabを用いてデジタル信号に変換して
コンピューターに保存した。

【００５７】実験は、注射用生理食塩液で1 mg/mLに調
整した精製ペプチドの各試料溶液を、個体あたり100μL
大腿静脈より静脈内投与を行った。投与後10分間の血流
変化を観察した。表３に、精製ペプチド４〜１６及び精
製ペプチド１の最終濃度10^-6Ｍにおけるマウス胃平滑筋
の最大収縮抑制率及び血流変化量（ペプチド１を１００
として換算）を示す。

【００５８】

【表３】

【００５９】

【発明の効果】本発明によれば、胃蠕動運動の抑制作用
を有し、臨床上の副作用を起こさない安全性の高い消化
管運動抑制剤が提供される。本発明の消化管運動抑制剤
は、消化管検査・胃腸Ｘ線検査・腹部ＭＲＩ検査・内視
鏡検査などのの検査前の処置に有効であるほか、液剤と
しても提供できるので簡便に使用でき、かつ経済的であ
る。

【００６０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> ITOHAM FOODS INC. <120> Novel Peptides and the Agent for suppressing gastrointestinal movement containing the same <130> P99-0589 <160> 17 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> PEPTIDE <222> 4 <223> Xaa represents Ala or Gly <220> <221> PEPTIDE <222> 5 <223> Xaa represents Val or Ile <220> <221> PEPTIDE <222> 9 <223> Xaa represents Asn or Ser <220> <221> PEPTIDE <222> 11 <223> Xaa represents Thr or Ser <220> <221> PEPTIDE <222> 13 <223> Xaa represents Leu or Tyr <220> <221> PEPTIDE <222> 17 <223> Xaa represents Met or Leu or nLeu <220> <221> PEPTIDE <222> 24 <223> Xaa represents Asn or Ala or Asp <220> <221> PEPTIDE <222> 25 <223> Xaa represents Ser or Ala <220> <221> PEPTIDE <222> 26 <223> Xaa represents Ile or Val <220> <221> PEPTIDE <222> 28 <223> Xaa represents Asn or Gly <400> 1 His Ser Asp Xaa Xaa Phe Thr Asp Xaa Tyr Xaa Arg Xaa Arg Lys Gln 1 5 10 15 Xaa Ala Val Lys Lys Tyr Leu Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Lys Arg Tyr Lys 20 25 30 Gln Arg Val Lys Asn Lys 35 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn 20 25 <210> 3 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 3 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys 20 25 30 Gln Arg Val Lys Asn Lys 35 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu 20 25 <210> 5 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 5 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn 20 25 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 6 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu 20 25 <210> 7 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 7 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile 20 25 <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 8 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser 20 25 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 9 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn 20 <210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 10 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu 20 <210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 11 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr 20 <210> 12 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 12 Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln Met 5 10 15 Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn 20 25 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 13 Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln Met 5 10 15 Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser 20 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 14 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser 20 25 <210> 15 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 15 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn 20 <210> 16 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 16 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asp 20 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 17 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu 20

【００６１】

【配列表フリーテキスト】 配列番号１：Xaa はAla 又はGly を表す（存在位置：４） 配列番号１：Xaa はVal 又はIle を表す（存在位置：５） 配列番号１：Xaa はAsn 又はSer を表す（存在位置：９） 配列番号１：Xaa はThr 又はSer を表す（存在位置：11） 配列番号１：Xaa はLeu 又はTyr を表す（存在位置：13） 配列番号１：Xaa はMet 又はLeu 又はnLeuを表す（存在位置：17） 配列番号１：Xaa はAsn 又はAla 又はAsp を表す（存在位置：24） 配列番号１：Xaa はSer 又はAla を表す（存在位置：25） 配列番号１：Xaa はIle 又はVal を表す（存在位置：26） 配列番号１：Xaa はAsn 又はGly を表す（存在位置：28）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA07 BA01 BA07 BA18 BA19 CA18 CA25 DB35 MA16 NA14 ZA282 ZA661 ZC541 4H045 AA10 AA30 BA17 BA18 BA19 CA40 DA45 EA25 FA30 FA34 FA40 FA58 HA03

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載のアミノ酸配列におい
   て、そのＮ末端から少なくとも23残基までのアミノ酸配
   列（但し、１位のHisは欠失していてもよく、；Ｃ末端
   側は-OH、-NH₂のどちらでもよい。）からなり、かつ、
   消化管運動抑制作用を有するペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のペプチドまたはそれら
   の薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、消
   化管運動抑制剤。