FI105013B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten CRF-analogien valmistamiseksi - Google Patents

Description

, 105013

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten CFR-analogien valmistamiseksi Tämä keksintö liittyy peptideihin, ja erityisemmin 5 hentetrakontapeptidi CRF:n analogeihin. Keksinnön kohteena on näin ollen menetelmä tällaisen terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin tai sen myrkyttömän suolan valmistami-siseksi.

Keksinnön tausta 10 Kokeelliset ja kliiniset havainnot ovat tukeneet käsitystä, että hypotalamuksella on avainasema adenohypo-fysiaalisten kortikotrooppisten solujen eritystoimintojen säätelyssä. Yli 25 vuotta sitten Guillemin, Rosenberg ja Saffran sekä Schally osoittivat toisistaan riippumatta 15 hypotalamuksessa olevan sellaisia tekijöitä, jotka lisäsivät ACTH:n eritysnopeutta aivolisäkkeestä, kun sitä inku-boitiin in vitro tai ylläpidettiin elinviljelmässä. Yksikään karakterisoiduista eritystä lisäävistä tekijöistä ei täyttänyt fysiologiselle kortikotropiinia vapauttavalle 20 tekijälle (CRF) asetettuja vaatimuksia ennen kuin lampaan CRF (oCRF) karakterisoitiin vuonna 1981 ja, kuten US-pa-tentissa 4 415 558 esitetään, sillä havaittiin olevan kaava :H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-: Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu- :,j,: 25 Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala- : : NH2. oCRF alentaa nisäkkäiden verenpainetta sekä stimuloi ACTH:n ja β-endorfiinin eritystä.

i « ;\j Rotan CRF (rCRF) on eristetty, puhdistettu ja se on ·;·. karakterisoitu hentetrakontapeptidiksi, jonka kaava on: • · 30 H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe- ... His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln- ;*· Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile- r * ‘Ile-NH2. Siihen voidaan viitata vaihtoehtoisesti rotan amu-niininä. Nyt ihmisen CRF:n kaavan on määritetty olevan 35 sama kuin rCRF:n kaava, ja termejä rCRF ja hCRF käytetään . erotuksetta. Synteettiset rCRF ja oCRF stimuloivat ACTH:n • · * • * · f f 2 105013 ja β-endorfiinin kaltaisia aktiivisuuksia (β-END-LI) in vitro ja in vivo sekä alentavat verenpainetta merkittävästi .

Keksinnön yhteenveto 5 Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään näiden 41 tähdettä sisältävien CRF-peptidien analogien valmistamiseksi, joiden biologinen aktiivisuus in vitro on vähintään suunnilleen sama kuin natiivien peptidien ja joiden biologinen vaikutus in vivo kestää merkittävästi kauemmin. 10 Keksinnön mukaan valmistetaan terapeuttisesti käyttökelpoinen peptidi tai sen myrkytön suola, jolla peptidillä on kaava: Y-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-R20-Nle-R22-R23-R24-R25-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-R32-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Nle-R39-Ile-R41-NH2, jossa Y 15 on asyyliryhmä, jossa on korkeintaan 7 hiiliatomia, tai vety; R20 on Glu tai D-Glu; R22 on Ala tai Thr; R23 on Arg tai Lys; R24 on Ala tai D-Ala; R25 on Glu tai Asp; R32 on His tai D-His; R39 on Glu tai Asp; R41 on Ile tai Ala.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista 20 se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Edullisten peptidien valmistus on esitetty vaatimuksissa 2-5. Tällaiset CRF-analogit tai niiden myrkyttömät additiosuolat voidaan dispergoida farmaseuttisesti tai eläinlääkinnälli-: sesti hyväksyttävään nestemäiseen tai kiinteään kantajaan.

25 Tällaisia peptidejä tai niiden farmaseuttisesti tai eläin- • · '•S'’· lääkinnällisesti hyväksyttäviä additiosuoloja voidaan an- ;"*taa nisäkkäille, erityisesti ihmisille, ACTH:n, β-endor- i · fiinin, β-lipotropiinin, muiden pro-opiomelanokortiinigee- r « nin tuotteiden ja kortikosteronin erityksen säätämiseksi e 30 ja/tai verenpaineen alentamiseksi ja/tai mielialaan, käyttäytymiseen ja gastrointestinaalisiin toimintoihin sekä autonomisen hermojärjestelmän toimintoihin vaikuttamisek- ;·’ si. Lisäksi CRF-analogeja voidaan käyttää aivolisäkkeen r ; kardiovaskulaarisen, gastrointestinaalisen tai keskusher- 35 moston toimintojen tilan arvioimiseksi.

« _ f 4 · • « · « « « 4 0 • · 105013 3

Edullisten suoritusmuotojen yksityiskohtainen kuvaus

Peptidien määrittämisessä käytettävä nimistö on Schroderin & Lubken teoksessa "The Peptides", Academic 5 Press (1965), kuvaama, missä teoksessa konventionaalisen esitystavan mukaisesti aminoryhmä on vasemmalla ja karbok-syyliryhmä oikealla. Alfa-aminohappotähteiden identifioimiseksi käytetään kolmikirjaimisia standardilyhenteitä, ja mikäli aminohappotähteellä on isomeerimuotoja, esitetään 10 aminohapon L-muoto, jollei erityisesti toisin ilmoiteta, esim. Ser = L-seriini, Orn = ornitiini, Nle - norleusiini, Nva = norvaliini ja Har - homoarginiini. Lisäksi käytetään seuraavia lyhenteitä: leu = joko L-leusiini tai CeH3-L-leu-siini (CML); ala = joko L-alaniini tai c“CH3-L-alaniini 15 (CMA).

Keksinnön mukaisesti saadaan aikaan CRF-analogeja, jotka ovat seuraavan kaavan mukaisia: Y-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-R20-Nle-R22-R23-R24-R25-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-20 R32-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Nle-R39-Ile-R41-NH2, jossa Y on asyy-liryhmä, jossa on korkeintaan 7 hiiliatomia, tai vety; R20 on Glu tai D-Glu; R22 on Ala tai Thr; R23 on Arg tai Lys; R24 on Ala tai D-Ala; R25 on Glu tai Asp; R32 on His tai D-His; • R39 on Glu tai Asp; R41 on Ile tai Ala.

25 Voidaan myös valmistaa näiden peptidien myrkyttömiä additiosuoloja. Lisäksi edullisesti D-Glu on asemassa 20.

• · Nämä analogit ovat tehokkaita, vaikka niitä olisi N-päästä » .'.J hieman lyhennetty, so. enintään noin 6 tähteen verran.

« ·

Peptidiin, jonka kaava on H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro- « · 30 Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-Glu-Met-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-V. Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2, viitataan AHC:na (al- Γ fakierteinen CRF). AHC:n analogeilla, joilla CML on ase- , massa 37, on biologista tehoa, ja ne ovat tehokkaita vaik- :<f/. 35 ka N-päästä hieman lyhennettyinäkin, s.o. enintään noin 6 : tähteen sekvenssin verran.

* · · • · I · • « 105013 4

Peptidit syntetisoidaan sopivan menetelmän mukaisesti, kuten yksinomaan kiinteäfaasitekniikoiden, osittain kiinteäfaasitekniikoiden, fragmenttikondensaation tai klassisen liuoslisäyksen avulla. Peptidien kemiallisille 5 synteeseille on yhteistä aminohapon eri osien labiilien sivuketjuryhmien suojaaminen sopivilla suojaryhmillä, jotka estävät kemiallisen reaktion tapahtumisen kyseisessä kohdassa niin kauan kunnes ryhmä lopulta poistetaan. Aminohapon tai fragmentin alfa-aminoryhmän suojaaminen on 10 myös tavallista, koska tällaisen yksikön karboksyyliryhmä reagoi, minkä jälkeen alfa-aminon suojaryhmä poistetaan selektiivisesti, jotta seuraava reaktio siinä kohdassa voisi tapahtua. Tämän mukaisesti on yleistä, että eräänä synteesin vaiheena tuotetaan välituote, joka sisältää kun-15 kin aminohappotähteen peptidiketjussa halutussa järjestyksessä ja jossa useassa tähteessä on sivuketjuja suojaavia ryhmiä.

Näin ollen tällaisen peptidianalogin kemiallinen synteesi voi johtaa välituotteen muodostumiseen: 20 X1-D-Pro-Pro-Ile-Ser (X2) -Leu-Asp( X5) -Leu-Thr( X2) -D-Phe-

His ( X7) -Leu-Leu-Arg( X3) -Glu(X5) -Val-Leu-R20(X5) -Nle-R22(X2)-R23(X3 tai X6)-R24-R25(X5)-Gln(X4)-Leu-Ala-Gln(X4)-Gln(X4)-Ala-R32( X7)-Ser ( X2) -Asn( X4) -Arg(X3)-Lys(X6)-CML-Nle-R39( X5) -Ile-: R41-X8 tai sen N-päästä lyhennetty muoto, jossa X1, X2, X3, 25 X4, X5, X6 ja X7 ovat kukin joko vety tai suojaryhmä, ja X8 « · : l,!,: on joko suojaryhmä tai hartsikantajaan yhdistävä sidos tai NH2, ja ossa R-ryhmät ovat kuten edellä on määritelty.

X1 on joko vety tai alfa-aminon suojaryhmä. X1:llä merkityt alfa-aminoa suojaryhmät ovat sellaisia, joiden 30 tiedetään olevan polypeptidien asteittaisessa synteesissä käyttökelpoisia. X1:llä merkittyyn alfa-aminon suojaryhmiin kuuluvia ryhmiä ovat (1) asyylityyppiset suojaryhmät, ku-··* ten formyyli, akrylyyli (Acr), bentsoyyli (Bz) ja asetyyli ' (Ac), joita käytetään edullisesti vain N-päässä; (2) aro- 35 maattiset uretaanityyppiset suojaryhmät, kuten bentsylok-sikarbonyyli (Z) sekä substituoidut Z:t, kuten p-kloori- « « t • · 9 i i · • · 5 105013 bentsyloksikarbonyyli, p-nitrobentsyloksikarbonyyli, p-bromibentsyloksikarbonyyli, p-metoksibentsyloksikarbonyy-li; (3) alifaattiset uretaanisuojaryhmät, kuten t-butylok-sikarbonyyli (BOC), di-isopropyylimetoksikarbonyyli, iso-5 propyloksikarbonyyli, etoksikarbonyyli, allyloksikarbonyy-li; (4) sykloalkyyliuretaanityyppiset suojaryhmät, kuten fluorenyylimetyloksikarbonyyli (FMOC), syklopentyloksikar-bonyyli, adaraantyloksikarbonyyli ja sykloheksyloksikarbo-nyyli; sekä (5) tiouretaanityyppiset suojaryhmät, kuten 10 fenyylitiokarbonyyli. BOC on edullinen alfa-aminon suoja-ryhmä, mikäli synteesissä käytetään alfa-aminon suojaryh-mien happokatalysoitua poistoa; kuitenkin FMOC on edullinen synteeseissä, joissa käytetään emäskatalysoitua poistomenetelmää, jolloin voidaan käyttää happolabiilimpia 15 sivuketjun suojarymiä, mukaanlukien t-butyyliesterit tai eetterit sekä myös BOC.

X2 on Thr:n ja Serin hydroksyyliryhmän suojaryhmä ja käytettäessä BOC-menetelmää se valitaan yleensä ryhmästä, joka käsittää asetyylin (Ac), bentsoyylin (Bz), tert-bu-20 tyylin (t-Bu), trifenyylimetyylin (trityl), tetrahydropyr-anyylin, bentsyylieetterin (Bzl) ja 2,6-diklooribentsyylin (DCB). BOC-menetelmässä Bzl on edullinen suojaryhmä ja FMOC-menetelmässä t-Bu. X2 voi olla myös vety, jolloin hyd- * » : ·' roksyyliryhmässä ei ole suojaryhmää.

« 25 X3 on Argin guanidiinoryhmän suojaryhmä, joka väli- • « V.: taan yleensä ryhmästä, joka käsittää nitron, p-tolueeni- | sulfonyylin (Tos), Z:n, adamantyloksykarbonyylin, ja BOC:n, tai se on vety. BOC-menetelmässä Tos on edullinen .‘I*. ja FMOC-menetelmässä 4-metoksi-2,3, 6-trimetyylibentseeni- « 30 sulfonyyli (MTR) tai pentametyylikromaani-6-sulfonyyli .. (PMC).

X4 on vety tai Asnin tai Ginin amidoryhmän suojaryh-;* mä, edullisesti ksantyyli (Xan).

‘X5 on vety tai Aspin tai Gluin 3- tai gamma-karbo-35 nyyliryhmän esterin muodostava suojaryhmä, ja se valitaan . yleensä ryhmästä, johon kuuluvat sykloheksyylin (OChx), 4 I · » 4 I · f • « 105013 6 bentsyylin (OBzl), 2,6-diklooribentsyylin, metyylin, etyylin ja t-butyylin (Ot-Bu) esterit. OChx on edullinen BOC-menetelmässä ja Ot-Bu FMOC-menetelmässä.

X6 on vety tai Lys:n sivuketjun aminosubstituentin 5 suojaryhmä. Esimerkkejä sopivista sivuketjun aminon suoja-ryhmistä ovat Z, 2-klooribentsyloksikarbonyyli (2-C1-Z), Tos, t-amyloksikarbonyyli (Aoc), BOC sekä edellä esitetyt aromaattiset tai alifaattiset uretaanityyppiset suojaryh-mät. 2-C1-Z on edullinen BOC-menetelmässä ja BOC FMOC-me-10 netelmässä.

X7 on vety tai His:n imidatsolitypen suojaryhmä, kuten Tos tai 2,4-dinitrofenyyli (DNP).

Kun ketjussa esiintyy Met, rikki voidaan haluttaessa suojata hapella.

15 Sivuketjun aminon suojaryhmän valinta ei ole rat kaisevaa, ellei sen pidä olla sellainen, ettei sitä poisteta alfa-aminoryhmien suojausta poistettaessa synteesin aikana. Näin ollen alfa-aminon suojarymä ja sivuketjun aminon suojaryhmä eivät voi olla samat.

20 X8 on NH2, suojaryhmä, kuten esteri, tai kiinteäfaa- sisynteesissä kiinteään hartsikantajaan liitettäessä käytetty vahvistettu sidos (anchoring bond), joka kantaja on edullisesti toinen seuraavista: -NH-bentshydryyliamiini 4 · · : ·* (BHA) -hartsikantaja ja -NH-parametyylibentshydryyliamiini 25 (MBHA) -hartsikantaja. Lohkaistaessa BHA- tai MBHA-hart- • · v.: sista CRF-amidianalogi saadaan suoraan. Käyttämällä täi- < I i : ' : laisen hartsin N-metyylijohdannaista voidaan saada aikaan :\j metyylisubstituoitu amidi.

t .'j*. Välituotteen kaavassa vähintään yksi seuraavista on 30 suojaryhmä: X1, X2, X3, X4, X4, X5, X6 ja X7. Kuhunkin R-ryh-mään erityisesti valittu aminohappo määrää, onko edellä määritelty ja yleisesti tekniikan tason mukainen suojaryh-;** mä myös kiinnittyneenä vai ei. Valittaessa peptidien syn- < t * teesissä käytettävää tietyn sivuketjun suojaryhmää nouda- : 35 tetaan seuraavia sääntöjä: (a) suojaryhmän tulee olla sta- . biili reagoivan aineen suhteen sekä reaktio-olosuhteissa, I < I « « 105013 7 jotka on valittu poistettaessa alfa-aminon suojaryhmää kussakin synteesin vaiheessa, (b) suojaryhmän tulee säilyttää suojaavat omineisuutensa eikä se saa hajota liitettäessä vallitsevissa olosuhteissa sekä (c) sivuketjun suo-5 jaryhmä pitää olla poistettavissa halutun aminohapposekvenssin synteesin jälkeen sellaisissa reaktio-olosuhteissa, jotka eivät muuta peptidiketjua.

Y:llä esitetyksi N-pään asyyliryhmäksi ovat edullisia asetyyli, formyyli, akrylyyli ja bentsoyyli. Lisäksi, 10 kuten edellä on esitetty, N-päätä voidaan lyhentää hieman ilman, että se vaikuttaisi merkittävästi biologiseen tehoon.

Tässä esitetään myös menetelmiä yhdisteiden valmistamiseksi, jotka käsittävät (a) peptidivälituotteen muo-15 dostamisen, jolla on vähintään yksi suojaryhmä ja joka on vaatimuksessa 1 esitetyn kaavan mukainen, jossa: X1, X2, X3, X4, X5, X6 ja X7 ovat kukin joko vety tai suojaryhmä, ja X8 on joko suojaryhmä tai hartsikantajan vahvistava sidos tai NH2 ja (b) suojaryhmän tai -ryhmien tai vahvistavan sidok-20 sen poistamisen kyseessä olevasta peptidivälituotteesta sekä (c) näin saadun peptidin muuttamisen haluttaessa sen myrkyttömäksi suolaksi.

Peptidit valmistetaan kemiallisen synteesin avulla ' ·’ edullisesti kiinteäfaasisynteesin avulla, kuten Merri- 25 field, J. Am. Chem. Soc.. 85, s. 2 149 (1964), on kuvan- * · m'm’ nut, vaikkakin voidaan käyttää myös muita edellä mainittu- : ja tekniikan tason mukaisia ekvivalentteja kemiallisia synteesejä. Kiinteäfaasisynteesi aloitetaan peptidin C- • · päästä liittämällä suojattu alfa-aminohappo sopivaan hart-30 siin, kuten Rivier et ai.:n US-patentissa 4 244 946, julkaistu 21.1.1981, on esitetty, joka julkaisu liitetään * '* tähän viitteeksi. Tällainen rCRFanalogien aloitusaine voi- ··* daan valmistaa liittämällä alfa-aminosuojattu Ile BHA- : hartsiin.

35 BOC:n suojaama Ile liitetään BHA-hartsiin metylee- , nikloridin ja dimetyyliformamidin (DMF) avulla. BOC-Ile:n i « « t · · < » ♦ • · 8 105013 liittämisen hartsikantajaan jälkeen alfa-aminon suojaryhmä poistetaan käyttäen metyleenikloridissa olevaa trifluori-etikkahappoa (TFA), TFA:ta yksin tai dioksaanissa olevan HCl:n avulla. Edullisesti käytetään 50 tilavuus-%:a TFA:ta 5 metyleenikloridissa 0-5 paino-%:n 1,2-etaaniditiolin kanssa. Suojauksen poistaminen suoritetaan lämpötilassa, joka on noin 0 °C:n ja huoneenlämpötilan välillä. Alfa-aminon spesifisten suojaryhmien poistamiseksi voidaan käyttää myös muita pilkkovia standardireagensseja sekä -10 olosuhteita, joita on kuvattu Schroderin & Lubken teoksessa "The Peptides", 1 s. 72 - 75 (Academic Press 1955).

Ile:ä suojaavan alfa-aminoryhmän poistamisen jälkeen jäljellä olevat alfa-amino- ja sivuketjusuojatut aminohapot liitetään vaiheittain halutussa järjestyksessä 15 edellä määritellyn välituotteen saamiseksi. Vaihtoehtona sille, että kukin aminohappo lisätään syntetoidessa erikseen, jotkut niistä voidaan liittää toisiinsa ennen niiden lisäämistä kiinteäfaasireaktoriin. Sopivan liittämisrea-genssin valinta kuuluu tekniikan tasoon. Erittäin sopivia 20 liittämisreagensseja ovat N,N'-disykloheksyylikarbodi-imi- : di (DCC) ja N,Nf-di-isopropyylikarbodi-imidi (DICI).

Peptidien kiinteäfaasisynteesissä käytetyt reaktiota aktivoivat aineet ovat peptidialalla hyvin tunnettuja.

: ·* Esimerkkejä tällaisista aktivoivista reagensseista ovat .·.· 25 karbodi-imidit, kuten N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi ja JN-etyyli-N' -(3-dimetyyliaminopropyyli )-karbodi-imidi. Mui-:*·*: ta aktivoivia reagensseja sekä niiden käyttöä peptidien liittämisessä kuvataan Schroderin & Lubken teoksen, yllä, kappaleessa II sekä Kapoorin, J. Phar. Sei.. 59, s. 127 30 (1970), artikkelissa.

Kutakin suojattua aminohappoa tai aminohapposek- 'I* venssiä laitetaan kiinteäfaasireaktoriin noin nelinkertai- ';·* sesti, ja liittäminen tapahtuu dimetyyliformamidi (DMF): CH2C12 (1:1) -alustassa tai pelkästään DMF: ssä tai 35 CH2Cl2:ssa. Tapauksissa, joissa liittäminen tapahtuu manu- .'. aalisesti, liittymisreaktiota valvotaan synteesin kussakin « · · 4 4 ·

« « · I

• • « 9 105013 vaiheessa ninhydriinireaktion avulla, kuten E Kaiser et ai. kuvaa julkaisussa Anal. Biochem. 34, 595 (1970). Niissä tapauksissa, joissa liittyminen on epätäydellistä, liittämisrektio toistetaan ennen alfa-aminon suojaryhmän 5 poistamista, ennen seuraavan aminohapon liittämistä. Liit-tämisreaktiot voidaan suorittaa automaattisesti esimerkiksi automaattisella Beckman 990 -syntetisoijalla käyttäen Rivier et ai.:n. Biopolymers. 1978, 17, s. 1 927 - 1 938, esittämää ohjelmaa.

10 Kun haluttu aminohapposekvenssi on valmis, peptidin saamiseksi aikaan hartsikantoaineesta poistetaan välituo-tepeptidi käsittelemällä sitä reagenssilla, kuten nestemäisellä fluorivedyllä, mikä peptidin poistamisen hartsista lisäksi poistaa myös kaikki jäljellä olevat sivuketju-15 jen suojaryhmät X2, X3, X4, X5, X6 ja X7 sekä alfa-aminon suojaryhmän X1 (jollei se ole asyyliryhmä, jonka tulee olla valmiissa peptidissä). Kun poistoon käytetään fluorivetyä, reaktioastiaan lisätään huuhteluaineiksi anisolia tai kre-solia sekä metyylietyylisulfidia. Kun sekvensseissä esiin-20 tyy Met:a, BOC-suojaryhmä voidaan poistaa trifluorietikka-happo (TFA)/etaaniditiolilla ennen peptidin poistamista hartsista mahdollisen S-alkylaation estämiseksi.

Seuraavassa esimerkissä esitetään edullinen mene- 9 1 • · : 1’ telmä CRF-analogien valmistamiseksi kiinteäfaasitekniikan .:.· 25 avulla.

• ·

Esimerkki I (vertailuesimerkki ) \ [D-Glu20, CML37] :-rCRFrn, jonka kaava on: H-Ser-Glu-

Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg- • · ;' Glu-Val-Leu-D-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln- 4 30 Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Met-Glu-Ile-Ile-NH2, synteesi • •t suoritetaan vaiheittain MBHA-vetykloridihartsissa, jonka ',7. substituoitumisaste on noin 0,1 - 0,5 mmol/g hartsia ja ”1 jota voidaan saada esimerkiksi Bachem, Inc.:sta. Synteesi n,» '· '/· suoritetaan automaattisella Beckman 990B -peptidisynteti- 35 soijalla käyttäen sopivaa ohjelmaa, joka on edullisesti: t · • · · « · · « « · · · 10 105013

Sekoitus- Reagenssit ja toimenpiteet Ajat vaihe (min) 1 C H2Cl2-pesu, 80 ml (2 kertaa) 3 2 Metanoli (MeOH) -pesu, 30 ml 5 (2 kertaa) 3 3 CH2Cl2-pesu, 80 ml (3 kertaa) 3 4 50 % TFA:ta sekä 5 % 1,2-etaani- ditiolia CH2Cl2:ssa, 70 ml (2 kertaa) 12 10 5 Isopropanoli-pesu, 80 ml (2 kertaa) 3 6 12,5 % TEA:a CH2Cl2:ssa, 70 ml (2 kertaa) 5 7 MeOH-pesu, 40 ml (2 kertaa) 2 15 8 CH2Cl2-pesu 80 ml (3 kertaa) 3 9 Boc-aminohappo (10 mmol) 30 ml:ssa joko DMF:ä tai CH2Cl2:a riippuen kyseessä olevan suojatun aminohapon liukoisuudesta (1 kerta), sekä 20 DCCrtä (10 mmol) CH2Cl2:ssa 30 - 300 B0C-Ile:n liittämisen tuloksena Ile:ä substituoituu noin 0,35 mmol grammaa hartsia kohti. Kaikista käytetyistä liuottimista on huolellisesti poistettu kaasu, edullisesti 25 inertin kaasun, esimerkiksi heliumin tai typen, avulla, jotta varmistettaisiin, ettei niissä ole happea, joka voi-si ei-toivotusti hapettaa Met-tähteen rikin.

Suojauksen poiston ja neutraloinnin jälkeen pepti- diketjua rakennetaan hartsissa vaihe vaiheelta. Yleensä • « 30 yhdestä kahteen mmol metyleenikloridissa olevaa BOC-suo- • · *./. jattua aminohappoa grammaa hartsia kohti ja yksi ekviva- • · !.,* lentti metyleenikloridissa olevaa 2-molaarista DCCrtä an- < · 'netaan reagoida kahden tunnin ajan. Kun liitetään BOC-Arg (Tos), käytetään 50 %:n DMF:n ja metyleenikloridin seosta.

r · · 35 Bzlrää käytetään Serrn ja Tyr:n hydroksyylisivuketjun suo- < · m jaryhmänä. P-nitrofenyyliesteriä (ONp) voidaan käyttää »

Asn:n tai Gin:n karboksyylipään aktivoimiseksi; esimerkik- I · '*·, si BOC-Asn (ONp) voidaan liittää yhden yön aikana käyttäen '!* yhtä ekvivalenttia HOBtia 50 %:ssa DMF:n ja metyleeniklo- « · 4 « f « « · « · « · 11 105013 ridin seoksessa. Xan suojaa Asn:n ja Ginin amidoryhmää, kun aktiivisen esterin menetelmän sijasta käytetään DCCin liittämistä. 2-Cl-Z:ä käytetään Lysin sivuketjun suojaryh-mänä. Tosia käytetään suojaamaan Argin guanidiinoryhmää 5 sekä His:n imidatsoliryhmää, ja Gluin tai Asp:n sivuketjun karboksyyliryhmä suojataan OBzlin avulla. Synteesin lopuksi saadaan seuraava koostumus: BOC-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Glu-(OBzl)-Pro-Pro-Ile-Ser(Bzl)-Leu-Asp(OBzl)-Leu-Thr(Bzl)-Phe-His(Tos)-Leu-Leu-Arg(Tos)-Glu(OBzl)-Val-Leu-D-Glu-10 (OBzl)-Met-Ala-Arg(Tos)-Ala-Glu(OBzl)-Gln(Xan) -Leu-Ala-

Gln( Xan) -Gln( Xan) -Ala-His (Tos) -Ser (Bzl) -Asn (Xan) -Arg (Tos) -Lys(2-C1-Z)-CML-Met-Glu(OBzl)-Ile-Ile-hartsikantoaine.Xan on voitu poistaa joko osittain tai kokonaan TFA-käsittelyn avulla, jota käytetään alfa-aminon suojaryhmien poistami-15 seen (deblock).

Näin saadun suojatun peptidihartsin lohkaisemiseksi ja suojauksien poistamiseksi sitä käsitellään 1,5 ml:11a anisolia, 0,5 ml:11a metyylietyylisulfidia sekä 15 ml:11a fluorivetyä (HF) grammaa peptidihartsia kohti, aluksi -20 20 eC:ssa 20 min ajan ja sen jälkeen 0 °C:ssa puolen tunnin ajan. Kun HF on poistettu kunnon vakuumissa, hartsi-peptidi pestään vuorotellen kuivalla dietyylieetterillä ja klo- , . roformilla, ja tämän jälkeen peptidit uutetaan 2 N etikka- • · ; happoliuoksella, josta on poistettu kaasu, ja erotetaan • · 25 suodattamalla hartsista.

.·.1 Peptidi puhdistetaan geelipermeaation avulla ja sen » · : 1,· jälkeen preparatiivisella HPLC:lla kuten ovat kuvanneet /.j Marki et ai.. J. Am. Chem. Soc.. l£ä, 3 178 (1981); Rivier ':1: et ai., i,_Chromatography, 203., 303 - 328 (1984); sekä 30 Hoeger et ai., BioChromatographyf 2, 3, 134 - 142 (1987).

"\ Kromatografiset fraktiot tarkastetaan huolellisesti « «·. HPLCilla, ja ainoastaan sellaiset fraktiot, jotka ovat huomattavan puhtaita, yhdistetään.

I · · i 'Sen tarkistamiseksi, onko saatu juuri tietty sek- · · 35 venssi, rCRF-analogia hydrolysoidaan 9 tunnin ajan : .·. 140 °C:ssa suljetuissa, tyhjäksi imetyissä putkissa, jotka I » « i « · · I « · » · • · 12 105013

sisältävät jatkuvasti kiehuvaa HCl:a, 3 μΐ tioglykolia/ml ja 1 nmol Nlera (sisäisenä standardina). Hydrolysaattien Beckman 121 MB -aminohappoanalysoijalla tehdyn aminohap-poanalyysin mukaan saadaan aminohapposuhteita, jotka var-5 mistavat, että on saatu 41 tähteen peptidirakenne. Esimerkki II

Syntetisoidaan [D-Pro4, D-Phe12, Nle21'38, CML37]-rCRF-peptidi (4-41), jonka kaava on: H-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Ala-10 Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Nle-Glu-Ile-Ile-NH2.

Peptidiä pidetään homogeenisena, kun se on ensin erityisesti käsitelty käänteisfaasi-HPLC:llä (high performance liquid chromatography) käyttäen Watersin HPLC-jär-15 jestelmää, jossa on 0,45 x 25 cm pylväs, joka on pakattu 5 pm C18-piidioksidilla, jonka huokoskoko on 300 A. Käytettävä puskuri A on nestemäinen trietyyliammoniumfosfaatti-liuos (TEAP), jonka pH on 3,0 ja joka sisältää 5 % CH3CN:a; puskuri B on seos, jossa on 20 % TEAP:a, pH 3, ja 80 % 20 asetonitriiliä. Määritysajo suoritetaan huoneenlämpötilassa gradientilla 30 % puskuri B:tä - 60 % puskuri B:tä 30 minuutissa. Virtausnopeus on 2,0 ml minuutissa ja reten-.. tioaika 20,79 min.

Edellä esitetyn menetelmän mukaisesti syntetisoidun * · 25 ja puhdistetun rCRF-peptidin spesifiseksi optiseksi rotaa- 4 · tioksi mitataan Perkin Elmerin polarimetrillä, jonka malli ! .* on 241, [a]22 = -32,9 ± 1,0 (c=l l-%:ssa etikkahapossa). Se « · oli yli 98 %:sti puhdasta.

< * » ! Näin saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi 30 vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 37 tähteen peptidirakenne.

« · · Tämän synteettisen peptidin vaikutukset ACTH:n ja 4 · · β-endorfiinin eritykseen tutkitaan in vitro sekä myös in • ·* YiYO. Synteettisen peptidin tehokkuus stimuloida viljelty- 35 jen rotan aivolisäkesolujen ACTH:n ja β-endorfiinin eri- • tystä mitattiin käyttäen menetelmää, joka on esitetty '411 ·

« » » I

Ί 13 105013 yleisesti julkaisussa Endocrinology. 21, 562 (1972), ja sitä verrattiin synteettiseen oCRF:n. Tämän peptidin noin 170 pikomaolaarisessa konsentraatiossa havaittiin puolet maksimivasteesta, kun saman vasteen saavuttamiseksi syn-5 teettistä oCRF:ä tarvittiin noin 250 pikomolaarinen kon-sentraatio. Tämän peptidin maksimikonsentraatioilla (1 -5 nM) eritysvaste tasaantui noin kaksinkertaiselle tasolle natiiviin hormoniin verrattuna. In vivo -koe suoritetaan käyttäen C. Rivier et al.:n. Sciencef 218, 377 (1982) 10 esittämää menetelmää, jonka mukaan teho säilyy merkittävästi kauemmin kuin CRF-standardin.

Esimerkki III (vertailuesimerkki) [D-Glu20, CML37]-oCRF-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-15 Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2, syntetisoidaan käyttäen samaa menetelmää, joka on esitetty yleisesti esimerkissä I.

Peptidiä pidetään homogeenisena, kun käytetään 20 ohutlevykromatografiaa ja useita erilaisia liuotinsystee- mejä. Erityisesti se käsitellään käänteisfaasi-HPLC:llä (high performance liquid chromatography) käyttäen Watersin HPLC-järjestelmää, jossa on 0,46 x 25 cm pylväs, joka on f ·' pakattu 5 pm C18-piidioksidilla, jonka huokoskoko on 300 A.

’ 25 Näin saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa • · valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saa- • « j ’/· tu 41 tähteen peptidirakenne.

\i Esimerkki IV (vertailuesimerkki)

M M

'!*· Syntetisoidaan [D-Phe12, D-Glu20, CML37]-rCRF-peptidi 30 (3-41), jonka kaava on: H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu- ·, Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Met-Ala-Arg- !!;_ Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML- ".* Met-Glu-Ile-Ile-NH2. Saadun puhdistetun peptidin aminohap- I « 9 poanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa I 1 · :<i#: 35 sen, että on saatu 39 tähteen peptidirakenne. Testaaminen ; /. esimerkissä III esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti • t t « · · · * • » 14 105013 osoittaa, että ACTH:n ja 6-END-LI:n erityksen stimuloinnin lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alenemista.

Esimerkki V (vertailuesimerkki) 5 [D-Glu20, Nle21, CML37] :-oCRF-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Nle-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2/ syntetisoidaan käyttäen samaa menetelmää, joka on esitetty 10 yleisesti esimerkissä I. Saadun puhdistetun peptidin ami-nohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja S-END-LI:n erityksen stimuloinnin 15 lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alenemista.

Esimerkki VI (vertailuesimerkki)

Syntetisoidaan [Asetyyli-Ser1, D-Phe12, Nle21' 3β, CML37]-rCRF-peptidi, jonka kaava on: Ac-Ser-Glu-Glu-Pro- 20 Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-

Leu-Glu-Nle-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-

Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Nle-Glu-Ile-Ile-NH2. Saadun puhdistetun , . peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin ( · '* kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen peptidi- « · . !·* 25 rakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän « « mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja 6-END-LI:n erityksen t · : stimuloinnin lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittä- : vää verenpaineen alenemista.

Esimerkki VII (vertailuesimerkki) 30 [D-Phe12, CML37]-oCRF-peptidi, jonka kaava on: H-Ser- ,···. Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu- 1·’^ Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln- '!* Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2, synte- « « · • tisoidaan käyttäen samaa menetelmää, joka on esitetty

< I I

35 yleisesti esimerkissä I.

t « « i i · « « · i · · · « I « · · « · 15 105013

Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen peptidirakenne.

Esimerkki VIII (vertailuesimerkki) 5 Syntetisoidaan [D-Phe12, D-Ala24, CML37]-rCRF-peptidi (4-41), jonka kaava on: H-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-D-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Met-Glu-Ile-Ile-NH2. Saadun puhdistetun peptidin aminohappoana-10 lyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 38 tähteen peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTHin ja 6-END-LI:n erityksen stimuloinnin lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alenemista.

15 Esimerkki IX (vertailuesimerkki) [D-Phe12, Nle21, CML37]:-oCRF-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Leu-Asp-Ile-Ala-20 NH2, syntetisoidaan käyttäen samaa menetelmää, joka on esitetty yleisesti esimerkissä I. Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja , . varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen peptidirakenne.

4 9 )' Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti

« I

L' 25 osoittaa, että ACTH:n ja 6-END-LI:n erityksen stimuloinnin « · lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpai- i · V neen alenemista.

Esimerkki X (vertailuesimerkki) '·1: Syntetisoidaan [Formyyli-Ser1, D-Phe12, Nle21,38, D- 30 His32, CML37]-rCRF-peptidi, jonka kaava on: For-Ser-Glu-Glu- • · , Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu- • < ·\ Val-Leu-Glu-Nle-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-D-

His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Nle-Glu-Ile-Ile-NH2. Saadunpuhdis- • · tetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun pep- « i · 35 tidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen ,·. peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen mene- « · • « · > i k · • « 16 105013 telmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja β-END-LI:n erityksen stimuloinnin lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alenemista.

Esimerkki XI (vertailuesimerkki) 5 [D-Ala24, CML37]-oCRF-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-

Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-D-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2, syntetisoidaan käyttäen samaa menetelmää, joka on esitetty 10 yleisesti esimerkissä I.

Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen peptidirakenne.

Esimerkki XII (vertailuesimerkki) 15 Syntetisoidaan [pGlu2, D-Phe12, D-Ala24, CML37]-rCRF- peptidi (2-41), jonka kaava on: pGlu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-D-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Met-Glu-Ile-Ile-NH2. Saadun puhdistetun peptidin 20 aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 40 tähteen peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja β-END-LI:n erityksen stimuloinnin I f lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpai-

I I

25 neen alenemista.

i i ,V Esimerkki XIII (vertailuesimerkki) '•’i [D-Glu20, D-Ala24, Nle21·38, CML37]-oCRF-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr- » · ‘ ·’: Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Nle-Thr-Lys-D-Ala- ( 30 Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Nle- "·, Asp-Ile-Ala-NH2, syntetisoidaan käyttäen samaa menetelmää, !"t joka on esitetty yleisesti esimerkissä I. Saadun puhdis- ",1 tetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun pep- i < : tidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen < i < -iit1. 35 peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen mene- ; telmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja β-END-LI:n eri- · « «li ·

IM I I I

17 105013 tyksen stimuloinnin lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alenemista.

Esimerkki XIV

Syntetisoidaan [Bentsoyyli-Ser7, D-Phe12, Nle21'38, D-5 His32, CML37]-rCRF-peptidi, jonka kaava on: Bz-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-D-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Nle-Glu-Ile-Ile-NH2. Saadun puhdistetun peptidin aminohap-poanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa 10 sen, että on saatu 41 tähteen peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja B-END-LI:n erityksen stimuloinnin lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alenemista.

15 Esimerkki XV (vertailuesimerkki) [D-His32, CML37]-oCRF-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-D-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2, syn-20 tetisoidaan käyttäen samaa menetelmää, joka on esitetty yleisesti esimerkissä I.

Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen peptidirakenne.

' ! 25 Esimerkki XVI

Syntetisoidaan [D-Phe12, D-Glu20, D-Ala24, D-His32, CML37]-rCRF-peptidi (6-41), jonka kaava on: H-Ile-Ser-Leu-: .1 Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Met- • a

Ala-Arg-D-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-D-His-Ser-Asn- · m ’ 30 Arg-Lys-CML-Met-Glu-Ile-Ile-NH2. Saadun puhdistetun pepti din aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ' ja varmistaa sen, että on saatu 36 tähteen peptidirakenne.

• · ·

Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti ' ti't osoittaa, että ACTH:n ja β-END-LI :n erityksen stimuloinnin ta# ! ·' 35 lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpai- ·...1 neen alenemista.

» · • a · • · · · · 18 105013

Esimerkki XVII (vertailuesimerkki) [D-Glu20, Nle21, D-His32, CML37] -oCRF-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-

Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Nle-Thr-Lys-Ala-Asp-5 Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-D-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2, syntetisoidaan käyttäen samaa menetelmää, joka on esitetty yleisesti esimerkissä I. Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen peptidi-10 rakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja B-END-LI:n erityksen stimuloinnin lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alenemista.

Esimerkki XVIII (vertailuesimerkki) 15 Syntetisoidaan [Akrylyyli-Glu2, D-Phe12, Nle21' 3e, D-

His32, CML37]-rCRF-peptidi (2-41), jonka kaava on: Acr-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-D-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Nle-Glu-Ile-Ile-NH2. Saadun 20 puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 40 tähteen peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja S-END-LI:n eri-.V. tyksen lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää 25 verenpaineen alenemista.

• I

Esimerkki XIX (vertailuesimerkki) • · · **** Syntetisoidaan [D-Phe11, D-Glu19, Ala20, Arg21, Glu28, • · · ! CML37] :-sauvagiini(sauvagine)-peptidi, jonka kaava on: *. 1i pGlu-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-D-Phe-Glu-Leu-

«M

V 2 30 Leu-Arg-Lys-Met-Ile-D-Glu-Ala-Arg-Lys-Gln-Glu-Lys-Glu-Lys-

Glu-Gln-Ala-Ala-Asn-Asn-Arg-Leu-CML-Leu-Asp-Ile-Ile-NH2.

:3: Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa vai- • · · mistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu t < r 40 tähteen peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn «41 35 yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja S- « · • « · · • · · 2 * « · 3 • · · · 19 105013 END-LI: n erityksen stimuloinnin lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alenemista.

Esimerkki XX (vertailuesimerkki)

Syntetisoidaan [Nle18,21, D-Glu20, D-His32, CML37]-AHC-5 peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-

Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-D-Glu-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-D-His-Leu-Asn-Arg-Leu-CML-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja 10 varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTHin ja β-END-LI:n erityksen lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alenemista.

15 Esimerkki XXI (vertailuesimerkki)

Syntetisoidaan [D-Pro4, D-Phe12, Nle18'21, Ile33, Asn36, CML37]:-AHC-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-20 Ile-Asn-Arg-Asn-CML-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja 6-END-LI:n erityksen 25 lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpai- 'r"f neen alenemista.

• · ·

Esimerkki XXII (vertailuesimerkki) i *·** Syntetisoidaan [D-Tyr3, Nle18, Nva21, D-Glu20, D-Ala24, • · ·.’·: CML37]-AHC-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-D-Tyr-Pro- • · · · 30 Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-

Leu-D-Glu-Nva-Ala-Lys-D-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-' Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-CML-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Saadun puhdis- .··*. tetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun pep- «Il tidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen : 35 peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen mene- telmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja β-END-LI:n eri- 20 105013 tyksen lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alenemista.

Esimerkki XXIII (vertailuesimerkki)

Syntetisoidaan [Glu2' 13, 22, D-Phe12, Nle18, Orn23, 5 CML37]-AHC-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-Glu-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Met-Glu-Orn-Ala-Glu-Lys-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-CML-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin 10 kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen pepti- dirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja B-END-LI:n erityksen stimuloinnin lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alenemista.

15 Esimerkki XXIV (vertailuesimerkki)

Syntetisoidaan synteettinen [D-Phe12, Glu13, Ile21, Lys36, CML37, Vai41]-AHC-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-Glu-Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-20 Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Lys-CML-Leu-Glu-Glu-Val-NH2. Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja B-END-LI:n eri-25 tyksen stimuloinnin lisäksi se saa aikaan myös erittäin ; merkittävää verenpaineen alenemista.

• · · ***** Esimerkki XXV (vertailuesimerkki) • · · : Synteettinen [D-Phe12, D-Glu20, Arg21, CML37]-AHC-pep- • · tidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu- • · · ; 30 Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-D-Glu-Arg-

Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg- :***: Leu-CML-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2 syntetisoidaan käyttäen samaa • · · .1". menetelmää, joka on esitetty yleisesti esimerkissä I. Saa- « · dun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmis-·' ·1 35 tetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 ’...· tähteen peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn ylei- • · • · « • « · * · « · » 105013 21 sen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja β-END-LI:n erityksen stimuloinnin lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alenemista.

Esimerkki XXVI (vertailuesimerkki) 5 Syntetisoidaan [D-Phe12, Nle18,21, D-Ala24, CML37]-AHC- peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-

Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Ala-Lys-D-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-CML-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Saadun puhdistetun peptidin 10 aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja β-END-LIin erityksen lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alene-15 mistä.

Esimerkki XXVII (vertailuesimerkki)

Syntetisoidaan [D-Glu20, Nle21, CML37] -oCRF-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-Nle-Thr-Lys-Ala-20 Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Leu-

Asp-Ile-Ala-NH2 käyttäen samaa menetelmää, joka on esitetty yleisesti esimerkissä I. Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja var-mistaa sen, että on saatu 41 tähteen peptidirakenne. Tes-. 25 taaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja B-END-LI:n erityksen stimuloinnin .1 lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpai- • · · • ·" neen alenemista.

• · '· " Esimerkki XXVIII (vertailuesimerkki) • ·· : 30 Syntetisoidaan [D-Phe12, Nle21’38, CML37]-oCRF-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-

Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Thr-Lys-Ala- ;***: Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Nle- • « ·

Asp-Ile-Ala-NH, käyttäen samaa menetelmää, joka on esitetty • ♦ · Ä ·„; 35 yleisesti esimerkissä I. Saadun puhdistetun peptidin ami- • '···’ nohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja var- • « 22 105013 mistaa sen, että on saatu 41 tähteen peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja fi-END-LI:n erityksen stimuloinnin lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpai-5 neen alenemista.

Esimerkki XXIX (vertailuesimerkki)

Syntetisoidaan [D-Glu20, Nle21' 38, D-His32, CML37] -oCRF-peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-D-Glu-10 Nle-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-D-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Nle-Asp-Ile-Ala-NH2 käyttäen samaa menetelmää, joka on esitetty yleisesti esimerkissä I. Saadun puhdistetun peptidin aminohappoanalyysi vastaa valmistetun peptidin kaavaa ja varmistaa sen, että on saatu 41 tähteen 15 peptidirakenne. Testaaminen edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti osoittaa, että ACTH:n ja 6-END-LI:n erityksen stimuloinnin lisäksi se saa aikaan myös erittäin merkittävää verenpaineen alenemista.

CRF stimuloi täysin aivolisäke-lisämunuaisen kuori 20 -akselia, ja CRF-analogien pitäisi olla käyttökelpoisia tämän akselin toimintojen stimuloijana tietyn tyyppisillä potilailla, joiden glukokortikoidin tuotanto on alhainen. CRF:n pitäisi olla käyttökelpoinen esimerkiksi sellaisten potilaiden aivolisäkkeen ja lisämunuaisten toiminnan pa- • * , ,·, 25 lauttamiseksi, jotka ovat saaneet eksogeenistä glukokorti- « « · koiditerapiaa ja joiden aivolisäkkeen ja lisämunuaisen • · · ,1 t kuoren toiminnat ovat olleet vajavaisia.

• · · \ \ Useimpien muiden säätelypeptidien on havaittu vai- • · · '· ” kuttavan keskushermostoon sekä mahalaukun ja suoliston * * * * 30 alueeseen. Koska ACTH:n ja B-END:n eritys on nisäkkäillä stressin vasteen välttämätön edellytys ("sine qua non"), :***: ei ollut yllättävää, että CRF:llä on merkittäviä vaikutuk- ··· siä aivoihin ruumiin stressivasteen välittäjänä. CRF näyt- • « « tää esimerkiksi lisäävän aivoissa hengitysnopeutta ja se 35 voi olla käyttökelpoinen hengitysva j auksen hoidossa.

'···' CRF:ää voidaan myös mahdollisesti soveltaa normaalien ja • · • · m « » i « • · 105013 .

23 henkisesti häiriytyneiden yksilöiden mielialan, oppimisen ja käyttäytymisen muuttamiseen. Koska CRF-analogit nostavat ACTH:n, B-END:n, β-lipotropiinin, pro-opiomelano-kortiinin muiden geenituotteiden ja kortikosteronin tasoa, 5 sen antamisen avulla voidaan indusoida niiden vaikutusta aivoissa ja niiden ympäristössä, vaikuttaen näin muistiin, mielialaan, kivunsietokykyyn jne. ja erityisemmin valppauteen, masentuneisuuteen ja tuskaisuuteen. Kun CRFrää annetaan esimerkiksi kammioihin (ventricles), se lisää hiirten 10 aktiivisuutta ja kehittää oppimiskykyä ja voi näin toimia luonnollisena piristeenä.

CRF-analogeilla voisi olla käyttöä myös nisäkkäiden, erityisesti ihmisen ja muiden nisäkkäiden, verenvirtauksen lisäämiseksi suoliston ja mahalaukun alueella.

15 Kaikkien CRF:n sukuisten peptidien on havaittu vaikuttavan suoliliepeen verisuoniverkostoon. oCRF estää myös mahahapon tuotantoa, ja CRF-analogien odotetaan olevan tehokkaita myös mahahaavojen hoidossa vähentämällä mahahapon tuotantoa ja/tai inhiboimalla nisäkkään mahalaukkuun ja suo-20 listoon liittyviä toimia.

CRF-analogeja tai niiden myrkyttömiä additiosuoloja yhdistettynä farmaseuttisesti tai eläinlääkinnällisesti hyväksyttävään kantajaan farmaseuttisen koostumuksen muo-dostamiseksi voidaan antaa nisäkkäille, ihminen mukaan I ( , ,·, 25 lukien, joko suonensisäisesti, ihonalaisesti, lihaksensi- < < t säisesti, ihon kautta, esimerkiksi nenän kautta, aivosel- • · · keytimen kautta tai suun kautta. Peptidien pitää olla yli • · · *. \ 90-%:sen puhtaita ja niiden puhtaus tulisi olla edullises- • · · *· ti vähintään noin 98 %; kuitenkin vähemmän puhtaat ovat • « · 1 *.· 1 30 tehokkaita ja niitä voidaan hyvin käyttää muihin nisäk käisiin paitsi ihmisiin. Tämä puhtaus tarkoittaa, että ko. peptidi muodostaa esitetyn painoprosentin kaikista läsnä olevista peptideistä ja peptidifragmenteista. Lääkäri voi • · · suorittaa sen antamisen ihmiselle verenpaineen alentami- '.,1 35 seksi tai endogeenisen glukokortikoidituotannon stimuloi- • ·

«M

• « · • · · • » · 24 105013 miseksi. Vaadittava annos vaihtelee hoidettavan sairauden, tilan vakavuuden ja halutun käsittelyn keston mukaan.

Näitä peptideitä voidaan käyttää myös hypotalamisen aivolisäkkeen adrenaliinitoiminnan arvioimiseksi nisäk-5 käillä, joilla epäillään endokriinista tai keskushermoston patologiaa, antamalla niitä sopivasti ja sen jälkeen tarkkaillen ruumiintoimintoja. Antamista voidaan käyttää esimerkiksi diagnostisena apuvälineenä Cushingin taudin ja mielialahäiriöiden, kuten sairaalloisen masennuksen, ha-10 vaitsemisessa.

Tällaiset peptidit annetaan usein farmaseuttisesti tai eläinlääkinnällisesti hyväksyttävässä muodossa myrkyttöminä suoloina, kuten additiosuoloina tai metallikomplek-seina, joissa on esim. sinkkiä, rautaa, kalsiumia, barium-15 ia, magnesiumia, alumiinia tms. (joiden katsotaan kuuluvan tämän hakemuksen tarkoituksiin additiosuoloina). Esimerkkejä tällaisista happoadditiosuoloista ovat vetykloridi, vetybromidi, sulfaatti, fosfaatti, tannaatti, oksalaatti, fumaraatti, glukonaatti, alginaatti, maleaatti, asetaatti, 20 sitraatti, bentsoaatti, sukkinaatti, malaatti, askorbaat-ti, tartraatti tms. Mikäli aktiivinen ainesosa annetaan tablettien muodossa, tabletti voi sisältää sideaineen, kuten traganttikumia, maissitärkkelystä tai gelatiinia; hajottavaa ainetta, kuten algiinihappoa; sekä voiteluai-, 25 netta, kuten magnesiumstearaattia. Jos haluttu antomuoto • 4 · on neste, voidaan käyttää makeutus- ja/tai flavoriaineita, • « · .*I ja kun antomuoto on suonensisäinen, isotonisessa suolaliu- • · · ·. \ oksessa voidaan käyttää fosfaattipuskuria tms.

• · · *· ” Peptideitä pitäisi antaa lääkärin ohjauksessa, ja ··· '.* * 30 farmaseuttiset koostumukset sisältävät yleensä peptidin yhdessä konventionaalisen, farmaseuttisesti tai eläinlää- • * · kinnällisesti hyväksyttävän kantajan kanssa. Yleensä annos on noin 1 - noin 200 mikrogrammaa peptidiä isäntäeläimen «aa kilogrammaa kohti. Joissakin tapauksissa kohteita voidaan • · *..* 35 käsitellä näillä peptideillä ACTH:n tai kortikosteroidien antamisen asemesta, tällaisissa tapauksissa voidaan käyt- a a a « a • aa a I « a a • a 25 105013 tää niinkin alhaista annosta kuin noin 10 ng/kg. Tässä käytettynä kaikki lämpötilat ovat yksikössä °C ja kaikki suhteet ovat tilavuussuhteita. Nestemäisten aineiden prosentit ovat myös tilavuusprosentteja.

5 Vaikka keksintö on kuvattu ottaen huomioon sen edulliset suoritusmuodot, jotka muodostavat tällä hetkellä keksijöiden parhaiten tunteman muodon, tulee ymmärtää, että voidaan tehdä erilaisia muutoksia ja modifikaatioita, jotka ovat alan ammattimiehelle ilmeisiä, ilman, että poi-10 ketään tähän liitetyissä vaatimuksissa esitetyn keksinnön piiristä. CRF-peptidiin voidaan esimerkiksi tehdä eri paikkoihin substituutioita ja modifikaatioita nykyisen ja tulevien kehitysten mukaan ilman, että analogien teho vähenee. On ilmeisen tärkeää, että aminohapposekvenssi noin 15 asemasta 7 asemaan 41 tai niiden ekvivalentit ovat synteettisessä peptidissä, kun taas loput molekyylistä ei ole ilmeisesti yhtä ratkaiseva. Esimerkiksi C-pään yksinkertaisen amidin sijasta siihen voidaan liittää alemmalla alkyylillä substituoitu amidi, esim. metyyliamidi, etyyli-20 amidi jne. Samoin N-päähän voidaan sisällyttää yhdestä kymmeneen lisäaminohappotähdettä ilman, että vaikutettaisiin haitallisesti biologiseen tehoon.

« <

( I I « I

( « I I T » I « 1 t f • · · • · · • · • · · • · · • · 9 9 9 9 9 9 9 9 M • · • · · • · · • · · • · · -9 9 9 9 99 9 999 9 9 « ·

IM

· · • « • · · • 1 • · « « · • · • » · • · « • > · · | » i I • · 105013 27 H-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-

Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-

Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Nle-Glu-Ile-Ile-NH2.

t 1

III

• ( < · < « « « · < < « • · · • · · • · • · · • · · • · • · • · • · · • · • 1 ··· • · · • · · • · · • · • • · · • · · • · • · • · · « · 1 t · • · * » 1 • · · · • · · • · » ·

Claims (5)

26 105013

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin tai sen myrkyttömän suolan valmistamiseksi, jolla pep-5 ti-dillä on kaava: Y-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-R20-Nle-R22-R23-R24-R25-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-R32-Ser-Asn-Arg-Lys-CML-Nle-R39-Ile-R41-NH2, jossa Y on asyyliryhmä, jossa on korkeintaan 7 hiiliatomia, tai 10 vety; R20 on Glu tai D-Glu; R22 on Ala tai Thr; R23 on Arg tai Lys; R24 on Ala tai D-Ala; R25 on Glu tai Asp; R32 on His tai D-His; R39 on Glu tai Asp; R41 on Ile tai Ala; tunnettu siitä, että menetelmä käsittää (a) pepti-divälituotteen muodostamisen, jolla on vähintään yksi suo-15 jaryhmä ja jonka kaava on: X1-D-Pro-Pro-Ile-Ser(X2)-Leu-Asp(X5)-Leu-Thr(X2)-D-Phe-His (X7) -Leu-Leu-Arg (X3) -Glu( X5) -Val-Leu-R20( X5) -Nle-R22(X2)-R23(X3 tai X6)-R24-R25(X5)-Gln(X4)-Leu-Ala-Gln(X4)-Gln( X4 ) -Ala-R32( X7 ) -Ser (X2) -Asn( X4 ) -Arg( X3) -Lys( X6) -CML-Nle-20 R39(X5)-lle-R41-X8 tai sen N-päästä lyhennetty muoto, jossa X1, X2, X3, X4, X5, X6 ja X7 ovat kukin joko vety tai suoja-ryhmä, ja X8 on joko suojaryhmä tai hartsikantajaan yhdistävä sidos tai NH2; (b) suojaryhmän tai -ryhmien tai yhdis-tävän sidoksen poistamisen peptidivälituotteesta; ja (c) • « , 25 näin saadun peptidin muuttamisen haluttaessa sen myrkyttö- • · !" mäksi suolaksi. • · · • · · .11

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- • * · \ \ n e t t u siitä, että R22 on Ala, R23 on Arg, R25 on Glu, R39 • · · *· on Glu ja R.. on Ile. ’ 30

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R20 on D-Glu.

: : 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- n e t t u siitä, että R22 on Thr, R23 on Lys, R25 on Asp, R39 on Asp ja R41 on Ala. • «

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- ’·;·* n e t t u siitä, että valmistetaan peptidi, jolla on : : : kaava • I · · * « · 28 105013