KR20040065212A - 건조안 및 건조안과 연관된 질환의 치료제 - Google Patents

건조안 및 건조안과 연관된 질환의 치료제 Download PDF

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KR20040065212A KR10-2004-7006854A KR20047006854A KR20040065212A KR 20040065212 A KR20040065212 A KR 20040065212A KR 20047006854 A KR20047006854 A KR 20047006854A KR 20040065212 A KR20040065212 A KR 20040065212A
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후지이아쯔꼬
요시다유꾸오
오노우에사또미
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센주 세이야꾸 가부시키가이샤
이또함 가부시키가이샤
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Abstract

활성 성분으로서 하기 화학식 I 로 나타내는 펩티드 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 건조안 및 건조안과 연관된 질환의 치료제:
[화학식 I]
H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-X1-Gln-X2-Ala-Val-X3-X4-Tyr-Leu-X5-X6
(식 중, X1, X3및 X4는 각각 Lys 또는 Arg 을 나타내며; X2는 Met, Leu 또는 nLeu 을 나타내고; X5는 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합, Gly 등을 나타냄) 을 나타내고; X6은 -OH 또는 -NH2를 나타낸다).

Description

건조안 및 건조안과 연관된 질환의 치료제 {REMEDIES FOR DRY EYE AND DISEASES ASSOCIATED WITH DRY EYE}
눈물은 정상적 시각 기능의 유지에 중요한 역할을 담당한다. 눈물은 각막 및 결막의 표면을 덮어서 이들의 습윤성을 유지시키며, 동시에 눈물은 각막 표면 상의 미융으로 인해 하중을 채워서 표면을 부드럽게 만들고, 이에 따라 깨끗한 영상을 수득할 수 있게 된다. 또한, 각막 및 결막의 상피 세포는 세포 성분을 활발히 대사시켜, 불필요한 세포 및 대사물질이 최표면으로부터 탈착 및 배출되고, 눈물은 이들을 세척 제거할 뿐만 아니라 필요한 산소 및 영양분을 보충해준다. 또한, 눈물은 각막 및 결막의 표면 상에 침입하는 외부 물질을 세척 제거하며, 눈물의 정균 작용으로 인해 외부로부터 침입하는 바이러스, 박테리아 및 진균에 대한 감염의 방어에 역할을 담당한다. 또한, 눈물은 눈꺼풀과 각막 및 결막 사이에 활액으로 작용하여 깜빡거림과 안구 운동이 부드럽게 수행된다. 즉, 눈물은 각막 및 결막 표면 상에 매우 얇은 필름을 형성하는 소량의 플루이드로서, 다양하고 정교한 기전에 의해 각막의 투명성 및 항상성 유지에 필수적이다.
눈물의 분비 장애가 각막 및 결막 표면 상에 이상을 야기하는 상태를 일반적으로 건조안으로 부른다. 건조안으로 인해 각막 및 결막의 장애가 야기되는 경우, 인공 눈물의 보충, 눈으로 히알루론산과 같은 고습 보유 점탄성 물질의 점적, 및 눈 표면을 젖도록 유지시키고 건조 증상을 완화시키기 위한 건조안 안경의 이용이 수행된다. 그러나, 상기 증상 치료 방법에 의해 증상은 완화될 수 있지만, 이들 치료 방법은 근본적 치료를 위한 병인론적 방법이 아니다. 눈물은 상술된 바와 같은 이들의 자연적 기능에 의해 건조안으로 인한 각막 및 결막 장애의 치료에 효과를 가지는 것으로 여겨지므로, 눈물샘에 직접 작용하여 눈물 분비를 촉진하는 화합물은 건조안 및 건조안과 연관된 질환에 대한 유용한 치료제로 기대된다.
눈물샘은 부교감 신경 및 교감 신경에 의해 조절되며, 전자가 우세하다. 부교감 신경은 아세틸콜린 및 VIP (Vasoactive Intestinal Peptide, 혈관작용성 장 펩티드) 를 분비한다. 반면에, 교감 신경은 노르에피네프린 및 신경펩티드 Y 를 분비한다. 아세틸콜린, 노르에피네프린 및 VIP 는 주로 눈물샘을 자극한다 (Dartt DA 등, Adv Eep Med Biol 438: 113-121, 1998). 아세틸콜린은 무스카린성 콜린성 경로를 활성화시키며, 또한 눈물 분비에 관여하는 것으로 나타난다 (Nakamura M 등, Curr Eye Res 16: 614-619, 1997). 노르에피네프린은 아드레날린 α및 β수용체에 결합하는 교감신경성 아민으로, α1아드레날린 수용체를 통해 눈물 단백질을 분비한다 (Dartt DA, Curr Eye Res 8:619-636, 1989). VIP 는 소화관 및 혈관의 평활근을 이완시키는 다양한 생물학적 활성을 갖는 펩티드로서, 상기 VIP 에 대한 수용체는 눈물샘에 존재하며 (Hodges RR 등, InvestOphthalmol Vis Sci 38:610-619, 1997), 실제로 눈물샘으로부터 단백질의 분비를 촉진하는 (Dartt DA 등, Am J Physiol 247:G502-509, 1984) 것으로 보고되어 있다.
상술된 바와 같이, 눈물샘 중 무스카린, 노르에피네프린 또는 VIP 수용체의 존재, 나아가 눈물 분비에 있어서의 관여가 나타나 있다. 그러나, 현재, 상기 생리 활성 성분들은 눈물 분비 촉진 활성에 근거하여 건조안의 예방제 또는 치료제로서 아직까지 실용화되어 있지 않다. VIP 에 관하여, U.S. 특허 4,745,100 에는 국소 투여에 의한 눈물 분비의 촉진 방법이 개시되어 있지만, 여기에는 VIP 유도체에 대해 구체적으로 기재되어 있지 않다. 또한, VIP 유도체와 같은, 우수한 기관지확장 활성 및 소화관 운동 억제 활성을 나타내는 펩티드가 JP-A 8-333276 및 JP-A 2001-151799 에 각각 개시되어 있지만, 상기 공보에는 눈물 분비 및 건조안에 대해서는 기재되어 있지 않다.
본 발명은 건조안 및 건조안과 연관된 질환의 치료제에 관한 것이다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 눈물 분비의 촉진에 의해 건조안 및 건조안과 연관된 질환의 치료제를 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명자들은 VIP 가 보유하는 눈물 분비 촉진 활성에 주의를 기울여 집중적으로 연구한 결과, JP-A 8-333276 및 JP-A 2001-151799 에 나타낸 VIP 유도체가 우수한 눈물 분비 촉진 활성을 갖는 것을 발견하였다. 이들은 추가 연구를 수행하여, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 하기를 제공한다:
(1) 하기 화학식 I 로 나타내는 펩티드 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 건조안 또는 건조안과 연관된 질환의 치료제:
H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-X1-Gln-X2-Ala-Val-X3-X4-Tyr-Leu-X5-X6
(식 중, X1, X3및 X4는 각각 Lys 또는 Arg 을 나타내며; X2는 Met, Leu 또는 nLeu 을 나타내고; X5는 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합, Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 를 나타냄) 을 나타내고; X6은 -OH 또는 -NH2를 나타내며, 단, X1, X3및 X4가 Lys 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 화학 결합이고, X6이 -NH2인 경우, X2는 Leu 또는 nLeu 를 나타낸다);
(2) 상기 1 에 있어서, 화학식 I 중 X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 인 치료제;
(3) 상기 1 에 있어서, 화학식 I 중 X5가 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합임) 인 치료제;
(4) 상기 1 에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Arg 이며, X2가 Leu 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly-Arg-Arg 이고, X6이 -NH2인 치료제;
(5) 상기 1 에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Lys 이며, X2가 Leu 이고, X5가 화학 결합이고, X6이 -NH2인 치료제;
(6) 상기 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 눈에 국소 투여되는 제제인 치료제;
(7) 상기 6 에 있어서, 눈에 국소 투여되는 제제가 점안제인 치료제;
(8) 하기 화학식 I 로 나타내는 펩티드 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 건조안 또는 건조안과 연관된 질환 치료용 약학 조성물:
[화학식 I]
H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-X1-Gln-X2-Ala-Val-X3-X4-Tyr-Leu-X5-X6
(식 중, X1, X3및 X4는 각각 Lys 또는 Arg 을 나타내며; X2는 Met, Leu 또는 nLeu 을 나타내고; X5는 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합, Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 를 나타냄) 을 나타내고; X6은 -OH 또는 -NH2를 나타내며, 단, X1, X3및 X4가 Lys 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 화학 결합이고, X6이 -NH2인 경우, X2는 Leu 또는 nLeu 를 나타낸다);
(9) 상기 8 에 있어서, 화학식 I 중 X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 인 약학 조성물;
(10) 상기 8 에 있어서, 화학식 I 중 X5가 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합임) 인 약학 조성물;
(11) 상기 8 에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Arg 이며, X2가 Leu 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly-Arg-Arg 이고, X6이 -NH2인 약학 조성물;
(12) 상기 8 에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Lys 이며, X2가 Leu 이고, X5가 화학 결합이고, X6이 -NH2인 약학 조성물;
(13) 상기 8 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 눈에 국소 투여되는 조성물인 약학 조성물;
(14) 상기 13 에 있어서, 눈에 국소 투여되는 조성물이 점안제인 약학 조성물;
(15) 건조안 또는 건조안과 연관된 질환 치료용 약제의 제조를 위한, 하기 화학식 I 로 나타내는 펩티드 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 용도:
[화학식 I]
H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-X1-Gln-X2-Ala-Val-X3-X4-Tyr-Leu-X5-X6
(식 중, X1, X3및 X4는 각각 Lys 또는 Arg 을 나타내며; X2는 Met, Leu 또는 nLeu 을 나타내고; X5는 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합, Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 를 나타냄) 을 나타내고; X6은 -OH 또는 -NH2를 나타내며, 단, X1, X3및 X4가 Lys 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 화학 결합이고, X6이 -NH2인 경우, X2는 Leu 또는 nLeu 를 나타낸다);
(16) 상기 15 에 있어서, 화학식 I 중 X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 인 용도;
(17) 상기 15 에 있어서, 화학식 I 중 X5가 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합임) 인 용도;
(18) 상기 15 에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Arg 이며, X2가 Leu 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly-Arg-Arg 이고, X6이 -NH2인 용도;
(19) 상기 15 에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Lys 이며, X2가 Leu 이고, X5가 화학 결합이고, X6이 -NH2인 용도;
(20) 상기 15 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 약제가 눈에 국소 투여되는 약제인 용도;
(21) 상기 20 에 있어서, 눈에 국소 투여되는 약제가 점안제인 용도;
(22) 건조안 또는 건조안과 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 온혈 동물에게 하기 화학식 I 로 나타내는 펩티드 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 건조안 또는 건조안과 연관된 질환의 치료 방법:
[화학식 I]
H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-X1-Gln-X2-Ala-Val-X3-X4-Tyr-Leu-X5-X6
(식 중, X1, X3및 X4는 각각 Lys 또는 Arg 을 나타내며; X2는 Met, Leu 또는 nLeu 을 나타내고; X5는 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합, Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 를 나타냄) 을 나타내고; X6은 -OH 또는 -NH2를 나타내며, 단, X1, X3및 X4가 Lys 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 화학 결합이고, X6이 -NH2인 경우, X2는 Leu 또는 nLeu 를 나타낸다);
(23) 상기 22 에 있어서, 화학식 I 중 X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 인 방법;
(24) 상기 22 에 있어서, 화학식 I 중 X5가 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합임) 인 방법;
(25) 상기 22 에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Arg 이며, X2가 Leu 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly-Arg-Arg 이고, X6이 -NH2인 방법; 및
(26) 상기 22 에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Lys 이며, X2가 Leu 이고, X5가 화학 결합이고, X6이 -NH2인 방법.
도면의 간단한 설명
도 1 은 VIP, 펩티드 5 또는 펩티드 15 가 눈물샘과 반응되는 경우, 토끼의 단리된 눈물샘으로부터의 단백질 분비율을 나타낸다.
도 2 는 VIP 또는 펩티드 5 가 토끼의 눈에 단회 적용되는 경우, 시간에 따른 눈물 분비량의 증분 (Schirmer 값) 을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 건조안 및 건조안과 연관된 질환의 치료에 사용되는 VIP 유도체는 화학식 I 로 나타내는 펩티드이며, X1, X3및 X4는 Lys 또는 Arg 이다. X2는 Met, Leu 또는 nLeu, 바람직하게는 Leu 이다. X5는 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7, 바람직하게는 화학 결합 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7일 수 있다. X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7인 경우, X7은 화학 결합, Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg, 가장 바람직하게는 Gly-Arg-Arg 이다. X6은 -OH 또는 -NH2, 보다 바람직하게는 -NH2이다.
본 발명의 화학식 I 로 나타내는 VIP 유도체의 대표예에는 표 1 의 펩티드 1 내지 25 (각각 펩티드 1 내지 25 로 불림) 등이 포함된다. 이들은 이후 서열 목록에서 서열 번호 1 내지 25 에 해당하는 펩티드이다. 특히, 펩티드 5 및 펩티드 15 가 유리하게 사용된다.
펩티드 1 내지 25 (서열 목록에 나타낸 서열 번호 1 내지 25 에 해당)
H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-X1-Gln-X2-Ala-Val-X3-X4-Tyr-Leu-X5(-X7)-X6(I)
펩티드 X1 X２ X３ X４ X５ X７ X６ *
1 Arg Leu Arg Arg Asn-Ser-Ile-Leu-Asn Gly -NH2
2 Arg Leu Arg Arg Asn-Ser-Ile-Leu-Asn Gly-Lys -NH2
3 Arg Leu Arg Arg Asn-Ser-Ile-Leu-Asn Gly-Arg -NH2
4 Arg Leu Arg Arg Asn-Ser-Ile-Leu-Asn Gly-Lys-Arg -NH2
5 Arg Leu Arg Arg Asn-Ser-Ile-Leu-Asn Gly-Arg-Arg -NH2
6 Arg Leu Arg Arg Asn-Ser-Ile-Leu-Asn Gly-Lys-Arg -OH
7 Lys Met Lys Lys Asn-Ser-Ile-Leu-Asn -OH
8 Lys Met Lys Lys Asn-Ser-Ile-Leu -NH2
９ Lys Met Lys Lys Asn-Ser-Ile -NH2
10 Lys Met Lys Lys Asn-Ser -NH2
11 Lys Met Lys Lys Asn -NH2
12 Lys Met Lys Lys -(화학 결합) -NH2
13 Lys Leu Lys Lys Asn-Ser -NH2
14 Lys Leu Lys Lys Asn -NH2
15 Lys Leu Lys Lys -(화학 결합) -NH2
16 Arg Met Arg Arg Asn-Ser-Ile-Leu -NH2
17 Arg Met Arg Arg Asn-Ser-Ile -NH2
18 Arg Met Arg Arg Asn-Ser -NH2
19 Arg Met Arg Arg Asn -NH2
20 Arg Met Arg Arg -(화학 결합) -NH2
21 Arg Leu Arg Arg Asn-Ser-Ile-Leu -NH2
22 Arg Leu Arg Arg Asn-Ser-Ile -NH2
23 Arg Leu Arg Arg Asn-Ser -NH2
24 Arg Leu Arg Arg Asn -NH2
25 Arg Leu Arg Arg -(화학 결합) -NH2
*: X6은 이후 서열 목록에서 아미노산 서열의 카르복실 말단을 나타낸다.
화학식 I 의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염의 예에는 알칼리 금속, 예컨대 나트륨, 칼륨 등과의 염; 알칼리 토금속, 예컨대 칼슘, 마그네슘 등과의 염; 무기 염기와의 염, 예컨대 알루미늄 염, 암모늄 염 등; 유기 염기, 예컨대 트리메틸아민, 피리딘, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염; 무기산, 예컨대 염화수소산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염; 유기산, 예컨대 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 락트산, 말레산, 시트르산, 숙신산,말산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염; 및 중합체산, 예컨대 타닌산, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과의 염이 포함된다.
화학식 I 의 VIP 유도체는, 예를 들어 JP-A 8-333276, JP-A 9-100237, JP-A 11-100399, JP-A 2001-151799 및 JP-A 2001-226284 에 나타낸 바와 같은 펩티드 합성을 위해 공지된 종래 방법에 따라 합성될 수 있다.
화학식 I 의 VIP 유도체는 하기 특성을 가질 수 있다.
첫번째로, VIP 유도체는 생체 내에서 고안정성 분자이다. 펩티드 및 단백질은 생체 내에서 펩티다아제에 의해 빠르게 대사되지만, 본 발명에서 사용되는 VIP 유도체 가운데 염기성이 증가된 펩티드는 대사에 저항성을 갖는다. 즉, VIP 를 구성하는 아미노산 중에서 15 번째, 20 번째, 및 21 번째 라이신 중 하나 이상을 아르기닌으로 치환하고, C-말단측 상의 글리신 잔기 다음에 염기성 아미노산, 예컨대 라이신 또는 아르기닌을 부가함으로서 염기성을 증가시켰으므로, 생체 내에 극히 다량 존재하는 산성 다당류에 대한 강한 친화도가 나타난다. 이러한 성질에 의해, 엔도펩티다아제, 예컨대 트립신에 의한 분해에 대한 저항성이 생체 내에서 증가된다. 예를 들어, 펩티드 5 를 사용한 트립신 소화 시험에 있어서, 콘드로이틴 술페이트의 존재 하에서 VIP 보다 더 높은 잔여율이 나타난다 (시험예 1). 이러한 경향은 기관지 폐포 세척 플루이드를 사용한 펩티드 소화 시험에서 보다 뚜렷이 나타나며, 90 분 후 펩티드 5 의 잔여율은 VIP 에서보다 약 1.8 배 더 높다 (시험예 2). 상기 언급된 우수한 생체 내 안정성으로 인해, 상기 고염기성 VIP 유도체는 오래 지속되는 약리 활성을 갖는다. 또한, 눈에 국소 적용되는 경우, 이들은 눈으로의 적용 후 거의 효소적 분해를 겪지 않는 점안제 제제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험예 5 에는, 펩티드 5 의 눈으로의 적용이 VIP 에서보다 더 오래 지속되는 눈물 분비 촉진 활성을 갖는 것이 나타난다.
또한, VIP 를 구성하는 아미노산 잔기 중 17 번째 메티오닌은 쉽게 산화되지만, 이 위치가 류신 또는 노르류신으로 치환된 VIP 유도체는 산화에 대한 저항성을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 사용되는 VIP 유도체 가운데, 17-류신-치환 펩티드는 거의 산화되지 않으며, 안정한 점안제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 화학식 I 의 VIP 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 (이후, 일부 경우 "VIP 유도체" 로 불림) 은 건조안 및 건조안과 연관된 질환의 치료제 (이후, 일부 경우 "건조안 치료제" 로 약칭함) 로서 전신 또는 국소 투여된다. 전신적으로, 이들은 비경구 (주사성 제제, 예컨대 정맥내 주사, 피하 주사 및 근육내 주사, 또는 좌약으로 투여됨) 및 경구 투여된다. 국소적으로, 이들은 피부 또는 눈에 투여된다.
비경구 투여되는 제제의 투여형의 예에는 주사성 제제, 좌약 등이 포함된다. 주사성 제제로 제형화되는 경우, 예를 들어 용매 (주사용 증류수), 안정화제 (나트륨 에데테이트 등), 등장화제 (염화나트륨, 글리세린 및 당 알콜, 예컨대 만니톨 등), pH 조절제 (염화수소산, 시트르산, 수산화나트륨 등) 및 현탁화제 (메틸셀룰로오스 등) 가 사용될 수 있고, 좌약으로 제형화되는 경우, 예를 들어 좌약 기재 (카카오 버터, 마크로골 등) 등이 적절히 선택되어 사용될 수 있다.
경구 투여되는 제제의 예에는 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽, 용액, 에어로졸 등이 포함된다. 제제가 분말, 과립, 정제 등으로 제형화되는 경우, 고형 제제의 제형화에 적합한 임의의 약학 담체, 예를 들어 부형제 (전분, 글루코오스, 프룩토오스, 백당 등), 윤활제 (스테아르산마그네슘 등), 붕해제 (전분, 결정성 셀룰로오스 등), 결합제 (전분, 아라비아 고무 등) 가 사용될 수 있고, 제제는 코팅제 (젤라틴, 백당 등) 로 코팅될 수 있다. 또한, 제제가 시럽 또는 용액으로 제형화되는 경우, 예를 들어 안정화제 (나트륨 에데테이트 등), 현탁화제 (아라비아 고무, 카르메로오스 등), 교정약 (단순 시럽, 글루코오스 등) 및 향미제가 적절히 선택되어 사용될 수 있다.
국소 제제의 예에는 연고, 크림, 로션, 점비제 및 국소 안과제가 포함되며, 국소 안과제가 바람직하다. 국소 안과제의 예에는 점안제, 안연고 및 서방성 제제가 포함되며, 점안제가 보다 바람직하다. 상기 국소 제제에 있어서, 본 발명의 VIP 유도체에 부가하여, 예를 들어 공지된 화합물, 예컨대 연고 기재 (바셀린, 라놀린 등), 용매 (생리 식염수, 정제수 등), 안정화제 (나트륨 에데테이트, 시트르산 등), 습윤제 (글리세린 등), 유화제 (폴리비닐피롤리돈 등), 현탁화제 (히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 등), 계면활성제 (Polysorbate 80, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 등), 방부제 (염화벤잘코늄, 파라벤, 클로로부탄올 등), 완충액 (붕산, 보락스 (borax), 아세트산나트륨, 시트르산염 완충액, 인산염 완충액 등), 등장화제 (염화나트륨, 글리세린, 만니톨 등) 및 pH 조절제 (염화수소산, 수산화나트륨 등) 가 적절히 선택되어 사용될수 있다.
또한, 국소 안과 서방성 제제로서, 성형 겔, 예컨대 콜라겐 등, 안내 (intraocular) 임플란트 및 생분해성 중합체, 예컨대 폴리락트산 또는 비생분해성 안내 임플란트를 성형하여 수득되는 공막 플러그가 사용될 수 있다.
일반적으로, 펩티드의 유리 또는 수지 용기 상으로의 흡착을 예방하기 위한 목적을 위해, 흡착 예방 성분이 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 흡착 예방 성분은 보관 용기의 벽 표면에 소수성으로 결합하여 접착을 예방하는 화합물, 보다 구체적으로는 분자 내에 소수성 기를 가지며, 표면 활성 작용을 갖는 화합물, 및 음으로 하전된 단백질이다. 전자의 예에는 폴리옥시에틸렌 알콜 에테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유, 글리세린 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 등이 포함되며, 후자의 음으로 하전된 단백질의 예에는 젤라틴, 알부민, 폴리게닌 (polygenin) 등이 포함된다. 젤라틴의 예에는 일본 약전에 따라 정제된 젤라틴 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 흡착 예방 성분으로서의 젤라틴은 단독으로 또는 이들의 둘 이상의 조합으로 사용될 수 있다. 알부민으로서, 인간에 대해 항원성을 갖지 않는 알부민이 있고, 혼입될 알부민의 농도는 보통 약 0.01 내지 50 w/v%, 바람직하게는 약 0.1 내지 2.0 w/v% 이다. 흡착 예방 성분 및 펩티드 용해용 용매로서, 이들이 주사용 용매로서 생리학적 허용가능한 한 임의 용매를 사용할 수 있고, 이들의 바람직한 예에는 일본 약전에 따른 주사용수 및 생리 식염수가 포함된다. 이와는 달리, 용기의 내벽 상에 실리콘을 코팅함으로써, 흡착 예방 효과가 수득될 수 있다.
본 발명의 건조안 치료제를 온혈 동물 (포유류, 예컨대 래트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 원숭이 및 인간, 조류, 예컨대 비둘기, 닭 및 칠면조) 에 투여함으로써, 눈물 분비가 촉진된다. 본 발명의 건조안 치료제가 성인 환자에게 투여되는 경우, VIP 유도체에 대한 1 회 용량은 주사성 제제의 경우 보통 0.00001 내지 100 mg, 바람직하게는 0.0001 내지 0.1 mg 이며, 경구 투여인 경우 보통 0.1 내지 500 mg, 바람직하게는 1 내지 20 mg 이다. 치료제가 성인 환자의 눈에 국소 적용되는 경우, 보통 VIP 유도체 0.001 내지 3.0 w/v%, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 w/v% 를 포함하는 점안제가 1 회 적용당 20 내지 50 ㎕ 씩, 1 일 1 회 내지 8 회 눈에 적용된다.
본 발명의 건조안 치료제는 목적 및 필요성에 따라, VIP 유도체 및 건조안 치료를 위한 기타 성분의 적절한 조합을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 목적에 위배되지 않는 한, 치료제는 다른 약리 활성 성분과 조합 사용될 수 있다.
본 발명의 건조안 치료제는 건조안, 예컨대 눈물 감소, 안건조증, Sjoegren 증후군, 건성각결막염, Stevens-Johnson 증후군, VDT (영상표시 단말기 증후군) 작업 연관 건조안 등의 치료를 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 치료제는 건조안에 연관된 질환, 예컨대 각막 및 결막 상피 장애, 각막 상피 침식, 각막 궤양, 검연 염증, 눈천포창, 춘계 결막염, 알러지성 결막염 등에 대한 치료제로서도 유용하다.
이후, 본 발명을 합성예, 제조예 및 시험예로 보다 상세히 예시할 것이지만, 본 발명이 여기에 제한되는 것은 아니다.
하기 합성예에서 사용되는 약어의 의미는 다음과 같다:
MBHA: p-메틸벤즈히드릴아민
MeOH: 메탄올
Boc: t-부톡시카르보닐기
TFA: 트리플루오로아세트산
TEA: 트리에틸아민
Cl2-Bzl: 디클로로벤질기
Cl-Z: 클로로벤질옥시카르보닐기
Xan: 잔틸기
Tos: p-톨루엔술포닐기
Bzl: 벤질기
OcHex: O-시클로헥실기
Bom: 벤질옥시메틸기
DCC: 디시클로헥실카르보디이미드
(합성예 1) 펩티드 5 의 제조
서열 번호 5 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 5 를 펩티드 고상 합성의 종래 방법에 따라 제조하였다.
MBHA 수지 HCl 염 (폴리스티렌-1% 디비닐벤젠 공중합체, 100 내지 200 메쉬) 을 교반하면서 2 내지 3-배 수지 부피의 MeOH 로 세척한 수동 (manual) 합성 반응 탱크 (유리로 제조됨, φ6.0 ×29.5 cm) 에 첨가한 후, 교반하면서 CH2Cl2(2 내지 3-배 수지 부피) 로 세척하여 수지를 부풀렸다. 10% 트리에틸아민/CH2Cl2로 중화 반응을 수행하고, DCC 및 N-히드록시벤조트리아졸을 첨가하여, 수지에서의 약 2 배 당량인 C-말단 아미노산에 해당하는 Boc-Arg(Tos)-OH 을 사용한 축합 반응을 수행하였다. 약 2 시간 동안의 반응 후 (교반하면서), 반응 혼합물을 MeOH 및 CH2Cl2로 세척하고, Kaiser 시험에 의해 α-아미노기의 소실을 확인한 후, 30 분 동안 50% TFA/CH2Cl2로 처리하여 탈보호시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 10% TEA/CH2Cl2로 중화시키고, 다시 MeOH 및 CH2Cl2로 세척하여, Kaiser 시험을 재수행하고 탈보호 반응을 확인하였다. 확인 후, C-말단으로부터 2 번째 Boc-Arg(Tos)-OH 의 커플링을 수행하기 위해, 유사한 단계를 반복하였다. 이후, 커플링/탈보호를 Boc-Gly-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH 순서로연속 수행하여, 펩티드 5 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-Leu-Asn-Gly-Arg(Tos)-Arg(Tos)-MBHA.
생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 100mL 의 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후에, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후 (10% 아세토니트릴 내지 50% 아세토니트릴 간의 단계적 구배), 동결건조하여 펩티드 5 를 수득하였다.
(합성예 2) 펩티드 15 의 제조
서열 번호 15 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 15 를 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 15 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Lys(Cl-Z)-Gln-Leu-Ala-Val-Lys(Cl-Z)-Lys(Cl-Z)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-MBHA.
생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 100mL 의 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후 (10% 아세토니트릴 내지 50% 아세토니트릴 간의 단계적 구배), 동결건조하여 펩티드 15 를 수득하였다.
(합성예 3) 펩티드 16 의 제조
서열 번호 16 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 16 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Leu-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Met-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 16 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Met-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-Leu-MBHA.
생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 100mL 의 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후 (10% 아세토니트릴 내지 50% 아세토니트릴 간의 단계적 구배), 동결건조하여 펩티드 16 을 수득하였다.
(합성예 4) 펩티드 17 의 제조
서열 번호 17 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 17 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Met-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 17 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Met-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-MBHA.
생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 100mL 의 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후 (10% 아세토니트릴 내지 50% 아세토니트릴 간의 단계적 구배), 동결건조하여 펩티드 17 을 수득하였다.
(합성예 5) 펩티드 18 의 제조
서열 번호 18 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 18 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Met-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 18 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Met-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-MBHA.
생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 100mL 의 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후 (10% 아세토니트릴 내지 50% 아세토니트릴 간의 단계적 구배), 동결건조하여 펩티드 18 을 수득하였다.
(합성예 6) 펩티드 19 의 제조
서열 번호 19 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 19 를 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Met-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 19 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Met-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-MBHA.
생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 100mL 의 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후 (10% 아세토니트릴 내지 50% 아세토니트릴 간의 단계적 구배), 동결건조하여 펩티드 19 를 수득하였다.
(합성예 7) 펩티드 20 의 제조
서열 번호 20 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 20 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Met-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 20 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Met-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-MBHA.
생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 100mL 의 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후 (10% 아세토니트릴 내지 50% 아세토니트릴 간의 단계적 구배), 동결건조하여 펩티드 20 을 수득하였다.
(합성예 8) 펩티드 21 의 제조
서열 번호 21 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 21 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Leu-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 21 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-Leu-MBHA.
생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 100mL 의 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후 (10% 아세토니트릴 내지 50% 아세토니트릴 간의 단계적 구배), 동결건조하여 펩티드 21 을 수득하였다.
(합성예 9) 펩티드 22 의 제조
서열 번호 22 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 22 를 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 22 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-MBHA.
생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 100mL 의 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후 (10% 아세토니트릴 내지 50% 아세토니트릴 간의 단계적 구배), 동결건조하여 펩티드 22 를 수득하였다.
(합성예 10) 펩티드 23 의 제조
서열 번호 23 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 23 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 23 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-MBHA.
생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 100mL 의 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후 (10% 아세토니트릴 내지 50% 아세토니트릴 간의 단계적 구배), 동결건조하여 펩티드 23 을 수득하였다.
(합성예 11) 펩티드 24 의 제조
서열 번호 24 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 24 를 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 24 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-MBHA.
생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 100mL 의 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후 (10% 아세토니트릴 내지 50% 아세토니트릴 간의 단계적 구배), 동결건조하여 펩티드 24 를 수득하였다.
(합성예 12) 펩티드 25 의 제조
서열 번호 25 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 25 를 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 25 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-MBHA.
생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 100mL 의 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후 (10% 아세토니트릴 내지 50% 아세토니트릴 간의 단계적 구배), 동결건조하여 펩티드 25 를 수득하였다.
(합성예 13) 펩티드 1 의 제조
서열 번호 1 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 1 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Gly-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 1 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-Leu-Asn-Gly-MBHA. 생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 동결건조하여 펩티드 1 을 수득하였다.
(합성예 14) 펩티드 2 의 제조
서열 번호 2 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 2 를 펩티드 5 의 제조 공정에서와 같이 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 2 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys(Cl-Z)-MBHA. 생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 동결건조하여 펩티드 2 를 수득하였다.
(합성예 15) 펩티드 3 의 제조
서열 번호 3 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 3 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 3 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-Leu-Asn-Gly-Arg(Tos)-MBHA. 생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 동결건조하여 펩티드 3 을 수득하였다.
(합성예 16) 펩티드 4 의 제조
서열 번호 4 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 4 를 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 4 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys(Cl-Z)-Arg(Tos)-MBHA. 생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 동결건조하여 펩티드 4 를 수득하였다.
(합성예 17) 펩티드 6 의 제조
서열 번호 6 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 6 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 PAM 수지 상에서, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 6 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys(Cl-Z)-Arg(Tos)-PAM. 생성 보호 펩티드-PAM 수지에 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 동결건조하여 펩티드 6 을 수득하였다.
(합성예 18) 펩티드 7 의 제조
서열 번호 7 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 7 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 PAM 수지 상에서, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Met-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 7 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Met-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-Leu-Asn-PAM. 생성 보호 펩티드-PAM 수지에 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 동결건조하여 펩티드 7 을 수득하였다.
(합성예 19) 펩티드 8 의 제조
서열 번호 8 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 8 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Leu-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Met-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 8 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Met-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-Leu-MBHA. 생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 동결건조하여 펩티드 8 을 수득하였다.
(합성예 20) 펩티드 9 의 제조
서열 번호 9 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 9 를 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Met-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 9 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Met-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-MBHA. 생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 동결건조하여 펩티드 9 를 수득하였다.
(합성예 21) 펩티드 10 의 제조
서열 번호 10 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 10 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Met-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH,Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 10 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Met-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-MBHA. 생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 동결건조하여 펩티드 10 을 수득하였다.
(합성예 22) 펩티드 11 의 제조
서열 번호 11 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 11 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Met-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로연속 수행하여, 펩티드 11 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Met-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-MBHA. 생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 동결건조하여 펩티드 11 을 수득하였다.
(합성예 23) 펩티드 12 의 제조
서열 번호 12 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 12 를 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Met-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 12 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Met-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-MBHA. 생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 동결건조하여 펩티드 12 를 수득하였다.
(합성예 24) 펩티드 13 의 제조
서열 번호 13 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 13 을 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 13 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-MBHA. 생성 보호 펩티드-MBHA 수지에무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 동결건조하여 펩티드 13 을 수득하였다.
(합성예 25) 펩티드 14 의 제조
서열 번호 14 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 14 를 펩티드 5 에서와 동일한 방식으로 합성하였다. 즉, 커플링/탈보호를 MBHA 수지 상에서, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln(Xan)-OH, Boc-Lys(Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Z)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-His(Bom)-OH 순서로 연속 수행하여, 펩티드 14 에 상응하는 보호 펩티드 수지를 수득하였다; His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Asn-MBHA. 생성 보호 펩티드-MBHA 수지에 무수 불화수소를 아니솔의 존재 하에 첨가하여 이들을 반응시켰다. 반응 후, 무수 불화수소를 감압 하에 증류 제거하고, 잔류물을 에테르로 세척하고, 10% 아세트산을 거기에 첨가하여 펩티드를 추출하였다. 추출물을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 동결건조하여 펩티드 14 를 수득하였다.
(제조예 1)
사용시 용해될 점안제 1
펩티드 5 2 g
염화나트륨 0.9 g
붕산 0.1 g
보락스 적량 (pH 7.8)
염화벤잘코늄 0.005 g
나트륨 에데테이트 0.02 g
정제수 100 mL 이 되도록 첨가
100 mL 의 정제수에, 5 g 의 펩티드 5 를 용해시키고, 멤브레인 필터 (0.45 ㎛) 를 통해 여과하였다. 상기 용액의 각각의 2 mL 부를 5 mL-점안제 용기 내에 분배하고 동결건조하였다. 약 80 mL 의 정제수 중에, 0.9 g 의 염화나트륨, 0.1 g 의 붕산, 0.005 g 의 염화벤잘코늄 및 0.02 g 의 나트륨 에데테이트를 용해시키고, 보락스로 pH 를 7.8 로 조절한 후, 정제수로 총 부피를 100 mL 로 조절하였다. 상기 용액을 멤브레인 필터 (0.45 ㎛) 를 통해 여과하고, 5 mL 앰플 내로 분배하고 밀봉하여, 용해 용액을 수득하였다. 사용 시, 용해 용액을 상기 5 mL-점안제 용기 내에 부어 점안제를 수득하였다.
(제제 2)
사용시 용해될 점안제 2
펩티드 15 0.1 g
만니톨 5 g
붕산 0.1 g
보락스 적량 (pH 7.8)
염화벤잘코늄 0.005 g
나트륨 에데테이트 0.02 g
정제수 100 mL 이 되도록 첨가
100 mL 의 정제수에, 0.25 g 의 펩티드 15 및 12.5 g 의 만니톨을 용해시키고, 멤브레인 필터 (0.45 ㎛) 를 통해 여과하였다. 상기 용액의 각각의 2 mL 부를 5 mL-점안제 용기 내에 분배하고 동결건조하였다. 약 80 mL 의 정제수 중에, 0.1 g 의 붕산, 0.005 g 의 염화벤잘코늄 및 0.02 g 의 나트륨 에데테이트를 용해시키고, 보락스로 pH 를 7.8 로 조절한 후, 정제수로 총 부피를 100 mL 로 조절하였다. 상기 용액을 멤브레인 필터 (0.45 ㎛) 를 통해 여과하고, 5 mL 앰플 내로 분배하고 밀봉하여, 용해 용액을 수득하였다. 사용 시, 용해 용액을 상기 5 mL-점안제 용기 내에 부어 점안제를 수득하였다.
(제조예 3)
1 팩 유형 점안제 1
펩티드 5 0.1 g
붕산 0.7 g
보락스 적량 (pH 7.7)
염화나트륨 0.5 g
나트륨 에데테이트 0.05 g
염화벤잘코늄 0.005 g
정제수 100 mL 이 되도록 첨가
염화나트륨, 붕산, 나트륨 에데테이트 및 염화벤잘코늄을 약 80 mL 의 정제수에 첨가하여 여기에 용해시키고, 보락스를 첨가하여 pH 를 7.7 로 조절하였다. 펩티드 5 를 상기 용액에 첨가하여 여기에 용해시킨 후, 정제수로 총 부피를 100 mL 로 만들어서 점안제를 수득하였다.
(제조예 4)
1 팩 유형 점안제 2
펩티드 15 0.5 g
염화나트륨 0.9 g
인산2수소나트륨 2 수화물 0.1 g
염화벤잘코늄 0.005 g
0.1 N 수산화나트륨 적량 (pH 7.2)
정제수 100 mL 이 되도록 첨가
염화나트륨, 인산2수소나트륨 2 수화물 및 염화벤잘코늄을 약 80 mL 의 정제수에 첨가하여 여기에 용해시키고, 0.1 N 수산화나트륨을 첨가하여 pH 를 7.2 로 조절하였다. 펩티드 15 를 상기 용액에 첨가하여 여기에 용해시킨 후, 정제수로 총 부피를 100 mL 로 만들어서 점안제를 수득하였다.
(제조예 5)
주사성 제제 1
주사용수 중에, 1.0 mg 의 펩티드 5, 200 mg 의 염화나트륨 및 300 mg 의 젤라틴을 용해시켰다. pH 를 7.4 로 조절하기 위해 적절한 양의 pH 조절제를 여기에 첨가하고, 주사용수로 총 부피를 20 mL 로 만들고, 용액을 여과에 의해 멸균하여, 그 각각의 2 mL 부를 유리 앰플 중에 분배하였다.
(제조예 6)
주사성 제제 2
주사용수 중에, 1.0 mg 의 펩티드 15, 200 mg 의 염화나트륨 및 250 mg 의 알부민을 용해시켰다. pH 를 7.4 로 조절하기 위해 적절한 양의 pH 조절제를 여기에 첨가하고, 주사용수로 총 부피를 20 mL 로 만들고, 용액을 여과에 의해 멸균하여, 그 각각의 2 mL 부를 유리 앰플 중에 분배하였다.
(시험예 1)
트립신 소화 시험
트립신 소화에 대한 고염기성화 펩티드 5 의 효과를 콘드로이틴 술페이트의 존재 하에 연구하였다.
1) 시험 방법
100 ㎕ 의 VIP 및 펩티드 5 의 용액 (1 mg/mL) 에 400 μL 의 0.2 M Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 중 콘드로이틴 술페이트 (pH 7.5, 100 ㎍/mL) 용액을 첨가하였다. 100 ㎕ 의 상기 용액에 0.5 mU 의 트립신을 첨가하고, 혼합물을 37℃ 에서 180 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 미분해 펩티드의 양을 HPLC 로 측정하였다.
2) 결과
콘드로이틴 술페이트의 존재 하에서 트립신에 의한 소화에 있어서, VIP 의 잔여율은 75% 인 반면, 펩티드 5 의 잔여율은 89% 만큼 높았다. 상기 결과는, 상기 펩티드와 산성 다당류의 상호작용이 효소 분해에 대한 저항성을 나타냄을 제시하였다.
(시험예 2)
기관지 폐포 세척 플루이드로의 소화 시험
기관지 폐포 세척 플루이드로의 소화에 대한 고염기성화 펩티드 5 의 효과를 연구하였다.
1) 시험 방법
VIP 및 펩티드 5 를 0.2% Tris-HCl 완충액 (pH 7.4) 중에 용해시키고 (1.1 mg/mL), 기관지 폐포 세척 플루이드 (BALF) 를 여기에 첨가하였다. 5 mL 의 생리 식염수를 마취 하에서 8 내지 9 주령 정상 SD 웅성 래트 (약 350 g) 의 기관 내에 붓고 식염수를 회수하여, 상기 절차를 총 3 회 반복함으로써 BALF 를 수득하였다. 0.5 mL 의 BALF 에 0.05 mL 의 샘플 용액을 첨가하고, 혼합물을 37℃ 에서 90 분 동안 반응시킨 후, 미분해 펩티드의 양을 HPLC 로 측정하였다.
2) 결과
BALF 와의 소화 시험에 있어서, VIP 의 잔여율은 45.5% 인 반면, 펩티드 5의 잔여율은 80.0% 로, VIP 에 비해 약 1.8 배 더 높은 잔여율을 나타내었다. 상기 결과는, 상기 펩티드가 생체 내에서 우수한 안정성을 나타냄을 제시하였다.
(시험예 3)
단리된 눈물샘으로부터 단백질의 분비 촉진 활성
토끼의 단리된 눈물샘을 VIP, 또는 펩티드 5 또는 15 로 처리하고, 분비 단백질의 양 증가에 대한 상기 펩티드의 약리 효과를 연구하였다.
1) 시험 용액의 제조
a) 정제수를 염화나트륨 (137.92 g), 염화칼륨 (7.01 g), 염화칼슘 2 수화물 (3.53 g) 및 염화마그네슘 6 수화물 (1.2 g) 에 첨가하고, 혼합물을 총 부피 1000 mL (용액 1) 로 만들었다. 별도로, 정제수를 인산2수소칼륨 (8.17 g) 에 첨가하고, 혼합물을 총 부피 500 mL (용액 2) 로 만들었다. 용액 1 (50 mL) 및 용액 2 (10 mL) 를 900 mL 의 정제수에 첨가하고, 2.07 g 의 글루코오스 및 2.1 g 의 중탄산나트륨을 여기에 용해시켜, 총 량을 1000 mL (pH 약 7.4) 로 조절하고 인큐베이션 배지를 수득하였다. 인큐베이션 배지를 95% 산소 및 5% 이산화탄소를 포함하는 혼합 기체로 버블링하였다.
b) VIP, 펩티드 5 또는 펩티드 15 를 인큐베이션 배지 중에 10-4M 농도로 용해시켜 시험 용액을 수득하였다.
2) 눈물샘 절편 표본의 제조
웅성 일본 흰토끼 (Japanese white rabbit) 를 전신 마취하고, 관류 용액(116 mM 염화나트륨, 5.4 mM 염화칼륨 포함) 을 복부 대동맥을 통해 관류하고, 주요 눈물샘 조직을 단리하고, 지방 연결 조직을 제거하여, 동일하게 분할하였다 (한 절편은 약 40 mg 였음). 상기 눈물샘 조직 절편을, 각각의 웰이 0.5 mL 의 인큐베이션 배지로 채워진 24-웰 플레이트로 옮긴 후, 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 배지를 매 20 분 마다 3 회 교환하여 총 60 분 동안 방치하고, 안정 상태 (steady state) 의 눈물샘 절편 표본을 수득하였다.
3) 시험 방법
a) 안정 상태인 절편 표본을 사용하고, 인큐베이션 배지를 0.5 mL 의 신선한 인큐베이션 배지로 교환한 후, 37℃ 에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 배지를 수집하여, 단백질 염색 시약 (DC 단백질 분석 시약, Bio Rad) 을 여기에 첨가하고, 단백질의 양을 측정하여, 습중량 mg 당 분비 단백질의 양으로 표시하였다. 이때의 단백질의 양을 단백질 분비율 100% 로 간주하고, 처리 전의 분비율로 이용하였다.
b) a) 에서의 인큐베이션 후 절편 표본의 인큐베이션 배지를 0.5 mL 의 시험 용액으로 교환하고, 상기 용액을 20 분 간격으로 총 5 회 교환 및 수집하였다. 단백질 염색 시약을 수집 용액에 첨가하고, 단백질의 양을 측정하였다. 대조군의 절편 표본에 대하여, 유사하게 인큐베이션 배지를 교환하고 단백질의 양을 측정하였다.
4) 결과
시험 결과를 도 1 에 나타낸다. 세로축은 단리된 눈물샘으로부터 단백질분비율 (%) 를 나타내며, 가로축은 각각의 시험 용액의 처리 시간 (분) 을 나타낸다. VIP, 펩티드 5 및 펩티드 15 로 처리되는 경우, 단백질 분비율은 대조군에 비해 0 내지 40 분의 처리 시간 동안 유의미하게 증가하였다 (n = 5, 평균 ±표준 오차,*; p < 0.05,**; p < 0.01, Dunnett 시험). 즉, 펩티드 5 및 15 및 VIP 모두가 우수한 단백질 분비 촉진 활성을 갖는 것이 드러났다.
(시험예 4)
점안제 (1) 의 눈물 분비 촉진 활성
펩티드 5 또는 15 를 토끼의 눈에 적용하고, 분비 눈물량을 측정하여, 눈물 분비량의 증가에 대한 상기 펩티드의 약리 효과를 연구하였다.
1) 용액의 제조
정제수를 염화나트륨 (0.9 g) 및 인산2수소나트륨 2 수화물 (0.1 g) 에 첨가하여 총 부피 100 mL 로 만들었다. 이어서, pH 를 7.0 으로 조절하기 위해 적절한 양의 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 비히클을 수득하였다. 펩티드 5 를 비히클 중에 0.1 w/v% 농도로 용해시키고, 펩티드 15 를 비히클 중에 2.0 w/v% 농도로 용해시켜, 시험 용액을 제조하였다.
2) 시험 방법
Schirmer 시험에 의해 눈물량 측정을 수행하였다. 일본 흰토끼의 눈에, 50 ㎕ 의 시험 용액을 단회 적용하고, 눈으로의 적용 전 및 10 분 후의 눈물 분비량을 측정하였다. 눈물량 측정 5 분 전에, 10 ㎕ 의 0.4 w/v% 옥시부프로카인히드로클로라이드 (AnelocalTM점안제, Senju Pharmaceutical Co., Ltd.) 를 적하하여 국소 마취하였다. 안검내 결막낭 (palpebra interior conjunctival sac) 내 눈물을 여과지를 이용하여 씻어낸 후, Schirmer 시험지 (Showa Yakuhin Kako Co., Ltd.) 를 이용하여 1 분 동안 눈물 분비량을 측정하였다.
3) 결과
시험 결과를 표 2 에 나타낸다. 펩티드 5 용액의 적용에 있어서, 토끼 눈으로의 단회 적용으로, 눈물 분비량이 유의미하게 증가하였다 (*; p < 0.01, paired t 시험). 또한, 펩티드 15 용액의 적용에 있어서, 통계적으로 유의한 차이는 인지되지 않았으나, 증가 경향이 나타났다 (p = 0.13, paired t 시험).
즉, 펩티드 5 및 15 는 우수한 눈물 분비 촉진 활성을 갖는 것으로 드러났다.
눈물 분비량 (Schirmer 값: mm/분, n = 6, 평균 ±표준 오차)
투여 전 투여 후
0.1% 펩티드 5 2.00 ±0.62 8.92 ±0.45*
2.0% 펩티드 15 3.25 ±1.20 7.75 ±2.16
(시험예 5)
점안제 (2) 의 눈물 분비 촉진 활성
시험예 4 와 동일한 방식으로 펩티드 5 를 적용하고, 눈물 분비량을 측정하였다. 본 시험에 있어서, 눈물 분비량을 시간에 따라 측정하였고, VIP 에서의 효과와 비교하였다.
1) 용액의 제조
시험예 4 에서와 동일한 방식으로 용액 제조를 수행하고, VIP 및 펩티드 5 를 비히클 중에 0.1 w/v% 농도로 용해시켜, 시험 용액을 제조하였다.
2) 시험 방법
50 ㎕ 의 비히클 또는 시험 용액을 일본 흰토끼의 눈에 단회 적용하고, 눈물 분비량을 적용 전, 10 분 후, 20 분 후, 30 분 후, 60 분 후 및 100 분 후에 측정하였다. 눈물 분비량의 측정은 시험예 4 에서와 동일한 방식으로 수행하였다.
3) 결과
투여 후 눈물 분비량의 변화를 도 2 에 나타낸다. 세로축은 투여 전으로부터, 누액 분비량 (Schirmer 값: mm/분) 에 있어서의 차이 (증분) 를 나타내었다. 가로축은 시간의 흐름 (분) 을 나타내었다. 눈으로의 VIP 및 펩티드 5 의 적용에 의해, 상기 양은 기재 투여의 대조군과 비교하여 투여 10 분 후에 유의미하게 증가하였다 (n = 8, 평균 ±표준 오차,*; p < 0.05,**; p < 0.01, 파라미터성 Dunnett-유형 다중 비교 시험). 투여 120 분 후 눈물 분비량의 증분의 축적값 (AUC 값=ΔSchirmer 값 ×분) 을 표 3 에 나타낸다. AUC 값은 펩티드 5 투여군 > VIP 투여군 > 대조군의 순서였으며, 펩티드 5 적용군은 대조군에 비해 유의미하게 더 높은 값을 나타내었다 (*; p < 0.05). 반면에, VIP 적용군에 있어서, 대조군과 비교하여 유의미한 차이는 인지되지 않았다 (p = 0.38). 즉, 펩티드 5 가 VIP 에 비해 우수한 눈물 분비 촉진 활성을 가짐이 드러났다.
적용 후 눈물 분비량 증분의 축적값
투여군 AUC0-120 분(ΔSchirmer 값 ×분)
비히클 투여군 (대조군) 65.6 ±72.9
0.1% VIP 투여군 215.0 ±98.2
0.1% 펩티드 5 투여군 359.2 ±85.0*
n = 8, 평균 ±표준 편차* p < 0.05, 파라미터성 Dunnett-유형 다중 비교 시험
상기 결과는, 본 발명의 VIP 유도체가 우수한 눈물 분비 촉진 활성을 가지며, 건조안 및 건조안과 연관된 질환의 치료제로서 유용함을 나타낸다.
<110> SENJU PHARMACEUTICAL CO., LTD. ITOHAM FOODS INC. <120> AGENT FOR TREATING OR PREVENTING DRY EYE OR DRY EYE ACCOMPANYING DISEASES <130> 663489 <150> JP 2001-340355 <151> 2001-11-06 <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 5 9 14 19 Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly 24 29 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 5 9 14 19 Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Lys 24 29 34 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 3 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 5 9 14 19 Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Arg 24 29 34 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 5 9 14 19 Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Lys Arg 24 29 34 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 5 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 5 9 14 19 Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Arg Arg 24 29 34 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 6 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 5 9 14 19 Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Lys Arg 24 29 34 <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 7 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 5 9 14 19 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn 24 29 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 8 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 5 9 14 19 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu 24 29 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Lys Lys Tyr Leu Asn Ser 24 29 <210> 14 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 14 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 5 9 14 19 Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn 24 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 15 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 5 9 14 19 Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu 24 <210> 16 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 16 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 5 9 14 19 Met Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu 24 29 <210> 17 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 17 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 5 9 14 19 Met Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile 24 29 <210> 18 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 18 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg 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Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 5 9 14 19 Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser 24 29 <210> 24 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 24 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 5 9 14 19 Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn 24 <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 25 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 5 9 14 19 Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu 24

Claims (26)

  1. 하기 화학식 I 로 나타내는 펩티드 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 건조안 또는 건조안과 연관된 질환의 치료제:
    [화학식 I]
    H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-X1-Gln-X2-Ala-Val-X3-X4-Tyr-Leu-X5-X6
    (식 중, X1, X3및 X4는 각각 Lys 또는 Arg 을 나타내며; X2는 Met, Leu 또는 nLeu 을 나타내고; X5는 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합, Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 를 나타냄) 을 나타내고; X6은 -OH 또는 -NH2를 나타내며, 단, X1, X3및 X4가 Lys 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 화학 결합이고, X6이 -NH2인 경우, X2는 Leu 또는 nLeu 를 나타낸다).
  2. 제 1 항에 있어서, 화학식 I 중 X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 인 치료제.
  3. 제 1 항에 있어서, 화학식 I 중 X5가 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합임) 인 치료제.
  4. 제 1 항에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Arg 이며, X2가 Leu 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly-Arg-Arg 이고, X6이 -NH2인 치료제.
  5. 제 1 항에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Lys 이며, X2가 Leu 이고, X5가 화학 결합이고, X6이 -NH2인 치료제.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 눈에 국소 투여되는 제제인 치료제.
  7. 제 6 항에 있어서, 눈에 국소 투여되는 제제가 점안제인 치료제.
  8. 하기 화학식 I 로 나타내는 펩티드 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 건조안 또는 건조안과 연관된 질환 치료용 약학 조성물:
    [화학식 I]
    H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-X1-Gln-X2-Ala-Val-X3-X4-Tyr-Leu-X5-X6
    (식 중, X1, X3및 X4는 각각 Lys 또는 Arg 을 나타내며; X2는 Met, Leu 또는 nLeu 을 나타내고; X5는 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합, Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 를 나타냄) 을 나타내고; X6은 -OH 또는 -NH2를 나타내며, 단, X1, X3및 X4가 Lys 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 화학 결합이고, X6이 -NH2인 경우, X2는 Leu 또는 nLeu 를 나타낸다).
  9. 제 8 항에 있어서, 화학식 I 중 X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 인 약학 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서, 화학식 I 중 X5가 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합임) 인 약학 조성물.
  11. 제 8 항에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Arg 이며, X2가 Leu 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly-Arg-Arg 이고, X6이 -NH2인 약학 조성물.
  12. 제 8 항에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Lys 이며, X2가 Leu 이고, X5가 화학 결합이고, X6이 -NH2인 약학 조성물.
  13. 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 눈에 국소 투여되는 조성물인 약학 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 눈에 국소 투여되는 조성물이 점안제인 약학 조성물.
  15. 건조안 또는 건조안과 연관된 질환 치료용 약제의 제조를 위한, 하기 화학식 I 로 나타내는 펩티드 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 용도:
    [화학식 I]
    H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-X1-Gln-X2-Ala-Val-X3-X4-Tyr-Leu-X5-X6
    (식 중, X1, X3및 X4는 각각 Lys 또는 Arg 을 나타내며; X2는 Met, Leu 또는 nLeu 을 나타내고; X5는 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합, Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 를 나타냄) 을 나타내고; X6은 -OH 또는 -NH2를 나타내며, 단, X1, X3및 X4가 Lys 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 화학 결합이고, X6이 -NH2인 경우, X2는 Leu 또는 nLeu 를 나타낸다).
  16. 제 15 항에 있어서, 화학식 I 중 X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 인 용도.
  17. 제 15 항에 있어서, 화학식 I 중 X5가 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합임) 인 용도.
  18. 제 15 항에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Arg 이며, X2가 Leu 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly-Arg-Arg 이고, X6이 -NH2인 용도.
  19. 제 15 항에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Lys 이며, X2가 Leu 이고, X5가 화학 결합이고, X6이 -NH2인 용도.
  20. 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제가 눈에 국소 투여되는 약제인 용도.
  21. 제 20 항에 있어서, 눈에 국소 투여되는 안과 약제가 점안제인 용도.
  22. 건조안 또는 건조안과 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 온혈 동물에게 하기 화학식 I 로 나타내는 펩티드 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 건조안 또는 건조안과 연관된 질환의 치료 방법:
    [화학식 I]
    H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-X1-Gln-X2-Ala-Val-X3-X4-Tyr-Leu-X5-X6
    (식 중, X1, X3및 X4는 각각 Lys 또는 Arg 을 나타내며; X2는 Met, Leu 또는 nLeu 을 나타내고; X5는 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합, Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 를 나타냄) 을 나타내고; X6은 -OH 또는 -NH2를 나타내며, 단, X1, X3및 X4가 Lys 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 화학 결합이고, X6이 -NH2인 경우, X2는 Leu 또는 nLeu 를 나타낸다).
  23. 제 22 항에 있어서, 화학식 I 중 X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly, Gly-Lys, Gly-Lys-Arg, Gly-Arg 또는 Gly-Arg-Arg 인 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 화학식 I 중 X5가 화학 결합, Asn, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Ile-Leu 또는 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7(여기서, X7은 화학 결합임) 인 방법.
  25. 제 22 항에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Arg 이며, X2가 Leu 이고, X5가 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-X7이고, X7이 Gly-Arg-Arg 이고, X6이 -NH2인 방법.
  26. 제 22 항에 있어서, 화학식 I 중 X1, X3및 X4가 Lys 이며, X2가 Leu 이고, X5가 화학 결합이고, X6이 -NH2인 방법.
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