CN1210543A - 血管活性肠肽类似物的合成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从四种保护的肽片段合成血管活性肠肽类似物Ac(1—31)－NH2的新方法。

Description

血管活性肠肽 类似物的合成
本发明涉及从四个保护的肽片段合成血管活性肠肽类似物Ac(1-31)-NH2的新方法。
血管活性肠肽(VIP)是一种调节气道粘液分泌并且有抗过敏和抗炎特性的平滑肌松驰剂/支气管扩张药。最近的研究发现了具有增加的代谢稳定性和增加的受体-结合特性的VIP类似物。此VIP类似物是欧洲专利申请第92/117,185号的主题。
迄今，已用固相合成法制备该VIP类似物。该固相合成法包括将用诸如叔丁氧羰基(Boc)通过酯键保护的α-氨基酸接触氯甲基化树脂或羟甲基树脂。随后，加入更多的氨基酸到该树脂。在酸性条件下除去该0氨基Boc保护，随后逐步偶联保护的氨基酸以获得中间体，保护的肽-树脂。除去保护基团并通过多个氢氯酸切割反应从该树脂上切下多肽。通过两步纯化该多肽，a)大小排阻凝胶色谱和b)制备性的高效液相色谱(HPLC)。此多步法费时并且导致目的肽的低效回收。
因此，本发明的一个目的是提供一种相对简单的，更有效的并且经济的合成VIP类似物的方法。
本发明提供了从保护的肽片段合成下式
1                           8               12                   17Ac-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala
        19                      25  26  27  28  29  30  31
Figure A9719207200041
VIP类似物，Ac(1-31)-NH2的新方法。优选地，此反应的特征是通过偶联Fmoc-保护的片段，更优选地，是通过偶联下列四个片段：肽片段Ⅰ(序列2)，肽片段Ⅱ(序列3)，肽片段Ⅳ(序列4)和肽片段Ⅳ(序列5)。此新方法无需在用固相法合成时所需的制备性HPLC预先纯化该肽片段，也不需要纯化在该目的环状VIP类似物合成过程中形成的中间体。在装配后的最终阶段通过一次过制备性HPLC纯化所得的产品。
本发明合成环状VIP类似物Ac(1-31)-NH2的方法包括偶联两个或多个保护的肽片段。优选的保护的片段是四个Fmoc保护的片段：片段Ⅰ,Fmoc-(26-31)-NH2(序列2)；片段Ⅱ,Fmoc(19-25)-OH(序列3)；片段Ⅲ,Fmoc-(9-18)-OH(序列4)；以及片段Ⅳ,Ac-(1-8)-OH(序列5)，如下所示。
Figure A9719207200051
Figure A9719207200053
Figure A9719207200054
本发明通过偶联四个Fmoc保护的肽片段，肽片段Ⅰ(序列2)，肽片段Ⅱ(序列3)，肽片段Ⅲ(序列Ⅳ)和肽片段Ⅳ(序列5)合成化合物Ac-(1-31)-NH2(序列1)的方法包括(a)脱去肽片段Ⅰ的Fmoc保护基并偶联该脱保护的肽片段Ⅰ和保护的肽片段Ⅱ；(b)脱去步骤(a)所得的肽的Fmoc保护基并偶联它和保护的片段Ⅲ；(c)脱去步骤(b)所得的肽的Fmoc保护基并偶联它和保护的片段Ⅳ；(d)脱去步骤(c)所得的保护肽的保护基得到脱保护的Ac(1-31)-NH2。
该保护的肽片段Ⅰ-Ⅳ是基于每个偶联反应产物的最大偶联效率和最小的外消旋而选择的。每个偶联反应使用等量的每个片段，以经济的路线获得目的肽。每次偶联后所生成的中间体直接用于下步偶联反应而无需进一步的纯化。
本文所述的固相合成法产生的每个片段的纯度在一次纯化步骤后通过分析性HPLC检测为介于大约82％到大约97％，而每一片段无需进一步纯化而用于合成该环状VIP类似物。
更具体地，该纯化的式Ac-(1-31)-NH2(序列1)化合物的合成方法包括：(a)脱去肽片段Ⅰ(序列2)的Fmoc保护基并偶联该脱保护的肽片段Ⅰ和保护的肽片段Ⅱ(序列3)得到保护的中间体肽Fmoc(19-31)-NH2(序列6)；(b)脱去中间体肽Fmoc(19-31)-NH2的保护基并偶联该脱保护的中间体Fmoc(19-31)-NH2和保护的片段Ⅲ(序列Ⅳ)得到保护的中间体肽Fmoc(9-31)-NH2(序列7)；(c)脱去该中间体肽Fmoc(9-31)-NH2的Fmoc保护基并偶联该脱保护的中间体Fmoc(9-31)-NH2和保护的片段Ⅳ(序列5)得到保护的中间体肽Ac-(1-31)-NH2；(d)脱去该保护的肽Ac(1-31)-NH2的保护基；以及(e)纯化该脱保护的肽Ac(1-31)-NH2，如，通过制备性HPLC。
如本文所述，用于定义肽的命名是那些在本领域中常用的，其中N末端的氨基出现在左边而C末端的羰基出现在右边。天然氨基酸是指发现于蛋白质中的天然产生的氨基酸的一个，即，Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Ser,Thr,Lys,Arg,Asp,Asn,Glu,Gln,Cys,Met,Phe,Tyr,Pro,Trp,和His。若该氨基酸有异构型，除非另有清楚的说明，否则其表示该氨基酸的L型。
下列缩写或符号用于表示除那些在本文的别处所述的之外的氨基酸，保护基，溶剂，试剂及类似物。
符号    意思
Ac      乙酰基
NIe     正亮氨酸
Fm      9-芴基甲基
DIPEA   N,N-二异丙基乙胺
DMF     二甲基甲酰胺
“VIP”后的字尾“-OH”和“-NH2”分别指该多肽的游离酸和酰胺类型。无论使用哪种字尾，该表述意指包括两种类型。
本文定义的环肽是指其中一个氨基酸的侧链羧基端通过形成酰胺键而共价结合到另一氨基酸的侧链氨基端的肽。
有几种命名和符号用于表示一个环肽。如下是实例：
a．环(Lys21-Asp25)-Fmoc—Ala19—Lys(Boc)20-Lys21-Tyr(tBu)22-Leu23-Asn24-Asp25-OH；
b．Fmoc-(19-25)-OH；
c．Fmoc-[Ala19-Asp25]-VIP环(21→25)；
d．[Fmoc-(序列3)-OH]；
e．Fmoc-[Ala19-Asp25]-VIP环(Lys21→Asp25)；
f.[Fmoc-(序列3)-OH]；
g．
Figure A9719207200071
上述每个结构(a-g)，和使用“序列号”的表达式代表和定义具有相当于VIP肽片段的氨基酸序列的相同的肽，其中的Fmoc基取代N末端的氢。另外，在21位的赖氨酸的侧链羧基和25位的天冬氨酸的侧链氨基间形成一个酰胺键，从而生成环肽片段。上述肽结构的表示式被认为是等同的和可互换的。
在本发明的环肽中，除非另有说明，使用以下构型。链中的氨基酸    结合形成环肽的氨基酸末端Lys             ε氨基εAsp             β羧基(β=beta)Glu             γ羧基(γ=gamma)
本发明的包括VIP类似物的肽片段可通过任何在氨基酸间形成肽键的常规方法而方便地合成。该常规方法包括，例如，任何可以使得一种具有其保护的羧基或其它反应基团的氨基酸或其残基的游离α氨基和另一种具有其保护的氨基或其它反应基团的氨基酸或其残基间缩合的溶液相方法。
包括VIP类似物的肽片段的合成法可通过将所需序列中的每个氨基酸在另一氨基酸或其残基后依次加入或通过首先常规地合成带有所需的氨基酸序列的肽片段并随后缩合以得到所需的肽而进行。
这种合成肽片段的常规方法包括，例如，任何固相肽合成法。在此方法中，肽片段的合成可按固相合成法的一般原则通过顺序地一次加入一种所需的氨基酸残基到生长的肽链中而进行[Merrifield,R.B.，美国化学会杂志(J.Amer.Soc.)85,2149-2154(1963)；Barany等，肽，分析，合成和生物学(The Peptides,Analysis,Synthesis and Biology)，第二册，Goss,E.和Meienhofer,J.Eds.学术出版社(Academic Prers)1-284(1980)]。
通常，肽的化学合成要用合适的保护基保护各种氨基酸部分的反应性侧链基团，而这些保护基可防止发生在那些位点的化学反应直到该保护基团最终被除去。周知的还有，保护氨基酸或片段的α-氨基，而反应发生在该羧基上，随后，选择性除去α氨基保护基使得随后的反应发生在那个位点。就关于该固相合成法已公开的具体保护基而言，应知道的是，可用有关在溶液相合成法中常用的保护基可保护每一氨基酸。
可用合适的保护基保护α氨基，这些保护基选自芳香族尿烷-型保护基，如苄氧羰基(Z)和取代的苄氧羰基，如，对-氯代苄氧羰基，对-硝基苄氧羰基，对-溴代-苄氧羰基，对-二苯基-异丙氧羰基，9-芴基-甲基-氧羰基(Fmoc)和对-甲氧苄氧羰基(Moz)；脂肪族尿烷-型保护基，如，叔丁氧羰基(Boc)，二异丙基甲氧羰基，异丙氧羰基，和烯丙氧羰基。Boc最适于α氨基保护。
可用合适的保护基保护羧基，这些保护基选自：芳香酯，如，苄基(OBzl)或用低级烷基，卤素，硝基，硫，或取代的硫，即，低级烷基(1-7碳原子)硫取代的苄基酯，脂族酯，如，低级烷基，叔丁基(Ot-Bu)，环戊基，环己基(OcHx)，环庚基，和9-芴基甲基(OFm)酯。OBzl和OFm最优选于谷氨酸(Glu)。OChx,OBzl和OFm最优选于天冬氨酸(Asp)。
可用合适的保护基保护羟基，这些保护基选自：醚，如，苄基(Bzl)或用低级烷基，卤素，如2,6-二氯苄基(DCB)，硝基，或甲氧基取代的苄基；叔丁基(t-Bu)，四羟吡喃，和三苯基甲基(trityl)醚。Bzl最优选于丝氨酸(Ser)和芳氨酸(Thr)。Bzl和DCB最适于酪氨酸(Tyr)。
可用合适的保护基保护侧链氨基，这些保护基选自：芳族尿烷型保护基如苄氧羰基(Z)和取代的苄氧羰基，如，对-氯代苄氧羰基，2-氯代苄氧羰基，(2-Cl-Z)，对-硝基-苄氧羰基，对-溴代-苄氧羰基，对-二苯基-异丙基-氧羰基，9-芴基甲氧羰基(Fmoc)和对-甲氧-苄氧-羰基(Moz)；脂族尿烷型保护基，如，叔丁氧羰基(Boc)，二异丙基甲氧羰基，异丙氧羰基，和烯丙氧羰基。Z最优选于鸟氨酸。2-Cl-Z和Fmoc最优选于赖氨酸(Lys)。
可用合适的保护基保护胍基，这些保护基选自硝基，对-甲苯磺酰基(Tos),Z，金刚烷氧羰基，和Boc。Tos最优选精氨酸(Arg)。
可用呫吨基(Xan)保护侧链酰胺基。没有保护优选于天氨酰胺和谷氨酰胺(Gln)。
可用合适的保护基保护咪唑基，这些保护基选自：对甲苯磺酰基(Tos)，9-芴基甲基-氧羰基(Fmoc)，三苯基甲基(trityl),2,4-二硝基苯基(Dnp),Boc和苄氧甲基(Bom)。Tos和Bom最优选于组氨酸(His)。
为本发明的目的，一个保护的氨基酸可表示为如，Lys(Boc),Gln(OtBu)，和Tyr(tBu)。
全部溶剂，包括甲醇(MeOH)，二氯甲烷(CH2Cl2)，乙腈(CH3CN)，醚，己烷和二甲基甲酰胺(DMF)，购自Fisher或Budick和Jackson。三氟乙酸(TFA)购自Halocarbon并且未经进一步纯化直接使用。二异丙基乙胺(DIPEA)，1,2-乙二硫醇(EDT)，二环己基碳二酰亚胺(DCC),N-羟基-琥珀酰亚胺(HOSu)和苯硫基甲烷购自Aldrich化学公司(Milwankee,WI),1-羟基苯并三唑(HOBT)购自Sigma化学公司(St.Louis,MI),[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和苯并三唑-1-基氧-三-(二甲基氨)-六氟磷酸鏻(BOP)购自Richelieu Biotechnoligies(St.Hyacinthe,Quebec,Canada)。2-甲氧-4-烷氧苄基醇共聚苯乙烯1％二乙烯基苯(Sasrin-树脂)购自Bachem Bioscience。Fmoc/tBu-保护的氨基酸全是L-型的并购自Bachem公司(Torrance,CA)。
分析性高效液相色谱(HPLC)在装有梯度主控(Master)和光谱鉴测器ⅢUV-可变的波长检测器的LDC Constrametric ⅡG上完成，并且在LichrosorbRP-8(5μ)柱(4.6mm×25cm)上进行；洗脱剂；带有20分钟线性梯度的(A)0.1M NaClO4(pH2.5)-(B)CH3CN；流速1ml/分钟；检测214nm。保护的中间体，Fmoc-(19-31)-NH2和Fmoc-(9-31)-NH2的HPLC在LichrosorbRP-8(5μ)柱(4.6mm×25cm)上进行；洗脱剂：(A)NaClO4(pH2.5)-(B)CH3CN；在20分钟内线性梯度40-90％(B)；流速1毫升/分钟；检测214nm。保护的Ac-(1-31)-NH2的HPLC在相同的柱上使用(B)CH3CN∶IPrOH(1∶1)进行；线性梯度60-95％(B)，20分钟内。环状VIP类似物的HPLC在(ⅰ)Vydac C-18柱上进行；洗脱剂：(A)H2O(0.1％TFA)-(B)CH3CN(0.1％TFA)；线性梯度在20分钟内15-30％(B)；流速1毫升/分钟；检测214nm(ⅱ)Zorbax Protein Plus柱；洗脱剂：(A)H2O(0.1％TFA)-(B)CH3CN(0.1％TFA)；线性梯度20-35％(B)，在20分钟内；流速2毫升/分钟；检测210nm(ⅲ)Lichrosorb RP-8(5μ)柱；洗脱剂：(A)NaClO4(pH2.5)-(B)CH3CN；线性梯度30％-50％(B)在20分钟；流速1毫升/分钟；检测206nm。制备性HPLC在Delta Prep 3000系统YMC ODS-A(120A,15μ)柱(4.7×50cm)上进行；洗脱剂(A)H2O(0.1％TFA)-(B)CH3CN∶MeOH(1∶1)(0.1％TFA)；线性梯度在3小时内20-50％(B)；流速80毫升/分钟；检测215nm。
快原子轰击质谱(FAB-MS)在Beckman VG2AB-1F或VG 70E-HF质谱仪中记录。在Beckman 121M型氨基酸分析仪上进行氨基酸分析。在110℃下于密封的真空管中用6N HCl(Pierce化学公司)水解保护的肽片段和游离肽。
在本发明中，通过反复的固相合成制备该四个肽片段Ⅰ-Ⅳ。贯穿该合成的偶联反应通过Kaiser茚三酮试验检测以测定反应的进程和完成。(Kaiser等，分析生物化学(Anal.Biochem.),34,595-598(1970)。通过如下的UV分析监测树脂的制备：
在合成过程中，保护的氨基酸(AA)树脂(Fmoc-AA-树脂)在任何位置的取代利用N-(9-芴基甲基)哌啶在301nm处的吸光度(ε=7800)。在试管中精确称量4-8mg的树脂并用0.5ml的溶于DMF中的20％哌啶处理。例如，加入0.5ml的溶于DMF的20％哌啶到含5.05mg Fmoc-Gly-树脂的试管中。在空试管中，以0.5ml的溶于DMF的0.5ml 20％哌啶作为空白。在随后的15分钟内，涡旋该含Fmoc-Gly-树脂的试管两到三次以确保所有树脂均匀接触哌啶溶液。在两试管中加入DMF至体积为50ml。在301nm处用空白将光度计调零。Fmoc-取代的吸光度计算如下：
Figure A9719207200111
通常，按如下步骤从肽树脂片段脱去Fmoc保护基：方案1:Fmoc-脱保护
    步骤     试剂     时间
    1     CH2Cl2     2×3
    2     DMF     3分钟
    3     25％哌啶     5分钟
    4     25％哌啶     15分钟
    5     DMF     3分钟
    6     MeOH     3分钟
    7     CH2Cl2     3分钟
    8     MeOH     3分钟
    9     CH2Cl2     3×3分钟
    10     DMF     3分钟
    11     偶联     90分钟
    12     DMF     3分钟
    13     MeOH     3分钟
    14     CH2Cl2     3分钟
    15     MeOH     2×3分钟
实施例1-8中所述的片段Ⅰ,Fmoc-(26-31)-NH2的合成包括用XAL-接头树脂并用苯并三唑1-基氧三-(二甲基氨)六氟磷酸鏻(BOP)作为偶联剂制备C-末端酰胺片段。通常，对每一氨基酸进行双偶联以确保最终纯度。一般地，四个当量的试剂用于首次偶联而第二次偶联使用两个当量的试剂。
实施例9-15中所述的片段Ⅱ,Fmoc-(19-25)-OH，的合成包括保护的七肽的分步的固相组装，其中，通过Fmoc-Asp(O-Sasrin)-OBzl将该COOH端残基，Asp，连接于Sasrin树脂的β-COOH处。起始的树脂偶联二肽，Fmoc-Leu-Asn-OH，其是以71.3％的收率(通过分析性HPLC测定纯度＞95％)制备于Fmoc-Leu-OH和H-Asn-OH(通过预活化Fmoc-Leu-OH成Fmoc-Leu-Osu)。将该三肽树脂分别用Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Lys(Alloc)-OH进行两循环的固相合成。将一部分所得的五肽-树脂依次用Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Ala-OH再进行两个循环的固相合成。用0.5％TFA-CH2Cl2切割一小份全部保护的七肽-树脂并通过HPLC得到1个主峰(估计纯度＞82％)。用Pd[(C6H5)3P]2和Bu3SnH进行Lys(Alloc)21-保护基的选择性去除，并用0.5％TFA-CH2Cl2切割所得的部分保护的七肽-树脂。需要总共五个10分钟的切割以彻底切除该树脂。通过分析性HPLC测定该产物，Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr-(tBu)-Leu-Asn-Asp(OBzl)纯度大于80％并得到75.7％的总收率(较之于起始树脂负载，Fmoc-Asp(O-Sasrin))-OBzl)。
该线性七肽的侧链对侧链的环化(Lys21对Asp25)用BOP和DIPEA在含有DMF的溶液中进行并在1.25小时内完成。此粗产物的分析性HPLC显示该线性七肽的几乎完全转变。用硅胶进行所得的环七肽的单步纯化。此纯化步骤除去任何在内酰胺化过程生成的寡聚体。该纯化的产物的分析性HPLC显示该环七肽的纯度＞98％。较之于起始树脂该纯化的环七肽的总收率为37％。
通过在涡旋仪上用10％钯碳在约六小时的时间内氢解进行该C末端苄酯的最终脱保护。随后，进行分析性HPLC，而得到＞97％纯度的总收率为33.7％(较之于起始树脂)的终产物，环(Lys21-Asp25)-Fmoc-Ala19-Lys(Boc)20-Lps21-Tyr(tBu)22-Leu23-Asn24-Asp25-OH。用1H-NMR光谱学证实该终产物的结构和鉴定并通过氨基酸分析和质谱充分表征。
实施例16-26中所述的片段Ⅲ,Fmoc-(9-18)-OH，和实施例27-36中所述的片段Ⅳ,Ac-(1-8)-OH的反复的固相合成用BOP作为隅联剂进行并用哌啶脱去该Fmoc保护基。高度的酸不稳定的Sasrin接头用于将侧链保护基保留在该片段上。通常，每个氨基酸进行两个偶联反应以确定最终纯度。首次隅联使用两当量的试剂而第二或第三次隅联使用一当量试剂。
切割后所得的平均纯度对肽片段Ⅲ为91％而对肽片段Ⅳ为95％。切割后所得的这些肽纯度令人满意地直接用于适于合成VIP类似物的肽片段而无需进一步纯化。
通过偶联该四个片段Ⅰ-Ⅳ而进行本发明的新的环状VIP类似物的合成，并如下所示。
Figure A9719207200141
脱保护的
每一循环的片段偶联是通过如下的相同步骤进行的：(1)用溶于DMF的10％Et2NH(2小时)脱去一个肽片段的Fmoc-保护基；(ⅱ)通过用已醚洗涤除去芴；(ⅲ)用溶于DMF-CH2Cl2的HBTU(1.2当量),HOBt(3.6当量)在0°/30分钟-一小时以及25°/3小时使用DIPEA(4.8当量)偶联该脱保护的肽片段和1.0当量的另一保护的片段；以及(ⅳ)蒸发并溶解于CH2Cl2，再用饱和的NaHCO3和10％柠檬酸萃取。
在一个优选的实施方案中，每一循环的片段偶联如下进行：(ⅰ)用溶于DMF的10％ Et2NH(2小时)脱去一个肽片段Ⅰ的Fmoc-保护基；(ⅱ)通过用已醚洗涤除去芴；(ⅲ)用溶于DMF-CH2Cl2的HBTU(1.2当量),HOBt(3.6当量)在0°/30分钟-一小时以及25°/3小时使用DIPEA(4.8当量)偶联该脱保护的肽片段和1.0当量的保护的片段Ⅱ；以及(ⅳ)蒸发并溶解于CH2Cl2，再用饱和的NaHCO3和10％柠檬酸萃取得到保护的中间体Fmoc(19-31)-NH2；(ⅴ)用溶于DMF的10％Et2NH(2小时)脱去中间体Fmoc(19-31)-NH2的Fmoc-保护基；(ⅵ)通过用已醚洗涤除去芴；(ⅶ)用溶于DMF-CH2Cl2的HBTU(1.2当量),HOBt(3.6当量)在0°/30分钟-一小时以及25°/3小时使用DIPEA(4.8当量)偶联该脱保护的中间体Fmoc(19-31)-NH2和1.0当量的保护的片段Ⅲ；以及(ⅷ)蒸发并溶解于CH2Cl2，再用饱和的NaHCO3和10％柠檬酸萃取得到的中间体Fmoc-(9-31)-NH2；(ⅸ)用溶于DMF的10％Et2NH(2小时)脱去中间体Fmoc(9-31)-NH2的Fmoc-保护基；(ⅹ)通过用已醚洗涤除去芴；(ⅹⅰ)用溶于DMF-CH2Cl2的HBTU(1.2当量),HOBt(3.6当量)在0°/30分钟一小时以及25°/3小时使用DIPEA(4.8当量)偶联该脱保护的中间体Fmoc(9-31)-NH2和1.0当量的保护的片段Ⅳ；以及(ⅹⅰ)蒸发并溶解于CH2Cl2，再用饱和的NaHCO3和10％柠檬酸萃取得到保护的中间体Ac-(1-31)-NH2。
实施例37-41详细描述该环VIP类似物的片段会聚合成。保护的中间体，Fmoc(19-31)-NH2,Fmoc(9-31)-NH2，和Ac(1-31)-NH2是在每个反应混合物循环中得到的主要产物。这些粗制的保护的中间体不再纯化并以其粗制的形式用于每个随后的循环中。分析性HpLC证明在所采用的条件下，起始材料被完全消耗。
充分保护的肽Ac(1-31)-NH2的最终脱保护是通过用TFA(90％)：EDT(3％)；苯硫基甲烷(5％)和苯甲醚(2％)在25℃反应2小时而进行的。分析性HPLC证明环状VIP类似物是该合成的主要产物(72-75％)。
通过过一次使用YMC ODS-A反相柱(4.7×50cm)的制备性HPLC进行该粗产物的纯化。用此柱可方便地实现粗产品的按比例放大到4.0g，而分离到总共8.48g纯化的环VIP类似物，或共9.95g(HPLC分析)估计为85.2％的粗产品型的本发明的环状VIP类似物。这相当于包括偶联反应，脱保护和纯化步骤的总收率为23.9％。由此法制备的环状VIP类似物通过分析性HPLC和毛细管电泳显示是均匀的(＞99％)。用FAB质谱和氨基酸分析确认了该环状VIP类似物的鉴定。
                        实施例
实施例1-8描述了保护的肽片段Ⅰ,Fmoc-(26-31-NH2),Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Lys-(Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-NH2的固相合成。实施例9-15描述了片段Ⅱ，环(Lys21-Asp25)-Fmoc-Ala19-Lys(Boc)20-Lys21-Tyr(tBu)22-Leu23-Asn24-Asp25-OH的合成。实施例16-26描述了保护的片段Ⅲ,Fmoc-(9-18)-OH,Fmoc-Asn-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-OH的固相合成。实施例27 36描述了保护的片段Ⅳ,Ac-(1-8)-OH,Ac-His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-OH的固相合成。实施例37-41描述了环VIP类似物，Ac(1-31)-NH2的合成。
                         实施例1
                  (3)-XAL-树脂的制备
用2×1500ml含10％三乙胺的NMP中和150g二苯甲基胺(BHA)树脂(负载：0.54毫当量/克，批号13933)，然后，用1000ml DMF,1000mlMeOH,1000ml CH2Cl2,1000ml MeOH和3×1000ml CH2Cl2洗涤。将96.3g(3)-XAL-接头(0.18mol,2.2当量),79.6g BOP(0.18mol)和24.3HOBt(0.18mmol)溶解于200ml NMP。加入47.03ml DIPEA，并将该溶液一次性加入含该中和的树脂的反应器中。搅拌该混合物90分钟。
移出一小份并用DMF和MeOH洗涤。通过UV分析测定该XAL-接头的负载为0.365mmol/g。用1000ml DMF,1000ml MeOH,1000ml CH2Cl2和2×1000ml MeOH洗涤该XAL-树脂。用1000ml，溶于CH2Cl2的10％乙酸酐和10％DIPEA封闭未偶联的BHA树脂30分钟。然后，过滤该树脂并用1000ml CH2Cl2,1000ml MeOH,2×1000ml CH2Cl2和2×1000mlMeOH洗涤。
                         实施例2
             Fmoc-Thr(t-Bu)-XAL-BHA的制备
在第一次偶联时，将119.2g Fmoc-Thr(t-Bu)-OH(300mmol),132gBOP(300mmol)和40.5g HOBt(300mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于1000ml NMP。加入78.4ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入实施例1所制备的XAL-树脂。搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用1000ml DMF(3分钟),1000ml MeOH(3分钟),1000mlCH2Cl2(3分钟)和2×1000ml MeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联时，将59.6g Fmoc-Thr(t-Bu)-OH(150mmol),66.3gBOP(150mmol)和20.2g HOBt(150mmol)在室温下搅拌于溶于1000ml NMP。将39.2ml DIPEA加入上述溶液，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入该树脂，并搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用1000ml DMF(3分钟),1000ml MeOH(3分钟),1000mlCH2Cl2(3分钟)和2×1000mlMeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Thr(t-Bu)-XAL-BHA树脂。
                         实施例3
           Fmoc-Gly-Thr-(t-Bu)-XAL-BHA的制备
按方案1所述的方法进行Fmoc-Thr(t-Bu)-XAL-BHA的Fmoc保护基的脱保护。Fmoc-Gly-OH对Thr(t-Bu)-XAL-BHA的偶联如下进行：
在第一次偶联时，将89.2g Fmoc-Gly-OH(300mmol),132gBOP(300mmol)和40.5g HOBt(300mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于1000ml NMP。加入78.4ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入Thr(t-Bu)XAL-BHA树脂。搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用1000ml DMF(3分钟),1000ml MeOH(3分钟),1000mlCH2Cl2(3分钟)和2×1000mlMeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联时，将44.6g Fmoc-Gly-OH(150mmol),66.3gBOP(150mmol)和20.2g HOBt(150mmol)在室温下搅拌溶于1000ml NMP。将39.2ml DIPEA加入上述溶液，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入该树脂，并搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用1000ml DMF(3分钟),1000ml MeOH(3分钟),1000mlCH2Cl2(3分钟)和2×1000mlMeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA树脂。
                         实施例4
            Fmoc-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA的制备
按方案1所述的步骤进行Fmoc-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA的Fmoc保护基的脱保护。偶联Fmoc-Gly-OH到Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA如下进行：
在第一次偶联时，将89.2g Fmoc-Gly-OH(300mmol),132gBOP(300mmol)和40.5g HOBt(300mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于1000ml NMP。加入78.4ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA树脂。搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用1000ml DMF(3分钟),1000ml MeOH(3分钟),1000mlCH2Cl2(3分钟)和2×1000mlMeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联时，将44.6g Fmoc-Gly-OH(150mmol),66.3gBOP(150mmol)和20.2g HOBt(150mmol)在室温下搅拌溶于1000ml NMP。将39.2ml DIPEA加入上述溶液，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入该树脂，并搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用1000ml DMF(3分钟),1000ml MeOH(3分钟),1000mlCH2Cl2(3分钟)和2×1000mlMeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA树脂。
                         实施例5
 Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA的制备
按方案1所述的步骤进行Fmoc-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA的Fmoc保护基的脱保护。偶联Fmoc-Lys-(Boc)-OH到Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA如下进行：
在第一次偶联时，将140.5g Fmoc-Lys(Boc)-OH(300mmol),132gBOP(300mmol)和40.5g HOBt(300mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于1000ml NMP。加入78.4ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA树脂。搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用1000ml DMF(3分钟),1000ml MeOH(3分钟),1000mlCH2Cl2(3分钟)和2×1000mlMeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联时，将70.3g Fmoc-Lys(Boc)-OH(150mmol),66.3gBOP(150mmol)和20.2g HOBt(150mmol)在室温下搅拌于溶于1000ml NMP。将39.2ml DIPEA加入上述溶液，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入该树脂，并搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用1000ml DMF(3分钟),1000ml MeOH(3分钟),1000mlCH2Cl2(3分钟)和2×1000mlMeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA树脂。
                         实施例6
Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA的制备
按方案1所述的步骤进行Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA的Fmoc保护基的脱保护。偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH到Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA如下进行：
在第一次偶联时，将140.5g Fmoc-Lys(Boc)-OH(300mmol),132gBOP(300mmol)和40.5g HOBt(300mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于1000ml NMP。加入78.4ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA-树脂。搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用1000ml DMF(3分钟),1000ml MeOH(3分钟),1000mlCH2Cl2(3分钟)和2×1000mlMeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联时，将70.3g Fmoc-Lys(Boc)-OH(150mmol),66.3gBOP(150mmol)和20.2g HOBt(150mmol)在室温下搅拌溶于1000ml NMP。将39.2ml DIPEA加入上述溶液，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入该树脂，并搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用1000ml DMF(3分钟),1000ml MeOH(3分钟),1000mlCH2Cl2(3分钟)和2×l000mlMeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA树脂。
                         实施例7
Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA的制备
按方案1所述的步骤进行Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA的Fmoc保护基的脱保护。偶联Fmoc-Leu-OH到Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA如下进行：
在第一次偶联时，将106g Fmoc-Leu-OH(300mmol),132gBOP(300mmol)和40.5g HOBt(300mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于1000ml NMP。加入78.4ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA树脂。搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用1000ml DMF(3分钟),1000ml MeOH(3分钟),1000mlCH2Cl2(3分钟)和2×1000mlMeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联时，将53g Fmoc-Leu-OH(150mmol),66.3gBOP(150mmol)和20.2g HOBt(150mmol)在室温下搅拌溶于1000ml NMP。将39.2ml DIPEA加入上述溶液，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入该树脂，并搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用1000ml DMF(3分钟),1000ml MeOH(3分钟),1000mlCH2Cl2(3分钟)和2×1000mlMeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)XAL-BHA树脂。
该肽树脂片段Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(t-Bu)-XAL-BHA，也称为Fmoc-(26-31)-XAL-BHA，的最终重量为267g。
                         实施例8
               Fmoc-(26-31)-XAL-BHA的裂解
在装有10g保护的Fmoc-(26-31)-XAL-BHA的500ml圆底烧瓶中加入200ml溶于CH2Cl2的0.5％TFA。室温下搅拌该淤浆0.5分钟并过滤。立即加入吡啶调滤液pH到7。在旋转真空器上于室温下蒸发该滤液。用200ml蒸馏水研制该残留物，然后，用2×200ml醚洗涤。真空干燥该所得固态物得到保护的Fmoc-(26-31)-NH2。
然后，用200ml 0.5％TFA溶液再处理该过滤的肽-树脂五次，15分钟，随后用吡啶调pH至7。蒸发后，研制并干燥，HPLC分析每个裂解的样品。HPLC的条件是：柱：Lichrosorb RP-18,5m,25cm；洗脱剂：(a)0.1MHClO4/H2O(pH2.5),(b)MeCN；梯度：34％-39％MeCN/20分钟；流速：1ml/分钟；和检测器：210nm Knan。
合并所有纯度高于90％的肽片段得到总共3.01g。合并的材料的纯度为94.5％。
                         实施例9
            Fmoc-Asp(O-Sasrin)-OBzl的制备
用DMF(2×500ml)和CH2Cl2(3×500ml)洗涤2-甲氧-4-烷氧苄基醇共聚苯乙烯1％二乙烯基苯交联的树脂(Sasrin-树脂，25g,0.96毫当量/克(meq/g),24meq)。加入Fmoc-Asp-∝-O-苄酯(3.5g,78.56mmole,3.27当量(eq))的CH2Cl2(400ml)溶液并用机械摇动器摇动。加入DCC(16.2g,78.5mmole,3.27eq)的CH2Cl2(100ml)溶液，随后，加入N-甲基吗啉(3.36ml,30mmole,3.27eq)和4-二甲基氨基吡啶(0.293g,2.4mmole,0.1eq)并摇动5小时。移出一小份，用甲醇洗涤并干燥。UV分析的负载测定为0.60mmol/g-树脂。用DMF(2×500ml)和甲醇(5×500ml)洗涤该树脂并真空干燥得到32.8g Fmoc-Asp(O-Sasrin-树脂)-OBzl。将10g一份的该树脂悬浮于DMF(180ml)并依次加入苯甲酸酐(6.78g,30mmol,5eq)的DMF(40ml)溶液和DIPEA(5.22ml,30mmole,5eq)并摇动该悬浮液30分钟。用DMF(5×200ml)洗涤该树脂并测定取代量为0.60mmol/g。
                         实施例10
Nα-Fmoc-L-亮氨酰-L-天冬酰胺(Fmoc-Leu-Asn-OH)的合成
将Fmoc-L-Leu-OH(10g,28.32mmol)溶解于DMF(10ml)-CH2Cl2(70ml)的混合物并冰浴冷却。加入N-羟基琥珀酰亚胺(3.58g,31.14mmol,1.1当量)和二环己基碳二亚胺(6.06g,31.14mmol,1.1当量)并在0℃下搅拌一小时和25℃下14小时。冰浴冷却该反应混合物，过滤并用CH2Cl2(40ml)洗涤沉淀。蒸干滤液并将残留物溶于二噁烷(80ml)-H2O(10ml)的混合物形成Fmoc-Leu-OSu溶液。将无水的L-天冬酰胺(5.606g,42.48mmol,1.5当量)的60mlNa2CO3(2.50g,42.28mmol,1.5当量)溶液加入上述的Fmoc-Leu-OSu溶液。再加入10ml二噁烷并将该反应混合物在25℃下搅拌2小时。加入乙酸乙酯(200ml)到该反应混合物中并在搅拌下加入5％HCl水溶液调节其pH至大约2。分离EtOAc层，再每次用100ml萃取水层再4次。用饱和的NaCl(100ml),H2O(3×100ml)洗涤该合并的EtoAc萃取物无水Na2SO4干燥，过滤并蒸干。将残留物溶解于温(40-45℃)的DMF(60ml)并在浊点加入H2O。过夜后结晶该产物。过滤，用醚洗涤并从DMF-H2O中重结晶。从二噁烷中低压升华干燥得到9.45g(71.3％)产物。NMR和FAB质谱证明其分子式C25H29N3O6,(M+H)+的测定质量，468.3。分析性HPLC显示该产物Fmoc-Leu-Asn-OH的纯度＞95％(图4)。HPLC条件是：柱子：Lichrosorb RP-8(5μ)；洗脱剂：(A)0.1MNaClO4(pH2.5)-(B)CH3CN；梯度：20分钟内40％-80％；流速1ml/l分钟；检测：210nm。
                         实施例11
Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys(Alloc)-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-Sasrin-OBzl的制备
固相肽合成如下进行(使用20ml溶剂/g树脂)：1)20％哌啶/DMF,1分钟；2)20％哌啶、DMF,10分钟；3)DMF, 4×2分钟；4)NMP,1×2分钟；5)如本文所述偶联保护的氨基酸；以及6)DMF,3×2分钟。
如上述，以10g,0.60mmol/g,6.0mmol的Fmoc-Asp(O-Sasrin)-OBzl进行固相肽合成。通过如下偶联二肽，Fmoc-Leu-Asn-OH到H-Asp(O-Sasrin-树脂)-OBzl制备Fmoc-Leu-Asn-Asp(O-Sasrin-树脂)-OBzl：
向Fmoc-Asn-Leu-OH,4.2g,9mmol,1.5eq中加入HBTU,3.41g,9mmol,1.5eq；HOBT,4.13g,27mmol,4.5eq；DIPEA,3.135ml,18mmol,
3eq；和NMP/CH2Cl2(1∶1)220ml。偶联该混合物1.25小时。在此具体的偶联中，将Fmoc-Leu-Asn-OH溶于160ml的NMP-CH2Cl2(1∶1)。由于NMP和CH2Cl2的混合是放热的，将该溶剂在加入到该肽前先冷却并加入到H-Asp(O-Sasrin树脂)-OBzl，随后加入DIPEA和HOBt，并摇动该反应容器2分钟。然后，加入30ml冷CH2Cl2，并最终加入溶解于20ml NMP-CH2Cl2(1∶1)的HBTU溶液和10ml NMP。保持NMP∶CH2Cl2(1∶1)的比率。该偶联反应的pH维持在5-6。
通过如下方法将Fmoc-Tyr(tBu)-OH偶联到树脂来制备Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-Sasrin-树脂)：向Fmoc-Tyr(tBu)-OH,5.4g,12mmol,2eq中加入HBTU,3.4g,12mmol,2eq；HOBt,1.8g,12mmol,2eq；DIPEA,5.75ml,33mmol,5.5eq；和NMP.220ml。将此混合物加入树脂并偶联一小时。
通过如下方法将Fmoc-Lys(Alloc)-OH偶联到树脂来制备Fmoc-Lys(Alloc)-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-Sasrin-树脂)-OBzl：向Fmoc-Lys(Alloc)-OH,5.4g,12mmol,2eq中加入HBTU,3.4g,12mmol,2eq；HOBt,1.8g,12mmol,2eq；DIPEA,5.75ml,33mmol,5.5eq；和NMP,220ml。将此混合物加入树脂并偶联一小时。
加入Fmoc-Lys(Alloc)21-OH后，用甲醇洗涤该树脂并干燥到达13.3g(0.45mmol/g,5.98mmol)的保护的Fmoc-(21-25)-(O-Sasrin-树脂)-OBzl。将一半该肽-树脂(6.65g,2.99mmol)再进行上述的两循环固相合成并如下与Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联：向Fomc-Lys(Boc)-OH,2.8g,6mmol,2eq中加入BOP,2.65g,6mmol,2eq；HOBt,0.918g,6mmol,2eq；DIPEA,3.25ml,18.65mmol,6.2eq；和NMP 120ml。将此加入到树脂并偶联一小时；和Fmoc-Ala-OH，如下：向Fmoc-Ala-OH,1.86g,6mmol,2eq中加入HBTU,2.27g,6mmol,2eq；HOBt,0.90g,6mmol,2eq；和NMP 120ml。将此混合物加入树脂并偶联一小时。
用DMF(3×120ml)和甲醇(4×120ml)洗涤该树脂并真空干燥得到7.3g(0.39mmol/g,2.84mmole)保护的Fmoc(19-25)-(O-Sasrin-树脂)-OBzl。用0.5TFA-CH2Cl2切割一部分Fmoc(19-25)-(O-Sasrin-树脂)-OBzl并用分析性HPLC分析其纯度为＞82％。
                         实施例12
通过Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys(Alloc)-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-Sasrin)-OBzl的脱保护的Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asp(O-Sasrin)-OBzl。
将保护的六肽-树脂Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys(Alloc)-Tyr(tBu)--Leu-Asn-Asp(O-Sasrin)-OBzl(7.2g,0.39mmol/g,2.8mmol)悬浮于130ml CH2Cl2并用氦气鼓泡。并加入乙酸(0.330ml,5.75mmol)，二(三苯基膦)二氯化钯(0.138g,0.196mmol)和氢化三丁亭(tributyltin hydride)(3.165ml,11.9mmol)并用氦气鼓泡该肽-树脂1.5小时并将该反应器排水。重复上述反应总五遍以确保该Alloc基的彻底去保护。用0.5％TFA/CH2Cl2切割一小份肽-树脂并用分析性HPLC显示该Alloc基的彻底去保护。用CH2Cl2(2×120ml)和甲醇(4×120ml)洗涤该树脂并真空干燥得到7.1g(0.40mmol/g,2.84mmole)部分保护的肽-树脂Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-Sasrin)-OBzl。
                         实施例13
切割Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-Sasrin)-OBzl：制备Fmoc-Ala-Lys(Boc)Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-OBzl
用0.5％TFA的CH2Cl2(140ml)溶液在室温下处理7.1g(2.84mmol)部分保护的Fmoc-(19-25)-Sarin-树脂-OBzl十分钟，过滤并将滤液立即加入吡啶调节pH6-7。用0.5％的TFA的CH2Cl2溶液如上述再处理该肽-树脂四次并合并滤液，蒸发。用水研制该肽，过滤，用水充分洗涤并真空干燥。用无水醚洗涤该粗制肽并真空干燥得到3.26g(总得率，75.7％)部分保护的Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-OBzl，通过分析性HPLC测定其纯度大于80％。
                         实施例14
线型七肽的环化：制备Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-OBzl环(Lys21→Asp25)
将部分保护的线型七肽Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-OBzl 3.26g(2.27lmmol)的100ml DMF溶液在20分钟内缓慢加入磁力搅拌的BOP试剂2.0g(4.53mmol,2eq)和DIPEA3.16ml(18.14mmol,8eq)的500ml DMF溶液。室温下搅拌1.25小时后，移出一小份，分析性HPLC显示该线型肽彻底环化。再搅拌该反应混合物一小时，用乙酸酸化，并蒸至约20ml，加入蒸馏水(200ml)。过滤收集沉淀，用蒸馏水充分洗涤并真空干燥。用无水醚洗涤该产物并干燥得到3.0g该保护的环七肽。分析性HPLC显示线性肽几乎彻底转变成环七肽。将该物质溶于100ml的10％甲醇的CH2Cl2溶液。通过硅藻土过滤该溶液除去不溶物(寡聚体)并将滤液蒸干得到2.85g粗制的保护环肽。将该物质溶于100ml CH2Cl2并加料至Waters Prep Pack硅胶柱(4.7×30cm,15.20μl)；流速：50ml/分钟；检测：280nm。依次用CH2Cl2(500ml),5％MeOH的CH2Cl2(2000ml)溶液及最后的8％的MeOH的CH2Cl2溶液洗脱该柱。混合含纯肽(HPLC检测)的级分，蒸干并结晶于二噁烷得到1.445g纯化的七肽(总收率，37％)，分析性HPLC检测其纯度＞98％。
                         实施例15
制备Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-OH环(Lys21→Asp25)
将实施例14的全保护的环七肽(1.445g,1.111mmol)溶于装于振动混合器烧瓶中的氦气流下的60ml MeOH中。向其中加入0.314g 10％钯碳，在振动混合器中氢化该反应混合物3.5小时。分析性HPLC显示保留了约30％的苄酯充分保护的环七肽。再加入0.2g 10％钯碳并继续氢化2.75小时。分析性HPLC显示发生了彻底的脱去苄基。硅藻土过滤该反应混合物并用MeOH洗涤。蒸发该滤液和洗涤液并结晶于二噁烷得到1.225g(91.1％收率；总收率33.7％)的环七肽酸。分析性HPLC显示该产物纯度＞97％。通过氨基酸分析，FAB-MS，旋光度和1H-NMR光谱鉴定和确认该产物。
                         实施例16
                 制备Fmoc-Ala-Sasrin树脂
用500ml二氯甲烷，和2×500ml DMF洗涤50g2-甲氧-4-烷氧苄基醇共聚苯乙烯1％二乙烯基苯交联的树脂(Sasrin树脂)。
将74.6g Fmoc-Ala-OH(240mmol)溶解于650ml CH2Cl2/DMF(2∶1体积比)。冰浴冷该溶液并加入49.5g DCC(240mmol)，再加入1.46g4-二甲基氨基吡啶(12mmol)和6.27ml N-甲基吗啉(60mmol)。在轨道旋转摇动器中搅拌该混合物9小时。
过滤该树脂并用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和500ml MeOH(3分钟)洗涤。
移出一小份，干燥并通过UV定量分析该负载为0.54mmol/g。
然后，用2×500ml CH2CH2(3分钟)和500ml DMF(3分钟)洗涤该树脂。然后，悬浮该树脂于400ml DMF，并加入54.3g苯甲酸酐(240mmol)，随后，加入100ml DMF，和41.7ml二异丙基乙胺(240mmol)。摇动该悬浮液30分钟。过滤该树脂并用500ml CH2Cl2(3分钟)，500ml MeOH(3分钟)2×500mlCH2Cl2(3分钟)，500ml DMF(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤。
                         实施例17
               制备Fmoc-Nle-Ala-Sasrin树脂
按方案1所述的方法脱去Fmoc-Ala-Sasrin树脂的Fmoc基。如下进行Fmoc-Nle-OH对Ala-Sasrin的偶联：
在第一次偶联中，将19.08g Fmoc-Nle-OH(54mmol),23.9BOP(54mmol)和7.3g HOBt(54mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。向上述溶液中加入14.1ml DIPEA，并剧烈搅拌该混合物。将所得试剂一次性加到Ala-Sasrin树脂，并搅拌该混合物2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联中，将9.54g Fmoc-Nle-OH(27mmol),11.9gBOP(27mmol)和3.65 HOBt(27mmol)的混合物溶解于400ml NMP并在室温下搅拌。加入7.05ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。一次性加入所得试剂到树脂并搅拌2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Nle-Ala-Sasrin树脂。
                         实施例18
              制备Fmoc-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂
按方案1所述的方法脱去Fmoc-Nle-Ala-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联中，将19.9g Fmoc-Gln-OH(54mmol),23.9BOP(54mmol)和7.3g HOBt(54mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。向上述溶液中加入14.1ml DlPEA，并剧烈搅拌该混合物。将所得试剂一次性加到Nle-Ala-Sasrin树脂，并搅拌该混合物2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联中，将9.9g Fmoc-Gln-OH(27mmol),11.9gBOP(27mmol)和3.65 HOBt(27mmol)的混合物溶解于400ml NMP并在室温下搅拌。加入7.05ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。一次性加入所得试剂到树脂并搅拌2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂。
                         实施例19
      制备Fmoc-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂
按方案1所述的方法脱去Fmoc-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联中，将25.3g Fmoc-Lys(Boc)-Gln-OH(54mmol),23.9 BOP(54mmol)和7.3g HOBt(54mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400ml NMP。向上述溶液中加入14.1ml DIPEA，并剧烈搅拌该混合物。将所得试剂一次性加到Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂，并搅拌该混合物2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联中，将12.7g Fmoc-Lys(Boc)-OH(27mmol),11.9gBOP(27mmol)和3.65 HOBt(27mmol)的混合物溶解于400ml NMP并在室温下搅拌。加入7.05ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。一次性加入所得试剂到树脂并搅拌2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂。
                         实施例20
              制备Fmoc-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln
                    -Nle-Ala-Sasrin树脂
按方案1所述的方法脱去Fmoc-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联中，将40.1g Fmoc-Arg(Pmc)OH(54mmol),23.9BOP(54mmol)和7.3g HOBt(54mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。向上述溶液中加入14.1ml DIPEA，并剧烈搅拌该混合物。将所得试剂一次性加到Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂，并搅拌该混合物2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联中，将20.1g Fmoc-Arg(Pmc)-OH(27mmol),11.9gBOP(27mmol)和3.65 HOBt(27mmol)的混合物溶解于400ml NMP并在室温下搅拌。加入7.05ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。一次性加入所得试剂到树脂并搅拌2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂。
                         实施例21
          制备Fmoc-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Pmc)-Lys(Boc)
                   -Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂
按方案1所述的方法脱去Fmoc-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Nle-Ala-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联中，将19.1g Fmoc-Leu-OH(54mmol),23.9BOP(54mmol)和7.3g HOBt(54mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。向上述溶液中加入14.1ml DIPEA，并剧烈搅拌该混合物。将所得试剂一次性加到Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂，并搅拌该混合物2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联中，将9.6g Fmoc-Leu-OH(27mmol),11.9gBOP(27mmol)和3.65 HOBt(27mmol)的混合物溶解于400ml NMP并在室温下搅拌。加入7.05ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。一次性加入所得试剂到树脂并搅拌2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂。
                         实施例22
        制备Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)
               -Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂
按方案1所述的方法脱去Fmoc-Leu Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联中，将25.4g Fmoc-Lys(Boc)-OH(54mmol),23.9BOP(54mmol)和7.3g HOBt(54mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。向上述溶液中加入14.1ml DIPEA，并剧烈搅拌该混合物。将所得试剂一次性加到Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂，并搅拌该混合物2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联中，将12.7g Fmoc-Lys(Boc)-OH(27mmol),11.9gBOP(27mmol)和3.65 HOBt(27mmol)的混合物溶解于400ml NMP并在室温下搅拌。加入7.05ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。一次性加入所得试剂到树脂并搅拌2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂。
                         实施例23
          制备Fmoc-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)
                 -Lys(Boc)Gln Nle-Ala-Sasrin树脂
按方案1所述的方法脱去Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联中，将28.7g Fmoc-Thr(tBu)-OH(54mmol),23.9BOP(54mmol)和7.3g HOBt(54mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。向上述溶液中加入14.1ml DIPEA，并剧烈搅拌该混合物。将所得试剂一次性加到Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂，并搅拌该混合物2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联中，将14.4g Fmoc-Thr(tBu)-OH(27mmol),11.9gBOP(27mmol)和3.65 HOBt(27mmol)的混合物溶解于400ml NMP并在室温下搅拌。加入7.05ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。一次性加入所得试剂到树脂中并搅拌2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂。
                         实施例24
          制备Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-
               Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-
                        Ala-Sasrin树脂
按方案1所述的方法脱去Fmoc-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联中，将24.8g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(54mmol),23.9BOP(54mmol)和7.3g HOBt(54mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。向上述溶液中加入14.1ml DIPEA，并剧烈搅拌该混合物。将所得试剂一次性加到Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂，并搅拌该混合物2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联中，将12.4g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(27mmol),11.9gBOP(27mmol)和3.65 HOBt(27mmol)的混合物溶解于400ml NMP并在室温下搅拌。加入7.05ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。一次性加入所得试剂到树脂并搅拌2小时。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂。
                         实施例25
制备Fmoc-Asn-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂
通过对称酐方法(Symmetric anhydride method)偶联Fmoc-Asn-OH前，按方案1所述的方法脱去Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin的Fmoc基。
将19.4g Fmoc-Asn-OH(54mmol)，和7.3g HOBt(54mmol)溶解于135ml CH2Cl2和270ml DMF的混合液中。冰浴下搅拌该混合物，然后，加入11.2g DCC(54mmol)。搅拌该混合物30分钟，过滤并将滤液一次性加入到Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂((10-18)Sasrin树脂)。90分钟内完成该偶联。
然后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500ml CH2Cl2(3分钟)和2×500 MeOH(3分钟)洗涤所得的树脂。
在第二次偶联中，将19.4g Fmoc-Asn-OH(54mmol)和7.3gHOBt(54mmol)溶解于135ml CH2Cl2和270ml DMF的混合液中。在加入11.2gDCC(54mmol)前，冰浴中搅拌该混合物。搅拌该混合物30分钟，过滤并将滤液一次性加入该(10-18)-Sasrin树脂。在90分钟内，完成该偶联。
然后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500ml CH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤该树脂。在完成偶联后，不进行脱保护。终产物，Fmoc-Asn-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Sasrin树脂(Fmoc(9-18)-Sasrin树脂)的重量为112g。
                         实施例26
            从Fmoc(9-18)-Sasrin树脂上切割Fmoc(9-18)
用400ml 0.2％的TFA的CH2Cl2溶液在室温下处理20g Fmoc(9-18)-Sasrin树脂，然后，过滤。通过加入吡啶立即调节该滤液pH至pH7。蒸发该滤液并用50ml蒸馏水研制，然后，用50ml醚洗涤。真空干燥所得的固态物。
然后，再用400ml 0.2％TFA溶液，10分钟，处理该过滤的肽-树脂六次，随后，用吡啶调节pH至7。蒸发后，研制并干燥，进行HPLC分析。分析性HPLC的条件：柱：Lichrosorb RP-18,5m,25cm；洗脱剂：(a)0.1MHClO4/H2O(pH2.5),(b)MeCN；梯度：34％-39％MeCN/20分钟；流速：1ml/分钟；检测器：210nm Knau。合并所有的纯度高于90％的肽片段得到共9.9g。切割112g肽树脂所得的52g产物的平均纯度为91％。
                         实施例27
                制备Fmoc-Glu(OtBu)-Sasrin树脂
用500ml二氯甲烷，和2×500ml DMF洗涤50g 2-甲氧基-4-烷氧苄基醇共聚苯乙烯1％二乙烯基苯交联的树脂(Sasrin树脂)。
将102g Fmoc-Glu(OtBu)-OH(240mmol)溶解于500mlCH2Cl2/DMF(9∶1体积比)。冰浴冷却该溶液，然后加入DCC溶液(通过溶解49.5gDCC(240mmol)于100ml CH2Cl2/DMF(9∶1)中而制备)。搅拌该混合物30分钟，然后，过滤除去DCU。加入该滤液到上述洗涤的Sasrin树脂，随后，加入1.46g 4-二甲基氨基吡啶(12mmol)和6.27ml N-二甲基吗啉(60mmol)。在轨道式旋转器上搅拌该混合物9小时。
过滤该树脂，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和500ml MeOH(3分钟)洗涤。移出一小份，干燥并通过UV分析其负载为0.59mmol/g。
用2×500ml CH2Cl2(3分钟)和500ml DMFC(3分钟)洗涤该树脂。然后，悬浮该树脂于400ml DMF中，并加入54.3g苯甲酸酐(240mmol)，随后，加入100ml DMF，和41.7ml二异丙基乙胺(240mmol)。振摇该悬浮液30分钟。过滤Fmoc-Glu(OtBu)-Sasrin树脂并用500ml CH2Cl2(3分钟),500mlMeOH(3分钟),2×500ml CH2Cl2(3分钟),500ml DMF(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)洗涤。
                         实施例28
          制备Fmoc-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂
按方案1中所述方法脱去Fmoc-Glu-(OtBu)-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联时，将23.4g Fmoc-Thr(tBu)-OH(59mmol),26.1gBOP(59mmol)和8.0g HOBt(59mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。加入15.4ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入Glu(OtBu)-Sasrin树脂。搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500mlMeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联时，将11.7g Fmoc-Thr(tBu)-OH(29.5mmol),13.1gBOP(29.5mmol)和4.0g HOBt(29.5mmol)在室温下搅拌溶于400ml NMP。将7.7ml DIPEA加入上述溶液，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入该树脂，并搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500mlMeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂。
                         实施例29
       制备Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂
按方案1中所述方法脱去Fmoc-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联时，将22.8g Fmoc-Phe-OH(59mmol),26.1gBOP(59mmol)和8.0g HOBt(59mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。加入15.4ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂。搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500mlMeOH(3分钟)洗涤该树脂。
茚三酮试验显示该偶联反应已完成，因此，无需第二次偶联。
                         实施例30
      制备Fmoc-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂
按方案1中所述方法脱去Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联时，将20g Fmoc-Val-OH(59mmol),26.1gBOP(59mmol)和8.0g HOBt(59mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。加入15.4ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入Phe-Thr(tBu)-Glu。搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500mlMeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联时，将10g Fmoc-Val-OH(29.5mmol),13.1gBOP(29.5mmol)和4.0g HOBt(29.5mmol)在室温下搅拌溶于400ml NMP。将7.7ml DIPEA加入上述溶液，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入该树脂，并搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500mlMeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂。
                         实施例31
             制备Fmoc-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-
                    Glu(OtBu)-Sasrin树脂
按方案1中所述方法脱去Fmoc-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu-(OtBu)-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联时，将18.4g Fmoc-Ala-OH(59mmol),26.1gBOP(59mmol)和8.0g HOBt(59mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。加入15.4ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂。搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500mlMeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联时，将9.2g Fmoc-Ala-OH(29.5mmol),13.1gBOP(29.5mmol)和4.0g HOBt(29.5mmol)在室温下搅拌溶于400ml NMP。将7.7ml DIPEA加入上述溶液，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入该树脂，并搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500mlMeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂。
                         实施例32
             制备Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-
                Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂
按方案1中所述方法脱去Fmoc-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu-(OtBu)-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联时，将24.3g Fmoc-Asp(OtBu)-OH(59mmol),26.1gBOP(59mmol)和8.0g HOBt(59mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。加入15.4ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂。搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500mlMeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联时，将12.1g Fmoc-Asp(OtBu)-OH(29.5mmol),13.1gBOP(29.5mmol)和4.0g HOBt(29.5mmol)在室温下搅拌溶于400ml NMP。将7.7ml DIPEA加入上述溶液，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入该树脂，并搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),800ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500mlMeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Thr(t-Bu)XAL-Glu(OtBu)-Sasrin树脂。
                          实施例33
制备Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂
按方案1中所述方法脱去Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr-(tBu)-Glu-(OtBu)-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联时，将22.6g Fmoc-Ser(tBu)-OH(59mmol),26.1gBOP(59mmol)和8.0g HOBt(59mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。加入15.4ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr-(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂。搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500mlMeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联时，将11.3g Fmoc-Ser(tBu)-OH(29.5mmol),13.1gBOP(29.5mmol)和4.0g HOBt(29.5mmol)在室温下搅拌溶于400ml NMP。将7.7ml DIPEA加入上述溶液，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入该树脂，并搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500mlMeOH(3分钟)洗涤该Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂。
                         实施例34
制备Fmoc-His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂
按方案1中所述方法脱去Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu-(OtBu)-Sasrin树脂的Fmoc基。
在第一次偶联时，将36.6g Fmoc-His(Trt)-OH(59mmol),26.1gBOP(59mmol)和8.0g HOBt(59mmol)的混合物在室温下搅拌溶解于400mlNMP。加入15.4ml DIPEA到上述溶液中，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Gln(OtBu)-Sasrin树脂。搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500mlMeOH(3分钟)洗涤该树脂。
在第二次偶联时，将18.3g Fmoc-His(Trt)-OH(29.5mmol),13.1gBOP(29.5mmol)和4.0g HOBt(29.5mmol)在室温下搅拌溶于400ml NMP。将7.7ml DIPEA加入上述溶液，并剧烈搅拌该混合物。将所得的试剂一次性加入该树脂，并搅拌该混合物90分钟。
过滤后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500mlCH2Cl2(3分钟)和2×500ml(MeOH(3分钟))洗涤该Fmoc-His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Gln(OtBu)-Sasrin树脂。
                         实施例35
His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂的乙酰化
用2×25％哌啶处理保护的肽树脂Fmoc-His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂并如方案1的脱保护步骤所述洗涤。脱去Fmoc保护基后，如下进行N末端胺的乙酰化。
将100ml Ac2O和100ml DIPEA的800ml CH2Cl2溶液加入该肽树脂并让该反应进行90分钟。
过滤该树脂，然后，用500ml DMF(3分钟),500ml MeOH(3分钟),500ml CH2Cl2(3分钟)和2×500ml MeOH(3分钟)连续洗涤，并真空干燥，得到110g保护的Ac(1-8)-Sasrin树脂，Ac-His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂。
                         实施例36
切割Ac-His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Sasrin树脂
用400ml 0.5％的TFA的CH2Cl2溶液在室温下处理20g保护的Ac(1-8)Sasrin树脂一分钟，然后，过滤。立即通过加入吡啶调节滤液pH至7。蒸发该滤液，用50ml蒸馏水研制该残留物，然后，用50ml醚洗涤。真空干燥所得固态物。然后，再用400ml 0.5％的TFA溶液处理该过滤的肽-树脂三次，随后用吡啶调节pH至7。蒸发，研制和干燥后，进行HPLC分析。
再用400ml 0.3％TFA溶液，10分钟处理该过滤的肽-树脂三次，随后，用吡啶调节pH至7。蒸发，研制和干燥后，进行该肽片段的HPLC分析。分析性HPLC的条件是：柱：Lichrosorb RP-18,5m,25cm；洗脱剂：(a)0.1M HClO4/H2O(pH2.5),(b)MeCN；梯度：34％到39％MeCN/20分钟；洗速：1ml/分钟；检测器：210nm Knan。
合并所有的纯度高于90％的肽共得到10.8g。获自110g肽树脂切割的总产量为46g，平均纯度为95％。
                         实施例37
合成Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-NH2(保护的Fmoc(19-31-NH2)
片段Ⅰ,Fmoc(26-31)-NH2(序列2)(8.91g,8.24mmol)溶解于90ml的10％的二乙胺的DMF溶液并在室温下搅拌2小时。真空蒸发该胺和溶剂并用己烷和醚(4∶1)的混合物研制该残留物，在过滤器上收集固态物并用己烷和醚的混和物(4∶1)洗涤，得到7.0g无色粉末H-(26-31)-NH2(收率98.9％)。
片段Ⅱ,Fmoc(19-25)-OH(序列3)(7.89g,8.15mmol),H(26-31)-NH2(7.0g,8.15mmol),HOBt(4.49g,29.3mmol)和DIPEA(6.81ml,39.1mmol)溶解于120ml DMF/CH2Cl2(1∶1)，然后，在冰水浴中搅拌。在10分钟内，分批加入固态HBTU(3.71g,9.78mmol)到上述溶液中。在0℃下继续搅拌30分钟，然后，在室温下3小时。真空蒸发该溶液除去溶剂并将该残留物溶于CH2Cl2。依次用饱和的NaHCO3(3次),10％柠檬酸水溶液(2次)，水和盐水洗涤该溶液并用无水MgSO4干燥。过滤该溶液并真空干燥该滤液得到17.4g粗制的保护的中间体无色固态物Fmoc(19-31)-NH2，收率约100％。分析性HPLC(测定该产物的纯度约70％)。
                         实施例38
合成Fmoc-Asn-Tyr(tBu)-Thr(tBur)-Lys(Boc)-Leu-Arg-(Pmc)-Lys(Boc)-(Gln-Nle-Ala-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-NH2:(保护的Fmoc(9-31-NH2)
Fmoc(19-31)-NH2(17.4g)溶解于90ml的10％的二乙胺的DMF溶液并在室温下搅拌2小时。真空蒸发该胺和溶剂并用己烷和醚(3∶1)的混合物研制该残留物，滤器收集固态物并用己烷和醚的混和物(3∶1)洗涤，得到16.67g无色粉末H-(19-31)-NH2(收率100)。
Fmoc(9-18)-OH(序列4)(16.59g,8.15mmol),H(19-31)-NH2(16.67g),HOBt(4.49g,29.3mmol)和DIPEA(6.81ml,39.1mmol)溶解于150ml DMF/CH2Cl2(2∶1),(该溶液稍为浑浊)，然后，在冰水浴中搅拌。在10分钟内，分批加入HBTU(3.70g,9.78mmol)到上述溶液中。溶液变成透明并在0℃下继续搅拌30分钟，然后，在室温下3小时。真空蒸发该溶液除去溶剂并将该残留物溶于CH2Cl2。依次用饱和的NaHCO3(3次),10％柠檬酸水溶液(2次)，水和盐水洗涤该溶液并用无水MgSO4干燥。过滤该溶液并真空干燥该滤液得到24.77g粗制的保护的中间体无色固态物Fmoc(9-31)-NH2，收率约79％。分析性HPLC测定该产物的纯度约69％。
                         实施例39
合成Ac-His(Trt)-Ser(tBu)Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-NH2(保护的Ac(1-31)-NH2
Fmoc(19-31)-NH2(24.77g)溶解于100ml的10％的二乙胺的DMF溶液并在室温下搅拌2小时。真空蒸发该胺和溶剂并用己烷和醚(3∶1)的混合物研制该残留物，滤器收集固态物并用己烷和醚的混和物(3∶1)洗涤，得到22.56g无色固体H-(29-31)-NH2(收率96.7％)。
H(19-31)-NH2(22.56g,6.22mmol),Ac(1-8)OH(序列5)(8.79g,6.22mmol),HOBt(3.43g,22.38mmol)和DIPEA(5.19ml,29.84mmol)溶解于200ml DMF/CH2Cl2(1∶1)，然后，在冰水浴中搅拌，同时在10分钟内，分批加入HBTU(2.83g,7.46mmol)到上述溶液中。在0℃下继续搅拌30分钟，然后，在室温下3小时。蒸发该溶液并将该残留物溶于CH2Cl2。依次用饱和的NaHCO3(3次),10％柠檬酸水溶液(2次)，水和盐水洗涤该溶液并用无水MgSO4干燥。过滤该溶液并蒸发该滤液得到29.54g粗制的保护的无色固态物Ac(1-31)-NH2，收率约72.2％。分析性HPLC测定该产物的纯度约78％。
                         实施例40
保护的Ac(1-31)-NH2的脱保护：合成环状VIP类似物
将保护的Ac(1-31)-NH2(29.54g)溶解于150ml的TFA(135ml),EDT(4.5ml)，苯甲硫醚(7.5ml)，苯甲醚(3ml)的混合液中并在室温下搅拌2小时。蒸发该溶液除去TFA并注入500ml预冷的醚中得到沉淀，收集，并用醚彻底洗涤。真空干燥该产物得到25.5g Ac(1-31)-NH2，无色，粉末，HPLC测定其纯度约72-75％。
                         实施例41
环状VIP类似物的纯化
在Delta Prep 3000系统上通过制备性HPLC多道进行该粗制的肽Ac(1-31)-NH2的纯化。定量HPLC(分析一小份Zorbax Protection Plus柱(对环状VIP类似物标准品)的粗产品发现在重25.5g粗产品中有9.95g该类似物。在一类型道中，将该肽(4g)溶解于200ml 0.1％TFA/H2O并施加到YMC ODS-A(120A,15μ)柱(4.7×50cm)。流动相是(A)0.1％TFA/H2O-(B)0.1％TFA)50％MeOH-CH3CN。以流速80ml/分钟的梯度洗脱起始于20％(B)(10分钟)，然后在180分钟内20％-50％(B)。在215nm进行UV检测。收集包括主峰的级分并通过分析性HPLC检测。混合判断为高纯度的级分，在冷指旋转蒸发器(cold finger rotary evaporator)上浓缩，并冻干得到1.2g环状VIP类似物Ac(1-31)-NH2。通过相同方法处理该粗产物的其余部分得到总8.48g(85.2％回收率)的纯化的环状VIP类似物；总收率23.9％。分析性HPLC和毛细管电泳证实该产物纯度＞99％。用氨基酸分析，FAB-MS，旋光性，紫外吸收和圆二色性鉴定本产物并确认其鉴定。
                            序列表(1)一般资料
(ⅰ)申请人
  (A)姓名：F.HOFFMANN-LA ROCHE AG
  (B)街道：Grenzacherstrasse 124
  (C)城市：Basle
  (D)州：BS
  (E)国家：Switzerland
  (F)邮编(ZIP)：CH-4010
  (G)电话：061-6885108
  (H)传真：061-6881395
  (I)电传：962292/965542 hlr ch
(ⅱ)发明名称：VIP类似物的合成
(ⅲ)序列数：7
(ⅳ)计算机可读形式：
  (A)媒体类型：软盘
  (B)计算机：Apple Macintosh
  (C)操作系统：Apple Macintosh
  (D)软件：Word 5.1
(ⅴ)当前申请资料：
申请号：EP(2)序列1资料：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：31aa
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单
  (D)拓朴结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：无
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：21..25
  (D)其它资料：/注=“在LYS21到ASP25处环化的侧链”
(ⅹⅰ)序列描述：序列1
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln
1               5                    10                 15
Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr
            20                  25                  30(2)序列2资料：
(ⅰ)序列特征
  (A)长度：6aa
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：无
(ⅹⅰ)序列描述：序列2
Leu Lys Lys Gly Gly Thr
1                5(2)序列3资料：
(ⅰ)序列特征
  (A)长度：7aa
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：无
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：3..7
  (D)其它资料：/注=“在LYS3到ASP7的侧链是环化的”
(ⅹⅰ)序列描述：序列3
Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp
1               5(2)序列4资料：
(ⅰ)序列特征
  (A)长度：10aa
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：无
(ⅹⅰ)序列描述：序列4：
Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln Xaa Ala
1               5                   10(2)序列5资料：
(ⅰ)序列特征
  (A)长度：8aa
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：无
(ⅹⅰ)序列描述：序列5：
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu
1               5(2)序列6资料：
(ⅰ)序列特征
  (A)长度：13aa
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：无
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：3..7
  (D)其它资料：/注=“在LYS3和ASP7的侧链是环化的”
(ⅹⅰ)序列描述：序列6
Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr
1               5                   10(2)序列7资料：
(ⅰ)序列特征
  (A)长度：23aa
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：无
(ⅹⅰ)序列描述：序列7：
Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn
1               5                   10                  15
Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr
            20

Claims (16)

1．一种合成化合物Ac-(1-31)-NH2(序列1)的方法，该方法包括偶联Fmoc保护的肽片段。
2．权利要求1的方法，其中所述的Fmoc保护的肽片段是肽片段Ⅰ(序列2)，肽片段Ⅱ(序列3)，肽片段Ⅲ(序列4)和肽片段Ⅳ(序列5)。
3．权利要求2的方法，该方法包括：
(a)脱去肽片段Ⅰ的Fmoc保护基并将该脱保护的肽片段Ⅰ和保护的肽片段Ⅱ偶联；
(b)脱去步骤(a)所得的肽的Fmoc保护基并将其与保护的片段Ⅲ偶联；
(c)脱去步骤(b)所得的肽的Fmoc保护基并将其与保护的片段Ⅳ偶联；
(d)脱去步骤(c)所得的肽的Fmoc保护基得到保护的Ac(1-31)-NH2。
4．权利要求3的方法，进一步包括纯化脱保护的肽Ac(1-31)-NH2。
5．权利要求4的方法，其中的纯化通过制备性HPLC进行。
6．一种通过偶联四种Fmoc保护的肽片段，即肽片段Ⅰ(序列2)，肽片段Ⅱ(序列3)，肽片段Ⅲ(序列4)和肽片段Ⅳ(序列5)，而合成纯化的化合物Ac(1-31)-NH2(序列1)的方法，该方法包括：
(a)脱去肽片段Ⅰ的Fmoc保护基；
(b)将该脱保护的肽片段Ⅰ和保护的肽片段Ⅱ偶联得到保护的中间体Fmoc(19-31)-NH2；
(c)脱去中间体Fmoc(9-31)-NH2的Fmoc保护基；
(d)将该脱保护的中间体Fmoc(19-31)-NH2和保护的片段Ⅲ偶联得到保护的中间体Fmoc(9-31)-NH2；
(e)脱去中间体Fmoc(9-31)-NH2的Fmoc保护基；
(f)将该脱保护的中间体Fmoc(9-31)-NH2和保护的片段Ⅳ偶联得到保护的中间体Ac-(1-31)-NH2；
(g)脱去保护的肽Ac(1-31)NH2的保护基；以及
(h)纯化该脱保护的肽Ac(1-31)-NH2。
7．权利要求6的方法，其中在步骤(h)中的纯化是通过制备性HPLC完成的。
8．权利要求6的方法，其中所述的肽片段和中间体的Fmoc保护基是用10％的Et2NH的DMF溶液脱保护的。
9．权利要求6的方法，其中，在脱保护后，通过用己烷-醚洗涤所述的肽和中间体而除去芴。
10．权利要求6的方法，其中，所述的脱保护的肽片段和中间体是
(a)使用HBTU,HOBt的DMF-CH2Cl2溶液，使用DIPEA，与1.0当量的所述的保护的肽片段偶联；
(b)蒸发并溶解于CH2Cl2；以及
(c)用饱和的NaHCO3和10％的柠檬酸抽提。
11．权利要求10的方法，其中，所述的偶联是用1.2当量的HBTU，3.6当量的HOBt和4.8当量的DIPEA在0°/30分钟-1小时和25°/3小时下进行的。
12．一种选择于Fmoc(19-31)-NH2(序列6)和Fmoc(9-31)-NH2(序列7)的肽。
13．一种选择于Fmoc-(26-31)-NH2(序列2)；Fmoc-(19-25)-OH(序列3)；Fmoc-(9-18)-OH(序列4)；和Ac-(1-8)-OH(序列5)的保护的肽片段。
14．权利要求13的肽片段，其中，(序列2)；(序列3)和(序列4)是脱保护的。
15．利用权利要求12-14任一定义的片段制备化合物Ac-(1-31)-NH2(序列1)的用途。
16．上文所述的本发明。
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