CN1458846A - 促红细胞生成性合成蛋白 - Google Patents

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C·L·亨特
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D·W·罗
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Abstract

本发明提供一些促红细胞生成性合成蛋白。还提供用于合成这些蛋白的方法。本发明还涉及这些促红细胞生成性合成蛋白以特定方式聚合物修饰的衍生物。此外还提供与这些蛋白及其衍生蛋白有关的方法和应用。

Description

促红细胞生成性合成蛋白
发明技术领域：
本发明涉及以特定方式聚合物修饰的促红细胞生成性合成蛋白，及其产生方法和应用。
参照相关申请：
在某种程度上，该申请是美国专利申请系列60/231,330(2000年9月8日提交)和60/236,377(2000年9月29日提交)的延续，其内容均在此完整引入作为参考。
发明背景：
红细胞生成是指产生红细胞的过程，该过程可以调节红细胞的更新和损耗。促红细胞生成素(EPO)是一种能够刺激红细胞生成的蛋白激素，天然的人EPO是一种含有165个氨基酸的糖蛋白，该蛋白最初在肾脏中产生，然后被分泌进入血流，继而在骨髓中刺激前体细胞产生红细胞。人EPO编码基因的预测产物是一种含有166个氨基酸残基的分子，但是在成熟形式的人EPO中，C端的精氨酸在翻译后修饰过程中被去除。
糖基化人EPO在第24、38和83位上带有3个N-联糖链。在第126位上还带有一个O-联糖链。糖基化的影响十分复杂。非糖基化EPO在体外具有活性。但研究表明，糖基化是EPO在体内具有全部活性所必需的。研究还表明，不同的糖基化模式可表现出不同的影响。例如，去唾液酸化EPO在体外的活性增强，但在体内的活性减弱，该结果归因于暴露的半乳糖残基被肝细胞识别、结合并清除。此外，完全唾液酸化EPO的分支模式可导致生物活性的差异。主要呈四角分支模式的EPO可表现出与“标准”EPO相同的活性，而主要呈二角分支模式的EPO可在体外具有高出三倍的活性，但在体内仅为正常活性的15％。此外，有多项研究表明，对EPO功能具有重要作用的只有N-联糖，而不包括O-联糖。
目前有几种药品可以使用，这些药品含有重组产生的糖基化EPO。但目前可用的EPO药品在血浆中的半衰期较短，并且易于被蛋白酶降解，因而其使用受到限制。由于各N-联糖基化位点及位点之间的分支情况和唾液酸含量高度不均一，所以这些药品还含有糖基化形式不同的复合混合物。这些缺点都会阻碍其产生最大的临床效力。
有人将PEG(聚乙二醇)等水溶性聚合物联接于这些EPO蛋白，以改善其循环半衰期和其他特性，但由于很难将其以受控方式和自定精确方式进行连接，所以获得的是混合产物。例如，已有多种方法被用来将PEG等聚合物基团和相关聚合物联接于蛋白上的活性基团(参考美国专利4,179,337(Davis et al.)和美国专利4,002,531(Royer))。有关综述，可参考”酶类药物”(J.S.Holcerberg andJ.Robert，eds.pp.367-383(1981)中的Abuchowski et al.以及Zalipsky，S.(Bioconjugate Chemistry(1995)6：150-165)。关于利用PEG和其他聚合物来修饰蛋白的论述，还可参考Cheng，T.-L.et al.，Bioconjugate Chem.(1999)10：520-528；Belcheva，N.etal.，Bioconjugate Chem.(1999)10：932-937；Bettinger，T.etal.，Bioconjugate Chem.(1998)9：842-846；Huang，S.-Y.et al.，Bioconjugate Chem.(1998)9：612-617；Xu，B.et al.Langmuir(1997)13：2447-2456；Schwarz，J.B.et al.，J.Amer.Chem.Soc.(1999)121：2662-2673；Reuter，J.D.et al.，BioconjugateChem.(1999)10：271-278；Chan，T.-H.et al.，J.Org.Chem.(1997)62：3500-3504)。蛋白上的典型连接位点包括伯氨基，如赖氨酸残基上或N末端的伯氨基，伯巯基，如半胱氨酸侧链的伯巯基，以及伯羧基，如谷氨酸残基或天冬氨酸残基上或C末端的伯羧基。最常见的连接位点是糖蛋白的糖残基、半胱氨酸，或靶蛋白的N末端和赖氨酸。
目前已描述过多种将聚合物联接于EPO的不同方法，但联接的过程无不趋于复杂。必须注意的是减少由结合反应导致的生物活性损失。例如，通常可利用折叠蛋白或重折叠蛋白来尽量减少结合位点的数量。但是，若靶蛋白或靶多肽上结合了过多的活性聚合物，其生物活性会严重降低或丧失。同样，若使用错误的连接体来联接聚合物和蛋白，或联接于靶蛋白的聚合物量不足，就会使所得结合物的治疗价值受到限制，并可能无法由循环寿命的延长来充分弥补生物活性的损失。修饰聚合物对蛋白活性位点的封闭也会带来一些问题。由于聚合物与蛋白的结合通常是在基于溶液的反应体系中进行，因而这种问题很难避免。有人建议用磷酸吡哆醛等物质对活性位点进行预封闭，但产生的结果并不一致(参考美国专利4,179,337(Davis et al.))。对通常带有少量与生物活性无关的结合位点的低分子量蛋白和肽而言，这些问题显得尤为尖锐。
举例来说，常见的一种技术是将水溶性聚合物联接于靶蛋白的伯氨基(如N末端氨基和赖氨酸的ε-氨基)。还有使用巯基反应性聚合物结合体将聚合物联接于半胱氨酸的巯基侧链。这两种方法都具有明显的问题，因为大多数蛋白都含有遍布于多肽骨架不同区域的多个上述活性基团，这些活性基团在确定蛋白的活性、折叠、再折叠和稳定性方面具有重要的作用。因此，尽管这些方法被普遍使用，但或多或少都会使蛋白的生物活性出现一定的或不必要的降低，并且通常会产生难以分离和鉴定的复合混合物(Delgada et al.，PharmaceuticalSciences(1997)3：59-66)。
为了减少随机结合，有人尝试制备了一些将天然赖氨酸去除并在特定聚合物结合位点添加赖氨酸的蛋白(美国专利4,904,584)。例如，有人用这种方式对G-CSF和IL-2进行了修饰。为了避免随机结合，还有人尝试制备了一些将天然半胱氨酸去除并在特定聚合物结合位点添加半胱氨酸的蛋白，或不将存在的天然半胱氨酸去除而只添加半胱氨酸的蛋白(EP0668353)。例如，有人制备出这样的EPO。尽管这些半胱氨酸或赖氨酸变异体理论上能够用于聚合物的位点特异性结合，但仍不能保证对所有选定位点进行受控修饰。
有一些蛋白包含多个带有相同或相似活性功能基团的侧链的氨基酸，在无法对这些蛋白进行位点特异性修饰的情况下，目前的工作集中在对蛋白的氨基或羧基末端进行修饰。氨基或羧基末端的修饰依赖于一些能够对这些位点进行单一修饰的化学结合技术(WO90/02136和WO90/02135)。例如，有人用该技术将PEG链与G-CSF和趋化因子IL-8的N-端残基相结合(Gaertner et al.，Bioconjug.Chem.(1996)7(1)：38-44；和WO96/41813)。但N-端或C-端修饰通常会降低蛋白的活性(可参考，例如，美国专利5,985,265中关于将PEG联接于G-CSF的N-端和赖氨酸侧链的论述)。尽管用水溶性聚合物对蛋白进行修饰的方法存在一些缺陷，但是将蛋白聚乙二醇化以及与其他水溶性聚合物联接的研究仍在继续。例如，还有人描述了将PEG联接于促红细胞生成素(EPO)的糖链和赖氨酸等内部氨基酸的方法(EP0605963和WO00/32772)，以及联接于N-末端的方法(美国专利6,077,939和WO00/32772)。遗憾的是，产生的这些聚乙二醇化EPOs是难以分离和鉴定的复合混合物。
另一个问题是上述聚合物具有高度非均一性，从而难以对聚合物修饰蛋白的混合物进行分析鉴定和纯化(Delgada et al.，Pharmaceutical Sciences(1997)3：59-66)。举例来说，用于制备PEG链或PEG型链的技术都涉及一个难以控制的聚合步骤，甚至分子量为3400等相对较低的值时也是如此，该步骤会使制备产物的链长分散在某一平均值附近；也就是说，这些技术涉及制备出(CH2CH2O)n的聚合物，其中的n不是一个离散值，而是在平均值附近的一个范围。衍生蛋白的这种不均一性通常会使其具有不易鉴定的一系列特性，更不用说将其分离。
但遗憾的是，目前用于治疗性应用的所有EPO蛋白都是由DNA重组技术获得，这使鉴定并采用适当聚合物的难题更加严重。DNA重组技术的使用严重限制了性能促进性基团与重组产生的EPO蛋白之间形成联接的类型和特异性。其原因首先是适用于联接的功能基团数量非常有限，其次是在被修饰的蛋白中通常含有若干个活性功能基团，从而使修饰不可能具有任何的特异性。例如，已有研究表明，当超氧化物歧化酶与PEG非选择性联接时，被修饰的酶的一些组分完全失活(P.McGoff et al.，Chem.Pharm.Bull.(1988)36：3079-3091)。此外，若随机联接了不同数量的这些基团，就会无法精确预测这种治疗性蛋白的药代动力学，从而使定量给药成为一个很大的难题。无法对连接进行控制还会导致：(a)效能降低、(b)需要用烦琐的纯化方法来分离大量的混合衍生物，以及(c)修饰基团的联接可能不稳定。此外，一些该领域已知的联接还具有免疫原性，如基于tresylchloride的联接。
因此，可以将PEG等水溶性聚合物联接于由生物学方法产生的蛋白，以延长这些蛋白的循环半衰期，并降低其蛋白水解作用和免疫原性，同时改善这些蛋白的其他特性，但由于很难将其以受控方式和自定精确方式进行连接，所以获得的是混合产物。并且在自定的精确位点进行聚合物联接的成果有限，因而对普遍适用于蛋白联接的优选位点的了解还十分缺乏。此外，由于联接的随机性以及PEG和普遍用于联接的其他水溶性聚合物的异向扩散性，目前还难以对PEG-蛋白结合物进行纯化和分析鉴定。因此，难以对可重复性联接进行控制以及聚合物不均一性的问题都是聚合物修饰蛋白被例行批准为治疗剂的严重障碍(19世纪70年代早期即出现，但迄今只有少数被批准用于治疗性应用)。
因此，人们需要一些方法来形成生物活性促红细胞生成蛋白，这些方法要不同于修饰天然EPO和重组EPO的DNA重组技术和聚合物技术。此外还需要一些临床特性被改进的促红细胞生成蛋白。本发明即可满足这些需要以及其他需要。
发明概述
本发明涉及促红细胞生成性合成蛋白及其产生方法和应用。具体地说，本发明涉及联接有一种或多种水溶性聚合物的促红细胞生成性合成蛋白。此外还提供含有本发明所述促红细胞生成性合成蛋白的药用组合物。
本发明还涉及利用本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白对哺乳动物进行治疗的方法。在一项实施方案中，本发明提供一种方法，用于提高哺乳动物体内的红细胞产量。另一实施方案则涉及一种方法，用于提高哺乳动物体内的血红素。还有一项实施方案涉及一种方法，用于提高哺乳动物体内的网织红细胞数。这些方法包括将本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白以有效的剂量给药于该哺乳动物，以获得所需的效果。
此外还提供一些方法，用于产生本发明的促红细胞生成性合成蛋白及其中间体，其中包括优选的聚合物修饰形式。该方法包括，将含有促红细胞生成性合成蛋白的非重叠性多肽链氨基酸序列的一些肽段进行化学连接，从而产生一种含有促红细胞生成性合成蛋白的多肽链。
附图简述
图1A-1E显示本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白的制备方法示意图。
图2A-2C显示本发明的促红细胞生成性合成蛋白的制备方法示意图。
图3A-3B显示多片段连接方法的示意图，该方法涉及将3种或3种以上的非重叠肽段进行化学连接，即相对于全长连接终产物而言，至少有一个肽段为中间片段。
图4A-4C说明所得侧链巯基的天然化学连接和化学修饰方法。
图5A-5B描述一种固相方法，用于产生本发明所述水溶性聚合物U-B-Polymer-J*的分支核心(B)和单一化学选择性功能基团(U)。
图6A-6D描述一种固相方法，用于产生本发明优选的基本不具有抗原性的水溶性聚酰胺Polymer-J*组分，该组分可随后用于联接U-B核心。
图7描述一种方法，用于使U-B组分与Polymer-J*组分结合，以产生本发明优选的具有通式U-B-Polymer-J*的聚合物合成构成体。
图8描述一种替代方法，用于将水溶性聚合物精确联接于一种肽段，该肽段可用于连接并产生本发明的促红细胞生成性合成蛋白。
图9显示本发明的促红细胞生成性合成蛋白的整个制备过程。
图10显示优选的促红细胞生成性合成蛋白的基本结构。pPEG＝“精确型PEG”
图11显示循环置换型SEP类似物的总体结构，该类似物带有重新定位的氨基端和羧基端。
图12显示优选的水溶性聚合物的结构及其不同的线性结构和分支结构。
图13显示支链pPEG聚合物的形成示意图。
图14显示合成细胞因子SEP1-L30的合成方法，该细胞因子是按实施例2所述制备的人EPO经聚合物精确修饰的合成类似物。
图15显示合成的细胞因子SEP1-L30，该细胞因子是按实施例2所述制备的人EPO经聚合物精确修饰的合成类似物。
图16显示合成的细胞因子SEP1-L26，该细胞因子是按实施例3所述制备的人EPO经聚合物精确修饰的合成类似物。
图17显示用于联接合成细胞因子SEP1-B50的优选支链水溶性聚合物的形成示意图，该细胞因子是按实施例4所述制备的人EPO经聚合物精确修饰的合成类似物。
图18显示合成的细胞因子SEP1-B50，该细胞因子是按实施例4所述制备的人EPO经聚合物精确修饰的合成类似物。
图19显示合成细胞因子SEP3-L42的合成方法，该细胞因子是按实施例5所述制备的人EPO经聚合物精确修饰的合成类似物。
图20显示合成的细胞因子SEP3-L42，该细胞因子是按实施例5所述制备的人EPO经聚合物精确修饰的合成类似物。
图21显示用于联接合成细胞因子SEP1-B51的优选水溶性聚合物的合成方法，该细胞因子是按实施例7所述制备的人EPO经聚合物精确修饰的合成类似物。
图22显示合成的细胞因子SEP1-B51，该细胞因子是按实施例7所述制备的人EPO经聚合物精确修饰的合成类似物。
图23显示用于联接合成细胞因子SEP1-B52的优选水溶性聚合物的合成方法，该细胞因子是按实施例8所述制备的人EPO经聚合物精确修饰的合成类似物。
图24显示合成的细胞因子SEP1-B52，该细胞因子是按实施例8所述制备的人EPO经聚合物精确修饰的合成类似物。
图25显示按实施例2-5和7-8所述制备的人EPO经聚合物精确修饰的合成类似物的典型分析数据。如图所示，典型的等电聚焦凝胶(IEF)结果和非还原性SDS-PAGE凝胶结果说明，折叠的纯化SEP1-B51具有相当于单体的分子量。
图26显示SEP化合物SEP0、SEP1-L26、SEP1-L30、SEP1-B50、SEP1-B51和SEP3-L42在因子依赖性细胞系中的体外活性。
图27显示SEP1-L42和SEP1-B50的血浆浓度对时间的典型药代动力学曲线，浓度单位为纳克每毫升(ng/ml)，时间单位为小时。
图28显示在缺氧大鼠模型中根据72小时红细胞(RBC)-59Fe摄取量(剂量百分率)测定的SEP1-B51以及CHO细胞产生的糖基化重组人促红细胞生成素(“rhEPO”)的体内活性的线性回归分析结果。
图29显示以5μg/kg剂量用SEP1-B51和rhEPO对大鼠进行单次静脉内给药后，大鼠体内每种化合物的血浆浓度对时间的典型药代动力学清除率曲线。
图30显示一种循环置换型聚合物修饰SEP构建体。
优选实施方案描述
本发明涉及促红细胞生成性合成蛋白及其产生方法和应用。
I.本发明的促红细胞生成性合成蛋白
在一项优选实施方案中，本发明涉及带有一种或多种与其联接的水溶性聚合物的促红细胞生成性合成蛋白。“促红细胞生成蛋白”是指具有在体外促进促红细胞生成素依赖性细胞系生长的生物活性的蛋白。在一项优选实施方案中，本发明的促红细胞生成性合成蛋白具有在体内促进红细胞增殖的生物活性。蛋白的促红细胞生成活性可通过多种方法中的任一种方法来检测，例如在体内给药之后进行红细胞生成跟踪测定，检测该蛋白对EPO一依赖性细胞系增殖的介导能力，等等。
“水溶性聚合物”是指可溶于水的基本不具有抗原性的聚合物。
按照文中的描述，若一种蛋白的某些，最优选的是全部，氨基酸残基是通过非重组技术来实现聚合，则该蛋白被称为“合成”蛋白。术语“非重组技术”是指涉及有机化学方法和其他合成聚合方法的技术，从而将这些技术与涉及RNA在体内或体外翻译成蛋白的技术区别开来。合成蛋白包括完全合成蛋白和半合成蛋白。完全合成蛋白的所有连接成分都是通过化学合成方法，即不依赖于核糖体的合成方法，人工产生的。半合成蛋白至少有部分连接成分是生物合成的，即利用细胞或无细胞翻译系统中的核糖体合成的，而其他部分是化学合成的。
在一项优选实施方案中，本发明的促红细胞生成性合成蛋白包含一段具有核糖体特定促红细胞生成素氨基酸序列的多肽链，以及通过一种或多种化学连接位点共价结合的一种或多种非重叠肽段。特别优选的促红细胞生成素是哺乳动物的促红细胞生成素，更优选的是人促红细胞生成素或其衍生物。举例来说，有多种促红细胞生成素的氨基酸序列为已知，并且已制备出多种人促红细胞生成素的活性变异体(可参考，例如，美国专利5,856,298；5,955.422；8,888,772；5,858,347；5,614,184；5,457,098和6,077,939,以及WO0/32772)，因此，本发明的促红细胞生成性合成蛋白可以包含已知具有上述氨基酸序列的多肽。
在一项优选实施方案中，核糖体特定促红细胞生成素含有一个或多个糖基化位点，而水溶性聚合物是通过与核糖体特定促红细胞生成素的一个或多个糖基化位点相对应的一个或多个位点联接于促红细胞生成性合成蛋白的多肽链。在一项更优选的实施方案中，水溶性聚合物只通过与一个或多个上述糖基化位点相对应的一个或多个位点联接于多肽链。本发明的该方面包括一些促红细胞生成性合成蛋白，其中的核糖体特定促红细胞生成素是通过重组方法产生的。因此，核糖体特定促红细胞生成素可以是天然的促红细胞生成素，也可以是非天然的促红细胞生成素，其中，非天然促红细胞生成素还可包含一个或多个非天然的糖基化位点。
“糖基化位点”是指一种蛋白氨基酸序列，该序列可编码寡糖(糖)链与该蛋白氨基酸序列上一种氨基酸残基侧链的酶促连接；例如N-联和O-联糖基化位点。应该了解的是，经突变而去除了一个或多个上述糖基化位点的促红细胞生成素也包含在该“糖基化位点”的定义中，因为聚合物修饰残基位点与其位置相同。“天然糖基化位点”是指自然界中存在的促红细胞生成素糖蛋白上的糖基化位点。“非天然糖基化位点”是指经过改造而引入促红细胞生成素的糖基化位点。例如，目前已利用这种方式对重组人EPO进行了改造(可参考，例如，美国专利5,856,298)
在某种程度上，本发明所述实施方案的基础是，当利用水溶性聚合物，如上文描述的聚合物，在一个或多个糖基化位点上对含有人促红细胞生成素多肽链的促红细胞生成性合成蛋白进行修饰时，该水溶性聚合物可用来实现通常存在于相应天然促红细胞生成素糖蛋白的同一位置上的糖链的一种或多种生物学效应。这些生物学效应包括调节抗蛋白酶能力、免疫原性、受体特异性、比活、效力和药代动力学。而去除存在的糖链并将其替换成本发明优选的水溶性聚合物的方法会带来明显的好处，其中包括，避免了在去除糖链的悬垂唾液酸残基等情况下可能导致的酶促降解和清除，并且解决了不稳定性、循环半衰期有限、分布、难以处理性等问题。此外，值得注意的是，本发明的这些聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白与未修饰的对应合成蛋白相比，能够在基本不丧失生物活性的条件下保持这些有利的生物学特性，其中包括生物活性增强，甚至在合成蛋白的单体分子量大于25kDa时也是如此。
因此，在另一项实施方案中，本发明涉及一种促红细胞生成性合成蛋白，该蛋白包含一段具有核糖体特定促红细胞生成素氨基酸序列的多肽链，其中，该多肽链联接有一种或多种水溶性聚合物，并且其单体分子量大于25kDa，同时，这种促红细胞生成性合成蛋白与所含多肽链不带有上述水溶性聚合物的对应合成蛋白相比具有相同或更高的生物活性。该生物活性可以是体外生物活性，也可以是体内生物活性，还可以是二者兼备。在一项优选实施方案中，该生物活性为体内生物活性。在另一项优选实施方案中，本发明涉及一种促红细胞生成性合成蛋白，该蛋白包含一段具有核糖体特定促红细胞生成素氨基酸序列的多肽链，其中，该多肽链联接有一种或多种水溶性聚合物，并且其单体分子量大于25kDa，同时，这种促红细胞生成性合成蛋白与所述核糖体特定促红细胞生成素相比具有相同或更高的生物活性。同样，该生物活性可以是体外生物活性，也可以是体内生物活性，还可以是二者兼备。在一项优选实施方案中，该生物活性为体内生物活性。最优选的是，这些聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白应联接有离散数量的水溶性聚合物。
“化学连接位点”是指第一种肽或多肽的N-端氨基酸和第二种肽或多肽的C-端氨基酸，这两种氨基酸之间通过化学连接会形成或能够形成不可逆的共价键。文中使用的“化学连接”是指一种化学选择性反应，其中包括两种化学基团的共价连接，每种化学基团带有一种可彼此反应并形成特定不可逆共价键的功能基团。化学连接包括(1)具有特定的C-端反应性基团的第一种肽或多肽与(2)具有特定的N-端反应性基团的第二种肽或多肽的共价连接，其中，该C-端反应性基团和N-端反应性基团之间会形成不可逆的共价键。具体地说，化学连接包括任何可用于连接未保护肽段的化学选择性反应。
就水溶性聚合物而言，优选的水溶性聚合物可表示为通式：
Un-s1-B-s2-Polymer-s3-J*
U是一种具有与促红细胞生成性合成蛋白多肽链共价结合的特定功能基团的残基。具体地说，U基团结合于促红细胞生成性合成蛋白内一种或多种非重叠肽段的一个或多个氨基酸侧链n上可彼此特定反应的功能基团，其中，n是1-6的离散整数。更优选的是侧链n为1-4的离散整数，最优选的是为1-2的离散整数。文中使用的术语“氨基酸”包括20种遗传编码氨基酸、自然界中存在的稀有氨基酸或非常见氨基酸，以及任何非天然氨基酸，如不规则氨基酸；当用于肽、多肽或蛋白质的描述中时，是指氨基酸残基。U和侧链n的优选实施方案是由彼此能够特定反应的基团形成共价键，其中，这些键选自肟、酰胺、胺、氨基甲酸乙酯、醚、硫醚、酯、酰肼、恶唑烷、噻唑烷、硫醚、醚和酯。U和n的最优选连接是，U通过化学连接形成的一种选自酰胺、肟、硫醚、酰肼、噻唑烷和恶唑烷的键而与侧链n共价结合。
B是一种具有三个或更多个相同或不同臂的分支核心，该核心可以存在，也可以缺失。最优选的是B存在，并且含有三个或更多个臂，再更优选的是含有四个或更多个臂。具体地说，B的一个臂与U联接(可选择性地通过间隔物或连接物s1联接)，B的第二个臂与Polymer联接(可选择性地通过间隔物或连接物s2联接)。优选的是，聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白中的B基团上至少有一个分支臂含有选自肟、酰胺、胺、氨基甲酸乙酯、硫醚、酯、酰肼、恶唑烷和噻唑烷的残基键。本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白的优选B分支基团可包含一种选自氨基、羧酸酯和混合氨基-羧酸酯的分支核心。优选的氨基分支核心包括赖氨酸或其衍生物，优选的羧酸酯分支核心包括谷氨酸或天冬氨酸或其衍生物，而优选的混合氨基-羧酸酯分支核心包括γ-谷氨酸或其衍生物。
Polymer组分是一种基本不具有抗原性的水溶性聚合物，当B存在时，该聚合物可以相同，也可以不同。“水溶性聚合物”是指可溶于水的一种基本不具有抗原性的聚合物，其原子分子量大于约1,000道尔顿。优选的是Polymer的有效水力分子量大于约10,000Da，更优选的是约为20,000-500,000Da，最优选的是约为40,000-300,000Da。“有效水力分子量”是指利用水性尺寸排阻层析法(SEC)测定的聚合物链的有效水溶化尺寸。当水溶性聚合物包含的聚合物链中带有环氧乙烷重复单元等聚环氧烷重复单元时，优选的是每条链的原子分子量约为200-80,000Da，更优选的是约为1,500-42,000Da，最优选的是约为2,000-20,000Da。在没有特别提及的情况下，分子量均指原子分子量。
Polymer组分可具有很宽的分子量范围以及不同的聚合物亚基。这些亚基可包括生物学聚合物、合成聚合物，或其组合。这些水溶性聚合物的实例包括：葡聚糖和葡聚糖衍生物，其中包括磷酸葡聚糖、P-氨基交联糊精和羧甲基糊精，纤维素和纤维素衍生物，其中包括甲基纤维素和羧甲基纤维素，淀粉和糊精，以及淀粉的衍生物和羟基化物，聚二醇及其衍生物，其中包括聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、聚乙二醇同聚物、聚丙二醇同聚物、乙二醇与丙二醇的共聚物，其中，所述同聚物和共聚物的一端可以被或不被烷基取代，肝素和肝素片段、聚乙烯醇和聚乙烯乙醚、聚乙烯吡咯烷酮、天冬酰胺，和聚氧乙烯多元醇酯，以及葡聚糖和葡聚糖衍生物、糊精和糊精衍生物。应该了解的是，所列水溶性聚合物的各种衍生物也包括在内。
水溶性聚合物，如上述水溶性聚合物，已众所周知，特别是聚乙二醇“PEG”等聚环氧烷型聚合物(参见例如＂Poly(ethylene glycol)Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications＂，J.M.Harris，Ed.，Plenum Press，New York，NY(1992)；and＂Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications＂，J.M.Harris and S.Zalipsky，Eds.，ACS(1997)；and InternationalPatent Applications：WO90/13540，WO92/00748，WO92/16555，WO94/04193，WO94/14758，WO94/17039，WO94/18247，WO94/28937，WO95/11924，WO96/00080，WO96/23794，WO98/07713，WO98/41562，WO98/48837，WO99/30727，WO99/32134，WO99/33483，WO99/53951，WO01/26692，WO95/13312，WO96/21469，WO97/03106，WO99/45964，and US Patents Nos.4,179,337；5；075,046；5,089,261；5,100,992；5,134,192；5,166,309；5,171,264；5,213,891；5,219,564；5,275,838；5,281,698；5,298,643；5,312,808；5,321,095；5,324,844；5,349,001；5,352,756；5,405,877；5,455027；5,446,090；5,470,829；5,478,805；5,567,422；5,605,976；5,612,460；5,614549；5,618,528；5,672,662；5,637,749；5,643,575；5,650,388；5,681,567；5,686,110；5,730,990；5,739,208；5,756,593；5,808,096；5,824,778；5,824,784；5,840,900；5,874,500；5,880,131；5,900,461；5,902,588；5,919,442；5,919,455；5,932,462；5,965,119；5,965,566；5,985,263；5,990,237；6,011,042；6,013,283；6,077,939；6,113,906；6,127355；6,177,087；6,180,095；6,194,580；6,214,966)。
更优选的Polymer组分包括聚环氧烷、聚酰胺环氧烷，或其衍生物。更优选的聚环氧烷和聚酰胺环氧烷包括通式-(CH2-CH2-O)-的环氧乙烷重复单元。还更优选的Polymer组分是具有通式-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的分子量大于约1,000Da的聚酰胺，其中，X和Y为相同或不同的分支型或线型二价基团，n是2-100的离散整数，更优选的是2-50的离散整数，并且X和Y之一或二者都含有一种线型或分支型水溶性重复单元，该重复单元具有生物相容性，并且基本不具有抗原性。最优选的水溶性重复单元包括通式-(CH2-CH2-O)-或-(CH2-CH2-O)-的环氧乙烷。这些水溶性重复单元的数量可以有很大不同，但这些重复单元的更优选数量为2-500、2-400、2-300、2-200、2-100，最优选的为2-50。更优选的实施方案的实例为，其中的X和Y之一或二者都选自：-((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)nl-)-或-((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)，其中，n1为1-6、1-5、1-4，最优选的是1-3，n2为2-50、2-25、2-15、2-10、2-8，最优选的是2-5。高度优选的实施方案的实例为，其中的X为-(CH2-CH2)-，而Y为-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-。
Polymer组分或一种或多种间隔物或连接物，如果存在，可带有一些生物稳定的或可生物降解的聚合物链或单元。例如，带有重复结合键的Polymer在生理条件下会根据键的不稳定性而具有不同的稳定程度。根据低分子量类似物的已知水解速率，可按照带有这些键的Polymer在生理条件下的相对水解速率对其进行分类，例如，稳定性从低到高为聚碳酸酯(-O-C(O)-O-)＞聚酯(-C(O)-O-)＞聚氨基甲酸酯(-NH-C(O)-O-)＞聚原酸酯(-O-C((OR)(R’))-O-)＞聚酰胺(-C(O)-NH-)。与此类似，将水溶性聚合物联接于靶分子的键系统可以是生物稳定的或可生物降解的，例如，稳定性从低到高为碳酸酯(-O-C(O)-O-)＞酯(-C(O)-O-)＞氨基甲酸乙酯(-NH-C(O)-O-)＞原酸酯(-O-C((OR)(R’))-O-)＞酰胺(-C(O)-NH-)。这些键只作为实例，而不是要限制能够在本发明所述水溶性聚合物的聚合物链或键系统中使用的键的类型。
组分J*是一种含有悬垂基团的残基，该基团在生理条件下的净电荷选自负值、正值和中性值。该残基包括取代或未取代的烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、烷芳基、酰基、烷氧基、烯基、炔基、酰胺基、氨基、羰基等等，及其盐类。优选的中性基团为烷基或烷氧基，其中可包括，但不局限于，带有1-18个碳原子的线型或分支型基团。J*被作为带电基团提供时可含有一种可电离的功能基团。功能基团的实例包括，但不局限于，羧酸、酯、酰胺、腈、巯基和羟基。J*基团可以是氨基酸、核酸、脂肪酸、糖类及其衍生物的一种成分，也可以是壳多糖、壳聚糖、肝素、磷酸乙酰肝素、软骨素、磷酸软骨素、皮肤素和磷酸皮肤素、环糊精、葡聚糖、透明质酸、磷脂、唾液酸等基团。优选的是，J*含有一种选自羧基、氨基、巯基、羟基、磷酰基、胍、咪唑及其盐类的可电离的基团。最优选的是，J*含有一种可电离的羧酸酯基团，并且在生理条件下的净电荷为负值。例如，本发明优选的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白具有3-7的等电点，因而可利用带负电荷的J*基团对pI进行精确调节。
组分s1、s2和s3是相同或不同的间隔物或连接物，这些组分可以分别存在或缺失。优选的间隔物或连接物包括，含有一种或多种用于水溶性聚合物的重复单元、二元胺和(或)二元酸单元、天然或非天然氨基酸或其衍生物的线型或分支型基团，以及脂肪族基团，其中包括烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、烷氧基等，优选的是这些基团含有多达18个碳原子，甚至含有额外的聚合物链。最优选的是间隔物或连接物含有一种聚合物链。
作为选择，还可以将上述通式Un-s1-B-s2-Polymer-s3-J*表示为“Un-B-Polymer-J*”，其中，s1、s2和s3基团可以存在，也可以不存在。
更优选的Polymer组分是，其中的水溶性聚合物Un-s1-B-s2-Polymer-s3-J*完全是由逐级合成方法产生。这样可以构建出具有精确分子量和特定结构的聚合物。相比之下，常见的聚合物合成是采用聚合方法，该方法产生的是一种链长不同的混合物，其分子量和大小呈分散状态，因而其分离即使可能，也非常困难。对分子纯度的控制能力是一种优势，因为这样可构建出联接有水溶性聚合物并且呈单分散状态的合成蛋白。这种控制能力可作为一个明显的优点，因为这样可避免由异类化合物带来的多种特性，同时可以较容易地只制备和分离那些带有最优选特性的化合物。
在另一项优选实施方案中，本发明的促红细胞生成性合成蛋白含有一种或多种不规则氨基酸。文中使用的“不规则氨基酸”是指具有非遗传编码侧链、非遗传编码骨架、非遗传编码Nα或αC(O)取代基团或其组合的氨基酸，也就是与利用核糖体组装的20种遗传编码氨基酸不同的氨基酸。优选的不规则氨基酸的实例包括，侧链上带有一种与遗传编码的功能基团不同的特定功能基团的氨基酸，以及假氨基酸和多种氨基酸衍生物。为此，本发明在促红细胞生成性合成蛋白的设计和(或)构建方面允许有很宽的选择性和灵活性。可根据本发明使用的非核糖体组装氨基酸的实例包括，但不局限于：D-氨基酸、β-氨基酸、假谷氨酸、γ-氨基丁酸、鸟氨酸、高半胱氨酸、N-取代氨基酸(R.Simon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1992)89：9367-71；WO91/19735(Bartlett et al.)，美国专利5,646,285(Baindur))、α-氨基亚甲氧乙酸(一种氨基酸-Gly二肽等排体)，和α-氨基含氧酸，以及具有非遗传编码侧链功能基团的其他氨基酸衍生物，等等。也可以使用含有硫酰胺、乙烯酰胺、肼基、甲叉氧、甲叉硫、磷酰胺、羟酰胺、羟乙烯、还原酰胺和取代还原酰胺等排体，以及β-磺酰胺的肽类似物。“假氨基酸”是指骨架结构和侧链基团与遗传编码氨基酸相同，但侧链原子的原子成分不同的氨基酸。
在一项优选实施方案中，提供的促红细胞生成性合成蛋白在其多肽链的不规则氨基酸上联接有水溶性聚合物。更优选的是，用于联接水溶性聚合物的不规则氨基酸带有化学选择性连接基团，这些基团在遗传编码功能基团存在的情况下不会与其发生反应。
如上所述，完全由逐级组装方法产生的水溶性聚合物可以呈单分散状态，如本发明优选的聚酰胺乙撑氧。因此，另一项优选实施方案是，其中的水溶性聚合物呈单分散状态(即分子成分是含有特定结构的单一所需分子的均一状态)。此外，由于可完全利用化学合成方法来制备促红细胞生成性合成蛋白，因而也可以制备单分散状态的这些蛋白。这些化合物的优势是纯度高，并且可避免因使用非均向分散聚合物而带来的纯化和分析鉴定问题。这些化合物在可重复性定量给药等方面也具有优势(例如，与糖蛋白和聚乙二醇化重组蛋白的典型混合物状态不同的是含有单一种类的分子)。
如上所述，本发明的促红细胞生成生合成蛋白的单体分子量在25kDa以上。就本发明而言，这些分子量的测定是采用变性SDS聚丙烯酰胺电泳法。术语“单体分子量”是指不同于可能具有多个蛋白或多肽拷贝的合成蛋白的单体合成蛋白的分子量。更优选的是，本发明的促红细胞生成性合成蛋白的单体分子量在40kDa以上，更优选的是50kDa或更高，最优选的是在60-70kDa以上。例如，本发明优选的促红细胞生成性合成蛋白SEP1-B51的单体分子量约为73kDa。但分子量更高的构建体也将处在本发明的范围之内。
在另一项实施方案中，本发明涉及一种促红细胞生成性合成蛋白，该蛋白在其连接位点含有一种假氨基酸，并且可选择性地联接有一种水溶性聚合物。这些化合物的产生方法是，使具有半胱氨酸等包含化学选择性活性功能基团的N-端氨基酸的第一种肽段或多肽段与具有α-羧基硫酯等化学连接相容性C-端功能基团的第二种肽段或多肽段相连接，从而形成一种在连接位点上带有未保护侧链功能基团的连接产物，再利用化学方法将连接位点上的未保护侧链功能基团转变成假氨基酸，例如将半胱氨酸巯基侧链羧甲基化成假谷氨酸。由天然化学连接位点的半胱氨酸转变而成的假氨基酸在文中被称为“假天然化学连接”，下文将对此进行详细描述。
此外还提供一种促红细胞生成性合成蛋白，该蛋白在其连接位点的氨基酸侧链上联接有水溶性聚合物。这些化合物的产生方法是，使具有半胱氨酸等包含化学选择性活性功能基团的N-端氨基酸的第一种肽段或多肽段与具有α-羧基硫酯等连接相容性C-端功能基团的第二种肽段或多肽段相连接，从而形成一种在连接位点上带有未保护侧链功能基团的连接产物，再使水溶性聚合物与连接位点上的未保护侧链功能基团相联接。
利用本发明的假氨基酸化学连接法和化学连接位点聚合物修饰法会带来一些优于先有技术的优势，其中包括，有效合成不含适当连接位点的一系列不同的促红细胞生成性合成蛋白，扩展那些可用于通过节约成本的常规方式进行位点特异性聚合物修饰的位点(和联接性质)，以及合成具有相当分子量的促红细胞生成性合成蛋白，等等。这些方法还特别适用于高通量模拟对所需生物学特性的精确调节，其中包括搜索用于联接水溶性聚合物的单个或多个位点。
如上所述，通过对聚合物联接位点和化学键性质的精确调节，以及对水溶性聚合物的分子量、聚合物成分、结构(如线型与分支型的比例，或其混合物)和悬垂基团(如带电与不带电基团的比例，或其混合物)的精确调节，可以改变本发明所述聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白的生物学特性。具体地说，促红细胞生成性合成蛋白上联接的水溶性聚合物可以增加蛋白的分子量以延长其半衰期，并使蛋白呈分支结构，等等，此外还可以使蛋白带有精确的电荷，从而使促红细胞生成性合成蛋白的等电点约等于带有该蛋白氨基酸序列的生物产生的相应蛋白。其优势在于可模拟相应核糖体特定蛋白的天然电荷情况。因此，本发明的优选实施方案涉及一些具有上述组合特性的促红细胞生成性合成蛋白，以及所使用的水溶性聚合物，特别是能够在预定位置进行联接的具有特定结构的加合聚合物。
具体地说，本发明优选的促红细胞生成性合成蛋白(“SEPs”)是人尿EPO的聚合物修饰合成类似物。在一项优选实施方案中，这些蛋白含有一种或多种通过硫醚键、肟键、酰胺键或其他键联接于一个或多个肽残基的水溶性聚合物。在一项高度优选的实施方案中，这些连接键位于人尿EPO的一个或多个天然糖基化位点上(即第24、38、83和126位)。最优选的是，SEP分子在两个或更多个这些位点上联接有聚合物基团。在一项替代实施方案中，还可以有其他蛋白残基被聚合物基团修饰。本发明所述促红细胞生成性合成蛋白的修饰位点包括无规卷曲中的残基、蛋白区域或结构域中的残基，或潜在蛋白酶剪切位点上或位点附近的残基。例如，可以在EPO的第9、69和(或)125位中的一个或多个位点上引入聚合物修饰。此外，若有一个或多个剩余的天然糖基化位点未被聚合物修饰，则可以在需要的情况下将这些区域内的一种或多种氨基酸转换成其他残基，例如，需要带正电荷时可转换成赖氨酸，或需要带负电荷时可转换成天冬氨酸或谷氨酸，或转换成丙氨酸，等等。本发明所述SEP分子的总分子量约为25-150kDa，更优选的是约为30-80kDa。通过增加或减少用于修饰给定类似物的水溶性聚合物的数量和结构可以实现对分子量的控制。
举例来说，聚合物肟联SEP类似物的优选构建方法是，将氨氧基、酮基或醛基功能化水溶性聚合物与SEP蛋白上具有侧链氨氧基、酮基或醛基功能的非天然编码氨基酸相联接。例如，SEP-0和1的第89和117位含有假谷氨酸(带有通式为-CHα-CH2-S-COOH的侧链(与谷氨酸侧链-CHα-CH2-CH2-COOH相比)的非天然编码氨基酸)。利用硫醚键构建SEP类似物的优选方法是，通过带有含巯基侧链的半胱氨酸或非天然氨基酸使其具有巯基功能性。图10显示一种优选促红细胞生成性合成蛋白的基本结构。
在一项可选实施方案中，本发明的SEP分子可包括已将EPO的天然氨基和羧基端重新定位的“循环置换型”EPO类似物。最优选的是通过这种重新定位将氨基和羧基端移至的结构限制性较低的位置，如移至无规卷曲，等等。这种重新定位位点的实例是第125和126位(相对于天然EPO的残基编号体系)附近的无规卷曲。最优选的是这些SEPs不含有二硫键，并且可通过化学修饰而在选定残基上带有聚合物基团。
作为选择，还可以将SEP分子的氨基和羧基端重新定位于天然的糖基化位点，或重新定位于可被糖基化的其他位点，如第126和125位。SEP分子还含有氨基和羧基端的修饰，以去除或改变电荷(如羧基端酰胺化，等等)。在这些循环置换型分子的一个优选实例中，新N-端和C-端分别位于第126和125位。优选的是将可形成二硫键的第7、29、33和161位天然半胱氨酸替换成不能形成二硫键的非天然编码氨基酸L-α-N-丁酸。为了提高产量，优选的是将残基R166、E37和V82替换成丙氨酸。此外，优选的是在相对于天然EPO编号方案的第1和166位之间插入一个额外的半胱氨酸，下文将其编号为“0”。所得分子含有4个半胱氨酸(在第126、0、38和83位(按N-端至C-端的方向显示))，这些半胱氨酸可作为(1)连接位点和(2)形成硫醚的pPEG联接位点。还可以选择性地将A125替换成半胱氨酸，以产生一个额外的pPEG联接位点。
本发明的这些SEP分子的总分子量可约为25-150kDa，更优选的是约为30-80kDa。通过增加或减少用于修饰给定类似物的水溶性聚合物(如pPEG)的数量和结构可以实现对分子量的控制。较大构建体在pPEG介导下的水力MW可大于100kDa。可选的pPEG联接位点位于第125、9和24位(按N-端至C-端的方向显示)。其他SEP类似物设计方案是在无规卷曲中具有替代的N-和C-末端，以及(或)从新N-末端和(或)C-末端位置带有截短的残基。图11显示优选循环置换型分子的基本结构。图12显示优选水溶性聚合物的结构，以及不同的线型和分支型构建体。
例如，除本文实施例中描述的特定SEP构建体之外，还通过对天然人EPO序列的循环置换设计出一种序列，其方式如下：利用额外的Cys残基使天然的N-端Ala1与C-端Arg166相联接，从而产生一种含有167个氨基酸的多肽；创建新N-端和C-端的方法是使多肽链在天然序列的第125-126位残基处断裂；将所有天然Cys残基替换成L-α氨基-n-丁酸残基；并进行如下取代：Glu37Ala；Asn38Cys；Val82Ala；Asn83Cys；Ser126Cys；Arg166Ala(所有残基编号都是基于天然人EPO序列)。这些设计要素的共同结果是产生所示的SEP-5氨基酸序列。通过Michael加成反应，用马来酰亚胺修饰的线型(TTD-Succ)6羧基酯聚合物构建体对SEP-5-L28蛋白的第126、0、24、38和83位Cys残基(基于人EPO序列的编号方式)进行聚合物修饰。这些变化可用于改善SEP-5-L28蛋白的合成和操作。用4种各含有N-端Cys残基的肽段制备出所设计的序列。化学连接位点为Cys0、Cys38、Cys83。合成这些肽，其中C-端肽是一种α-羧基酯；另3种肽是α-硫酯，因而N-端Cys残基的侧链被Acm保护。Cys24的侧链未被保护。从C-端的两种肽段开始，利用天然化学连接依次使这些肽段相联接。然后通过Michael加成反应使连接位点的游离Cys侧链与马来酰亚胺修饰的线型(TTD-Succ)6羧基酯聚合物构建体反应，再将Cys侧链上的Acm保护基团去除，并以类似方式进行下一种肽段的连接和聚合物修饰。在去除Acm基团并连接下一种(第4种)肽段之后，以类似方法去除最终的Acm基团并进行聚合物修饰，从而产生图30所示的上述循环置换型聚合物修饰SEP构建体。
II.本发明所述促红细胞生成性合成蛋白的产生
尽管聚合物修饰促红细胞生成蛋白在此前已有相关的描述，但本发明与这些早期成果有明显的不同。例如，本发明的促红细胞生成性合成蛋白是完全或部分通过化学方法合成的。而且本发明的促红细胞生成性合成蛋白上有一个或多个特定的、自选的和自定的位点被水溶性聚合物修饰。
此外，本发明的促红细胞生成蛋白的合成产生方法能够确保制剂中每个分子的每个自选位点和自定位点上都带有这些修饰。这种合成的一致性和可控性使本发明与先有技术中实现随机修饰的方法有显著的区别。值得注意的是，本发明允许设计一种促红细胞生成性合成蛋白，该蛋白的任何非关键残基都可以通过衍化而包含一种加合聚合物。此外，用户可以明确规定所有这些自选位点和自定位点上用于使所述加合物结合于多肽或蛋白骨架的连接键(酰胺键、硫酯键、硫醚键、肟键，等等)。而且还可以改变和控制希望在特定位点上出现的特定加合聚合物，从而使终产物中的每种蛋白或多肽都在完全相同的衍化位点上精确含有相同的衍化加合物。因此，本发明能够产生均一的聚合物修饰促红细胞生成多肽和蛋白制剂。
本发明不但提供一种方法，用于改变与水溶性聚合物结合的联接位点的位置和数量，而且还允许改变结合聚合物的性质。在任何特定的自选位点和自定位点上引入的加合聚合物可以是任意规定的长度。与本发明所述方法相同的是，还可以在不同的位点使用不同长度的聚合物。因此，在一项实施方案中，本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白可以被水溶性加合聚合物单重修饰，也可以被多重修饰。当在特定多肽或蛋白中引入一种以上的加合聚合物时，使用的聚合物可以是“单类的”、“复类的”、“均一类的”或“不同类的”。文中使用的术语“单类的”是指多肽或蛋白被单一种类的聚合物修饰。相比之下，术语“复类的”是指多肽或蛋白被一种以上的单一聚合物修饰。如果复类多肽或蛋白的每个修饰位点上存在单一种类的相同聚合物，则可认为这些多肽或蛋白是“均一类的”。相比之下，如果复类多肽或蛋白的修饰位点被不同类型的聚合物修饰，则可认为这些多肽或蛋白是“不同类的”。
此外还可以改变每个自选位点和自定位点上的加合聚合物的线性程度或分支程度。因此，加合聚合物可以是线型的、分支型的或均一分支型的。术语“均一分支型”是指特定位点上的聚合物的所有分支具有相同的结构和长度。正如我们所了解的，本发明可以独立地改变任何单一分支的长度，以及出现在该分支点上的聚合物的结构。
总而言之，本发明可以规定多肽或蛋白骨架中被聚合物修饰的自选位点和自定位点的(1)位置和(2)频率，并可以控制所有这些位点上出现的分支的(3)长度、(4)种类和(5)程度。此外，对带有多种聚合物修饰的多肽和蛋白而言，本发明可以独立地规定每个位点的上述所有5种变量。此外，对带有分支型聚合物修饰的促红细胞生成性合成多肽和蛋白而言，本发明可以独立地规定每个分支点的上述所有5种变量。这样就可以合成聚合物精确修饰的促红细胞生成性合成蛋白的均一组合物，这些蛋白带有多个拷贝的任一种或所有20种不含多余聚合物联接的遗传编码氨基酸侧链。
因此，本发明在聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白的设计、合成和应用方面提供了很大的灵活性。例如，本发明所述促红细胞生成性合成蛋白的氨基酸序列与对应的遗传编码蛋白的氨基酸序列相比可含有一个或多个缺失、插入或取代。该氨基酸序列可以用一种或多种不规则氨基酸进行取代，例如假氨基酸和(或)带有非天然侧链的其他氨基酸，如经过修饰而带有用于联接水溶性加合聚合物的单一化学选择性功能基团的氨基酸，等等。因此，水溶性聚合物的联接可以通过不规则氨基酸来实现，也可以通过遗传编码的氨基酸来实现。该水溶性聚合物可以是线型或分支型的，并且可带有一种含羧酸、脂肪链、酰胺或胺等化学基的末端基团。此外，该水溶性聚合物可以呈单分散状态，即含有单一种类的具有明确规定的结构和成分的分子。因而可以设计该水溶性聚合物的性质，用于精确调节其修饰的靶蛋白的半衰期、免疫原性、效力、保存稳定性、剂量、供应能力，等等。
具体地说，本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白的产生方法可能包括以下步骤：设计、肽合成、肽连接、使全长连接产物折叠以产生蛋白，以及评定该蛋白的生物活性。我们发现，聚合物修饰可以在肽合成、肽连接或产物折叠步骤的一个或多个步骤中实现。但优选的是在折叠之前将聚合物联接于肽或连接产物。在利用该方法产生的蛋白中筛选具有所需生物活性的蛋白，这些蛋白即可作为本发明的促红细胞生成性合成蛋白。
在一种优选方法中，含有促红细胞生成性合成蛋白的多肽链的制备方法是，将含有促红细胞生成性合成蛋白的非重叠性多肽链氨基酸序列的肽段进行化学连接。具体地说，本发明的促红细胞生成性合成蛋白分子的制备方法是将含有所需促红细胞生成性合成蛋白的非重叠性多肽链氨基酸序列的肽段进行化学连接，其中，用于连接的一种或多种肽段在自定位点和预定位点上联接有水溶性聚合物。然后使聚合物修饰的多肽链折叠，以产生本发明的一种聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白。
用于产生本发明的促红细胞生成性合成蛋白的另一种优选方法包括，将含有本发明所述聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白的非重叠性多肽链氨基酸序列的肽段进行化学连接，并在一种或多种化学连接位点的氨基酸侧链上联接一种或多种水溶性聚合物。然后使聚合物修饰的多肽链折叠，以产生本发明的一种聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白。
尽管优选程度较低，但促红细胞生成性合成蛋白的制备方法还可以是，(1)将含有促红细胞生成性合成蛋白的非重叠性多肽链氨基酸序列的肽段进行化学连接，以产生与促红细胞生成性合成蛋白相一致的全长多肽链，其中至少有一种肽段含有一个不规则氨基酸，该氨基酸带有第一种化学选择性功能基团，(2)使多肽链折叠，并且(3)使其与含有第二种化学选择性基团的水溶性聚合物相联接，第二种化学选择性基团能够与第一种化学选择性基团彼此特定地反应。
具体地说，本发明包括的以及实施例中例举的这些用于合成促红细胞生成性合成蛋白的不同方法可以按附图所示加以说明。例如，图1A-1E显示在连接前或在连接后使水溶性聚合物(文中定义的U-B-Polymer*)联接于部分未保护肽段或完全未保护肽段(
Figure A0181538200291
)的连接方法，或其组合方法。在图1A-1D中，Yaa表示第一肽段上带有特定化学选择性基团的C端氨基酸(如带有α-羧基硫酯的氨基酸)，该化学选择性基团可用于与第二肽段的化学连接，第二肽段上带有一种能够与Yaa产生化学选择性化学连接的可彼此反应的特定N端氨基酸Xaa(如氨基末端半胱氨酸)基团。Yaa与Xaa的化学选择性反应可在彼此之间产生一种共价键(如酰胺键)。因此，Yaa与Xaa可形成一种化学选择性配对连接。图中的Un-表示另一种被精确掺入到自定位点的氨基酸侧链上的特定化学选择性基团，该基团对水溶性聚合物U-B-Polymer-J*上的U基团具有化学选择性，并且可彼此反应。例如，当Un是一种经过修饰而带有酮基的侧链时，水溶性聚合物U-Polymer-J*上的U-可以是一种能够与酮基产生化学选择性反应的基团，例如与酮基产生肟键的氨氧基。Un-的下标“n”表示用于携带化学选择性基团U的氨基酸或其侧链的数量，例如，当有两个自定的具体位点要被聚合物修饰时，n＝2，此时也可以表示为U2或Un-2。n始终是一个正整数，通过设计可以精确地控制n的大小。因此，Un和U表示另一种与化学选择性基团Xaa和Yaa不反应并且相容的化学选择性配对连接。图1A和1B说明两种不同的可能反应。在描述的第一种反应中，带有Un功能性的多肽链与另一种多肽相连接，然后与U-B-Polymer-J*基团反应，以产生聚合物修饰的多肽。在描述的第二种反应中，带有Un功能性的多肽链与U-B-Polymer-J*基团反应，以产生聚合物修饰的多肽，然后再与另一种多肽连接，以产生更长的聚合物修饰多肽。这两个图的区别在于，图1A中是带有Xaa残基的多肽被聚合物修饰，而图1B中是带有Yaa残基的多肽被聚合物修饰。图1C说明本发明能够在连接成较长多肽之前或在连接之后对多种多肽进行修饰。在图1D中，PG和PG’代表保护基团，其中PG’表示一种正交保护基团，即PG和PG’能够在不同的条件下被去除，从而可用于不同的水溶性聚合物通过相同的化学键联接于Un基团的情况，或Un基团是不希望被聚合物修饰的侧链功能基团(例如，在水溶性聚合物的U基团被设计成专门与伯氨基或侧链巯基反应的条件下，带有活性-NH2或-SH的侧链)的情况。图1D显示，可以用保护基团来保护按本发明所述方法进行连接的多肽中的特定侧链。
图1E说明一些基团的差异，这些基团可以在用于图1A-1D所示连接方法和聚合物修饰方法的肽段中存在，也可以不存在。
图2A-2C显示本发明所述促红细胞生成性合成蛋白的其他制备方法的示意图。具体地说，图2A-2B描述连接的方法，该方法涉及将水溶性聚合物U-B-Polymer-J*联接于氨基末端Xaa基团侧链上的连接位点(如半胱氨酸的侧链巯基)。图2C说明一些基团的差异，这些基团可以在用于图2A-2B所示连接方法和聚合物修饰方法的肽段中存在，也可以不存在。
图3A-3B显示用于实现多片段连接的其他方法的示意图，该方法涉及将3种或3种以上的非重叠肽段进行化学连接，即相对于全长连接终产物而言，至少有一个肽段为中间片段。由这种方式制备的肽可用于产生在另一连接反应中使用的肽段，例如图1A-1E、图2A-2C和图4A-4C所示的连接反应。一般而言，根据所用的化学连接方法，用于多片段连接的中间片段带有被保护的Xaa基团或被保护的Yaa基团，以避免肽发生环化或形成多联体。在顺序连接或连续连接反应中，中间片段的Xaa基团被保护(例如，Cys(Acm))，而其Yaa基团则无保护(例如，Yaa-COSR，其中-COSR是α-羧基硫酯)。这里的Yaa基团可随意地与带有无保护的Xaa基团的第二种肽反应，其中第二种肽没有游离的Yaa基团。连接完成后，去除保护基团以再生出用于下一连接反应的Xaa基团。该过程可根据需要继续进行，从而产生延伸的多肽链。保护Yaa基团对汇聚化学连接尤为有用，包括产生由四种或更多种片段构成的连接终产物。举例来说，对一种由四片段连接(即进行三次连接)而定向产生的蛋白而言，可以将对应于蛋白一个末端的两种片段以及对应于蛋白另一末端的两种片段并行连接，而不是顺序连接，然后通过最终连接反应使两个末端结合。这种汇聚型化学连接方案也可以采用正交连接的化学物。图1E、2C和4C再次说明了肽段中存在或不存在的一些基团的差异。
图4A-4C说明如何按照本发明的原理来实现所得侧链巯基的天然化学连接和化学修饰。具体地说，图4A-4B描述的是利用连接位点上所得半胱氨酸侧链巯基的天然化学连接和化学修饰方法，通过巯烷基化并产生含有硫酯键的化学修饰侧链(用ψ表示)来形成一种“假氨基酸”(用ψXaa表示)。在一项未描述的可选实施方案中，可以通过脱硫反应将该侧链巯基转变成丙氨酸(Liang et al，J.Amer.Chem.Soc.(2001)123(4)：526-533)。这两种反应的一个重要方面是，任何不希望被转变或修饰的其他侧链巯基都应当用一种适当保护基团(PG)加以保护，或在多片段连接中用正交保护基团(PG’)加以保护，其中带有羧基末端Yaa基团的片段包含一种被保护的氨基末端Xaa基团，即PG-Xaa-肽，通过图4B中的例子提供说明。图4C说明根据图4A-4B以及图1A-1E、图2A-2C和图3A-3B，在用于连接和聚合物修饰中的肽段上可能存在或缺失的各种不同基团。
结合设计，构建用于合成多肽骨架的肽或多肽片段。其中包括根据选用于组装各种多肽骨架片段的连接化学反应来选择适当的连接位点、为指定靶蛋白选择聚合物结合化学反应，以及选择特殊的聚合物结合位点。当使用天然化学连接时，通过在靶多肽骨架氨基酸序列中搜索适当的天然半胱氨酸残基来确定半胱氨酸连接位点。当使用“扩展的天然化学连接”时，如文中所述，则可以通过在靶多肽骨架氨基酸序列中搜索允许坚固连接的适当的天然连接位点结合处来选择连接位点，如Xaa-Gly位点。由于扩展的天然化学连接不局限于在半胱氨酸残基处连接，任何氨基酸残基都可以作为连接位点结合处。在某些情况下，结合天然化学连接和扩展的天然化学连接可能是设计的一部分。
在一项优选实施方案中，可利用天然化学连接来产生部分或所有全长多肽链。在与促红细胞生成性合成蛋白对应的天然蛋白中存在的半胱氨酸可被用作化学连接位点。但是当优选连接点上没有适当的半胱氨酸时，可以将该位点上的非半胱氨酸氨基酸替换成半胱氨酸，以使该位点能够发生天然化学连接。如果需要，还可以按照文中的描述将新引入的半胱氨酸转变成与该位点的伯氨基酸相对应的假氨基酸残基。作为选择，当在某个位点上引入用于聚合物修饰的半胱氨酸时，可利用其侧链巯基来联接巯基反应性水溶性聚合物构建体，条件是靶多肽上不希望被修饰的其他所有半胱氨酸都已被保护。
在另一项优选实施方案中，可利用文中描述的扩展的天然化学连接方法来产生部分或所有全长多肽。该方法是使用N-末端的Nα-取代2或3碳链的烷基或芳基巯基氨基酸。根据文中描述的扩展的天然化学连接方法，可以有利地使用这些残基(当存在于用于连接的肽段或多肽段的N-端时)将这种多肽连接于一种带有C-端α-羧基硫酯基团的多肽。
用于合成肽类的常用方法是，用标准的自动化肽合成仪进行标准的Boc和(或)Fmoc逐级固相肽合成，或按照标准方法进行手动合成，也可以从供应商处定制和购买。(“合成肽，用户指南”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“肽合成原理，第二版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；“肽合成准则，第二版”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；以及“保护基团”，P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994；“Fmoc固相肽合成，实用方法”，Eds.，W.C.Chan和P.D.White，Oxford UniversityPress，2000)。用于硫酯介导型连接连接的肽类，如用于天然化学连接的肽类，也可以用标准方法制备。(可参考，例如，Dawson et al.，Science(1994)266：776-779；Canne et al.，Tetrahedron Lett.(1995)36：1217-1220；Kent，et al.，WO96/34878；Kent，et al.，WO98/28434；Ingenito et al.，JACS(1999)121(49)：11369-11374；and Hackeng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)96：10068-10073；Amiato et al.，同上)
在水溶性聚合物的连接和位点特异性联接过程中，肽的合成采用的是化学正交策略(参考，例如，图1-4和实施例)，以便能避免造成不必要联接的副反应。举例来说，根据连接方案和聚合物联接方法，可以采用不同的正交合成策略。具体地说，应该考虑的因素有，用于联接的水溶性聚合物的性质，特别是其与多肽结合的功能基团，例如下文针对本发明优选的拟糖聚合物进行的论述。
具体地说，制成的上述水溶性聚合物包含一种特有的功能基团U，该基团能选择性地与用于连接的靶肽、全长物质、甚至折叠多肽上的一种特有的功能基团反应。由于使用了化学合成方法，所以制成的肽在精确自定位点含有一种可彼此反应的化学选择性基团。本发明的该方面包括肽合成原理(保护基团策略)和化学连接(部分保护或无保护基团策略)。在保护基团策略中，除了水溶性聚合物上所需的功能基团外，靶分子上所有可能的反应性功能基团及其可彼此反应的功能基团都用适当的保护基团封闭。已知的许多保护基团都适合用于该目的(可参考，例如，“有机合成中的保护基团”，第三版，T.W.Greeneand P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochemCatalog 2000；“合成肽，用户指南”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman& Company，New York，NY，1992；“Advanced Chemtech组合有机化学与固相有机化学手册”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhoded，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；“肽合成原理，第二版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Yerlag，1993；“肽合成准则，第二版”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Yerlag，1994；以及“保护基团”，P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
因此，制成的水溶性聚合物可具有各种功能基团，例如上文描述的那些功能基团。在部分保护或无保护基团策略中，所使用的聚合物上的功能基团及其可彼此反应的存在于靶肽或靶多肽上的功能基团是一种化学选择性反应对，反应系统中即使存在其他功能基团也不会发生反应。其中包括可用于胺捕获策略(例如通过半胺形成、亚胺形成和Michael加成反应而连接)、巯基捕获策略(例如通过硫醇盐形成、二硫化物交换而连接)、天然化学连接策略(例如通过硫酯交换，其中包括侧链含有半胱氨酸或巯基的氨基酸衍生物)，以及正交连接耦联策略(例如通过噻唑烷形成、硫酯交换、硫酯形成、二硫化物交换和胺形成而连接)的基团(可参考，例如，Coltart，DM.，Tetrahedron(2000)56：3449-3491)。
该实施方案中优选的化学选择性U基团应包含一种带有特异功能基团的残基，该功能基团可用于水兼容性化学连接，如天然化学连接(Dawson，et al.，Science(1994)266：776-779；Kent，et al.，WO96/34878)、扩展的常规化学连接(Kent，et al.，WO98/28434)、肟型化学连接(Rose，et al.，J.Amer.Chem.Soc.J.Amer.Chem.Soc.(1994)116：30-33)、硫酯型连接(Schnlzer，et al.，Science(1992)256：221-225)、巯醚型连接(Englebretsen，et al.，Tet.Letts.(1995)36(48)：8871-8874)、腙型连接(Gaertner，et al.，Bioconj.Chem.(1994)5(4)：333-338)，以及噻唑烷型连接和恶唑烷型连接(Zhang，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)：9184-9189；Tam，et al.，WO95/00846)或其他方法(Yan，L.Z.andDawson，P.E.，“利用天然化学连接与脱硫的组合方法来合成不含半胱氨酸残基的肽和蛋白质”，J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，在此引入作为参考；Gieselnan et al.，Org.Lett.20013(9)：1331-1334；Saxon，E.et al.，“Traceless”staudingerLigation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds，Org.Lett.2000，2，2141-2143)。
根据上文描述的多种联接化学性质，在水溶性聚合物与靶肽或靶多肽之间形成的键可选自羧酸酯键、酯键、尿烷键、原酯键、酰胺键、胺键、肟键、酰亚胺键、脲键、硫脲键、硫醚键、硫尿烷键、硫酯键、醚键、噻唑烷键、腙键、恶唑烷键，等等。最优选的键是肟键和酰胺键。
上述肽连接反应步骤，如图1-4所示，可以使用固相或液相连接策略。图8描述了另一种用于将水溶性聚合物与一种肽段精确联接的方法，该肽段可用于连接产生本发明的促红细胞生成性合成蛋白。第一步使用了固相肽合成(“SPPS”)(例如Fmoc或Boc SPPS)，其中与聚合物定向连接的氨基酸侧链被一种正交保护基团所保护(例如，如果用Fmoc SPPS，可使用Boc基团来保护聚合物结合位点，或者，如果用Boc SPPS，则可以使用Fmoc基团作为正交保护基团)。在肽合成之后，上述正交保护基团被选择性地去除，而其余的肽仍被保护。这样就为下一步固相聚合物合成提供了单一结合位点。一旦正交保护基团被去除，聚合物链就作为一种前体被结合。更优选的是用图6A-6D中描述的方法逐轮的合成该聚合物链。尽管只显示了一种单一聚合物结合位点，但是可提供的多于一种。图9显示整个反应的流程图。
如上所述，化学连接涉及在第一种化学成分和第二种化学成分之间形成一种选择性共价键的过程。使用第一种和第二种成分上存在的可彼此反应的特异功能基团可以使连接反应具有化学选择性。举例来说，肽和多肽的化学连接涉及带有相容的可彼此反应的C-端和N-端特异氨基酸残基的肽或多肽片段的化学选择性。可利用多种不同的化学反应来实现该目的，其实例包括天然化学连接(Dawson，et al.，Science(1994)266：776-779；Kent，et al.，WO96/34878)、肟型化学连接(Rose，et al.，J.Amer.Chem.Soc.J.Amer.Chem.Soc.(1994)116：30-33)、硫酯型连接(Schnlzer，et al.，Science(1992)256：221-225)、巯醚型连接(Englebretsen，et al.，Tet.Letts.(1995)36(48)：8871-8874)、腙型连接(Gaertner，et al.，Bioconj.Chem.(1994)5(4)：333-338)，以及噻唑烷型连接和恶唑烷型连接(Zhang，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)：9184-9189；Tam，et al.，WO95/00846；美国专利5,589.356)；Gieselman et al.，Selenocysteine介导的天然化学连接(Org.Lett.(2001)3(9)：1331-1334))；以及Staudinger酰胺型化学连接(Saxon et al.，Org.Lett.(2000)2：2141-2143)。因此，可以理解，能用于联接未保护肽段的任何化学选择性反应化学都适用于该目的。
选择给定的连接化学反应条件是为了维持连接反应中使用的肽或多肽的所需的相互作用。例如，pH和温度、连接反应标记物在水中的溶解度、第一种片段与第二种片段的比率、水含量以及反应混合物的成分，都可以被改变以优化连接。利用添加或去除能使连接片段以不同程度溶解的试剂可进一步控制所需连接反应的特异性和速率，即通过操纵肽或多肽片段的溶解度来控制反应基团的暴露程度和提供量。通过对所需的化学选择性反应产物与一种或多种内部对照和(或)外部对照的比较结果进行分析，可以容易地确定反应条件。
当连接涉及接合具有N-末端半胱氨酸残基的多肽时，优选使用天然化学连接方法(Dawson，et al.，Science(1994)266：776-779；Kent，et al.，WO96/34878)。该方法被证实是一种用以在连接位点产生天然酰胺键的可靠方法。天然化学连接涉及在具有C-末端α-羧基硫酯基团的第一种肽或多肽片段和具有N-末端半胱氨酸残基的第二种肽或多肽之间发生的一种化学选择性反应。巯基交换反应产生了一种初始硫酯-联中间体，其自发地重排以在连接位点上形成一种天然酰胺键，同时再生出半胱氨酸侧链巯基。在许多情况下，天然蛋白的序列会包含位置适当的半胱氨酸，从而可以合成具有N-末端半胱氨酸残基的多肽片段，并将其用于天然化学连接。在另外的一些情况下，可以引导肽合成，以便在多肽中引入半胱氨酸残基以实现该目的。例如在其标准形式，天然化学连接涉及在靶多肽序列的半胱氨酸残基上发生的硫酯-介导的化学选择性反应；在连接位点上形成了一种肽键，并且再生出天然形式的Cys的侧链。
作为选择，通过使用“假天然化学连接”或“扩展的天然化学连接”可以合成出本发明的蛋白。假天然化学连接涉及使用在用于蛋白合成的肽类中的预选位置上的非天然的假氨基酸残基(例如，见图4)。该假氨基酸的结构既模拟了半胱氨酸的结构，又模拟了在合成蛋白的这种预选位置上发现的天然氨基酸的结构。因此，假天然化学连接涉及由天然化学连接在连接位点产生的半胱氨酸的侧链的硫烷化。一个优选方面是，在发生半胱氨酸硫烷化的连接位点处，至少有一种肽含有一个具有经一种适当保护基团保护的巯基的天然半胱氨酸。
在本发明的一项优选实施方案中，半胱氨酸基团的巯基部分被修饰成为一种预期的侧链，例如，一种核糖体特异性氨基酸及其类似物的侧链，，或一种非核糖体特异性氨基酸的侧链。文中所用的核糖体特异性氨基酸是指，在蛋白翻译过程中可被核糖体识别并掺入到核糖体所产生的蛋白中的氨基酸。大量已发表的文献中都有关于对半胱氨酸侧链巯基进行化学修饰的描述(可参考，例如，”蛋白科学中的通用方法”，由John E.Coligan et al.，John Wiley & Sons主编，NY(2000))。Kaiser，E.T.对转变半胱氨酸的侧链以模拟天然氨基酸侧链的特性进行了描述(参考，例如，Kaiser，E.T.et al.，“酶活性位点的化学改变”，Science.1984 Nov 2；226(4674)：505-11)。此外，也描述了使用半胱氨酸侧链来将一种标记物引入肽或蛋白的方法。关于半胱氨酸侧链修饰的综述可参考：“蛋白接合和交联化学”，S.S.Wong，(1991，CRC Press)；“蛋白质的化学修饰”，Gary E.Means et al.，(1971，Holden-day)，“蛋白质的化学修饰：精选方法和分析过程”，Glazer，A.N.et al.，(1975，Elsevier)；“用于蛋白修饰的化学试剂”，RL Lundblad(1991，CRC Press)。Tam et al.(Biopolymers(1998)46：319-327)公开了将同型半胱氨酸用于非-Cys天然化学连接，然后用对-硝基苯磺酸盐(甲基化试剂)将同型半胱氨酸侧链通过硫烷化而转变为天然甲硫氨酸的侧链(-CH2-CH2-S-CH3)的方法。此外，本发明也可被用于将同型半胱氨酸转变为假氨基酸，即转变为除甲硫氨酸外的其他氨基酸。但是，根据本发明，对至少含有一个不希望被转变的天然半胱氨酸的肽而言，在配对形成二硫化物的过程中必须使用保护基团来避免其天然半胱氨酸被破坏，这与文中描述的半胱氨酸转变方法相同。适当的保护基团将在下文描述。
虽然假天然化学连接方法无助于模拟某些核糖体特异性氨基酸的侧链(如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸及脯氨酸的侧链)(但丙氨酸侧链可以通过脱硫反应来形成(Liang，Z.Y.and Dawson，P.E.，“利用天然化学连接与脱硫的组合方法来合成不含半胱氨酸残基的肽和蛋白质”，J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，在此引入作为参考))，但是可用于形成与多种核糖体特异性氨基酸或非编码氨基酸类似的侧链。按照本发明的假天然化学连接方法产生的氨基酸将含有巯醚键，而且不具有β-分支(因为它们的β位上都是甲基，即aa-CH2-S-)。因此，β-分支型氨基酸、异亮氨酸和苏氨酸的假氨基酸形式可以具有悬垂侧链结构，而没有β几何结构和相应的几何约束。
值得注意的是，本发明的上述方法可用于形成与核糖体特异性氨基酸侧链的长度相同或更长或更短的氨基酸侧链。利用侧链长度的这种变化可以使三维构象稳定(或不稳定)，以增加蛋白的稳定性(或增强蛋白改变自身构象的能力，从而能接受与天然蛋白的底物、抑制剂、受体、配体等不同的底物、抑制剂、受体、配体)。例如，cys-CH2-SH+Br-CH2-COOH得到Cys-CH2-S-CH2-COOH(这种“假谷氨酸”具有一个额外的侧链原子，即-S-基；作为选择，如果在上述位置中使用天冬氨酸，所得产物会具有两个额外的侧链原子，即-S-CH2-基)。其他侧链也具有相同数量的侧链原子，但不同的是掺入了巯醚键(-S-)。例如，Cys-CH2-SH+Br-CH2-NH-PG，在去除PG后得到Cys-CH2-S-CH2-NH2。所得结构的侧链中没有额外原子，但是一个-CH2-基团被-S-所代替。本文的另一个实例是甲硫氨酸，Cys-CH2-SH+I-CH2-CH3得到Cys-CH2-S-CH2-CH3(与天然甲硫氨酸的结构对比：Met-CH2-CH2-S-CH3)；从而巯醚被重定位了。精氨酸也是如此：Cys-CH2-SH+Br-CH2-NH-CH((-NH2)(＝NH2 +))得到Cys-CH2-S-CH2-NH-CH((-NH2)(＝NH2 +))。优选的是将反应性氨基保护起来，具体地说，在构建假赖氨酸过程中使用该方法可避免不必要的副反应。一旦硫烷化反应完成，即可去除保护基团。
总的来说，当需要尽可能地模拟天然蛋白时，最优选的是使用与蛋白在该位置正常出现的核糖体特异性氨基酸的侧链长度相同的假氨基酸分子；优选程度较低的是使用比核糖体特异性氨基酸的侧链长一个原子的假氨基酸分子，优选程度更低的是使用比核糖体特异性氨基酸的侧链长两个原子的假氨基酸分子。此外，在选择半胱氨酸连接位点时，优选的是不会发生遗传突变而破坏其功能的位点，或该位置上的氨基酸是相关蛋白中的保守氨基酸的位点。利用丙氨酸扫描、同源性模拟以及其他方法可以确定这些位点。
与天然化学连接相同，假天然化学连接也是将含有氨基末端半胱氨酸残基的肽与含有羧基末端硫酯的肽相连接。然后使半胱氨酸的巯基侧链与通式为Raa-X的一种化合物反应，其中，X是一种有用的保留基团，而Raa是一种基团，其结构模拟了核糖体特异性氨基酸或合成氨基酸的侧链末端部分。
值得注意的是，用于假天然化学连接的半胱氨酸侧链可以是天然的L一型，也可以是D-型。使用D-型可以在连接位点引入蛋白酶抗性，因此，当需要增加蛋白酶解稳定性时，可能需要使用D-型半胱氨酸。但使用D-型半胱氨酸时，该位点的骨架结构会发生改变。除蛋白酶抗性外，这种变化还可用于改变生物活性。但是，为了尽可能减小对生物活性的影响，优选的是将D-型半胱氨酸定位于无序区等具有高度柔性的位点，例如所得折叠分子表面的无规卷曲部位，或分子的无序末端。理想的是通过假天然化学连接将带电的大侧链(如Lys、Arg、Asp或Glu的侧链)置于合成分子的表面。
合适的有用保留基团X的实例包括卤素，特别是碘和溴。Raa基团的实例包括PO4、COOH、COO、CONH2、胍盐、胺、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、咪唑、烷化咪唑、吲哚或烷化吲哚基团。
选择使用何种Raa取决于需要在特定位置上呈现的氨基酸侧链。因此，以具有如下氨基酸序列的一种预期多肽或蛋白为例：
其中Q和W分别表示可以存在或缺失的额外氨基酸残基，aax和aay表示内部相邻残基(分别具有侧链x和y)，而aaNH2和aaCOOH分别表示多肽或蛋白的氨基(N-)末端残基和羧基(C-)末端残基，该多肽或蛋白的合成方法是制备两种肽段：
Figure A0181538200392
和Cys-W-aaCOOH
其中Cys表示用半胱氨酸替换aay，并且R是与硫酯基团相容的任何基团，其中包括，但不局限于，芳基、苄基和烷基。R的实例包括3-羧基-4-硝苯基硫酯、苄酯和巯基丙酸亮氨酸酯(参考，例如，Dawsonet al.，Science(1994)266：776-779；Canne et al.，TetrahedronLett.(1995)36：1217-1220：Kent，et al.，WO96/34878；Kent，et al.，WO98/28434；Ingenito et al.，JACS(1999)121(49)：11369-11374：以及Hackeng et al.，Proc．Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)96：10068-10073)。其他实例包括二硫苏糖醇、烷基或芳基巯基酯，它们可以通过众所周知的intein-介导的生物学技术而产生(参考，例如，Chong et al.，Gene(1997)192：277-281；Chong et al.，Nucl.Acids Res.，(1998)26：5109-5115；Evanset al.，Protein Science(1998)7：2256-2264；and Cotton et al.，Chemistry & Biology(1999)6(9)：247-256)；然后使上述片段相连接，以形成：
再使连接片段与Ry-X反应，其中，Ry是一种能够模拟y侧链结构的侧链基团。该反应是在足以使半胱氨酸的巯基转变为“假-y”侧链的条件下进行的。举例来说，如果所选的Raa是CH2-COOH或(CH2)2-COOH，那么该反应会形成一种能够模拟天冬氨酸或谷氨酸结构和功能的氨基酸残基(“假-Asp”或“假-Glu”)。如上所述可知，也可以使用两种以上的肽段来进行更复杂的合成反应。
该方法的一个重要特征是对反应片段中不希望被修饰的半胱氨酸残基进行侧链保护，以避免连接位点以外的Cys残基被化学修饰，或防止反应片段中计划通过连接反应后化学修饰来形成相同“假氨基酸”的其他任何Cys残基被化学修饰。
文中所用的符号表示苄基；IM表示咪唑基团，而IN表示吲哚基团；PG表示保护基团。下文总结了可用以合成含有根据本发明的假氨基酸残基的Raa侧部基团(其中X是卤素(I、Br、Cl和F)，并且最优选的是I和Br，而F优选用于与连接)：
碱性氨基酸：
Lys(无额外原子)
      -CH2-SH+X-CH2-CH2-NH-PG，然后去保护形成
      -CH2-S-CH2-CH2-NH2
Arg(无额外原子)
      -CH2-SH+X-CH2-NH-C((NH2)(＝NH2+))
      形成-CH2-S-CH2-NH-C((NH2)(＝NH2+))
His(2个额外原子)
      -CH2-SH+X-CH2-IM形成-CH2-S-CH2-IM
酸性氨基酸：
Asp(2个额外原子)
      -CH2-SH+X-CH2-COOH形成-CH2-S-CH2-COOH
Glu(1个额外原子)
      -CH2-SH+X-CH2-COOH形成-CH2-S-CH2-COOH
不带电荷的极性氨基酸：
Tyr(无或1个额外原子)
      -CH2-SH+F--pOH形成-CH2-S--pOH)(无额外原子，相同的几何结构)
      -CH2-SH+Br/l-CH2--pOH形成-CH2-S-CH2--pOH(1个额外原子)
Gln(1个额外原子)
      -CH2-SH+X-CH2-C(O)(NH2)形成-CH2-S-CH2-C(O)(NH2)
Asn(2个额外原子)
      -CH2-SH+X-CH2-C(O)(NH2)形成-CH2-S-CH2-C(O)(NH2)
Ser(2个或3个额外原子)
      -CH2-SH+X-CH2OH)形成-CH2-S-CH2OH(2个额外原子)
      -CH2-SH+X-CH2-CH2OH)形成-CH2-S-CH2-CH2OH(3个额外原子)
Thr(2个或3个额外原子，丧失β分支)
      -CH2-SH+X-CH((CH3)(O-PG))然后去除PG
      gives-CH2-S-CH((CH3)(OH))(2个额外原子)
      -CH2-SH+X-CH2-CH((CH3)(O-PG))然后去除PG
      gives-CH2-S-CH2-CH((CH3)(OH))(3个额外原子)
非极性氨基酸：
Leu(1个或2个额外原子)
      -CH2-SH+X-CH((CH3)(CH3))形成-CH2-S-CH((CH3)(CH3))(1个额外原子)
      -CH2-SH+X-CH2-CH((CH3)(CH3))形成-CH2-S-CH2-CH((CH3)(CH3))
      (2个额外原子)
Ile(2个或3个额外原子，丧失β分支)
      -CH2-SH+X-CH(CH3)-CH2-CH3形成-CH2-S-CH(CH3)-CH2-CH3(2个额外原子)
      -CH2-SH+X-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3形成-CH2-S-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3(3
      (3个额外原子)
Phe(1个或2个额外原子)
      -CH2-SH+F-形成-CH2-S-(1个额外原子)
      -CH2-SH+Br/l-CH2-形成-CH2-S-CH2-(2个额外原子)
Met(无额外原子)
      -CH2-SH+l-CH2-CH3形成-CH2-S-CH2-CH3
Trp(1个额外原子)
      -CH2-SH+F-IN形成-CH2-S-IN
但是，在不便于或不希望对蛋白序列进行修饰以在多肽的特定N-端引入用于连接的半胱氨酸或高半胱氨酸残基或在连接位点使用假氨基酸的情况下，可以将天然化学连接方法加以扩展，即使用N-端被修饰成含有N-取代的，优选的是Nα-取代的，2或3碳链的烷基或芳基巯基氨基酸的多肽，从而可以将天然化学连接的原理应用于不含半胱氨酸残基的多肽(参考美国专利申请系列60/231,339，在此引入作为参考)。
“扩展的天然化学连接”方法涉及将含有羧基硫酯的，更优选的是α-羧基硫酯的，第一种成分与含有N-取代的，优选的是Nα-取代的，2或3碳链的烷基或芳基巯基氨基酸的第二种成分相连接。第一种成分中的羧基硫酯与第二种成分中N-取代2或3碳链的烷基或芳基巯基上的巯基之间可通过硫酯键连接的中间体发生化学选择性反应，并形成最初的连接产物。更具体地说，COSR硫酯成分与氨基烷基硫成分之间的巯基交换可产生一种硫酯键连接的中间连接产物，该产物在自发重排之后可经过一种5元或6元环中间体而产生酰胺键连接的第一连接产物，中间体的形式取决于氨基烷基硫成分的通式分别为I还是II：
    J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2               I
    J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2    II
其中J1是含有一种或多种可选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或其部分、一种聚合物、一种染料、一种适当功能化的表面、一种连接物或可检测标记，或适用于化学肽合成或扩展的天然化学连接的其他任何化学基团；R1、R2和R3各自是与C1结合的H或供电子基团；条件是R1、R2和R3中的至少一种含有与C1结合的供电子基团；J2是含有一种或多种可选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或其部分、一种聚合物、一种染料、一种适当功能化的表面、一种连接物或可检测标记，或适用于化学肽合成或扩展的天然化学连接的其他任何化学基团。
连接位点上的N-取代2或3碳链的烷基或芳基巯基[HS-C2-C1(R1)-]或[HS-(C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-)可以在不破坏产物的肽相容条件下被去除，从而在连接位点上产生具有天然酰胺键的通式III的最终连接产物：
    J1-C(O)-HN-J2                          III
其中J1、J2、R1、R2和R3的定义如上文所述。
选择的R1、R2和R3基团有助于在肽相容裂解条件下将N-C1键裂解。例如，可利用供电子基团，特别是与C1结合的供电子基团，在C1处形成一种能够促进裂解的共振稳定性阳离子。优选的是，化学连接反应包含一种作为赋形剂的巯基催化剂，并且该反应是在pH值约为中性的条件下在水相或有机-水混合相环境中进行。第一种成分与第二种成分可以通过一种能够自发重排而形成N-取代酰胺键连接产物的5元或6元环来实现化学连接。当第一种成分和第二种成分均为肽或多肽时，N-取代酰胺键连接产物具有通式IV或V：
    J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2             IV
    J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2  V
文中J1、J2、R1、R2、R3和Z2的定义如上文所述。
在N-取代酰胺键连接产物上结合的供电子基团R1、R2或R3可促进N-C1键的裂解，并有助于将2或3碳链烷基或芳基巯基从N-取代酰胺键连接产物上去除。在肽相容性裂解条件下将N端烷基或芳基巯基链去除后，可产生一种在连接位点上具有天然酰胺键的连接产物。当第一种成分和第二种成分均为肽或多肽时，N-取代酰胺键连接产物具有通式：
    J1-CONαH-CH(Z2)-C(O)-J2                 X
通式I中的典型的R1取代基显示在表1中。
                             表1
Figure A0181538200441
通式II中的典型的R1、R2和R3取代基显示在表2中
Figure A0181538200451
与N-取代2碳链化合物的情况相同，为了保持与C1碳的电共轭，苄基和吡啶甲基供电子取代基R1’、R3’和R5’必需定位于邻位或对位上，以加强连接后的Nα-C1键裂解。但是当R2和R3是与C2和C3形成苄基时，R1’和R3’中的至少一种应含有强供电子基团，其中R1’或R3’选自甲氧基(-OCH3)、巯基(-SH)、羟基(-OH)，以及甲硫基(-SCH3)。当N-取代3碳硫代链中的R2和R3为氢时，R1可含有一种苄基或吡啶甲基，其中的R1’、R3’和R5’含有强供电子基团或中等供电子基团，或其组合。与N-取代2碳链烷基或芳基巯基的情况相同，强供电子基团可加强3碳链烷基或芳基巯基对连接后裂解的灵敏度。因而可相应地选择特定的供电子基团或其组合。
与N-取代2碳链化合物的情况相似，本发明的N-取代3碳链化合物可以将目的构建体R1’和R5’位置上能够用于取代的R1取代成巯基。在此，该供电子巯基也是与C1结合，而将其引入这些部位使得化合物能够通过两种途径来实现6元环形成性连接。此外还可以提高可用于与α-羧基硫酯反应的巯基的局部浓度，并且在结构局限性方面提供了可促进连接的额外构象。
本发明的N-端N-取代2或3碳链烷基或芳基硫代氨基酸可以按照，例如，方案I和方案II的描述并根据该领域已知的标准有机化学技术来加以合成。可参考，例如，“高等有机化学、反应、机制和结构”，第4版，J.March(Ed.)，John Wiley & Sons，New York，NY，1992；“有机转换详解：功能基团制备指南”，R.Larock(Ed.)，VCH Publishers，New York，NY，1989。其合成可以采用溶液合成法、聚合物支持合成法，或其组合。优选的方法是采用Nα保护的、N-烷基化的、S-保护的氨基烷基或芳基硫代氨基酸前体。合成所使用的试剂可以从任意的公司购买。此外，应该充分了解的是，以试剂盒等形式提供的起始成分和多种中间体，如各种氨基酸衍生物，均可以保存以备后用。
在制备本发明的N-端Nα-取代2或3碳链烷基或芳基硫代氨基酸时，使用的是保护基团策略。一般而言，用于多种合成策略的优选保护基团(PG)均适用于固相肽合成(“SPPS”)方法。在某些情况下还必须使用能够在不同条件下被去除的正交保护基团。这些保护基团中有很多已为该领域所了解，并且可用于该目的(可参考，例如，“有机合成中的保护基团”，第3版，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；Nova Biochem Catalog 2000；“合成肽使用手册”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，NewYork，NY，1992；“Advanced Chemtech组合有机化学与固相有机化学手册”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，AdvancedChemtech，1998；“肽合成原理，第2版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Yerlag，1993；“肽合成准则，第2版”，M.Bodanszky andA.Bodanszky，Ed.，Springer-Yerlag，1994；以及“保护基团”，P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。实例包括苄氧基羰基(Z)、Boc、Bpoc、Trt、Nps、FmocCl-Z、Br-Z；NSC、MSC、Dde，等等。适用于硫基的保护基团的实例包括，但不局限于，苄基、4-甲苄基、4-甲氧苄基、三苯甲基、ACM、TACAM、氧蒽基、二硫化衍生物、吡啶甲基，和苯甲酰甲基。
更具体地说，可以按照方案I(固相制备Nα-取代前体)、方案II(液相制备Nα-取代前体)来制备Nα-取代2或3碳链烷基或芳基硫。方案I是利用标准的聚合物支持有机合成方法，直接将Nα-取代2或3碳链烷基或芳基硫组装在固相上，而方案II是利用标准的结合方法将Nα-保护的、N-烷基化的、S-保护的氨基烷基或芳基硫代氨基酸前体结合在树脂上。当产生外消旋产物或非对映体产物时，可能先要利用标准方法进行分离，然后再用于扩展的天然化学连接。
                          方案I
ECL辅助衍生分子的固相合成
Figure A0181538200471
X＝卤素
                         方案II
α-羧基硫酯的产生可以按照该领域已知的标准技术用化学或生物学方法来实现，例如文中描述的方法，其中包括实施例中描述的方法。在化学合成方法中，α-羧基硫酯肽可以在溶液中合成，也可以在硫酯-生成树脂上合成，这些技术是众所周知的(可参考，例如，Dawson etal.，Science(1994)266：776-779；Canne et al.，Tetrahedron Lett.(1995)36：1217-1220；Kent，et al.，WO96/34878；Kent，et al.，WO98/28434；Ingenito et al.，JACS(1999)121(49)：11369-11374；and Hackeng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)96：10068-10073；Amiato et al.，同上)。举例来说，化学合成的硫酯肽可以用相应的α-硫代酸肽来制备，而α-硫代酸肽可以在硫酯-树脂上或在溶液中合成，但是优选的是树脂方法。肽-α-硫代酸可以被转变为对应的3-羧基-4-硝苯基硫酯、对应的苄酯，或任何一种烷基硫酯。所有这些硫酯都提供适用于连接的保留基团，使用3-羧基-4-硝苯基硫酯比使用相应的苄酯的反应速率略快，而苄酯的反应性又比烷基硫酯更强。另一个例子，可以用三苯甲基交联的巯基丙酸亮氨酸硫酯-生成树脂来合成C-末端硫酯(Hackeng et al.，同上)。此外，还可以用3-羧基丙磺胺保险栓连接物来实现C-末端硫酯的合成，其方法是，通过用重氮甲烷或碘甲基氰活化，然后用一种适当巯基取代(Ingenito et al.，同上；Bertozzi et al.)。
此外，C-末端α-羧基硫酯肽也可以用生物学方法制备，如intein-介导的生物学技术(可参考，例如，Chong et al.，Gene(1997)192：277-281；Chong et al.，Nucl.Acids Res.，(1998)26：5109-5115；Evans et al.，Protein Science(1998)7：2256-2264；and Cotton et al.，Chemistry & Biology(1999)6(9)：247-256)。举例来说，可利用带有或不带有诸如亲合标签等标记物的intein表达系统，使用其蛋白-剪接元件的可诱导的自裂解活性来产生C-末端二硫苏糖醇(DTT)酯肽或多肽片段。具体地说，在DTT、β-巯基乙醇或半胱氨酸等巯醇存在条件下，intein可经过特殊的自裂解过程，该过程产生一种带有C-末端硫酯的肽段。可参考，例如，chong et al.，(1997)同上；chong et al.，(1998)同上；Evans et al.，同上；and Cotton et al.，同上。但是，当使用一种重组产生的片段时，最终构建体的化学合成部分通常会含有其加入的聚合物修饰。
将本发明的N-取代的2或3碳链烷基或芳基巯基成分与第一种羧基硫酯成分相连接，可产生一种在连接位点具有N-取代酰胺键的连接产物。选择连接反应的条件是为了维持硫酯与N-取代的2或3碳链烷基或芳基巯基部分的选择反应性。在一项优选实施方案中，上述连接反应是在一种pH值为6-8的缓冲溶液中进行的，并且其优选的pH值范围是6.5-7.5。该缓冲溶液可以是水性的、有机的或其混合物。此外，上述连接反应还可以含有一种或多种催化剂和(或)一种或多种还原剂、脂类、洗涤剂、其他变性剂或增溶剂，等等。优选的催化剂的实例是含有巯基和膦的基团，如苯硫酚、苄基硫醇、TCEP和烷基膦。变性剂和(或)增溶剂的实例包括溶于水或TFE、HFIP、DMF、NMP等有机溶剂的胍盐、尿素，混有水的乙腈，或含有胍盐和尿素的水。此外，还可以用温度来调节连接反应的速率，常用温度为5-55℃，并且优选使用的温度在15℃和40℃之间。举例来说，在pH为6.8-7.8时，在含有6M胍盐和2％苯硫酚的反应体系中可以很好地进行连接。
对N-取代的2碳链烷基或芳基巯基而言，连接事件是由COSR硫酯成分和氨基烷基巯基成分之间的巯基交换引起的。这种交换产生一种硫酯连接的中间连接产物，该产物在自发重排后通过一种5元环中间体而产生通式为J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-J2的第一连接产物，该第一连接产物在连接位点上具有一种可去除的N-取代的2碳链烷基或芳基巯基[HS-C2-C1(R1)-]，其中的取代基如上文所定义。连接位点上的N-取代的2碳链烷基或芳基巯基[HS-C2-C1(R1)-]可以在肽相容条件下被去除，从而在连接位点上产生具有天然酰胺键的通式为J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最终连接产物。
对N-取代的3碳链烷基或芳基巯基而言，在COSR硫酯成分和氨基烷基巯基成分之间的巯基可产生一种硫酯连接的中间连接产物，该产物在自发重排后通过一种6元环中间体而产生通式为J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2的第一连接产物，该第一连接产物在连接位点上具有一种可去除的N-取代的3碳链烷基或芳基巯基[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]。连接位点上的N-取代的3碳链烷基或芳基巯基[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)]可以在肽相容条件下被去除，从而在连接位点上产生具有天然酰胺键的通式为J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最终连接产物。
优选在酸性条件下进行N-取代的烷基或芳基巯基的去除，以便促进N-C1键的裂解，并在连接位点上形成一种稳定的未取代的酰胺键。“肽相容裂解条件”是指适合肽类的物理-化学条件，并且适于将烷基或芳基巯基部分从连接产物中去除的条件。总的来说，根据所使用的α-取代化合物来选择肽相容裂解条件，该条件可以通过常规的和众所周知的方法容易地被推断出(可参考，例如，“有机合成中的保护基团”，第三版，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley& Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；“合成肽，用户指南”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“Advanced Chemtech组合有机化学与固相有机化学手册”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhoded，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；“肽合成原理，第二版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Yerlag，1993；“肽合成准则，第二版”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Yerlag，1994；以及“保护基团”，P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
举例来说，当上述R1、R2或R3取代基含有一个甲氧基、羟基、巯基或甲硫基、甲基等基团时，更普遍的去除方法涉及肽合成化学典型的酸裂解条件。该方法包括在含有或不含有还原剂和(或)清除剂系统(例如，诸如氟化氢(HF)、三氟乙酸(TFA)、三甲基磺酰氟乙酸(TMSFA)等酸)的强酸性或含水酸的条件下，进行N-C1键的裂解。可以选择更有效的酸裂解系统来优化Nα-C1键的裂解，以去除给定构建体上的烷基或芳基巯基部分。这些条件是众所周知的，并有利于维持肽的完整性。此外，还可以加入巯基清除剂，特别是当肽或多肽序列中存在色氨酸时，可以避免色氨酸侧链与被释放的芳基或烷基巯基部分发生反应。巯基清除剂的实例包括乙二醇、半胱氨酸。B-巯基乙醇和硫代甲酚。
当吡啶甲基基团作为取代基时，其他专门的裂解条件包括光或还原性裂解条件。举例来说，当上述R1、R2或R3取代基含有一个吡啶甲基时，可以按照标准的方法，利用光分解作用(例如，紫外光)、锌/乙酸或电解还原作用来进行裂解。当N-取代的2碳链巯基的R1含有一个硫代甲烷基团时，就可以利用汞或HF裂解作用。此外，当第一种或第二种连接成分含有其他保护基团时，还可以使用上述裂解系统来进行固相支持物上的同时裂解，并且(或)可用作为一种去保护剂。
在本发明的一项实施方案中，在肽合成步骤中(特别是在自动肽合成和正交连接策略及汇聚连接策略中)使用Nα-取代的2碳或3碳烷基或芳基巯基来正确地形成N-末端衍生的多肽，该多肽可被用作为扩展的化学连接的底物以产生促红细胞生成性合成蛋白。中性化合物包含一种全保护的、部分保护的或全未保护的酸稳定性Nα-取代的2碳或3碳烷基或芳基巯基，其通式为(PG1)S-C2-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2或(PG1)S-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2，显示在表III和表IV中。具体地说，在Nα-取代的氨基烷基或芳基巯基转变为Nα-取代的酰胺烷基或芳基巯基后，R1、R2和R3中的一个或多个含有一种与C1结合的供电子基团，该基团能在C1上形成一种在肽相容裂解条件下可以促进Nα-C1键裂解的共振稳定性阳离子。PG1和PG2是可以单独或共同存在的或者缺失的保护基团，并且也可以相同或不同，其中的Z2是与化学肽合成或扩展的天然化学连接相适合的任何化学基团，并且其中的J2也是与化学肽合成或扩展的天然化学连接相适合的任何化学基团。PG1(或X1)是一种用以保护胺的基团。PG2(或X2)是一种用以保护巯基的基团。许多这类保护基团都被了解并适用于该目的(可参考，例如，“有机合成中的保护基团”，第三版，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley& Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；“合成肽，用户指南”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“Advanced Chemtech组合有机化学与固相有机化学手册”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhoded，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；“肽合成原理，第二版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；“肽合成准则，第二版”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；以及“保护基团”，P.J.Kocienski，Ed.，Geerg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
                      表III
Figure A0181538200521
优选的PG1和X1保护基团的实例包括，但不局限于，Boc(t-丁基氨基甲酸酯)、Troc(2，2，2-三氯乙基氨基甲酸酯)、Fmoc(9-芴甲基氨基甲酸酯)、溴-Z或氯-Z(溴-或氯-苄基甲酸酯)、Dde(4，4-二甲基-2，6-dioxocycloexl-ylidene)、MsZ(4-甲基亚磺酰基-甲酸酯)、Msc(2-甲基硫乙基甲酸酯)、Nsc(4-硝基苯基磺酰基-乙氧甲酸酯)。优选的PG1和X1保护基团选自“有机合成中的保护基团”，Greene and Wuts，第三版，Wiley-Interscience，(1999)，而最优选的是Fmoc和Nsc。优选的PG2保护基团包括，但不局限于，Acm(乙酰氨基甲基)、MeoBzl或Mob(对-甲氧基苄基)、Meb(对-甲基苄基)、Trt(三苯甲基)、Xan(吨基)、tButhio(s-t-丁基)、Mmt(对-甲氧三苯甲基)、2或4吡啶甲基(2或4吡啶基)、Fm(9-芴甲基)、tbut(t-丁基)、Tacam(三甲基乙酰氨基甲基)。优选的PC2和X2保护基团选自“有机合成中的保护基团”，Greene and Wuts，第三版，Wiley-Interscience，(1999)，，并且最优选的是Acm、Mob、MeB、Picolyl。
                        表IV
可以按照上文的方案I和方案II来制备本发明的Nα-取代的2碳或3碳链烷基或芳基巯基的保护形式。
本发明所述化合物的产生可采用多种不同的方法，其中包括卤素介导的氨基烷化作用、还原性氨化作用，并且还可以通过制备与固相氨基酸合成方法相适应的Nα-保护的、N-烷化的、S-保护的、氨基烷基或芳基硫代氨基酸前体来产生。如果需要，还可利用标准方法对外消旋产物或非对映体产物进行分离，以使化合物的手性纯度达到可接受的程度。
III.本发明优选的水溶性聚合物的合成和产生
文中所用的术语“分子异质性”是指蛋白制剂中的每一种蛋白所联接的聚合物分子数量不同。术语“分子多样性”是指(a)被聚合物修饰的蛋白位点不同，(b)蛋白制剂中相同蛋白的不同位点上或不同蛋白的相同位点上的加合聚合物的长度不同，或者(c)蛋白制剂中相同蛋白的不同位点上或不同蛋白的相同位点上的加合聚合物的所有分支程度和(或)性质不同。文中所用的术语“分子均一性”是指蛋白制剂中的所有蛋白分子在相同位置上含有相同的氨基酸序列和相同的聚合物修饰。两种或多种“分子均一性”蛋白制剂的混合物在文中被称为“分子性明确的”制剂。
根据本发明的这个方面，上述聚合物异质性、多样性和不适应性问题的解决方法涉及产生一类新的生物相容性聚合物，该聚合物结合了多肽(长度明确、便于合成)和“pPEG”(“精确型PEG”，一种具有柔性、两亲性并且无免疫原性的不易受蛋白酶作用的聚合物)的优势，Rose，K.et al.(美国专利申请系列09/379,297，在此引入作为参考)。这种新型生物相容性聚合物的通式为：
-[CO-X-CO-NH-Y-NH]n-
n为一个整数，优选的是1-100的整数，更优选的是2-100的整数，其中的X和Y是通过酰胺键相连接的具有明确结构的生物相容性重复元件。优选的是X和Y均为不含活性功能基团的二价有机基，或是二者均缺失，X和Y可以相同或不同，并且各自的重复单元(n)可以独立变化。优选的是，当n＝2时，X和Y中的至少一种选自取代的、未取代的、分支型和线型的脂肪族基团和芳香族基团。更优选的是，X和Y之一选自苯基、C1-C10烯基、C1-C10烷基、含有杂原子的苯基、含有杂原子的C1-C10烯基、含有杂原子的C1-C10烷基，及其组合。
特别优选的pPEG基团具有如下通式：
         -{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}n-
其中，优选的是n为1-100，更优选的为2-100；
-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-}n-，
其中，优选的是n为1-50，更优选的为2-50。
上述pPEG基团可通过多种方法中的任一种来合成。但这些基团的优选产生方法是多单元固相逐级链组装法，而不是聚合方法。利用这种组装方法可以使制剂的基团具有明确而均一的结构，例如其长度、X和Y取代基的性质、分支点位置(如果存在)，以及所有分支的长度、X和Y取代基和位置。
优选的是通过如下步骤来合成该基团：
(a)用一种摩尔数过量的通式为HOOC-X-COOH的二价酸衍生物将通式为Z-Q-支持物的化合物的氨基或羟基酰化，其中Z是H2N-或HO-；Q是一种连接物或一种靶分子；支持物是一种固相基质或表面；
(b)活化步骤(a)的产物上的自由羧基；
(c)用一种摩尔数过量的通式为NH2-Y-NH2的二元胺将步骤(b)的产物氨化；以及
(d)用HOOC-X-COOH和NH2-Y-NH2选择性地重复步骤(a)-(c)，其中该X和Y是缺失的，或是相同或不同的二价有机基，并且其变化与每个上述选择性重复单元无关，并且可以与前面的酰化和氨化步骤中所用的取代基X和Y相同或不同。
在一项优选实施方案中，使用的是6个、12个、18个和32个上述重复单元。如果需要，也可以将重复单元与，例如，赖氨酸的氨基协同使用，从而形成分支型pPEG结构。可以用多种化学物将pPEG联接于本发明的合成蛋白，其中包括形成硫醚键、肟键和酰胺键。
在一项实施方案中，多个单元的逐级固相链组装方法包括：
第1步：使保护的或未保护的二元酸与树脂上的氨基结合，从而在连接位点产生酰胺键(其中PG是一种保护基团，该基团可以存在或不存在，这取决于所用的二元酸)：
             PG-OOC-X-COOH+NH2-Y-NH-树脂
第2步：如果保护基团(PG)存在，则去除树脂上的保护基团
             HOOC-X-CO-NH-Y-NH-树脂
第3步：使保护的或未保护的二元胺与树脂上的羧基结合，从而在连接位点产生酰胺键(其中PG可以存在或不存在，这取决于所使用的二元胺)
          PG-NH-Y-NH+HOOC-X-CO-NH-Y-NH-树脂
第4步：如果保护基团(PG)存在，则去除树脂上的保护基团
          -NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-树脂
第5步：将步骤1-4重复“n”次，以添加“n”个单元，然后从树脂上裂解
-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-
如上所述，用于与本发明的促红细胞生成性合成蛋白相联接的优选水溶性聚合物为线型和分支型pPEG构建体。使用的pPEG可含有悬垂基团，这些基团在生理条件下可带有电荷或呈中性，并且可根据所用pPEG的结构而具有不同的化学联接性质、长度、分支和溶解度。如上所述，本发明的优选pPEGs包括一种含有-CO-X-CO-NH-Y-NH-重复单元的水溶性聚酰胺，其中，X与Y之一或二者都含有水溶性重复单元，最优选的是“PEG”型重复单元。原则上还可以用简单的两步固相法来获得寡聚脲，以氨基树脂NH2-树脂，和对称型二胺NH2-Y-NH2为例的方法如下所示：
用羰基二咪唑进行活化→im-CO-NH-树脂
用二胺NH2-Y-NH2进行氨解→NH2-Y-NH-CO-NH-树脂
其中，这两个步骤可以重复多次，以产生具有-NH-Y-NH-CO-重复单元的寡聚脲，但该方法的优选程度较低。原因是上述步骤在室温下的产量不确定，甚至使用高度过量的试剂和很长的反应时间也是如此。因此，优选的是用三步固相法来悬垂聚酰胺，以氨基树脂NH2-树脂为例的方法如下所示。为避免产生同质异构产物，试剂HO2C-X-CO2H和NH2-Y-NH2应该对称。
用二元酸HO2C-X-CO2H进行酰化→HO-CO-X-CO-NH-树脂
羰基二咪唑进行活化→im-CO-OCO-X-CO-NH-树脂
用二胺NH2-Y-NH2进行氨解→NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-树脂
这三个步骤可按顺序重复多次，以产生具有-NH-Y-NH-CO-X-CO-重复单元的聚酰胺。该聚合物可含有精确数量的单体单元，每一步的X和Y可各自不同，并且末端基团可任意选择。例如，在酰化步骤中使用琥珀酸酐(“Succ”)并在氨解步骤中使用4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺可以产生X为-CH2CH2-、Y为-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH-、重复单元为-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH-COCH2CH2CO-的“PEG”型聚酰胺。尽管该方法涉及不含保护基团的二价试剂，但除了如下所示的用分支型Lys核心制备分支型构建体的情况之外，使用标准的商品化肽合成树脂不会产生交联的问题(Rose et al.，(美国专利申请系列09/379,297)；和Rose et al.，J.Am.Chem.Soc.(1999)121：7034)。
举例来说，分支型pPEG构建体的制备方法与Rose et al.，(美国专利系列09/379,297)和Rose，K.and Vizzavona，J.(J.Am.Chem.Soc.(1999)121：7034)中描述的“化学体”构建体的制备方法类似。因此，可以将分支型pPEG构建体制备成含有一种分支核心，如赖氨酸分支核心，该核心通过肟键与-(COCH2CH2CO-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH)n-等优选水溶性聚酰胺相结合。例如，在聚酰胺另一末端的Lys侧链上的氨氧乙酰基可以很容易地与四聚核心(O＝CHCO)4Lys2Lys-等赖氨酸核心上的乙醛酰基形成肟键。因此，每个赖氨酸分支点的肟键都可以具有-Lys(COCH2ON＝CHCO-)酰胺-的结构。备选结构是在聚酰胺与聚酰胺游离悬垂基团之间形成肟键，优选的是使用单保护二氨，并在聚酰胺结合后进行去保护，从而产生如下所示的四价分支结构：
[O＝CHCO-(NH-CH2CH2CH2-[OCH2CH2]3-CH2-NH-COGH2CH2CO-)n]4Lys2Lys-
肟类化学物可用于制备二聚和四聚分支构建体，而且还适用于八聚分支构建体的组装(Rose，K.，J.Am.Chem.Soc.(1994)116：30；Rose，K.et al.，Bioconj.Chem.(1996)7：552)。当使用上述pPEG聚酰胺时，当然也可以将其他的化学反应用于该目的(可参考，例如，图13)。此外，可以将聚酰胺形成结合到用于肽合成的合成方案中，该方案包括Boc或Fmoc化学，但是，当执行该方案时，应牢记氨解步骤会去除Fmoc基团，并且如果使用Boc化学物，还将会去除吲哚的甲酰基保护。
因此，上述pPEGs可具有不同的分支核心(如赖氨酸分支核心等)，这些分支核心可通过选定的键(如酰胺键、硫酯键、肟键，等等)与线型水溶性聚酰胺(如-(Succ-TTD)n-等)相连接，其中，每个线型水溶性聚酰胺的每个游离末端上都可以添加特定的悬垂基团(如羧酸酯、氨基、酰胺等)以提供所需的电荷。此外，本发明的线型和分支型pPEGs还可含有一种特异的功能基团，用于与带有一个或多个可彼此反应的特异功能基团的合成蛋白相联接，而优选的是，pPEGs的悬垂基团不具有抗原性(可参考，例如，图13)。
在一项特别优选的实施方案中，本发明的促红细胞生成性合成蛋白是被分子组成均一的拟糖水溶性聚合物所修饰，该聚合物具有通式：
U-s1-B-s2-Polymer-s3-J*
其中，U是一种具有特定功能基团的残基，B是一种具有三个或三个以上相同或不同臂的分支核心，该核心可以存在，也可以不存在，Polymer是一种分子量大于约5,000Da的具有通式-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的聚酰胺，其中的X和Y为相同或不同的分支型或线型二价基团，n是2-50的离散整数，并且X和Y之一或二者都含有一种基本不具有抗原性的线型或分支型水溶性重复单元，J*是一种含有悬垂基团的残基，其中的悬垂基团基本不具有抗原性，并且在生理条件下的净电荷选自负值、正值和中性值，而s1、s2和s3是相同或不同的间隔物或连接物，这些间隔物或连接物可以分别存在或缺失。上述聚合物包括美国专利申请系列60/236,377中的聚合物，其内容在此完整引入作为参考。通式U-s1-B-s2-Polymer-s3-J*也可表示为U-B-Polymer-J*，其中的间隔基团或连接基团s1、s2、s3可以存在，也可以不存在。
本发明优选的拟糖聚合物的优选形成方法如图5-7所示。图5A-5B描述一种固相方法，用于产生本发明所述水溶性聚合物U-B-Polymer-J*的分支核心(B)和单一化学选择性功能基团(U)。该方法可以在溶液中进行，但优选的是如图所示的固相法。具体地说，图5A显示带有活性基团(
Figure A0181538200581
)的被正交保护的U-B前体，该构建体的基本几何结构用键连接的圆点来表示(
Figure A0181538200582
)，这种基本几何结构并不是要限制所用化学键或基团的类型，而只用于说明组合结构的几何关系，以及适合于产生本发明所述U-B基团的化学细节。将一种含有适当的可裂解连接物和互反应性基团( )的聚合体支持物/树脂活化，使其能够与U-B前体共价连接，然后使其与正交保护的U-B前体相结合：
该系统采用了聚合体支持物有机化学的原理。结合之后，按照图示对分支核心进行处理(只显示了一个分支点，其他分支点可以存在，也可以不存在)，使其适于随后联接所需的Polymer组分，如基本不具有抗原性的水溶性线型聚合物。此外还对U基团进行了说明，U基团可作为被正交保护的U-B前体的一部分在合成开始时提供，也可以在分支核心B的处理过程中或之后再产生。尽管Polymer组分的联接可以在树脂上进行，也就是在裂解之前进行，但优选的方法是将U-B部分从聚合体支持物/树脂上裂解，以产生U-B核心，然后将其纯化，并随后用于Polymer组分的联接。
如图所示，核心基团B的悬垂分支点上可含有相同或不同的功能基团(Func)，这些基团可以被可逆地保护(PG、PG’或PG”)，也可以不保护。在所有情况下，最终的Polymer组分联接步骤都涉及在悬垂分支点上产生一种功能基团(Func)，并产生U基团(参考图7)。图5B描述了一种替代方法，该方法是将被保护的U-B前体与一种带有连接物的聚合体支持物结合使用，当连接物被裂解，即可产生所需的被保护或未保护的U-基团。图5B还描述了组装前分支核心B与聚合体支持物的联接方法，以及利用可产生U-基团的树脂来制备U-B基团的方法，该U-B基团可随后用于联接Polymer组分。
图6A-6D描述一种固相方法，用于产生本发明优选的基本不具有抗原性的水溶性聚酰胺Polymer-J*组分，该组分可随后用于联接U-B核心。尽管图中描述的固相法是优选的方法，但也可以采用液相法来获得相同的最终结果。在图6A和6B中，利用固相有机化学原理使二元酸与二元胺单元相结合。还可以选择性地引入被保护的氨基-X’-酸和(或)氨基-Y’-酸单元，用于为具有符合通式-[NH-Y-NHCO-X-CO]-的聚酰胺结构的最终裂解产物中的X和Y基团提供额外的变化。图6A描述N-端至C-端方向的合成方法，图6B则描述C-端至N-端方向的合成方法。在图6C和6D中，利用固相有机化学原理使氨基-X’-酸和(或)氨基-Y’-酸单元相结合。图6C描述N-端至C-端方向的合成方法，图6D则描述C-端至N-端方向的合成方法。由图6A-6D可知，可以根据合成反应的循环次数来精确地控制聚酰胺终产物的性质。此外，悬垂基团J*的构建几乎可以按任何自定标准来进行。在使用单分散性重复单元X、Y、X’和Y’的条件下，聚酰胺终产物的准确分子量可以被精确地控制。
图7描述一种优选的方法，用于使U-B组分与Polymer-J*组分结合，以产生本发明优选的具有通式U-B-Polymer-J*的聚合物合成构成体。如图所示，提供的保护基团可以多种多样，并且可根据特定构建体的最终预期用途来任意选择不同的保护基团。此外还描述了用于产生所需U-B-Polymer-J*构建体的不同途径，其中包括固相法和液相法。
如上所述，优选的水溶性重复单元包括聚环氧烷、聚酰胺环氧烷，或其衍生物。最优选的水溶性重复单元包括通式-(CH2-CH2-O)-或-(CH2-CH2-O)-的环氧乙烷。这些水溶性重复单元的数量可以有很大不同，但更优选的数量为2-500、2-400、2-300、2-200、2-100、2-50，更优选的是2-32，最优选的是3-8。更优选的实施方案的实例为，其中的X和Y之一或二者都选自：-((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)n1-)-或-((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)，其中，n1为1-6、1-5、1-4，最优选的是1-3，而n2为2-50、2-25、2-15、2-10、2-8，最优选的是2-5。高度优选的实施方案的实例为，其中的X为-(CH2-CH2)-，而Y为-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-。再更优选的是单分散性组合物，其中的每个n均为离散整数。在一项高度优选的实施方案中，X为-(CH2-CH2)-，Y为-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)n-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-n，其中的n为12-36。
具体地说，当水溶性聚合物包含的聚合物链中带有环氧乙烷重复单元等聚环氧烷重复单元时，优选的是Polymer的每条链的原子分子量都约为1,500-42,000Da，最优选的则约为2,000-20,000Da。
优选的U基团含有一种能够进行化学连接的部分。优选的聚合物是分支型聚合物，其中的基团B含有三个或三个以上的臂。优选的组分J*含有一种在生理条件下可电离的基团，最优选的是带有负电荷。U和J之一或二者都可含有一种保护基团，该基团能够在不破坏构建体完整性的情况下被去除。
优选的间隔物或连接物包括含有一种或多种用于水溶性聚合物的重复单元、二元胺和(或)二元酸单元、天然或非天然氨基酸或其衍生物的线型或分支型基团，以及脂肪族基团，其中包括烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、烷氧基等，优选的是这些基团含有多达18个碳原子，甚至含有额外的聚合物链。
如上所述，组分U是含有一种功能基团的残基，该功能基团能够与靶分子或被靶分子结合，如肽或多肽或其他所需表面。当U是含有一种用于连接靶分子的功能基团的残基时，U可含有一种亲核基团或亲电子基团，而靶分子可相应地含有一种可彼此反应的亲电子基团或亲核基团。
已知有多种可彼此反应的上述功能基团能够与肽和多肽的常见侧链功能基团或衍生的侧链功能基团相联接(Zalipsky et al.，Bioconjugate Chemistry(1995)6：150-165；“生物共轭化学展望”，C.F.Meares，Ed.，ACS，1933；“蛋白接合与交联化学”，S.S.Wong，Ed.，CRC Press，Inc.(1993))。功能基团的实例包括能够与氨基反应的基团，如(a)羧酸酯，如对-硝基苯基，或琥珀酰亚胺；(b)羰基咪唑；(c)吖内酯；(d)环酰亚胺硫酮；以及(e)异氰酸酯或异硫氰酸酯。能够与羧酸基团和活性羧基反应的功能基团的实例包括(a)伯胺；或(b)肼和酰肼功能基团，如酰基酰肼、肼基甲酸酯、半氨基甲酸酯、硫代肼基甲酸酯、氨氧基，等等。能够与巯基或硫氢基反应的功能基团包括苯乙二醛、马来酰亚胺和卤素。能与诸如(羧)酸等羟基反应的功能基团或能够与亲电子中心反应的其他亲核基团的实例包括羟基、氨基、羧基、巯基、活性次甲基，等等。
举例来说，上述聚合物可以带有组分U，该组分U作为与靶分子连接的功能基团，其中的功能基团是丙烯酸酯、醛、酮、氨氧基、胺、羧酸、酯、硫酯、卤素、巯基、氰乙酸酯、二棕榈酰基、磷酯酰乙醇胺、二硬酯酰磷酯酰乙醇胺、环氧化物、酰肼、叠氮化物、异氰酸酯、马来酰亚胺、甲基丙烯酸酯、硝基苯羧酸酯、正二硫吡啶、硅烷、巯基、乙烯砜、琥珀酰亚胺戊二酸、琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酸、tresylate，等等。此外，还可以提供可活化形式的U，例如，可以将羧酸转变为能与胺等亲核试剂反应的活性酯。
在一项优选实施方案中，U是一种具有能与靶分子上特异功能基团选择性地反应的特异功能基团的残基。本发明的该方面包括如上文第II节中描述的肽合成的原理(保护基团策略)和化学连接(部分保护或无保护基团策略)。因此，U可以代表各种保护基团，如上文描述的那些内容。优选的U基团应适用于胺捕获策略(例如，通过半胺形成、亚胺形成和Michael加成反应而连接)、巯基捕获策略(例如通过硫醇盐形成、二硫化物交换而连接)、天然化学连接策略(例如通过硫酯交换，其中包括侧链含有半胱氨酸或巯基的氨基酸衍生物)，以及正交连接耦联策略(例如通过噻唑烷形成、硫酯交换、硫酯形成、二硫化物交换和胺形成而连接)(可参考，例如，Coltart，DM.，Tetrahedron(2000)56：3449-3491)。特别优选的U含有一种具有特异功能基团的残基，该功能基团可用于如上文第II节中描述的水相容性化学连接化学反应中。因此，U可以是一种能形成键的功能基团，这些键选自羧酸酯、酯、尿烷、硫酯、醚、噻唑烷、腙、恶唑烷等。最优选的键是肟键和酰胺键。
如上所述，B是一种具有三个或三个以上臂的分支核心部分，并且既可以存在也可以缺失。当B存在时，其一个臂与U连接，或通过间隔物或连接物与U相连，并且其他的所有臂都与Polymer连接，或通过间隔物或连接物与Polymer连接。分支核心B的实例包括，但不局限于，氨基、酰胺、羧基及其组合。其中包括由赖氨酸等形成的寡酰胺，或由烷二胺和丙烯酸形成的寡聚物(“聚氨基胺”)，后者在分支核心中提供净正电荷。(可参考，例如，Zeng et al.，J.Pept.Sci.(1996)2：66-72；Rose et al.，Bioconjugate Chem.，(1996)7(5)：552-556；NovoBiochem目录和肽合成手册，Laufelfingen，2001；Wells et al.，Biopolymers(1998)47：381-396；Mahajan etal.，(1999)40：4909-4912；Judson et al.(1998)39：1299-1302；Swali et al.，(1997)62：4902-4903；美国专利5,932,462、5,919,455、5,643,575、5,681,567)。也可以使用其他多种不同的适用于该目的的分支核心，其中包括取代二胺、取代二元酸、诸如甘油等烷酸，以及具有三个或三个以上功能基团或可活化基团的其他部分，这些基团包括多价烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、烷氧基，等等，以及寡聚糖(如Nierengarten et al.，Tetrahedron Lett.(1999)40：5681-5684；Matthews et al.，Prog.Polym.Sci.(1998)1-56；Suner et al.，Macromolecules(2000)33：253；Fischer et al.，Angew.Chem.Int.Ed.(1999)38：884；Sunder et al.，Adv.Mater.(2000)12：235；Mulders et al.，Tetrahedron Lett.(1997)38：631-634；Mulders et al.，Tetrahedron Lett.(1997)38：30-3088；和Turnbull et al.，Chembiocehm(2000)1(1)：70-74)。最优选的是分支核心通过酰胺键与Polymer组分相连接。
优选的分支核心选自氨基官能团、羧基官能团或氨基与羧基组合的官能团。优选分支核心的实例分别为赖氨酸氨基核心、天冬氨酸或谷氨酸分支核心，以及γ-谷氨酸分支核心。此外，优选的分支型聚合物构建体的分支选自寡聚酰胺或聚氨基胺核心等单一分支核心。但也可以使用其他类型的分支型构建体，如蠕虫样结构，其分支选自沿聚合物骨架分布的多分支核心序列(Schlüter et al.，Chem.Int.Ed.(2000)39：864)。根据聚合物骨架和重复单元的化学组成和(或)体积，可以将蠕虫样结构设计成水溶性或倾向于诱导液晶结构(Oualiet al.，Macromolucules(2000)33：6185)，从而有利于其递送应用性、稳定性和作用持久性。与本发明的其他分支型聚合物构建体相同，蠕虫样构建体可包含一种悬垂的含有U的功能基团。
如上文第I节所述，Polymer组分或一种或多种间隔物或连接物可带有一些生物稳定的或可生物降解的聚合物链或中间连接物或键。此外，如上文第I节所述，组分J*是一种含有悬垂基团的残基，该基团在生理条件下的净电荷选自负值、正值和中性值。最优选的是，J*含有一种可电离的羧酸酯基团，并且在生理条件下的净电荷为负值。如第I节所述，组分s1、s2和s3是相同或不同的间隔物或连接物，这些组分可以分别存在或缺失。最优选的间隔物或连接物包括一种聚合物链，其中的间隔物或连接物含有一个或多个具有通式-[CO-X-CO-NH-Y-NH]n-的重复单元。
IV.药剂学：
本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白可以作为药学制剂使用，以实现治疗疾病和病情的目的。因此，在另一项实施方案中，本发明提供药用组合物，包括一种本发明的促红细胞生成性合成蛋白或其药学容许性盐类。这种药用组合物可以包含一种或多种赋形剂。优选的赋形剂选自缓冲液、载体蛋白、氨基酸、去污剂、脂质体、水溶性聚合物和防腐剂。此外，除了促红细胞生成性合成蛋白之外，该药用制剂还可包含一种或多种额外的药用活性成分，例如一种或多种额外的生物活性剂(例如，有机小分子、其他蛋白治疗剂，等等)。这种药用组合物可在本发明的优选方法中使用。这些方法包括，提高哺乳动物的红细胞产量、红细胞比容、血红蛋白和网织红细胞数的方法。这些方法的步骤包括，将本发明的促红细胞生成性合成蛋白以有效的剂量给药于哺乳动物，以观测所需疗效。
当给药于需要治疗的病人或个体时，最优选的是用药物递送系统将该促红细胞生成性合成多肽和(或)蛋白进行给药。利用该系统可以将药物提供给患者，其提供方式可以使药物被患者接受，并且可提高所需生物活性的效力。就本发明而言，优选的药物递送系统包括可通过口、鼻、或吸入途径、或经肌肉、皮下、皮肤、静脉内、尿管内或眼内给药的所有系统。
这些药物递送系统包括可提供位点特异性释放的制剂，或能够加强小肠粘膜保护作用的制剂。合适的制剂包括：干粉剂、病毒颗粒包裹递送、脂质体包裹、皮肤贴剂、电辅助传送(电穿孔治疗)和聚合物/烟腙结合物。
在一项优选实施方案中，这种药物递送装置会对生物环境的变做出反应，并且基于这些变化进行药物的递送(或停止递送)。多种物质已被用于控制药物和其他活性制剂的释放：聚尿烷、聚硅氧烷、聚甲基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇，用于亲水性和强度、聚乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚甲基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、乙二醇二乙酸酯与乙酸乙烯酯的共聚物、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸，等等。在另一项优选实施方案中，可生物降解的聚合物被用以促进药物的递送。这类聚合物包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、丙交酯与乙交酯的共聚物(PLGA)、聚酸酐和聚原酸酯。在美国专利6,072,041；6,041,253；6,018,678；6,017,318；6,002,961；5,879,712；5,849,331；5,792,451；5,783,212；5,766,633；5,759,566；5,690,945；5,681,811；5,654,000；5,438,040；4,810,499和4,659,558中描述了药物递送装置及其使用方法
因此，本发明的另一方面涉及一些药用组合物和方法，用于通过将治疗有效剂量的含有本发明所述聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白的化合物或其药学容许的盐类给药来治疗那些需要治疗的哺乳动物。“药学容许的盐类”是指一种能保持本发明的多肽的生物学效力和特性的盐，并且该盐不是生物学或其他方面不合要求的。盐类可以来自酸或碱。酸加成性盐来自无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸(得到硫酸盐和硫酸氢盐)、硝酸、磷酸等，也可以来自有机酸，如醋酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、水杨酸、p-甲苯磺酸等。碱加成性盐可以来自无机碱，包括钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐，等等。来自有机碱的盐类包括那些由一级胺、二级胺、三级胺、包括天然取代胺在内的取代胺，以及环胺所形成的盐，包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、氨丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡碱、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶，等等。优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、哌啶、氨丁三醇和胆碱。
在此使用的术语“治疗”包括任何对哺乳动物尤其是对人的疾病和病情所进行的治疗，包括：(i)预防在可能受疾病感染的但未被诊断出患病的主体中的疾病或病情的发生；(ii)抑制疾病或病情，即阻止疾病的发展；以及(iii)缓解疾病或病情，即促使症状的复原或改善。
在此使用的术语“通过用促红细胞生成蛋白进行治疗来预防或缓解哺乳动物的疾病状态”应包括所有被该领域普遍承认的可有效地用促红细胞生成蛋白大体上进行治疗的疾病状态，以及那些被发现通过用本发明的特定化合物进行治疗而被有效预防或缓解的疾病状态。这些疾病状态包括，作为说明而不是限制，贫血、β地中海贫血、恶性贫血、镰状细胞病、慢性细菌性心内膜炎、骨髓炎、幼年风湿性关节炎、风湿热、Crohn’s病、溃疡性结肠炎，等等。
在此使用的术语“治疗有效剂量”是指，当将给药于需要治疗的哺乳动物时，聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白的使用量足以实现治疗(按照上文的定义)的目的，例如，作为红细胞增殖的诱导剂的抗贫血剂，等等。根据蛋白衍生物、病情或疾病及其严重程度、以及待治疗的哺乳动物及其体重、年龄等的不同，构成“治疗有效剂量”的剂量也在变化，但是该领域的一般技术人员可以运用当前的知识和该公开内容常规地测定出剂量。文中使用的术语“q.s.”是指添加量足以实现规定的功能，例如，足以使溶液达到所需体积(如100ml)。
如上所述，可以将本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白及其药学容许的盐类，即活性成分，以治疗有效剂量进行给药，也就是给药于需要治疗的哺乳动物的剂量足以实现治疗目的。在此，促红细胞生成性合成蛋白的给药可以通过具有类似应用的制剂所普遍使用的任何一种给药方式来实现。文中使用的术语“本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白”、“本发明所述多肽的[药学容许的盐类]”以及“活性成分”可以互换使用。
制剂中的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白水平可以在该领域技术人员使用的整个范围内变化，例如，整个制剂中可含有重量百分比(％w)约为0.01-99.99％的蛋白拮抗剂或显效剂和约0.01-99.99％w的赋形剂。更典型的是，聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白的含量约为0.5-80％w。
尽管本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白的人用剂量还需要优化，但总的来说，化合物的给药剂量显然取决于主体和需要预防或缓解的疾病状态、病痛的性质或严重程度、给药方式和方案，以及医师在开药时的判断。该领域的普通技术人员都能够很好地对其使用进行优化。
可以经由任何可接受的全身途径或局部途径来进行给药，例如，经胃肠外、经口(特别是幼儿制剂)、经静脉内、经鼻、经支气管吸入(即气雾剂)、经皮肤或局部途径，其用药形式可以是固体、半固体或液体或气雾剂，例如，药片、药丸、胶囊、粉末、液体、溶液、乳剂、血管注射剂、悬浮液、栓剂、气雾剂，等等。此外，本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白还能够以缓释形式或受控释放形式进行给药，其中包括长效注射剂、渗透泵、药丸、皮肤贴剂(包括电迁移)，等等，从而以预定比率将该多肽进行持续给药，并且优选的是以适于能以精确剂量单次给药的单位剂量形式给药。该组合物包括常规的优选载体或赋形剂，以及本发明蛋白的拮抗剂或显效剂，此外，还可以包括其他医学制剂、药学制剂、载剂、佐药等。载体可选自各种油类，其中包括石油、来自动物的、植物的或人造的油，例如，花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等、优选的流体载剂是水、生理盐水、水性葡聚糖和乙二醇，特别优选的是注射用溶液。合适的药用载剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、干脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。E.W.Martin在“Remington’s药物科学”中对其他合适的药用载剂及其制剂进行了描述。
此外，如果需要，上述药用组合物还可以含有少量无毒的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等，例如醋酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺，等等。
尽管可能需要更多的活性成分，但是可以利用方便的每日用药方案，用口服给药来递送本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白，并且该方案可以根据需要抑制的程度或病痛缓解的情况而加以调整。为了进行这种口服给药，通过掺入任何常用的赋形剂以形成一种药学容许性的无毒的组合物，这些赋形剂如药用级别的甘露醇、乳糖、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁、糖精、滑石、纤维素、交联羟甲纤维素钠、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁，等等。该组合物可以采用的形式包括溶液、悬浮液、可分散性药片、药丸、胶囊、粉末、缓释制剂等。口服制剂尤其适于治疗胃肠道疾病。通过使用能促进体循环摄取的赋形剂可调整全身用途的药物的口服生物药效率，如含有乙酰化氨基酸的制剂。可参考，例如，US5,935,601和US5,629,020。
上述组合物可以采用胶囊、药丸或药片的形式，并且该组合物因而可一并含有活性成分和一种稀释剂，如乳糖、蔗糖、磷酸氢钙等；一种分解质，如交联羟甲纤维素钠、淀粉或其衍生物；一种润滑剂，如硬脂酸镁等；以及一种粘合剂，如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯树胶、明胶、纤维素及其衍生物，等等。
在药学上能够给药的流体组合物的制备方法是，例如，使本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白(约0.5-20％)以及任选的药用佐剂在水、生理盐水、水性葡聚糖、甘油、乙二醇、乙醇、防腐剂等载剂中溶解、分散，等等，以形成一种溶液或悬浮液。此外，如果需要，用于给药的药用组合物还可含有少量无毒的辅助物质，如湿润剂、悬浮剂、乳化剂或增溶剂、pH缓冲剂等，例如醋酸钠、柠檬酸钠、环糊精衍生物、聚氧乙烯、脱水山梨醇单月桂酸酯或硬脂酸酯，等等。该领域的技术人员已了解或将会了解这些剂型的实际制备方法；可参考，例如，“Remington’s药物科学”，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。用于给药的组合物或制剂不论在任何情况下都应含有一定量的活性成分，其剂量能够有效地预防或缓解被治疗主体的症状。当用于向幼儿口服给药时，优选的是流体制剂(如糖浆或悬浮液)。
对含有流体的固体剂型而言，优选的是将溶解在，例如，碳酸丙烯、植物油或甘油三酯中的溶液或悬浮液包裹在明胶胶囊中。对流体剂型而言，可以用足够量的药学容许的流体载剂，例如水，将溶解在诸如聚乙烯中的溶液稀释，以便于在给药时进行测量。
作为选择，制备流体制剂或半固体口服制剂的方法也可以是，将活性成分溶解或分散于植物油、乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯(如碳酸丙烯)，等等，并将这些溶液或悬浮液包裹在硬的或软的明胶胶囊壳中。
在运用本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白治疗上述病情时，优选的是将文中描述的活性成分经胃肠外给药。一般而言，胃肠外给药的特征是进行注射，可以是皮下注射、肌内注射或静脉内注射，也可包括真皮内注射或腹膜内注射，以及胸骨内注射或输液技术。可以经血管注射剂制备成常规的形式，即流体溶液或悬浮液，固体形式适宜在注射前配制在流体、乳剂或生物相容性的基于聚合物的微球体(例如，脂质体、聚乙二醇衍生物、聚(D，C)丙交酯等)中形成溶液或悬浮液。适合的赋形剂是，例如，水、生理盐水、葡聚糖、甘油、乙醇，等等。此外，如果需要，被给药的上述药用组合物还可以含有还可以含有少量无毒的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、增溶剂、蛋白载体等，例如醋酸钠、聚氧乙烯、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、环糊精、血清白蛋白，等等。
本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白可以经胃肠外给药，其方法是，例如，将上述化合物溶解在一种适当的溶剂(如水或生理盐水)中或掺入到一种脂质的制剂中，然后将其分散在一种容许性输入液中。本发明的多肽的每日剂量通常是通过一次输液或通过间隔一定时间的多次输液来进行给药的。水溶性形式的活性成分的水性溶液尤其适合用于胃肠外给药，水溶性形式有水溶性盐，或水性注射悬浮液，其中含有增粘物质，如羧甲纤维素钠、山梨醇和(或)葡聚糖，以及，如果需要，还可以含有稳定剂。此外，该活性成分还可以是冻干产物的形式，并且在胃肠外给药前，通过添加适当的溶剂而配制成一种溶液。
最近设计出一种用于胃肠外给药的方法，该方法是植入一种缓释或持续释放系统，从而使剂量维持在恒定水平。可参考，例如，US3,710,795、US5,714,166和US5,041,292，其内容在此引入作为参考。
用于胃肠外给药的这些组合物中包含的活性成分百分比在很大程度上取决于该活性成分的特定性质，以及多肽的活性和主体的需要量。但是，溶液中的活性成分百分比可以是0.01-10％，若组合物为固体，该百分比可以更高，但随后需要稀释至上述百分比。优选的是，溶液中的组合物含有0.02-8％的活性成分。
本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白的另一种给药方法是同时利用快速注射和连续输液。
气雾剂给药是一种用以将本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白直接递送到呼吸道的有效方法。该方法的一些优势是：1)该方法能防止发生酶促降解作用、胃肠道的弱吸收，以及防止由于肝脏的首次排泄作用而引起治疗剂的损失；2)该方法能将活性成分给药至其呼吸道中的靶位点，而使用其他方法则可能由于活性成分的分子大小、电荷或与肺外位点的亲合力而不能实现上述目的；3)该方法可以使药物经肺泡快速地吸收到身体中；以及4)该方法避免了其他器官系统与活性成分接触，这一点对可能由于接触引起不良副作用的器官来说很重要。由于这些原因，气雾剂给药特别有利于治疗哮喘、局部肺感染，以及其他疾病或肺和呼吸道病情。
药学吸入装置现有的三种类型是：喷雾器吸入器、配量-剂量吸入器和干粉吸入器。喷雾器装置能产生一股高速气流，该气流能使蛋白衍生物(已经配置成流体形式)以雾的形式被携带喷洒到患者的呼吸道中。典型的配量-剂量吸入器将制剂与一种压缩气体共同密封，并且在启动时，在压缩气体的作用下释放出标准量的多肽，因此提供了一种将制剂以规定量给药的可靠方法。干粉吸入器将多肽以自由流动的粉末形式给药，利用该装置可以将粉末在呼吸过程中分散在患者的气流中。为了形成一种自由流动的粉末，将蛋白衍生物与一种赋形剂一起配制，如乳糖。将标准量的蛋白衍生物以胶囊的形式贮存，并通过每次启动来给药于患者。上述所有方法都可以用于将本发明给药。
此外，基于脂质体的药学制剂也适合于同本发明的聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白一起使用。可参考，例如，美国专利Nos.5,631,018、5,723,147和5,766,627。使用脂质体的好处被认为与由于脂质体对药物的包载所产生的组织分布和药代动力学参数的有利变化有关，因而该领域的技术人员可以被其应用于本发明的多肽。此外，还可以将受控释放型液态脂质体药剂用于注射或口服。
用于以栓剂形式进行全身给药的传统粘合剂和载剂包括，例如，聚乙二醇或甘油三酯，如PEG1000(96％)和PEG4000(4％)。上述栓剂可以由混合物制成，该混合物可含有约0.5-10w/w％的活性成分；优选的是含有约1-2w/w％的活性成分。
该说明书中提到的所有出版物和专利申请在此均以同等程度引入作为参考，如同每个出版物或专利申请都被单独地明确指出要引入作为参考。尽管已对本发明进行了全面描述，但参考下文的实施例会更容易地理解本发明，除非特别指出，这些实施例只作为说明，而不是要限制本发明。
实施例
缩写
Acm＝乙酰氨基甲基巯基保护基团[即-CH2NHCOCH3]
AoA＝氨基氧乙酰基
Arg(Tos)＝L-精氨酸(侧链被NG甲苯磺酰基保护)
ART＝绝对网织红细胞数
Asp(cHex)＝L-天冬氨酸(侧链被环己基酯保护)
AUC＝曲线下面积
Boc＝叔丁氧羰基
CD＝圆二色性
CDI＝羰基二咪唑
CHO＝中国仓鼠卵巢
CL＝清除率(mL/hr/kg)
Cmax＝最大浓度
Cys(4MeBzl)＝L-半胱氨酸(侧链经(4-甲基)苄基保护)
Cys(Acm)＝L-半胱氨酸(侧链被乙酰氨基甲基[即-CH2NHCOCH3]保护)
DCM＝二氯甲烷
DIC＝二异丙基碳二亚胺
DIEA＝二异丙基乙胺
DMF＝二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲亚砜
DPC＝十二烷基磷酸胆碱
Dpr＝L-1，2二氨基丙酸
ED50＝要求达到最大效果的50％的有效剂量
EDA＝(4，7，10)-三氧十三烷-1，13-二胺
ELISA＝酶联免疫测定
EPO＝促红细胞生成素
ES-MS＝电喷射电离质谱
FBS＝胎牛血清
Glu(cHex)＝L-谷氨酸(侧链被环己基酯保护)
GM-CSF＝粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
HATU＝O-(7-氮苯三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲铵六氟磷酸盐
HCT＝红细胞比容
HGB＝血红蛋白
His(Dnp)＝L-组氨酸(侧链被N1m二硝基苯酚保护)
HOBT＝N-羟苯三唑
HPLC＝高压液相色谱
IMDM＝Iscove’s改良型Dulbecco’s培养基
IPA＝异丙醇
Lev＝乙酰丙酸
Lys(CIZ)＝L-赖氨酸(侧链被2-氯苯氧羰基保护)
MBHA＝4-甲基二苯甲胺
MRT＝平均滞留时间
MTT＝4-甲基三苯甲基
MTT＝噻唑蓝
NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺
-OCH2-Pam-树脂＝-O-CH2-Bz-CH2CONHCH2(共聚苯乙烯-二乙烯基苯)-树脂
Pbo＝4-(CH3S(O)-)苄基
PBS＝磷酸盐缓冲液
PCV＝压缩的细胞体积
RBC＝红细胞
RET＝＝网织红细胞
rhEPO＝重组人EPO
RSA＝鼠血清白蛋白
SDS＝十二烷基磺酸钠
SDS-PAGE＝SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SEP＝促红细胞生成性合成蛋白
Ser(Bzl)＝L-丝氨酸(侧链被苄基保护)
实施例1
促红细胞生成性合成蛋白SEP-0的合成
进行促红细胞生成性合成蛋白SEP的合成。全长的合成蛋白(命名为“SEP-0(1-166)”)的序列为：APPRLICDSR    VLERYLLEAK EAEKITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYA    WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψP   LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAISPPDAASAAPL    RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO：1)其中ψ特指含有巯基经羧甲基化的半胱氨酸的非天然氨基酸残基。该SEP-0蛋白是由四种多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-0：1(GRFN1711；包括SEQ ID NO：1的第1-32位残基)：
       APPRLICDSR  VLERYLLEAK  EAEKITTGCA  EH-硫酯
片段SEP-0：2(GRFN1712；包括SEQ ID NO：1的第33-88位残基)：
CSLNEKITVP DTKVNFYAWK  RMEVGQQAVE  VWQGLALLSE
AVLRGQALLV KSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保护)
片段SEP-0：3(GRFN1713；包括SEQ ID NO：1的第89-116位残基)：
CPLQLHVDKA VSGLRSLTTL LRALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保护)
片段SEP-0：4(GRFN1714；包括SEQ ID NO：1的第117-166位残基)：
CAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS  NFLRGKLKLY
TGEACRTGDR-羧酸酯(其中的C-末端半胱氨酸(Cys161)带有一个吡啶甲基(pico)保护基团)
采用Boc(叔丁氧羰基)化学的原位中和方法在硫酯生成树脂上合成肽SEP-0：1、SEP-0：2和SEP-0：3，并且在ABI1433A自动肽合成器或手动链组装装置上用已确立的SPPS、侧链保护和硫酯树脂策略(Hacieng，et al.，PNAS(1996)96：10068-10073；and Schnolzer，et al.，Int.J.Pept.Prot.Res.，(1992)40：180-193)来逐步进行固相肽合成(SPPS)，也可以从供应商处订购和得到。例如，使用一组标准的Boc SPPS保护基团，即：Arg(Tos)；Asp(cHex)；Cys(4MeBzl) & Cys(Acm)；Glu(cHex)；His(DNP)；Lys(CIZ)；Ser(Bzl)；Thr(Bzl)；Trp(甲酰)；Tyr(BrZ)；侧链未被保护的Met、Asn和Gln。类似地，在-OCH2-Pam-树脂上合成片段SEP-0：4。根据标准的Boc化学流程将肽类去保护，并且同时用HF/对甲酚将其从树脂支持物上裂解下来；然而，对那些在HF/对甲酚中含有未去除保护基团的肽类来说，仍然保留有保护基团。用制备型C4反相高压液相色谱(HPLC)进行肽类的纯化。用ES-MS(电喷射电离质谱)对含有纯净肽的组分进行鉴定，将各组分合并，并且冻干以利于随后的连接。
步骤1：连接#1将片段SEP-0：4和SEP-0：3以15mM的浓度溶解在TFE中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的饱和磷酸缓冲液(pH7.9)，则得到一种含有肽段的澄清溶液。连接反应完成后，将连接混合物加入到2ml TFE(三氟乙醇)、6ml 6M氯酸胍和含有25％β-巯基乙醇的100mM磷酸盐的溶液中，并孵育20分钟。用含有15mg/mlTCEP(三(2-羧乙基)膦)的冰醋酸酸化上述溶液，并装入制备型C4反相HPLC柱上(直径为1英寸)。然后用制备型梯度反相HPLC进行肽类的纯化。利用ES-MS对含有所需连接产物SEP-0：Acm+SEP-0：3+SEP-0：4的组分进行鉴定，并将各组分合并。
步骤2：去除Acm#1去除Acm的方法是，用HPLC级水将含有SEP-0：Acm+SEP-0：3+SEP-0：4合并组分的水性乙腈溶液稀释1倍，并加入固体脲，使其终浓度为2摩尔。加入摩尔数三倍过量(相对于预计的总半胱氨酸的浓度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并将所得溶液搅拌1小时。然后将该溶液以20％的浓度配制在β-巯基乙醇中，装入半制备型反相HPLC柱上，并利用逐级梯度进行纯化。用ES-MS对含有所需产物SEP-0：3+SEP-0：4的组分进行鉴定，并冻干过夜。
步骤3：连接#2将等量的SEP-0：3+SEP-0：4和SEP-0：2以15mM的浓度共同溶解在纯TFE中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的250mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)，则得到一种含有肽段的澄清溶液。在经过1天的连接反应之后，将连接混合物加入到pH4的10ml TFE(三氟乙醇)、10mlβ-巯基乙醇、10ml哌啶和20ml 6M氯酸胍的溶液中，并孵育20分钟以去除所有残余的保护基团。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液使上述溶液酸化，并装入制备型C4反相HPLC柱上(直径为1英寸)，然后用线性梯度进行纯化。用ES-MS对含有所需连接产物SEP-0：Acm+SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4的组分进行鉴定，并冻干过夜。
步骤4：羧甲基化将SEP-0：Acm+SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4以15mM的浓度溶解在TFE中。加入两倍过量(v/v)的含有6M氯酸胍的浓度为200mM的磷酸盐缓冲液(pH7.9)，则得到一种含有肽段的澄清溶液。加入溶解在尽可能少量甲醇中的25倍过量的溴代乙酸，并且使上述溶液反应2小时。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液使上述溶液酸化，并装入制备型反相HPLC柱上(直径为1英寸)，然后用逐级梯度进行纯化。用ES-MS对含有所需羧甲基化产物SEP-0：Acm+SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4的组分进行鉴定，并将各组分合并。
步骤5：去除吡啶甲基在2M HCl中活化锌粉30分钟。将肽SEP-0：Acm+SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4+Et以约10mmg/ml的浓度溶解在纯TFE中。用6M氯酸胍、含有(临用前加入)35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸(即N-十二烷基肌氨酸钠)的pH为4的100mM的醋酸盐溶液将上述溶液稀释4倍(v/v相对于TFE)。再向溶液中加入活化的锌粉。每间隔1小时监控一次反应，并且在5小时后停止反应。在反应结束后，将上清移去，并用含有20％TFE的6M氯酸胍及含有35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸的pH为4的100mM的醋酸盐溶液将残余锌粉清洗2次共5分钟，以及用含有20％β-巯基乙醇的相同溶液清洗1次。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液使上述混合产物酸化，并装入制备型反相HPLC柱上，然后用逐级梯度进行纯化。用ES-MS对含有所需的修饰产物SEP-0：Acm+SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4+Et-Pico的组分进行鉴定，并将各组分合并。
步骤6：去除Acm#2用HPLC级水将合并的SEP-0：Acm+SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4+
Et-Pico的溶液稀释4倍，并加入终浓度为2摩尔的固体脲。加入摩尔数3倍过量(相对于预计的总半胱氨酸的浓度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并将所得溶液搅拌1小时。然后将该溶液以20％的浓度配制在β-巯基乙醇中，装入半制备型反相HPLC柱上，并利用逐级梯度进行纯化。用ES-MS对含有所需产物SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4+Et-Pico的组分进行鉴定，再用含有2x(w/w相对于肽的质量)DPC(十二烷基胆碱磷酸)的水将其稀释2倍(v/v)并冻干过夜。
步骤7：连接#3将等量的SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4+Et-Pico和SEP-0：1以15mM的浓度共同溶解在纯TFE中，并加入含有6M氯酸胍的250mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)。再向溶液中加入1％苯硫酚。经过1天的连接反应之后，将连接混合物加入到10ml TFE(三氟乙醇)、10mlβ-巯基乙醇、10ml哌啶和20ml氯酸胍pH为4的溶液中，并孵育20分钟以去除所有残余的保护基团。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液使上述溶液酸化，并装入制备型反相HPLC柱上(直径为1英寸)，然后用线性梯度进行纯化。用电喷射质谱对含有所需连接产物SEP-0(1-166)：(SEQ ID NO：1)的组分进行鉴定，再用含有2x(w/w相对于肽的质量)十二烷基肌氨酸的水将其稀释2倍(v/v)并冻干过夜。
步骤8折叠：将全长的连接产物SEP-0(1-166)溶解在含有6M氯酸胍和20％TFE以及摩尔数十倍过量(相对于蛋白中的Cys残基)的半胱氨酸的浓度为250mM的Tris缓冲液(pH8.7)中。该溶液在含有3M氯酸胍的浓度为200mM的Tris缓冲液(pH8.7)中室温透析过夜。再将该溶液在含有1M氯酸胍的浓度为200mM的Tris缓冲液(pH8.7)中4℃透析4小时，最后将该溶液在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中4℃透析4小时，从而得到最终的折叠产物。用电喷射ES-MS和CD(圆二色性)光谱测定法来证实折叠。
步骤9纯化：用Centricon浓缩管将上述折叠多肽浓缩5倍，并装入经pH7.0的10mM磷酸盐缓冲液平衡的Resource S阳离子交换柱上。用至500mM NaCl的线性盐梯度将折叠蛋白在10分钟内洗脱下来。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对含有所需折叠产物SEP-0(1-166)的组分进行鉴定，并于-80℃冷冻贮存。分析性反相HPLC色谱、折叠蛋白产物的ES-MS谱和CD光谱都证明折叠蛋白的存在。
实施例2
促红细胞生成性合成蛋白SEP-1-L30的合成
进行在SEP-0的第24和126位上含有肟型基团的第二种促红细胞生成性合成蛋白(命名为SEP-1-L30)的合成。然后利用这些基团形成SEP-1-L30，其中蛋白骨架上连接了线性的(EDA-Succ-)18羧酸盐(EDA＝(4，7，10)-三氧十三烷-1，13二胺，也被称为TTD；Succ＝-CO-CH2CH2CO-)聚合物。全长的SEP-1(1-166)的序列为
  APPRLICDSR    VLERYLLEAK  EAEKOXITTGCA   EHCSLNEKIT
  VPDTKVNFYA    WKRMEVGQQA  VEVWQGLALL      SEAVLRGQAL
  LVKSSQPWψP   LQLHVDKAVS  GLRSLTTLLR      ALGAQKψAIS
  PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK  LFRVYSNFLR      GKLKLYTGEA
  CRTGDR(SEQ ID NO：2)其中ψ特指含有经羧甲基化的巯基的半胱氨酸的非天然氨基酸残基，其中KOX特指其ε-氨基经化学修饰连接了以肟键结合指定的水溶性聚合物的肟连接基团的非天然赖氨酸。此外，图15还显示SEP-1-L30的结构。
图14中显示了下文化学合成SEP-1-L30的图示说明。简单地说，图14(A)和图14(B)中，水溶性聚合物GRFN32(GP32)通过肟键形成化学连接反应与肽SEP-1：1和SEP-1：4相连接。如图所示，肽SEP-1：1的第32位带有一种C-末端Yaa基团，该基团包括一种用以随后的天然化学连接的组氨酸α-羧基硫酯，以及第24位(天然人EPO的糖基化位点)带有一种非天然的赖氨酸残基，该残基的侧链经化学修饰而带有一种包括氨氧酰基的Un＝1基团。显示对应于最终全长产物第1位的N-末端丙氨酸以作为参考。肽SEP-1：4的第117位带有一种未保护的N-末端Xaa基团，该基团包括半胱氨酸，第126位(天然人EPO的糖基化位点)带有一种含有氨氧酰基修饰的赖氨酸的Un＝1基团，以及第161位带有半胱氨酸(二硫化物型半胱氨酸，该半胱氨酸的侧链硫醇经吡啶甲基基团保护。保护Cys161以避免在随后的被引入作为天然化学连接位点的半胱氨酸的转换过程发生硫烷化(见图14(D))；此外还可以使用吡啶甲基保护基团，因为其去除条件与去除第一次天然化学连接反应中保护半胱氨酸的Acm(乙酰氨基甲基)的条件互不干扰(见图14(C))。通过肟型化学连接实现在GP32聚合物的第24和126位构建位点专一性和唯一连接，从而产生精确的聚合物修饰的肽SEP-1：1+GP32和SEP-1：4+GP32。图14(C)显示SEP-1：4+GP32和一种中肽片段SEP-1：3的天然化学连接，以及产生SEP-1：3+SEP-1：4+GP32的流程，其中的连接位点是在Lys1116和Cys117。如图所示，肽SEP-1：3包括一种在第89位的含有被保护的半胱氨酸的N-末端Xaa基团，以及在第116位的含有组氨酸α-羧基硫酯的C-末端Yaa基团。在天然化学连接之后，去除Acm保护基团以使该连接产物准备用于下一步的连接。图14(D)显示SEP-1：3-SEP-1：4+GP32和一种中肽片段SEP-1：2的天然化学连接，以及产生SEP-1：2+SEP-1：3+SEP-1：4+GP32的流程，其中的连接位点是在Try88和Cys89。如图所示，肽SEP-1：2包括一种在第33位的含有Acm半胱氨酸的N-末端Xaa基团，以及在第89位的含有色氨酸α-羧基硫酯的C-末端Yaa基团。在天然化学连接之后，将连接产物暴露于溴醋酸中，以使第89和117位半胱氨酸的侧链硫醇发生羧甲基化，从而将其转换为假谷氨酸。在羧甲基化之后，去除Acm和吡啶甲基保护基团以使该未保护的聚合物修饰的连接产物准备用于下一步的连接。图14(E)显示SEP-1：3-SEP-1：4+GP32和一种肽片段SEP-1：1+GP32(对应于全长产物的N-末端片段)的天然化学连接，以及产生全长SEP-1-L30产物SEP-1：1+GP32+SEP-1：2+SEP-1：3+SEP-1：4+GP32的流程，其中最后的连接位点是在His32和Cys33。如图所示，全长的SEP-1-L30产物包括两种只与自定义位点相连的水溶性聚合物(GP32)，其中自定义位点即对应于天然人EPO的第24和126位的糖基化位点。详细的合成过程将在下文描述。
A.GRFN1776和GRFN1711与GRFNP32的肟化作用
使带有氨氧乙酰基团的水溶性聚合物与带有酮羰基团的肽相连接，从而形成肟键。为此而合成以下肽段：
片段SEP-1：4(GRFN1776；包括SEQ ID NO：2的第117-166位残基)：
CAISPPDAAK  AAPLRTITAD TFRKLFRVYS  NFLRGKLKLY
TGEACRTGDR-羧酸酯(其中的Lys126的ε-氨基经乙酰丙酸残基修饰，并且其中的Cys1117被Acm所保护)
片段SEP-1：1(GRFN1711；包括SEQ ID NO：2的第1-32位残基)：
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-硫酯(其中的Lys24经乙酰丙酸残基修饰)
按照实施例1所述，在硫酯生成树脂上合成片段SEP-1：1(GRFN1711)，并且在-OCH2-Pam-树脂上合成片段SEP-1：4(GRFN1776)。首先用Fmoc基团将这两种肽段的第24和126位的赖氨酸的ε-氨基保护起来。在链组装完成后，再按照标准的Fmoc去保护方法将携带Fmoc的氨基去保护，并且通过将每个肽树脂与乙酰丙酸相连而加以修饰。然后，按照实施例1所述，将上述肽类去保护，并且同时将其从树脂支持物上裂解下来。利用制备型C4反相HPLC进行肽类的纯化。用ES-MS鉴定含有纯净肽的组分，合并并冻干以便于随后的连接。按照标准方法(Rose，K.et al.，美国专利申请系列09/379,297；Rose，et al.，J Am Chem Soc.(1999)121：7034)在Sasrin羧基生成树脂上进行GRFNP32[-(EDA-Succ)18羧酸酯]的合成。通过结合五倍过量的活化的Boc-氨氧乙酸而将氨氧乙酰(AOA)基团与聚合物的N-末端氨基相连。利用经典的Fmoc-化学方法将聚合物链从树脂支持物上裂解下来。利用制备型C4反相HPLC进行聚合物链的纯化。用ES-MS鉴定含有纯净聚合物的组分，合并并冻干以便于随后的连接。
以等摩尔比将片段SEP-1：4和GRFNP32共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后将该溶液冻干。将干粉溶解，并且利用制备型梯度C4反相HPLC将聚合物修饰的肽与未修饰肽及未反应聚合物分离。用ES-MS鉴定含有所需肟化产物SEP-1：4+GP32的组分，合并并冻干。
以等摩尔比将片段SEP-1：1和GRFNP32共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后将该溶液冻干。将干粉溶解，并且利用制备型梯度C4反相HPLC将聚合物修饰的肽与未反应聚合物分离。用ES-MS鉴定含有所需肟化产物SEP-1：1+GP32的组分，合并并冻干。
B.促红细胞生成性合成蛋白SEP-1-L30的合成
SEP-1-L30是由四种多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-1：1+GP32(GRFN1711+GRFNP32，对应于SEQ ID NO：2的第1-32位残基)：
APPRLICDSR  VLERYLLEAK  EAEKOXITTGcA  EH-硫酯(其中Lys24的ε-氨基经通过乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟键与GRFNP32结合的乙酰基肟连接基团修饰，表示为KOX)
片段SEP-1：2(GRFN1712，对应于SEQ ID NO：2的第33-88位残基)：
CSLNEKIT  VPDTKVNFYA  WKRMEVGQQA  VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保护)
片段SEP-1：3(GRFN1713，对应于SEQ ID NO：2的第89-116位残基)：
CP    LQLHVDKAVS    GLRSLTTLLR  ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保护)
片段SEP-1：4+GP32(GRFN1716+GRFNP32，对应于SEQ ID)NO：2的第117-166位残基)：
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR-羧酸酯(其中Lys126的ε-氨基经通过乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟键与GRFNP32结合的乙酰基肟连接基团修饰，表示为KOX，并且其中的C-末端半胱氨酸带有一个吡啶甲基(pico)保护基团)
按照实施例1中的描述来完成附加肽的合成、连接、羧甲基化、保护基团去除、折叠以及纯化，以产生全长的折叠的SEP-1-L30。分析性反相HPLC色谱、折叠蛋白产物的ES-MS谱和CD光谱都证明折叠蛋白的存在。
实施例3
促红细胞生成性合成蛋白SEP-1-L26的合成
进行在SEP-0的第24和126位上含有肟型基团的第三种促红细胞生成性合成蛋白(命名为SEP-1-L26)的合成。然后利用这些基团形成SEP-1-L26，其中线型聚合物(EDA-Succ)18羧酸盐和(EDA-Succ)6-酰胺通过第24和126位的肟键而结合到蛋白骨架上。全长的SEP-1(1-166)的序列为
    APPRLICDSR    VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA   EHCSLNEKIT
    VPDTKVNFYA    WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
    LVKSSQPWψP   LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS
    PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
    CRTGDR(SEQ ID NO：2)
其中ψ特指含有经羧甲基化的巯基的半胱氨酸的非天然氨基酸残基，其中KOX特指其ε-氨基经化学修饰连接了以肟键结合指定的水溶性聚合物的肟连接基团的非天然赖氨酸。此外，图15还给出了SEP-1-L30的结构。
与SEP-1-L30相比，SEP-1-L26被设计成在第126位上带有一种更小的和不带电荷的水溶性聚合物。连接在第24位的聚合物与SEP-1-L30中的相同。全长产物的合成与实施例2中的描述相同。图16显示了SEP-1-L26的结构。
A.GRFN1776与GRFNP6以及GRFN1711与GRFNP32的肟化作用
使带有氨氧乙酰基团的水溶性聚合物与带有酮羰基团的肽相连接，从而形成肟键。为此而合成以下肽段：
片段SEP-1：4(GRFN1776；包括SEQ ID NO：2的第117-166位残基)：
CAISPPDAAK  AAPLRTITAD TFRKLFRVYS  NFLRGKLKLY
TGEACRTGDR-羧酸酯(其中的Lys126的ε-氨基经乙酰丙酸残基修饰，并且其中的Cys117被Acm所保护)
片段SEP-1：1(GRFN1711；包括SEQ ID NO：2的第1-32位残基)：
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-硫酯(其中的Lys24经乙酰丙酸残基修饰)
按照实施例1所述，在硫酯生成树脂上合成片段SEP-1：1(GRFN1711)，并且在-OCH2-Pam-树脂上合成片段SEP-1：4(GRFN1776)。首先用Fmoc基团将这两种肽段的第24和126位的赖氨酸的ε-氨基保护起来。在链组装完成后，再按照标准的Fmoc去保护方法将携带Fmoc的氨基去保护，并且按照标准的耦联方法通过将每个肽树脂与乙酰丙酸相连而加以修饰。然后，按照实施例1所述，根据标准的Boc-化学方法将上述肽类去保护，并且同时将其从树脂支持物上裂解下来。利用制备型C4反相HPLC进行肽类的纯化。对每种肽而言，用ES-MS鉴定含有纯净肽的组分，合并并冻干以便于随后的连接。
按照标准方法(Rose，K.et a1.，美国专利申请系列09/379,297；Rose，et al.，J Am Chem Soc.(1999)121：7034)在Sasrin羧基生成树脂上进行水溶性聚合物(EDA-Succ)18羧酸酯(GRFNP32)的合成。按照标准方法(Rose，K.et al.，美国专利申请系列09/379,297；Rose，et al.，J.Am.Chem.Soc.(1999)121：7034)在Sieber酰胺生成树脂上进行水溶性聚合物(EDA-Succ)6-酰胺(GRFNP6)的合成。通过结合五倍过量的活化的Boc-氨氧乙酸而将氨氧乙酰(AOA)基团与每个树脂结合性聚合物的N-末端氨基相连。利用经典的Fmoc-化学方法将两种聚合物链分别从各自的树脂支持物上裂解下来。利用制备型C4反相HPLC进行每种聚合物链的纯化。对每种聚合物而言，用ES-MS鉴定含有纯净聚合物的组分，合并并冻干以便于随后的连接。
以等摩尔比将片段SEP-1：4和GRFNP6共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后将该溶液冻干。将干粉溶解，并且利用制备型梯度C4反相HPLC将聚合物修饰的肽与未修饰肽及未反应聚合物分离。用ES-MS鉴定含有所需肟化产物SEP-1：4+GP6的组分，合并并冻干。
以等摩尔比将片段SEP-1：1和GRFNP32共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后将该溶液冻干。将干粉溶解，并且利用制备型梯度C4反相HPLC将聚合物修饰的肽与未反应聚合物分离。用ES-MS鉴定含有所需肟化产物SEP-1：1+GP32的组分，合并并冻干。
B.促红细胞生成性合成蛋白SEP-1-L26的合成
SEP-1-L26是由四种多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-1：1+GP 32(GRFN1711+GRFNP32，对应于SEQ ID NO：2的第1-32位残基)：
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24的ε-氨基经通过乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟键与GRFNP32结合的乙酰基肟连接基团修饰，表示为KOX)
片段SEP-1：2(GRFN1712，对应于SEQ ID NO：2的第33-88位残基)：
CSLNEKIT  VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保护)
片段SEP-1：3(GRFN1713，对应于SEQ ID NO：2的第89-116位残基)：
CP LQLHVDKAVS  GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保护)
片段SEP-1：4+GP6(GRFN1716+GRFNP6，对应于SEQ ID NO：2的第117-166位残基)：
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR-羧酸酯(其中Lys126的ε-氨基经通过乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟键与GRFNP6结合的乙酰基肟连接基团修饰，表示为KOX，并且其中的C-末端半胱氨酸[即Cys161]带有一个吡啶甲基(pico)保护基团)
按照实施例1和2中的描述来完成附加肽的合成、连接、羧甲基化、保护基团去除、折叠以及纯化，以产生全长的折叠的SEP-1-L26。分析性反相HPLC色谱、折叠蛋白产物的ES-MS谱和CD光谱都证明折叠蛋白的存在。
实施例4
促红细胞生成性合成蛋白SEP-1-B50的合成
进行第四种促红细胞生成性合成蛋白(命名为SEP-1-B50)的合成。全长的SEP-1-B50的氨基酸序列与SEP-1-L30的氨基酸序列相同：
APPRLICDSR    VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA   EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA    WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPWψP   LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS
PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(SEQ ID NO：2)其中ψ特指含有经羧甲基化的巯基的半胱氨酸的非天然氨基酸残基，其中KOX特指其ε-氨基经化学修饰连接了以肟键结合指定的水溶性聚合物的肟连接基团的非天然赖氨酸。
但是，该蛋白是由具有四种线性(Succ-EDA)12基团的分支型聚合物构建体衍生得到的，而不是由SEP-1-L30的线型(Succ-EDA)18聚合物衍生得到的。衍生可以通过肟键而实现。
图17是分支型水溶性聚合物GRFNP29(GP29)化学合成的图解，该GP29通过肟型连接而结合到SEP-1-B50上，下文将对此进行详细描述。如图17所示，一种呈直角保护的赖氨酸U-B前体被用于产生U-B组分GRFN17(GP17)，该组分的U基团为氨氧酰基，并且具有3X赖氨酸分支核心B，该核心带有四个悬垂巯基，用于随后通过硫醚键与带有琥珀酸残基提供的悬垂羧酸酯的线型水溶性聚酰胺环氧乙烷构建体GP29相结合。全长产物的组装是按照实施例2所述进行的。SEP-1-B50的结构如图18所示。
A.携带巯基的模板GRFNP17的合成
以0.4mmol数量级在酰胺生成(4-甲基)二苯甲胺(MBHA)-树脂上手动合成模板GRFNP17。用标准的耦联方法(Schnlzer，M.，Int JPept Protein Res.(1992)40：180-93)结合上Fmoc-Lys(Boc)-OH。使用了3.8ml含有2.1mmol氨基酸和10％DIEA的0.5M的HBTU；即5倍过量的氨基酸。在去除Fmoc保护基团之后，用标准的氨基酸耦联方法(3.8ml含有2.1mmol氨基酸和10％DIEA的0.5M的HBTU；即5倍过量的氨基酸)结合上Fmoc-Lys(Fmoc)-OH。在第二次去除Fmoc步骤之后，用标准的氨基酸耦联方法(7.6ml含有4.2mmol氨基酸和10％DIEA的0.5M的HBTU；即相对于自由氨基5倍过量的氨基酸)结合上Fmoc-Lys(Fmoc)-OH。在最后的Fmoc去保护步骤之后，溶于DMF的5倍过量(相对于自由氨基)的S-乙酰巯基乙酸五氟苯酯(SAMA-oPfp)被结合30分钟。去除C-末端赖氨酰残基的侧链Boc保护基团，其方法是用含有10％DIEA的DMF清洗以中和树脂，然后用纯净TFA分批清洗两次各1分。将2mmol Boc-氨氧乙酸和2mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在3m1的DMF中。在加入2mmol DIC(二异丙基碳二亚胺)之后，活化上述酸30-60分钟。将所得溶液加入中性树脂中，并结合1小时。最后，用溶于DMF的20％的哌啶去除S-联乙酰基。在作为自由醛清除剂的半胱氨酸存在条件下，根据标准的Boc-化学方法(Schnlzer，M.，Int J Pept Protein Res.(1992)40：180-93)，将该模板去保护并同时将其从树脂支持物上裂解下来。将回收的溶于50％B[即含有0.1％TFA的50％的水性乙腈](不含醛)的聚酰胺冷冻并冻干。纯化过程中，将模板粗产物溶于2ml 50％B，并加入100％A[即含有0.1％TFA的水]以稀释样品(因为必然要添加醛，所以应避免加入氯酸胍或醋酸盐)。将该模板装入在T＝40℃条件下用3％B平衡的C4制备型反相HPLC柱中。将盐等度洗脱，再用线性梯度纯化出所需的模板GRFNP17。用ES-MS对含有所需产物的组分进行鉴定，然后合并，冻干。
B.分支型水溶性聚合物GRFNP29的合成
合成分子量为15kDa的分支型(EDA-Succ)12聚合物GRFNP29，其方法是，将纯化的含有巯基的模板GRFNP17与一种线型聚合物GRFNP31，即Br-乙酰基-(EDA-Succ)12羧酸酯，通过硫醚键形成连接，其中GRFNP31是按照标准方法(Rose，K.et al.，美国专利申请系列09/379,297；Rose，et al.，J Am Chem Soc.(1999)121：7034)在Sasrin羧基生成树脂上合成的。
将摩尔数1.3倍过量(对于总巯基)的纯化的GRFNP31，即Br-乙酰化(EDA-Succ)12，和纯化的含有巯基的模板GRFNP17以～10mM的浓度共同溶解在0.1M Tris-HCl/6M氯酸胍中，pH8.7。溶解后，用pH8.7的0.1M Tris-HCl缓冲液将上述溶液稀释3倍(v/v)。在室温下搅拌该连接混合物，并用反相HPLC和ES/MS对该反应进行监测。根据需要添加额外的GRFNP31反应物，直到所需反应产物成为主要产物。为了激发反应，添加3x(与连接混合物的体积比)0.1M醋酸盐/6M氯酸胍中，pH4，然后将该溶液装入制备型C4反相HPLC柱中，再用线性梯度进行纯化。用ES-MS对含有纯净GRFNP29构建体的组分进行鉴定，然后合并，冻干。
C.GRFN1776和GRFN1711与GRFNP29的肟化作用
按照实施例2中的描述合成片段SEP1：4和片段SEP-1：1。以等摩尔比将片段SEP-1：4和GRFNP29共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后将该溶液冻干。将干粉装入制备型反相HPLC柱(直径为1英寸)中。利用制备型梯度C4反相HPLC将聚合物修饰的肽与未修饰肽及未反应聚合物分离。用ES-MS鉴定含有所需肟化产物SEP-1：4+GP32的组分，并将各组分合并。
以等摩尔比将片段SEP-1：1和GRFNP29共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后将该溶液冷冻并冻干。将干粉溶解含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并装入制备型GPC(凝胶渗透层析)柱(直径为1英寸)中。利用等度洗脱将聚合物修饰的肽与未修饰肽及未反应聚合物分离。用ES-MS鉴定含有所需肟化产物SEP-1：1+GP29的组分，并将各组分合并。
D.促红细胞生成性合成蛋白SEP-1-B50的合成
SEP-1-B50(SEQ ID NO：2)是由四种多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-1：1+GP29(GRFN1711+GRFNP29，对应于SEQ ID NO：2的第1-32位残基)：
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24的ε-氨基经通过乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟键与GRFNP32结合的乙酰基肟连接基团修饰，表示为KOX)
片段SEP-1：2(GRFN1712，对应于SEQ ID NO：2的第33-88位残基)：
CSLNEKIT  VPDTKVNFYA  WKRMEVGQQA  VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保护)
片段SEP-1：3(GRFN1713，对应于SEQ ID NO：2的第89-116位残基)：
CP  LQLHVDKAVS  GLRSLTTLLR  ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保护)
片段SEP-1：4+GP29(GRFN1716+GRFNP29，对应于SEQ ID NO：2的第117-166位残基)：
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR-羧酸酯(其中Lys126的ε-氨基经通过乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟键与GRFNP6结合的乙酰基肟连接基团修饰，表示为KOX，并且其中的C-末端半胱氨酸带有一个吡啶甲基(pico)保护基团)
除纯化是在Resource Q柱中完成外，按照实施例1和2中的描述来完成附加肽的合成、连接、羧甲基化、保护基团去除、折叠以及纯化，以产生全长的折叠的SEP-1-B50(SEQ ID NO：2)。分析性反相HPLC色谱、折叠蛋白产物SEP-1-B50的ES-MS谱和CD光谱都证明折叠蛋白的存在。
实施例5
促红细胞生成性合成蛋白SEP-3-L42的合成
进行第五种促红细胞生成性合成蛋白(命名为SEP-3-L42)的合成。全长的SEP-3蛋白的氨基酸序列为：
      APPRLICDSR  VLERYLLEAK  EAECITTGCA  EHCSLNECIT
      VPDTKVNFYA  WKRMEVGQQA  VEVWQGLALL  SEAVLRGQAL
      LACSSQPWEP  LQLHVDKAVS  GLRSLTTLLR  ALGAQKEAIS
      PPDAACAAPL  RTITADTFRK  LFRVYSNFLR  GKLKLYTGEA
      CRTGDR(SEQ ID NO：3)
用马来酰亚胺-功能化的(EDA-Succ)18(GRFNP32)聚合物单位(通过Michael加成反应)对第24、38、83和126位的半胱氨酸残基进行修饰，以形成SEP-3-L42。图20显示了SEP-3-L42的结构。
图19显示了下文描述的化学合成SEP-3-L42的图示说明。简单地说，图19(A)和图19(B)显示了从SEP-3：1到SEP-3：4的四种SEP-3-L42的肽段的天然化学连接，从而在对应于人EPO的所有四种天然糖基化位点的连接位点上产生了半胱氨酸。具体地说，图19(B)显示了具有所有被保护的二硫化物型半胱氨酸的全长多肽，可通过Michael加成反应使四种带电的线型水溶性聚合物(命名为GRFN32-马来酰亚胺(GP32-马来酰亚胺))在半胱氨酸连接位点发生位点特异性的联接。此外，图19(B)还显示了二硫化物型半胱氨酸的最终去保护步骤，从而产生全长的聚合物修饰的产物。
详细地说，SEP-3是由四种多肽片段在溶液中合成的：
片段SEP-3：1(GRFN1747，对应于SEQ ID NO：3的第1-37位残基)：
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNE-硫酯(其中Cys7、Cys29、和Cys33被Acm所保护)
片段SEP-3：2(GRFN1774，对应于SEQ ID NO：3的第38-82位残基)：
CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LA-硫酯(其中Cys38的侧链被Acm所保护)
片段SEP-3：3(GRFN1749，对应于SEQ ID NO：3的第83-125位残基)：
CSSQPWEP LQLHVDKAVS  GLRSLTTLLR  ALGAQKEAIS
PPDAA-硫酯(其中Cys83的侧链被Acm基团所保护)
片段SEP-3：4(GRFN1750，对应于SEQ ID NO：3的第126-166位残基)：
CAAPL  RTITADTFRK LFRVYSNFLR  GKLKLYTGEA
CRTGDR-羧酸酯(其中的Cys161被Pob[即4-(CH3S(O)-)苄基-]所保护)
肽的合成：按照实施例1所述，利用确立的侧链保护策略，用Boc化学SPPS的原位中和方法在硫酯生成树脂上合成肽SEP-3：1、SEP-3：2和SEP-3：3，按照在上文中指出的特定肽来改变保护基团策略。类似地，在-OCH2-Pam-树脂上合成片段SEP-3：4。按照实施例1所述，将肽类去保护并同时将其从树脂支持物上裂解下来。用制备型RF-HPLC进行所得的上述肽类的纯化。用ES-MS对含有纯净肽的组分进行鉴定，合并并并且冻干以利于随后的连接。
步骤1：连接#1将片段SEP-3：4和SEP-3：3以15mM的浓度溶解在TFE中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的饱和磷酸缓冲液(pH7.5)，则得到一种含有肽段的澄清溶液。连接反应完成后，将连接混合物(定义为1体积)加入到2体积的{2ml TFE、6ml 6M氯酸胍和含有25％β-巯基乙醇的100mM磷酸盐}的溶液中，并孵育20分钟。用含有15mg/ml TCEP的冰醋酸酸化上述溶液，并装入制备型C4反相HPLC柱上中，然后用线性梯度进行纯化。利用ES-MS对含有所需连接产物SEP-3：Acm+SEP-3：3+SEP-3：4的组分进行鉴定，并合并。
步骤2：去除Acm#1去除Acm的方法是，用HPLC级水将含有SEP-3：Acm+SEP-3：3+SE-3：4合并组分的水性乙腈溶液稀释1倍，并加入固体脲，使其终浓度为2摩尔。加入摩尔数三倍过量(相对于预计的总半胱氨酸的浓度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并将所得溶液搅拌1小时。然后将该溶液以20％的浓度配制在β-巯基乙醇中，装入半制备型C4反相HPLC柱中，并利用逐级梯度进行纯化。用ES-MS对含有所需产物SEP-3：3+SEP-3：4的组分进行鉴定，并冻干过夜。
步骤3：连接#2将等量的SEP-3：3+SEP-3：4和SEP-3：2以15mM的浓度共同溶解在纯TFE(三氟乙醇)中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的250mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)，则得到一种含有肽段的澄清溶液。在经过1天的连接反应之后，将连接混合物(定义为1体积)加入到2体积pH4的10ml TFE、10mlβ-巯基乙醇、10ml哌啶和20ml 6M氯酸胍的溶液中，并孵育20分钟以去除所有残余的保护基团。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液酸化上述溶液，并装入制备型C4反相HPLC柱中，然后用线性梯度进行纯化。用ES-MS对含有所需连接产物SEP-3：Acm+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4的组分进行鉴定，并冻干过夜。
步骤4：去除Acm去除Acm的方法是，用HPLC级水将含有SEP-3：Acm+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4合并组分的水性乙腈溶液稀释1倍，并加入固体脲，使其终浓度为2摩尔。加入摩尔数三倍过量(相对于预计的总半胱氨酸的浓度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并将所得溶液搅拌1小时。然后将该溶液以20％的浓度配制在β-巯基乙醇中，装入C4半制备型反相HPLC柱中，并利用逐级梯度进行纯化。用ES-MS对含有所需产物SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4的组分进行鉴定，并冻干过夜。
步骤5：连接#3将等量的SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4和SEP-3：1以15mM的浓度共同溶解在纯TFE中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的250mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)，则得到一种含有肽段的澄清溶液。在经过1天的连接反应之后，将连接混合物(定义为1体积)加入到2体积pH4的10ml TFE、10mlβ-巯基乙醇、10ml哌啶和20ml6M氯酸胍的溶液中，并孵育20分钟以去除所有残余的保护基团。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液酸化上述溶液，并装入制备型C4反相HPLC柱中，然后用线性梯度进行纯化。用ES-MS对含有所需连接产物SEP-3：1+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4的组分进行鉴定，并冻干过夜。
步骤6：与聚合物GRFNP32连接按照制造商提供的方法，通过用BMPS(3-马来酰胺丙酸NHS酯，Pierce，USA)将GRFNP32功能化来制备马来酰亚胺-功能化的线型(EDA-Succ)18聚合物，该聚合物被称为GRFNP32-马来酰亚胺，则形成一种马来酰亚胺-功能化的(EDA-Succ)18聚合物[即马来酰亚胺-(EDA-Succ)18]。用尽可能少量的必须的TFE溶解SEP-3：1+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4。将三倍过量的GRFNP32-马来酰亚胺溶解在pH7.5的6M氯酸胍、10mM的磷酸盐中，并加入到TFE溶液中。用分析型反相HPLC对Michael加成反应的进程进行监控。反应结束后，将上述溶液装入C4制备型反相HPLC柱中，然后用线性梯度进行纯化。用ES-MS对含有所需聚合物修饰的产物SEP3：Acm+SEP-3：1+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4+pPEG[即连接的全长为166个残基的多肽链，该多肽链带有与Cys24、Cys38、Cys83和Cys126的侧链巯基相连的四拷贝的GRFNP32，因此也被称为SEP3：Acm+SEP-3：1+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4+GP32]的组分进行鉴定，并冻于过夜。
步骤7：去除Pbo去除Pbo的方法是，将SEP3：Acm+SEP-3：1+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4+GP32的冻干粉末溶解在含有5％乙二硫醇的纯TFA中。然后，通过添加10％苯甲硫醚和15％溴代三甲基硅烷30分钟来裂解Pbo基团。将上述溶液在旋转蒸发器中干燥，并溶解在含有1％TFA的水性乙腈中。将所得溶液装入半制备型反相HPLC柱中，并利用逐级梯度进行纯化。用ES-MS对含有所需Cys161-去保护的产物SEP3：Acm+SEP-3：1+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4+GP32-Pbo的组分进行鉴定，并冻干过夜。
步骤8：去除Acm将Acm从Cys7、Cys29和Cys33侧链最终去除的方法是，用HPLC级水将含有SEP3：Acm+SEP-3：1+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4+GP32-Pbo合并组分的水性乙腈溶液稀释1倍，并加入固体脲，使其终浓度为2摩尔。加入摩尔数三倍过量(相对于预计的总半胱氨酸的浓度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并将所得溶液搅拌1小时。然后将该溶液以20％的浓度配制在β-巯基乙醇中，装入半制备型C4反相HPLC柱中，并利用逐级梯度进行纯化。用ES-MS对含有所需聚合物修饰修饰产物SEP-3(1-166)的组分进行鉴定，并冻干过夜。
步骤9折叠：将全长的连接产物SEP-3(1-166)溶解在含有6M氯酸胍和20％TFE以及摩尔数十倍过量(相对于蛋白中的Cys残基)的半胱氨酸的200mM的Tris缓冲液(pH8.7)中。该溶液在含有3M氯酸胍的浓度为200mM的Tris缓冲液(pH8.7)中室温透析过夜。再将该溶液在含有1M氯酸胍的浓度为200mM的Tris缓冲液(pH8.7)中4℃透析4小时，最后将该溶液在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中4℃透析4小时，从而得到最终的折叠产物。用电喷射ES-MS和CD光谱测定法来证实折叠。
步骤10纯化：用Centricon浓缩管将上述折叠多肽浓缩5倍，并装入经pH7.0的10mM磷酸盐缓冲液平衡的Resource S阳离子交换柱中。用至500mM NaCl的线性盐梯度将折叠蛋白在10分钟内洗脱下来。用SDS-PAGE对含有所需折叠产物SEP-3-L42的组分进行鉴定，并于-80℃冷冻贮存。
实施例6
促红细胞生成性合成蛋白的生物活性测定
用UT/7和32D 103197细胞系来进行折叠的促红细胞生成性合成蛋白、SEP-0、SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50和SEP-3-L42的生物活性的检测，在因子-依赖性细胞系增殖测试中使用商品化的重组促红细胞生成素作为对照标准。UT-7是人巨核母细胞白血病细胞系，该细胞系在生长和存活方面对白介素-3、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或促红细胞生成素(EPO)中之一具有绝对的依赖性(MiuraY，et al.，Acta Haematol(1998)99：180-184；Komatsu N，et al.，Cancer Res.(1991)51：341-8)。32D 103197是鼠造血细胞系(Metcalf，D.Int J Cell Clining(1992)10：116-25)。
在Iscove’s改良型Dulbecco’s培养基(IMDM)、10％FBS(胎牛血清)、谷氨酰胺和Penstrep中配制SEP构建体的储液，并且将这些储液的2x稀释液顺次地加入到多孔板中，多孔板中已添加了浓度为5000个细胞/的人UT/7 EPO细胞。在5％CO2存在条件下，37℃培养这些多孔板，并每天监测细胞的生长情况。四天后，在多孔板中添加20μl溶于PBS(磷酸盐缓冲液)的2.5mg/ml的MTT(甲基噻唑四唑)并孵育4小时。加入150μl的IPA，并在562nm下，读出每个孔的光吸收值。测定SEP化合物的ED50(达到最大效果的50％的有效剂量)值，并将其与CHO(中国仓鼠卵巢)-细胞产生的rhEPO(重组人促红细胞生成素)的ED50值比较。这些实验的结果都证明所有的促红细胞生成性合成蛋白均显示出生物活性。表VI中给出了SEP-0、SEP-1-L26、SEP-1-L30和SEP-1-B50的ED50测定结果。
                      表VI
  促红细胞生成蛋白          体外ED50值
UT-7(人)细胞      32D 103197(小鼠)细胞
    SEP-0     1,570         863
    SEP-1-L26     46.5         100.8
    SEP-1-L30     71.5         182.5
    SEP-1-B50     182         6200
    rh EPO     32.5         136.3
当仅用通过聚合物修饰的SEP-1-L30的吸光度来计算蛋白浓度的消光系数使肽含量标准化时，表VII和图26给出了这些实验中、SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50、SEP-3-L42和SEP-1-B51(下文实施例7中描述了SEP-1-B51化合物的合成)的其他结果。总的来说，这些体外测试证明了聚合物结构和结合位点的不同会对体外的生物活性造成不同的影响，其中这些化合物的效力具有如下相对次序(1)当测试人EPO受体活性时为(从最强到最弱)：SEP-1-L26≈SEP-1-L30＞SEP-1-B50≈SEP-1-B51＞SEP-3-L42＞SEP-0；以及(2)当测试鼠EPO受体活性时为(从最强到最弱)：SEP-1-L26＞SEP-1-L30＞SEP-0＞SEP-3-L42＞SEP-1-B50≈SEP-1-B51。
                        表VII
         体外ED50值
    促红细胞生成蛋白    UT-7细胞(人EPO R)   32D 103197细胞(小鼠EPO R)
    SEP-0      11       20
    SEP-1-L26      0.8       1
    SEP-1-L30      0.8       4
    SEP-3-L42      7       70
    SEP-1-B50      2.5       125
    SEP-1-B51      2       125
此外，表VII和图26中的结果还表明，与未被聚合物修饰的构建体SEP-0相比，聚合物修饰的SEP构建体在受体选择上有显著的差异。具体地说，SEP-1-L26被不同的线型聚合物修饰，这些聚合物连接在对应于人EPO糖基化位点的第24位上(该位点结合了具有悬垂负电荷的5.5kDa的线型聚合物)；该构建体对人和鼠受体的活性较小。在对应于人EPO糖基化位点的第24和126位上，SEP-1-L30被具有悬垂负电荷的5.5kDa的线型聚合物修饰；该构建体对人受体的活性比对鼠受体的活性高出约5倍。在对应于人EPO糖基化位点的第24、38、83和126位上，SEP-3-L42被具有悬垂负电荷的5.5kDa的线型聚合物修饰，该构建体对人受体的活性比对鼠受体的活性高出约10倍。发现差异最大的是SEP-1-B50和SEP-1-B51，它们都被分支的、电负性15kDa的聚合物修饰，这些聚合物连接在对应于人EPO糖基化位点的第24和126位上，并且具有大约5的p1(与人EPO近似)；这两种构建体对人受体的活性比对鼠受体的活性高出～60倍。
由于鼠EPO缺失了对应于人EPO第126位的糖基化位点(鼠EPO具有非糖基化的脯氨酸，而不具有在人EPO中发现的O-糖基化的丝氨酸)，该变化的受体活性可能部分归因于这种差异，并且因此鼠受体优先选择在对应于第126位上缺失了O-联糖基化的EPO。该结果同SEP-1-L26与SEP-1-L30和SEP-1-B50与SEP-1-B52的比较结果一致。例如，SEP-1-L26的第126位具有一种1.8kDa的电负性聚合物，而SEP-1-L30的第126位具有一种5.5kDa的电负性聚合物。尽管对人EPO受体有相同的活性，但是发现对鼠EPO受体则存在4倍的差异。发现差异最大的是SEP-1-B50和SEP-1-B51构建体，在对应于人EPO糖基化位点的第126位上连接了电负性15kDa的聚合物。如同SEP-3-L42，在对应于人EPO的所有四种天然糖基化位点即24、38、83和126上加入了5.5kDa的电负性聚合物，使对鼠受体的选择性更大程度地降低，但这种降低程度比SEP-1-B50和SEP-1-B51构建体小。这些结果证明，可以通过对相应于生物产生的糖基化蛋白中糖基化位点的位点进行精确修饰来调节受体特异性，也可以通过调整聚合物的大小、分支的性质以及电荷来调节受体特异性。
实施例7
促红细胞生成性合成蛋白SEP-1-B51的合成A.SEP-1-B51的组成。合成了第六种促红细胞生成性合成蛋白(命名为SEP-1-B51)。全长SEP-1-B51的氨基酸序列与SEP-1-B50相同：
    APPRLICDSR    VLERYLLEAK    EAEKOXITTGCA EHCSLNEKIT
    VPDTKVNFYA    WKRMEVGQQA    VEVWQGLALL    SEAVLRGQAL
    LVKSSQPWψP   LQLHVDKAVS    GLRSLTTLLR    ALGAQKψAIS
    PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK    LFRVYSNFLR    GKLKLYTGEA
    CRTGDR(SEQ ID NO：2)
其中ψ特指含有经羧甲基化的巯基的半胱氨酸的非天然氨基酸残基，其中KOX特指其ε-氨基经化学修饰连接了以肟键结合指定的水溶性聚合物的肟连接基团的非天然赖氨酸。
但是，与SEP-1-B50相比，该蛋白是由具有四种线型(Succ-TTD)12-Succ-丙胺酸-OH[即(Succ-TTD)12-Succ-Ala-OH，或(Succ-TTD)12Succ-Ala]聚合物的分支型聚合物构建体衍生得到的，这四种线型聚合物通过酰胺键接合到赖氨酸的分支核心上。设计将线型聚合物通过酰胺键耦联到分支核心上是为了提高稳定性。此外，上述四种聚合物还被设计携带丙氨酸基团和悬垂的负电荷，带有负电荷是为了模拟唾液酸，而带有丙氨酸则是为了具有与糖链的悬垂糖基相似的疏水性质。此外，分支型聚合物还被设计具有一种位于分支核心和蛋白骨架连接位点间的水溶性间隔物，以提高分支核心模板的合成和操作特性，并且也模拟了在天然糖链中发现的位于糖与蛋白骨架连接位点和糖链第一个分支点之间的间隔物。
图21是分支型水溶性聚合物GRFNP41(GP41)化学合成的图解，该GP41通过肟型连接而结合到SEP-1-B51上，下文将对此进行详细描述。全长产物的组装是按照实施例2所述进行的。SEP-1-B51的结构如图22所示。
B.用以与分支模板(GRFNP40)结合的(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的合成
以0.5mmol数量级在Sasrin酸流动型羧酸-生成树脂上合成线型聚合物(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)。将0.5mmole(～0.5克)的Sasrin酸流动型羧酸-生成聚苯乙烯树脂(羟基取代1.02mmole/g)在DMF中溶胀15分钟，然后排干液体。将溶于8ml含有500μl(3.9mmole)DIEA(二异丙基乙胺)的DMF的450mg(4.5mmole)琥珀酐和488mg(4mmole)4-二甲氨基嘧啶加入到羟基-功能化树脂中，并剧烈搅拌使反应进行30分钟，然后排干液体。重复连接反应，并通过使用DMF(～50ml)搅拌流动清洗1分钟来去除过量的反应物和可溶的副产物，然后排干液体。活化HOOC-CH2CH2CO-O-树脂(0.5mmole)，其方法是添加8ml新制的溶于DMF的1.0M(8mmole)CDI(羰基二咪唑)溶液，并使其反应40分钟，然后排干液体。通过使用DMF(～50ml)搅拌流动清洗1分钟来去除过量的反应物和可溶的副产物，然后排干液体。再加入溶解在4ml的溶于DMF的0.5M(2mmole)HOBT溶液的4ml(4克，1 8.2mmole)(4，7，10)-三氧十三烷-1，13二胺(TTD)，并剧烈搅拌使反应进行30分钟，然后排干液体。通过使用DMF(～50ml)搅拌流动清洗1分钟来去除过量的反应物和可溶的副产物，然后排干液体。在树脂中添加溶解于8ml含有500μl(3.9mmole)DIEA(二异丙基乙胺)的HOBT(N-羟苯三唑)的琥珀酐(450mg，4.5mmole)，并剧烈搅拌使反应进行15分钟，然后排干液体。将上述三个步骤(CDI活化；TTD耦联；琥珀酐反应)重复11次[即总共进行12次]。通过使用DMF(～50ml)搅拌流动清洗1分钟来去除过量的反应物和可溶的副产物，然后排干液体。用8ml新制的溶于DMF的1.0M(8mmole)CDI溶液活化HOOC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-树脂(0.5mmole)，并使其反应40分钟，然后排干液体。通过使用DMF(～50ml)搅拌流动清洗1分钟来去除过量的反应物和可溶的副产物，然后排干液体。将2.5mmole H-AlaOtBu.HCl溶解于4.75ml含有150μl(111mg，0.825mmole)DIEA的溶于DMF中的0.5M(2.375mmole)HOBT中，并剧烈搅拌以使其与CDI-活化的HOOC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-树脂(0.5mmole)反应1小时，然后排干液体。用DCM(二氯甲烷)彻底清洗产物tertBuOOC-CH(CH3)-NH-OC-CH2CH2
CO(TTD-琥珀酰)12-O-树脂，排干液体，然后在真空中将树脂干燥至恒重。产物-树脂通常重约2克。
根据标准的Fmoc-化学方法，用溶于DCM的4％的TFA将线型(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu聚合物从树脂支持物上裂解下来。将沉淀粗产物溶解于含有1％TFA的50％的水性乙腈中，并冻干。少量含有1％TFA的50％的水性乙腈溶解冻干聚合物并稀释，使有机物的浓度低于1％。将该粗产物装入在T＝40℃条件下用3％B平衡的C4制备型反相柱中。将盐等度洗脱，再用20-35％的Buffer B(含有1％TFA的50％的水性乙腈)对0.1％水性TFA的线性梯度以超过60分钟的时间进行所需的模板的纯化。用ES-MS对含有所需物质(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的组分进行鉴定，冷冻并冻干。
C.携带了用以形成分支的多个氨基和用以(后续)与蛋白连接的被保护的氨氧基的模板的合成(GRFNP40)
以0.4mmol数量级在Sieber酰胺生成树脂上手动合成模板GRFNP40。在每一步连接、去保护和活化步骤之间都进行一次1分钟的流动-清洗步骤。将2mmol Nα-Fmoc-Nβ(Boc-氨氧乙酰基)-L-二氨基丙酸结合到树脂上1小时，其中使用的是经溶于DCM/DMF(二甲基甲酰胺)的2mmol DIC和2mmol NHS预活化NHS-酯30分钟的树脂。在去除Fmoc保护基团(2×3分钟，溶于DMF中的20％的哌啶)和清洗之后，在树脂中添加溶解于8ml含有2.2mmol DIEA的HOBT(N-羟苯三唑)中的琥珀酐4mmol。该步骤后，用8ml溶于DMF中的新制的0.5M(4mmole)的CDI活化羧基。在4ml溶于DMF中的0.5M的HOBT中添加4ml(18.2mmole)TTD，并结合30分钟。
将Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(2mmol)结合到所得的氨基-TTD-Succ-Dpr(BocAoA)-树脂上，其中使用的是经溶于DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS预活化30分钟的树脂，并结合14小时。将该结合反应重复一次。在去除Fmoc步骤(2×3分钟，溶于DMF中的20％的哌啶)后，如上所述将4mmol Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(2mmol)结合到树脂上，包括重结合。在最后一次Fmoc保护步骤(2×3分钟，溶于DMF中的20％的哌啶)后，根据标准的Fmoc-化学方法，用溶于DCM中的4％的TFA将模板从树脂支持物上裂解下来，并冻干。将沉淀粗产物溶解于含有1％TFA的50％的水性乙腈中，并冻干。用少量的含有1％TFA的50％的水性乙腈溶解冻干聚合物并稀释，使有机物的浓度低于1％。将该模板装入在T＝40℃条件下用3％B(含有1％TFA的乙腈)平衡的C4制备型反相HPLC柱中。将盐和其他非酰胺物质等度洗脱，再用5-12％的BufferB(含有1％TFA的乙腈)对0.1％水性TFA的线性梯度以超过60分钟的时间进行所需的模板的纯化。用ES-MS对含有所需Lys-Lys(Lys)-TTD-Succ Dpr(BocAoA)酰胺物质(GRFNP40)的组分进行鉴定，冷冻并冻干。
D.酰胺-耦联的分支型聚合物(GRFNP41)的组装和去保护
合成分子量为16kDa的分支型(TTD-Succ)49聚合物GRFNP41，其方法是，将GRFNP39[(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu]与纯化的模板GRFNP40耦联。在存在20倍(摩尔)过量的DIEA的条件下，用以10mg/ml的浓度溶解在DMSO中的0.95mole的HATU{0-(7-氮苯三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲铵六氟磷酸盐}活化纯化的(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)(1.0mmole)，其中的GRFNP39在60℃条件下，以20mg/ml的浓度溶解在DMSO(二甲基亚砜)中。立即加入以3.9mg/ml的浓度溶解在DMSO中的纯化的模板GRFNP40(0.24mmole)。用C4分析型反相HPLC和ES-MS对反应进程进行监控。通常，连接反应在数分钟内就能完成。为了激发反应，添加4倍体积(相对于连接混合物的体积)pH4的0.1M醋酸盐/6M氯酸胍，然后将该溶液装入制备型(C4)反相HPLC柱中，将盐和其他不含有酰胺的物质等度洗脱，再用25-30％的Buffer B(含有1％TFA的乙腈)对0.1％水性TFA的线性梯度在80分钟内完成所需分支型聚合物的纯化。用ES-MS对含有所需物质的组分进行鉴定，冷冻并冻干。
将所得的纯化聚合物以1mg/ml的浓度溶解在纯TFA中1小时，以使Boc基团从氨氧乙酰基团上去除，并且也使叔丁基酯基团从-Ala-OtBu基团上去除。在旋转蒸发器中将上述溶液旋转干燥，再将干燥的聚合物溶解在50％的Buffer B(含有1％TFA的乙腈)中。添加氨氧乙酸(a.k.a.‘羧甲氧胺’)，并使其终浓度为0.5M，以清除络合形成的杂质。20分钟后，用3.3体积的Buffer A(溶于水中的0.1％的TFA)稀释上述溶液，并装入制备型C4反相HPLC柱中，用泵抽吸10％的Buffer B，直到去除所有的氨氧乙酸，然后用15-45％的Buffer B对0.1％水性TFA的逐级梯度以超过80分钟的完成聚合物的纯化。将含有所需分支型聚合物(GRFNP41)的合并组分冷冻并冻干。
E.肽段GRFN1776和GRFN1711与分支型聚合物GRFNP41的肟型连接(肟化作用)
按照上文实施例1所述，用Boc化学SPPS的标准原位中和方法合成片段SEP-1：4(GRFN1776；包括SEQ ID NO：2的第117-166位残基)和片段SEP-1：1(GRFN1711；包括SEQ ID NO：2的第1-32位残基)。按照上文描述的标准方法，在-OCH2-Pam-树脂上合成肽GRFN1776。按照上文描述的标准方法，在硫酯生成树脂上合成肽GRFN1711。以等摩尔比将在Lys126上含有乙酰基丙酰基基团的片段GRFN1776和含有AoA的片段GRFNP41共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。将该溶液冻干。将干粉粗产物重溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并装入制备型反相(C4)HPLC柱中。利用制备型梯度反相HPLC将聚合物修饰的肽与未修饰肽及未反应聚合物分离。用ES-MS对含有所需肟键合(肟化)的产物SEP-1：4+GP41的组分进行鉴定，并且合并，冻干。
以等摩尔比将在Lys24上含有乙酰基丙酰基基团的片段GRFN1711和含有AoA的片段GRFNP41共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。将该溶液冷冻并冻干。将干粉溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并装入C4制备型反相HPLC柱中。利用制备型梯度洗脱C4反相HPLC将聚合物修饰的肽与未修饰肽及未反应聚合物分离。用ES-MS对含有所需肟键合(肟化)的产物SEP-1：1+GP41的组分进行鉴定，并且合并，冻干。
F.促红细胞生成性合成蛋白SEP-1-B51的合成
SEP-1-B51(SEQ ID NO：2)是由四种多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-1：1+GP41(GRFN1711+GRFNP41，对应于SEQ ID NO：2的第1-32位残基)：
APPRLICDSR  VLERYLLEAK  EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24的乙酰基丙酰基悬垂基团以肟键与分支型聚合物GRFNP41结合，表示为KOX；并且其中的His32被Dnp所保护)
片段SEP-1：2(GRFN1712，对应于SEQ ID NO：2的第33-88位残基)：
CSLNEKIT  VPDTKVNFYA  WKRMEVGQQA  VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保护；并且其中的三个Trp残基被甲酸基所保护)
片段SEP-1：3(GRFN1713，对应于SEQ ID NO：2的第89-116位残基)：
CP LQLHVDKAVS  GLRSLTTLLR  ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保护；并且其中的His94被Dnp所保护)
片段SEP-1：4+GP41(GRFN1716+GRFNP41，对应于SEQ ID NO：2的第117-166位残基)：
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR-羧酸酯(其中的C-末端半胱氨酸(即Cys161)带有一个吡啶甲基(pico)保护基团；并且其中Lys126的乙酰基丙酰基悬垂基团以肟键与分支型聚合物GRFNP41结合，表示为KOX)
除了以下调整外，均按照实施例1-4中的描述来完成附加肽的合成、连接、羧甲基化、保护基团去除、折叠以及纯化，以产生全长的折叠的SEP-1-B51(SEQ ID NO：2)。
步骤1：连接#1将片段SEP-1：4+GP41以3mM的浓度溶解在TFE中(1体积)。将片段SEP-1：3以2.25mM的浓度溶解在2体积含有6M氯酸胍的浓度为300mM的磷酸钠缓冲液(pH7.9)中。将上述两种溶液混合，使片段SEP-1：4+GP41的终浓度为1mM，SEP-1：3的终浓度为1.5mM，然后加入1％苯硫酚，则得到一种pH为6.8-7.2的肽段溶液(‘3体积’)。在室温条件下使反应过夜进行。连接反应完成后，在连接混合物中添加β-巯基乙醇(3体积)，再添加3体积pH为7.9的含有6M氯酸胍的浓度为300mM的磷酸钠缓冲液和TCEP(肽段总重量的0.25倍)，并搅拌溶液20分钟。用0.6体积的冰醋酸使上述溶液酸化至pH为4.0+/-0.1，从而得到一种澄清溶液，在该溶液中添加了30体积的pH为4.0的含有6M氯酸胍的浓度为100mM的醋酸钠稀释缓冲液。将所得溶液用泵抽入制备型反相(C4)HPLC柱中，然后用25-45％的Buffer B梯度以超过80分钟的时间进行连接产物的纯化。利用电喷射质谱对含有所需连接产物(Cys89(Acm)){SEP-1：3+SEP-1：4+GP41}的组分进行鉴定，并将各组分合并。
步骤2：去除Acm#1去除Acm的方法是，用HPLC级水将含有(Cys89(Acm)){SEP-1：3+SE-1：4+GP41}合并组分的水性乙腈溶液稀释1倍，并加入固体脲，使其终浓度为2摩尔。加入摩尔数三倍过量(相对于预计的总半胱氨酸的浓度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并将所得溶液搅拌1小时。然后将该溶液以20％的浓度配制在β-巯基乙醇中，装入半制备型反相HPLC柱上，并用泵抽吸25％的Buffer B，直到洗脱所有的非肽物质，然后利用50％Buffer B的逐级梯度对产物进行纯化。利用电喷射质谱对含有所需连接产物{SEP-1：3+SEP-1：4+GP41}的组分进行鉴定，并将各组分合并。用ES-MS对所需产物SEP-0：3+SP.-0：4进行鉴定，并合并，冻干。
步骤3：连接#2将步骤2得到的{SEP-1：3+SEP-1：4+GP41}产物[即1713-1776-GP41]以3mM的浓度溶解在TFE中(1体积)。将片段SEP-1：2(GRFN1712)以2.25mM的浓度溶解在2体积含有6M氯酸胍的浓度为300mM的磷酸钠缓冲液(pH7.9)中。将上述两种溶液混合，使片段{SEP-1：3+SEP-1：4+GP41}的终浓度为1mM，而SEP-1：2的终浓度为1.5mM，然后加入1％苯硫酚，则得到一种pH为6.8-7.2的肽段溶液(‘3体积’)。在室温条件下使反应过夜进行。然后在连接混合物中添加3体积的稀释缓冲液(即相对于前面所用TFE的体积)：pH为4.0的含有6M氯酸胍的浓度为100mM的醋酸钠，然后将其加入到冷却至4℃的含有3体积TFE、3体积β-巯基乙醇、3体积哌啶和6体积pH为4.0的含有6M氯酸胍的浓度为100mM的醋酸钠溶液中，室温搅拌20分钟以去除所有的残余保护基团。用1.8体积冷冻的冰醋酸使上述溶液酸化，其中添加了TCEP(肽段总重量的0.25倍)，从而得到一种澄清溶液，将该溶液孵育20分钟。然后在该溶液中添加30体积的pH为4.0的含有6M氯酸胍的浓度为100mM的醋酸钠稀释缓冲液，混合该溶液。将所得溶液用泵抽入制备型反相(C4)HPLC柱中。然后抽吸30％C(Buffer C：溶于60％异丙醇/30％乙腈/10％水的0.1％的TFA)缓冲液，直到所有的非肽物质都从柱中洗脱，然后利用37-57％Buffer C的梯度以超过80分钟的时间进行连接产物的纯化。用ES-MS对含有所需连接产物(Cys33(Acm)){SEp-1：2+SEP-1：3+SEP-1：4+GP41}的组分进行鉴定，并合并，冻干。
步骤4：Cys89和Cys117残基的羧甲基化将(Cys33(Acm)){SEP-1：2+SEP-1：3+SEP-1：4+GP41}[即(Cys33(Acm))-1712-1713-1776-GP41]以1mM的浓度溶解在TFE中。添加10体积含有6M氯酸胍的浓度为300mM的磷酸钠缓冲液(pH7.9)。加入25倍过量(相对于巯基)的以75mg/ml浓度溶解在甲醇中的溴代乙酸，并在搅拌条件下，使上述溶液室温反应2小时。然后用11体积的含有6M氯酸胍的浓度为100mM的醋酸钠稀释反应混合物，并装入制备型反相HPLC柱中，然后抽吸20％Buffer C，直到所有非肽成分被洗脱，然后再用至55％Buffer C的逐级梯度进行纯化。用ES-MS对含有所需修饰产物(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-1：2+SEP-1：3+SEP-1：4+GP41}的组分进行鉴定，并合并，冻干。
步骤5：去除吡啶甲基在2M HCl中活化锌粉(每毫克肽71毫克锌粉)5分钟，并重复一次活化反应，然后用6M氯酸胍、含有(临用前加入)35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸钠的pH为2.2的50mM甘氨酸以及10％v/vTFE清洗锌10分钟以去除过量的酸。重复一次清洗。将含有Cys161(Pico)的肽(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-1：2+SEP-1：3+SEP-1：4+GP41}以30mg/ml的浓度溶解在纯TFE中。用4体积(相当于TFE)的6M氯酸胍、含有(临用前加入)35mg/mlL-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸钠的pH为2.2的50mM甘氨酸以及10％v/vTFE将上述溶液稀释。再向溶液中加入活化的锌粉，并室温搅拌50分钟。通过样品(经等体积的β-巯基乙醇和几格令的TCEP处理，然后用2体积的6M氯酸胍和100mM醋酸钠稀释后再用于分析)的分析型C4反相HPLC每间隔～1小时对反应进行监控，并且在2-5小时后结束反应。在完成吡啶甲基的去除后，可通过对分析型HPLC峰的ES-MS分析来指示(即分子量减小91Da)，用过滤法去除上清，并且用6M氯酸胍，pH4、含有35mg/ml L-甲硫氨酸的100mM醋酸盐和含有20％TFE的35mg/ml十二烷基肌氨酸清洗残余锌粉3次。在混合的上清中添加BioRad SM-2微珠(约为溶液体积的1/3)，清洗并室温搅拌30分钟，然后过滤。以10％v/v的浓度添加β-巯基乙醇，再加入0.25x(混合的肽重量)的TCEP，室温搅拌5分钟。用等体积的pH4.0的100mM的醋酸钠、6M氯酸胍按1∶1稀释上述溶液，并装入制备型(C4)反相HPLC柱中，用泵抽吸35％的Buffer C，直到洗脱所有的非肽物质，再用55％Buffer C的逐级梯度进行所需产物的纯化。用电喷射质谱对含有所需Cys161-去保护产物(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-1：2+SEP-1：3+SEP-1：4+GP41-Pico}的组分进行鉴定，并合并。
步骤6：去除Acm#2用HPLC级水将含有(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-1：2+SEP-1：3+SEP-1：4+GP41-Pico}[即(Cys33(Acm)；ψ89，117)-1712-1713-1776-GP41]的合并组分稀释3倍，并加入固体脲，使其终浓度为2摩尔。加入摩尔数三倍过量(相对于总半胱氨酸的浓度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并将所得溶液室温搅拌1小时。然后将该溶液以20％的浓度配制在β-巯基乙醇中，并装入半制备型(C4)反相HPLC柱中。用泵抽吸Buffer C(20％)，直到洗脱所有的非肽物质，然后利用55％Buffer C的逐级梯度对所需产物进行纯化。利用电喷射质谱对含有所需产物(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-1：2+SEP-1：3+SEP-1：4+GP41-Pico}的组分进行鉴定，再用含有2x(w/w相对于肽的质量)DPC(十二烷基胆碱磷酸)的水将其稀释2倍(v/v)，并冻干过夜。
步骤7：连接#3将(Cys33(Acm)；ψ89，117)  {SEP-1：2+SEP-1：3+SEP-1：4+GP41-Pico}[即(Cys33(Acm)；ψ89，117)-1712-1713-1776-GP41]以3mM的浓度溶解在纯TFE中(1体积)。将SEP-1：1[即1711-GP41]溶解在2体积含有6M氯酸胍的300mM磷酸盐缓冲液(pH7.9)中，并加入1％苯硫酚。室温条件下，将连接混合物搅拌过夜。在上述溶液中添加3体积(相对于前面所用TFE的体积)的β-巯基乙醇和9体积的连接缓冲液(含有6M氯酸胍的pH7.9的300mM的磷酸盐缓冲液)。在溶液中添加0.25x(混合的肽重量)TCEP，然后将该溶液室温搅拌20分钟。加入冰醋酸(0.6体积)将溶液酸化至pH4.0，然后加入30体积的含有6M氯酸胍的pH4.0的100mM的醋酸钠，并装入制备型(C4)反相HPLC柱中。用泵抽吸Buffer C(25％)，直到洗脱所有的非肽物质，然后利用35-55％Buffer C的线性梯度以超过80分钟的时间进行所需连接产物的纯化。利用电喷射质谱对含有所需连接产物SEP-1(1-166)(ψ89，117){SEP-1：2+SEP-1：3+SEP-1：4+GP41-Pico}：(SE1 ID NO：2)的组分进行鉴定，并合并。
步骤8折叠：在含有全长连接的肽SEP-1(1-166)(ψ89，117){SEP-1：2+SEP-1：3+SEP-1：4+GP41-Pico}[即1711(GP41)-1712-1713-1776-GP41]合并组分中加入固体氯酸胍、1M的Tris缓冲液(pH8.7)和蒸馏水，使终溶液含有0.1mg/ml的连接肽SEP-1(1-166)、6M的氯酸胍和100mM的Tris。将该连接肽(“蛋白”)溶液装在15ml透析盒中，并在含有3M氯酸胍、5mM半胱氨酸和2mM胱氨酸的浓度为100mM的Tris缓冲液(pH8.5)中4℃透析过夜。然后再将该蛋白溶液在含有1M氨酸胍的浓度为100mM的Tris缓冲液(pH8.5)中4℃透析8小时，最后将该溶液在10mM的Tris缓冲液(pH7.0)中4℃透析14小时，从而得到最终的折叠产物。将来自透析盒的含有折叠蛋白的溶液合并。用ES-MS、分析型RP-HPLC和CD光谱测定法来证实折叠。
步骤9纯化：将含有折叠蛋白的溶液装入经pH7.0的10mM的Tris缓冲液平衡的Q-Sepharaose来自交换柱中。利用125mM NaCl的线性盐梯度洗脱该折叠蛋白。用非还原SDS-PAGE对含有所需折叠产物SEP-1-B51的组分进行鉴定，并合并。用超滤管将上述合并组分浓缩至2mg/ml，然后将蛋白溶液装入2.6×100cm的S-300凝胶过滤柱中。用pH7.0的10mM的Tris、137mM的NaCl将纯化的SEP-1-B51洗脱下来。用非还原SDS-PAGE对含有高纯度SEP-1-B51的组分进行鉴定，并合并，并于-80℃冷冻贮存。最后，用分析型(C4)反相HPLC、ES-MS、非还原SDS-PAGE以及CD光谱测定法对折叠蛋白SEP-1-B51的性质进行描述。图25显示了典型的等电点聚焦凝胶(IEF)和非还原SDS-PAGE凝胶，其显示折叠的纯化SEP-1-B51的相对分子量。为了比较，在同一块胶上加入了分子量标准。如图所示，利用非还原SDS-PAGE所确定的SEP-1-B51的相对分子量约为73kDa。相对pI约为5.0。此外，还显示了折叠的纯化SEP-1-B51产物的典型的RP-HPLC色谱图。这说明了本发明的聚合物精确修饰的蛋白的纯度和增加的相对分子量。
实施例8
促红细胞生成性合成蛋白SEP-1-B52的合成A.SEP-1-B52的组成。合成了第七种促红细胞生成性合成蛋白(命名为SEP-1-B52)。全长SEP-1-B52的氨基酸序列与SEP-1-B51相同：
    APPRLICDSR    VLERYLLEAK    EAEKOXITTGCA EHCSLNEKIT
    VPDTKVNFYA    WKRMEVGQQA    VEVWQGLALL    SEAVLRGQAL
    LVKSSQPWψP   LQLHVDKAVS    GLRSLTTLLR    ALGAQKψAIS
    PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK    LFRVYSNFLR    GKLKLYTGEA
    CRTGDR(SEQ ID NO：2)
其中ψ特指含有经羧甲基化的巯基的半胱氨酸的非天然氨基酸残基，并且其中KOX特指其ε-氨基经化学修饰连接了以肟键结合指定的水溶性聚合物的肟连接基团的非天然赖氨酸。
SEP-1-B52蛋白是第24和126位残基经一种与SEP-1-B51类似的分支型(Succ-TTD)12-Succ-Ala聚合物构建体衍生得到的，但是，对该类似体而言，聚合物是通过丙酮酸与氨氧乙酸之间的肟键相连的。此外，第24和126位的赖氨酸残基的ε-氨基被修饰以带有一个氨氧乙酰基功能基团，而不是乙酰基丙酰基基团，并且该分支型(Succ-TTD)12-Succ-Ala聚合物构建体被制成带有一个悬垂的丙酮酸酰基基团。设计这些变化是为了促进合成和操作，并且进一步增加肟键的稳定性。
图23是分支型水溶性聚合物GRFNP43(GP43)化学合成的图解，该GP43通过肟型连接而结合到SEP-1-B51上，下文将对此进行详细描述。全长产物的组装是按照实施例2所述进行的。SEP-1-B52的结构如图24所示。
B.用以与分支模板(GRFNP42)结合的(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的合成
以0.5mmol数量级合成(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)。将0.5mmole(～0.5克)的Sasrin酸流动型羧酸-生成聚苯乙烯树脂(羟基取代1.02mmole/g)在DMF中溶胀15分钟，然后排干液体。将溶于8ml含有500μl(3.9mmole)DIEA(二异丙基乙胺)的DMF的450mg(4.5mmole)琥珀酐和488mg(4mmole)4-二甲氨基嘧啶加入到羟基-功能化树脂中，并剧烈搅拌使反应进行30分钟，然后排干液体。重复连接反应，并通过使用DMF(～50ml)搅拌流动清洗1分钟来去除过量的反应物和可溶的副产物，然后排干液体。活化HOOC-CH2CH2CO-O-树脂(0.5mmole)，其方法是添加8ml新制的溶于DMF的1.0M(8mmole)CDI(羰基二咪唑)溶液，并使其反应40分钟，然后排干液体。通过使用DMF(～50ml)搅拌流动清洗1分钟来去除过量的反应物和可溶的副产物，然后排干液体。再加入溶解在4ml的溶于DMF的0.5M(2mmole)HOBT溶液的4ml(4g，18.2mmole)TTD，并剧烈搅拌使反应进行30分钟，然后排干液体。通过使用DMF(～50ml)搅拌流动清洗1分钟来去除过量的反应物和可溶的副产物，然后排干液体。在树脂中添加溶解于8ml含有500μl(3.9mmole)DIEA(二异丙基乙胺)的HOBT(N-羟苯三唑)的琥珀酐(450mmg，4.5mmole)，并剧烈搅拌使反应进行15分钟，然后排干液体。将上述三个步骤(CDI活化；TTD耦联；琥珀酐反应)重复11次[即总共进行12次]。通过使用DMF(～50ml)搅拌流动清洗1分钟来去除过量的反应物和可溶的副产物，然后排干液体。用8ml新制的溶于DMF的1.0M(8mmole)CDI溶液活化HOOC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-树脂(0.5mmole)，并使其反应40分钟，然后排干液体。通过使用DMF(～50ml)搅拌流动清洗1分钟来去除过量的反应物和可溶的副产物，然后排干液体。将2.5mmoleH-AlaOtBu.HCl溶解于4.75ml含有150μl(111mg，0.825mmole)DIEA的溶于DMF中的0.5M(2.375mmole)HOBT中，并剧烈搅拌以使其与CDI-活化的HOOC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-树脂(0.5mmole)反应1小时，然后排干液体。用DCM(二氯甲烷)彻底清洗产物tertBuOOC-CH(CH3)-NH-OC-CH2CH2
CO(TTD-琥珀酰)12-O-树脂，排干液体，然后在真空中将树脂干燥至恒重。产物-树脂通常重约2克。
根据标准的Fmoc-化学方法，用溶于DCM的4％的TFA将(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu线型聚合物从树脂支持物上裂解下来。将沉淀粗产物溶解于含有1％TFA的50％的水性乙腈中，并冻干。少量含有1％TFA的50％的水性乙腈溶解冻干聚合物并稀释，使有机物的浓度低于1％。将该粗产物装入在T＝40℃条件下用3％B平衡的C4制备型反相柱中。将盐等度洗脱，再用20-35％的Buffer B(含有1％TFA的50％的水性乙腈)对0.1％水性TFA的线性梯度以超过60分钟的时间进行所需的模板的纯化。用ES-MS对含有所需物质(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的组分进行鉴定，冷冻并冻干。
C.携带了用以形成分支的多个氨基和用以(后续)与蛋白连接的被保护的氨氧基的模板的合成(GRFNP40)
以0.4mmol数量级在Boc-Leu-OCH2-Pam树脂上手动合成模板。在每一步连接、去保护和活化步骤之间都用DMF进行一次1分钟的流动-清洗步骤。通过用纯(即100％)TFA处理来去除Boc基团。在用DMF清洗后，将经过溶解在3.8ml的含有1ml DIEA的1.8mmol HBTU活化的树脂与2mmol的Fmoc-(Rink-linker)-OH耦联。去除Fmoc保护基团(2×3分钟，溶于DMF中的20％的哌啶)后，通过用溶解在DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS使NHS-酯活化来将2mmol Fmoc-Lys(MTT)-OH[MTT＝4-甲基三苯甲基]耦联到树脂上。去除Fmoc保护基团(2×1分钟，溶于DMF中的0.5％的DBU)后，将树脂与溶解于8ml含有2.2mmol DIEA的HOBT中的4mmol琥珀酐耦联。该步骤后，用8ml溶于DMF中的新制的0.5M CDI活化羧基。在4ml 0.5M的HOBT溶液中添加4mlTTD，并结合30分钟。
通过用溶解在DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS使NHS-酯活化来将2mmol Fmoc-Lys(Fmoc)-OH耦联到树脂上。去除Fmoc(2×1分钟，溶于DMF中的0.5％的DBU)后，将4mmol Boc-Lys(Boc)-NHS结合到3ml的DMF中。
用溶于DCM中的2％的TFA多次清洗来去除MTT保护基团。当上清不再是黄色时，去保护反应就完成了。用溶于DMF中的10％的DIEA中和树脂10分钟。通过用溶解在DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS使NHS-酯活化40分钟来将2mmol丙酮酸耦联到树脂上。其中使用的是经溶于DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS预活化30分钟的树脂。用含有5％水的纯TFA将模板去保护并将其从树脂支持物上裂解下来。将裂解溶液在旋转蒸发器中挥发干燥并冻干。将残余物溶解在含有1％TFA的50％的水性乙腈中，并冻干。少量含有1％TFA的50％的水性乙腈溶解冻干的模板并稀释，使有机物的浓度低于1％。将该含有丙酮酸的模板装入在T＝40℃条件下用0％B[即100％Buffer A＝溶解在水中的0.1％的TFA]平衡的C4 Prep柱中。将盐等度洗脱，再用5-12％的Buffer B对0.1％水性TFA的线性梯度以60分钟的时间进行所需的模板的纯化。用ESI-MS对含有所需物质(GRFNP42)的组分进行鉴定，冷冻并冻干。
D.酰胺-耦联的分支型聚合物(GRFNP43)的组装和去保护
合成分子量为16kDa的分支型(TTD-Succ)49聚合物GRFNP43，其方法是，将GRFNP39与纯化的模板GRFNP42耦联。在存在20倍(摩尔)过量的DIEA的条件下，用以10mg/ml的浓度溶解在DMSO中的0.95mole的HATU活化纯化的(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)(1.0mmole)，其中的GRFNP39在60℃条件下，以20mg/ml的浓度溶解在DMSO中。立即加入以3.9mg/ml的浓度溶解在DMSO中的纯化的模板GRFNP42(0.24mmole)。用C4分析型反相HPLC和ES-MS对反应进程进行监控。通常，连接反应在数分钟内就能完成。为了激发反应，添加4倍体积(相对于连接混合物的体积)pH4的0.1M醋酸盐/6M氯酸胍，然后将该溶液装入制备型(C4)反相HPLC柱中，将盐和其他不含有酰胺的物质等度洗脱，再用20-35％的Buffer B(含有1％TFA的乙腈)对0.1％水性TFA的线性梯度以超过80分钟的时间进行所需分支型聚合物的纯化。用ES-MS对含有所需物质的组分进行鉴定，冷冻并冻干。
将所得的纯化聚合物以1mg/ml的浓度溶解在纯TFA中1小时，以去除Ala-OtBu叔丁基酯的保护。在旋转蒸发器中将上述溶液挥发干燥，再将干燥的聚合物溶解在50％的Buffer B(含有1％TFA的乙腈)中。在制备型反相HPLC柱中，用15-45％的Buffer B对0.1％水性TFA的逐级梯度以80分钟的时间进行聚合物的脱盐。将含有所需分支型聚合物(GRFNP43)的合并组分冷冻并冻干，并且用该冻干的粉末以进行肟化连接步骤。
E.肽段GRFN1776和GRFN1711与分支型聚合物GRFNP43的肟型连接(肟化作用)
按照上文实施例2、3、4和7所述，用标准的耦联方法合成片段SEP-1：4和片段SEP-1：1，只是添加在各自肽段中的Lys24和Lys126上的不是乙酰丙酸，而是氨氧乙酰基基团(AoA)。由此，在肽-树脂组装后，将每个肽-树脂上的侧链Fmoc基团去除，并且通过用溶解在DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS使NHS-酯活化来将2mmol Boc-氨氧乙酸添加到树脂中。用HF将这两种肽去保护，并将其从树脂上裂解下来，然后用C4反相HPLC进行纯化。采用适当的预防措施以避免与羰基化合物接触。以等摩尔比将片段SEP-1：4和GRFNP43共同溶解在含有0.1％TFA(三氟乙酸)的50％的水性乙腈中。将该溶液冻干。将干粉重溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并装入制备型C4反相HPLC柱中。利用制备型梯度反相HPLC将聚合物修饰肽与未修饰肽及未反应聚合物分离。用ES-MS对含有所需肟化产物SEP-1：4+GP43的组分进行鉴定，并合并。
以等摩尔比将片段SEP-1：1和GRFNP43共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。将该溶液冷冻并冻干。将干粉溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并装入制备型梯度C4反相HPLC柱中。利用制备型反相梯度洗脱将聚合物修饰肽与未修饰肽及未反应聚合物分离。用ES-MS对含有所需肟化产物SEP-1：1+GP43的组分进行鉴定，并合并。
F.促红细胞生成性合成蛋白SEP-1-B52的合成
SEP-1-B52(SEQ ID NO：2)是由四种多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-1：1+GP43(GRFN1711+GRFNP43，对应于SEQ ID NO：2的第1-32位残基)：
APPRLICDSR  VLERYLLEAK  EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24的乙酰基丙酰基悬垂基团以肟键与分支型聚合物GRFNP41结合，表示为KOX；并且其中的His32被Dnp所保护)
片段SEP-1：2(GRFN1712，对应于SEQ ID NO：2的第33-88位残基)：
CSLNEKIT  VPDTKVNFYA  WKRMEVGQQA  VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保护；并且其中的三个Trp残基被甲酸基所保护)
片段SEP-1：3(GRFN1713，对应于SEQ ID NO：2的第89-116位残基)：
CP LQLHVDKAVS  GLRSLTTLLR  ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保护；并且其中的His94被Dnp所保护)
片段SEP-1：4+GP43(GRFN1716+GRFNP43，对应于SEQ ID NO：2的第117-166位残基)：
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR-羧酸酯(其中的C-末端半胱氨酸(即Cys161)带有一个吡啶甲基(pico)保护基团，并且其中Lys126的AoA悬垂基团以肟键与分支型聚合物GRFNP43结合，表示为KOX)
按照实施例1、2、3、4和7中的描述来完成附加肽的合成、连接、羧甲基化、保护基团去除、折叠以及纯化，以产生全长的折叠的SEP-1-B52(SEQ ID NO：2)，用分析性(C4)反相HPLC、ES-MS和非还原SDS-PAGE对该蛋白的性质进行描述。按照其他SEP构建体的描述来完成生物检测。
实施例9
SEP-3-L42的功效研究
将SEP-1-L30重新配制到添加了0.25％大鼠血清白蛋白(RSA)的Citrate Buffer(20mM柠檬酸+100mM氯化钠)中，并且在第1、3和6天，将其以0、1、5或10μg/kg，tiw的剂量静脉内给药于正常雄性大鼠(每组5只大鼠)。在最后一次注射(第9天)后4天，收集血液样品，并分析其血液学参数。当与对照组的数据比较时，在用SEP-3-L42以这些剂量进行最后一次注射后4天，红细胞(RGB)、血红蛋白(HGB)、红细胞比容(HCT)和网织红细胞数(RET)值没有统计学意义的显著差异。
实施例10
SEP-3-L42的药代动力学研究
将SEP-3-L42重新配制到添加了0.25％RSA的pH为6.9的CitrateBuffer(20mM柠檬酸+100mM氯化钠)中，并且将其以5μg/kg的单一剂量静脉内给药于正常雄性大鼠。在给药后0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144和168小时收集血液样品。用ELISA试剂盒(R&DSystems，Human Erythropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit#DEP00)，根据制造商的说明书来测定血浆中SEP-3-L42的浓度。该结果显示在图27中。
如图17所示，与SEP-3-L42相比，SEP-1-B50的清除率略微减慢。在剂量测试中，无论其循环半衰期如何，SEP-3-L42在促进红细胞增殖方面没有表现出统计学上的显著差异。与之相反，SEP-1-B50能以相同剂量刺激红细胞增殖。该结果说明可以利用聚合物结构来调节体内的生物学特性，包括药代动力学行为和潜能。
实施例11
SEP-1-L30的功效研究
将SEP-1-L30重配制到添加了0.25％RSA的Citrate Buffer(20mM柠檬酸+100mM氯化钠)中，并且在第1、3和5天，将其以0、1、5、25或50μg/kg，tiw的剂量静脉内给药于正常雄性大鼠(每组5只大鼠)。在最后一次注射(第9和第13天)后4天和8天，收集血液样品，并分析其血液学参数。在用SEP-1-L30处理后的任何间期，与对照组比较，RBC值、HGB值和HCT值都没有统计学上的显著差异。用25和50μg/kg SEP-1-L30处理的大鼠在最后一次注射(第9天)后4天，其网织红细胞数增高(与对照组的那些数据比较，具有统计学上的显著差异)。在第9或第13天，所有用SEP-1-L30处理的动物中都没有发现血液学参数的其他差异。[未提供数据]
实施例12
SEP-1-L30的药代动力学研究
将SEP-1-L30重配制到添加了0.25％RSA的pH为6.9的CitrateBuffer(20mM柠檬酸+100mM氯化钠)中，并且将其以5或25μg/kg的单一剂量静脉内给药于正常雄性大鼠。在给药后0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144和168小时收集血液样品。用ELISA试剂盒(R&D Systems，Human Erythropoietin Quantikine IVDImmunoassay Kit #DEP00)，根据制造商的说明书来测定血浆中SEP-1-L30的浓度。在给药后的所有特定时间点，都没有检测到SEP-1-L30。
实施例13
SEP-1-B50的功效研究
将SEP-1-B50重配制到添加了0.25％RSA的无菌PBS(磷酸盐缓冲液)中，并且在第1、3和6天，将其以0、1、5、25或125μg/kg，tiw的剂量静脉内给药于正常雄性大鼠(每组5只大鼠)。在最后一次注射(第10、15和20天)后4、9和14天，收集血液样品，并分析其血液学参数。数据显示在下面的表VIII中。在最后一次注射(第10天)后4天，在接受了5、25和125μg/kg SEP-1-B50处理的动物中发现，增加的RBC、HGB、HCT和RET具有剂量相关效应(与对照组的那些数据比较，具有统计学上的显著差异)。在第15天时，这些动物的RBC、HGB和HCT保持着比对照值高的水平，并且在以125μg/kgSEP-1-B50处理的动物中，直到第20天(最后一次注射后14天)，RBC、HGB和HCT仍然显著地比对照值高。
                      表VIII
         SEP-1-B50多次给药后的血液学测定结果
RBC 10天 15天 20天
对照1μg/kg5μg/kg25μg/kg125μg/kg 7.01±0.3017.07±0.4827.16±0.4027.98±0.484**8.71±0.512** 6.86±0.3916.85±0.4467.27±0.2297.73±0.448*8.89±0.598** 6.96±0.1787.00±0.3156.92±0.2387.20±0.3318.25±0.641**
HGB 10天 15天 20天
对照1μg/kg5μg/kg25μg/kg125μg/kg 14.2±0.4914.4±1.1815.6±0.43*16.1±0.49**16.9±0.82** 14.0±0.6114.2±0.4415.3±0.33*15.1±0.5716.4±0.32** 13.9±0.3614.1±0.3014.4±0.3013.8±0.2215.0±1.07*
HCT 10天 15天 20天
对照1μg/kg5μg/kg25μg/kg125μg/kg 41.1±1.3942.6±1.8244.7±1.69*46.6±1.50**49.8±2.13** 40.5±0.9340.6±1.8344.1±1.2743.6±1.6148.4±3.95** 40.9±1.3341.2±1.1341.5±0.9040.3±1.0544.3±3.39*
RET 10天 15天 20天
对照1μg/kg5μg/kg26μg/kg125μg/kg 2.4±1.143.8±1.146.6±3.60*6.2±1.12*8.4±1.60** 2.5±1.102.3±0.461.8±0.481.1±0.24*0.9±0.50** 0.9±0.131.3±0.410.8±0.260.2±0.21**0.3±0.36**
*与对照有显著差异p＜0.05**与对照有显著差异p＜0.01
实施例14
SEP-1-B50的药代动力学研究
将SEP-1-B50重配制到添加了0.25％RSA的pH为6.9的CitrateBuffer(20mM柠檬酸+100mM氯化钠)中，并且以5或25μg/kg的单一剂量水平将其静脉内给药于正常雄性大鼠。在给药后0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144和168小时收集血液样品。用ELISA试剂盒(R&D Systems，Human Erythropoietin Quantikine IVDImmunoassay Kit #DEP00)，根据制造商的说明书来测定血浆中SEP-1-B50的浓度。分别对以5和25μg/kg剂量处理后9.7小时和9.9小时的清除半衰期进行测定。对5和25μg/kg剂量的观测MRT(平均滞留时间)分别为13.9小时和14.4小时。图27中显示了SEP-1-B50的典型的药代动力学概图。
实施例15
SEP-1-B51的功效研究
通过两次实验，将SEP-1-B51静脉内给药于正常雄性大鼠。
实验1：将SEP-1-B51重新配制在添加了0.25％RSA的CitrateBuffer(20mM柠檬酸钠+100mM氯化钠)中，然后在第1、3和6天将其以0、1、5或25μg/kg，tiw的剂量静脉内给药于雄性大鼠(每组5只大鼠)，并在最后一次注射的4、9和14天后(第10、15和20天)收集血液样品，用于血液学参数分析。数据显示于下文表IX。与对照组相比，在第3次和最后一次SEP-1-B51静脉内注射的4天后(第10天)，接受25μg/kg SEP-1-B51的动物体内的RBC、HGB、HCT和绝对网织红细胞数(ART)出现了具有统计学意义的显著增加。在第15天时，这些动物的RBC值仍高于对照值，并且在第20天时仍与对照值具有可比性。第10天后，网织红细胞的产量有所降低，第15天时，在接受5和25μg/kg的动物体内观测到网织红细胞数的明显降低。
                       表IX
         多次SEP-1-B51给药后的血液学检测结果
RBC 10天 15天 20天
对照1ug/kg5ug/kg25ug/kg 5.66±0.4975.32±0.2756.22±0.3776.70±0.257** 5.62±0.3855.23±0.4706.18±0.2986.25±0.348* 5.90±0.2865.77±0.2006.39±0.3695.94±0.294
HGB 10天 15天 20天
对照1ug/kg5ug/kg25ug/kg 14.3±1.1013.3±0.4115.1±0.5316.5±0.52** 14.2±0.8813.2±0.9314.8±0.3015.0±0.91 14.8±0.7214.3±0.3715.4±0.2514.3±0.64
HCT 10天 15天 20天
对照1ug/kg5ug/kg25ug/kg 36.8±3.0834.5±1.2139.9±1.5143.8±1.83** 36.2±2.5933.4±2.5638.6±0.9139.3±2.77 37.9±1.9337.1±0.8240.2±1.3637.2±1.60
ART 10天 15天 20天
对照1ug/kg5ug/kg25ug/kg 0.29±0.0890.34±0.500.28±0.0590.48±0.121* 0.28±0.0860.23±0.0550.11±0.021**0.06±0.054** 0.21±0.0340.19±0.0750.20±0.0811.45±3.100
**与对照有显著差异p＜0.01*与对照有显著差异p＜0.05
实验2：将SEP-1-B51重新配制在添加了0.25％人血清白蛋白的Citrate Buffer(20mM柠檬酸钠+100mM氯化钠)中，然后在第1、3和5天将其以0、1、5或25μg/kg，tiw的剂量静脉内给药于雄性大鼠(每组5只大鼠)，并在最后一次注射的2、4和6天后(第7、9和11天)收集血液样品，用于血液学参数分析。此外还在其余的研究日(第2、3、4、5、6、8、10、12和13天)每天收集只用于红细胞比容测定〔按压缩的细胞体积(PCV)〕的血液样品。数据显示于下文表X。从第一次注射的2天(第3天)后开始，接受剂量为5和25μg/kg的动物体内的HCT(PCV或计算)值明显增加，并一直持续到第3次和最后一次注射的6天(第11天)后。在接受剂量为5和25μg/kg的动物体内，测定的(最后一次给药的2、4和6天后；第7、9和11天)RBC和HGB值也明显增加。在25μg/kg组，ART的明显增加只出现在最后一次注射后2和4天(第7和9天)。
                        表X
        多次SEP-1-B51给药σ后的血液学检测结果
RBC 7天 9天 11天
对照1ug/kg5ug/kg25ug/kg 5.61±0.6796.08±0.1416.29±0.4596.61±0.295** 5.23±0.4675.70±0.3006.07±0.308**6.24±0.268** 5.34±0.4055.67±0.5476.11±0.248*6.38±0.173**
HGB 7天 9天 11天
对照1ug/kg5ug/kg25ug/kg 13.7±1.0714.6±0.2715.8±0.50**16.7±0.86** 12.9±0.7913.9±0.1914.9±0.53**15.1±0.66** 13.3±0.9313.9±0.9014.8±0.18*14.6±0.69*
HCT 7天 9天 11天
对照1ug/kg5ug/kg25ug/kg 35.6±3.6138.9±0.8241.3±1.92**44.4±2.08** 33.2±2.3935.9±0.9439.1±1.01**39.7±2.23** 34.5±3.1935.9±2.4339.2±0.7*39.6±2.32**
ART 7天 9天 11天
对照1ug/kg5ug/kg25ug/kg 0.50±0.1580.30±0.044*0.45±0.1250.78±0.117** 0.36±0.0930.30±0.0260.36±0.0560.71±0.152** 0.34±0.0790.25±0.0540.25±0.0450.32±0.099
*与对照有显著差异p＜0.05**与对照有显著差异p＜0.01注释：第7天(第三次给药后两天)；第9天(第三次给药后四天)
    第11天(第三次给药后六天)
用25μg/kg单一剂量的SEP-1-B51经静脉内处理其他组的大鼠，并且在注射后48小时收集血液样品以用于分析其血液学参数。此外还仅在注射(第1、2、4和8天)后8、24和72小时以及7天后，收集用于红细胞比容测定〔按压缩的细胞体积〕的血液样品。在第3天(注射后2天)，接受SEP-1-B51静脉内处理的大鼠的HCT、HGB和ART值比对照值高，并且在第4天，这些动物的HCT仍然显著增加。
实施例16
在红细胞增多和缺氧模型中SEP-1-B51的功效研究
将以10只正常小鼠为一组的数组小鼠(赋形剂对照，以4种剂量水平的在CHO-细胞(“rhEPO”)中重组产生的糖基化的人促红细胞生成素，以及以4种剂量水平：0.32、1、5、25μg/kg/假定100mU/ng的SEP-1-B51)每天暴露在压强维持在506.5mb的大气中18小时，持续20天。将配制在添加了0.25％人血清白蛋白的Citrate Buffer中的rhEPO或SEP-1-B51以200μl-量经静脉内(IV)注射到经历缺氧状态4天后的小鼠中。2天后，用0.2μCi的59Fe经腹腔(i.p.)注射每只小鼠。3天后，通过测定用心脏穿刺术取得的500μl血液中的放射量来估计RBC-放射铁摄取量。
SEP-1-B51和rhEPO的72-小时RBC-59Fe摄取量(剂量百分比)结果显示，随剂量向5μg/kg增加，59Fe摄取量的增加具有明显的剂量相关效应，当剂量大于5μg/kg时(25μg/kg)，该反应处于平台期。因此，使用三种最低剂量水平来计算线性回归。图28显示了SEP-1-B51和rhEPO的线性回归分析结果。SEP-1-B51和rhEPO的效应基本上一致。SEP-1-B51与rhEPO的“效能比”是1.0035(0.6947-1.4498的95％可信区间)，该分析中确定的SEP-1-B51的效能为100mU/ng(69-145的95％可信区间)。
在体内SEP-1-B51表现出与rhEPO相似的活性，并且以剂量依赖性方式发挥作用，包括在较高剂量时形成的反应平台，其原因是该模型中诱导了常见于rhEPO的负反馈机制。这说明在SEP-1-B51分子的自定糖基化位点上精确连接的聚合物结构可以模拟rhEP0糖链所具有的体内活性。
实施例17
SEP-1-B51的药代动力学研究
将以5ug/kg单一剂量的重新配制在添加了0.25％人血清白蛋白的Citrate Buffer中的SEP-1-B51或rhEPO(相当于500U/kg)经静脉内给药于几组正常雄性大鼠，并且在给药后5、30、60分钟和24小时以及第2、3、4、5、6和7天放血。用R&D Systems抗EPO ELISA试剂盒(R&D Systems，Human Erythropoietin Quantikine IVDImmunoassay Kit #DEP00)，根据制造商的说明书通过ELISA试验来确定血浆样品中SEP-1-B51或rhEPO的浓度。
进行浓度的对数的最小平方分析，得到的药代动力学参数列在下面的表XI中。在接受以5ug/kg单一剂量的SEP-1-B51经静脉内给药的雄性大鼠中，其血浆浓度随时间的变化可以用一种单指数药代动力学分布函数来描述，其半衰期为10.5±0.5小时。SEP-1-B51的中心象限的分布容积(Vc)为32.5±2.0ml/kg。清除率(CL)为2.15ml/hr/kg，其平均滞留时间(MRT)为15.1±0.7小时。相比之下，在接受以5ug/kg剂量的rhEPO经静脉内给药的雄性大鼠中，其血浆浓度的变化可以用双指数药代动力学分布函数来描述，其α半衰期为1.24±0.22小时，其β半衰期为5.51±0.40小时。rhEPO的Vc为57.0±3.2ml/kg。CL为16.0±0.5ml/hr/kg，约比SEP-1-B51的CL大8倍。rhEPO的平均滞留时间(MRT)为5.73±0.17小时，约比SEP-1-B51的MRT短3倍。
                           表XI
           SEP-1-B51与rhEPO的药代动力学参数的比较
 曲线   AUC(ng/mL-hr)   Cmax(ng/mL)   Vc(mL/kg)   CL(mL/hr/kg)
 SEP-1-B51   2326±121   154±9   32.5±2.0   2.15±0.11
 rhEPO   312±9   87.9±5.0   57.0±3.2   16.0±0.5
 曲线   MRT(小时)   T1/2α(Hours)   T1/2β(Hours)
 SEP-1-B51   15.1±0.7   10.5±0.5   N/A
 rhEPO   5.73±0.17   1.24±0.22   5.51±0.40
图29以图形表示了SEP-1-B51和rhEPO的血浆清除率。这些数据说明SEP-1-B51的循环半衰期比糖基化的重组人EPO的循环半衰期明显地增加，这种增加是由分子中精确连接在自定位点上的聚合物引起的。
本发明是结合其特定实施方案来加以描述的，但应该了解的是，可以对本发明做进一步改进，而该申请书应包括任何变化、应用或修改，这些变化、应用或修改可以符合本发明的一般原理，也可以偏离本发明的公开内容，但是处于本发明所属领域已知或惯用准则的范围内，并且适用于上文阐述的本质特征。
序列表
                           序列表<110>格莱风科学公司(Gryphon Sciences)<120>促红细胞生成性合成蛋白<130>03504.265<140><141><150>60/231,339<151>2000-09-08<150>60/236,377<151>2000-09-29<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1               5                  10                  15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
         20                  25                  30Cys Ser Leu Asn Glu Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
     35                  40                  45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
 50                  55                  60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65                  70                  75                  80Leu Val Lys Ser Ser Gln Pro Trp Cys Pro Leu Gln Leu His Val Asp
             85                  90                  95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
        100                 105                 110Gly Ala Gln Lys Cys Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
    115                 120                 125Pro Leu Arg Thr lle Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130                 135                 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145                 150                 155                 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg
            165<210>2<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1               5                  10                  15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Lys lle Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
         20                  25                  30Cys Ser Leu Asn Glu Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
     35                  40                  45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
 50                  55                  60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65                  70                  75                  80Leu Val Lys Ser Ser Gln Pro Trp Cys Pro Leu Gln Leu His Val Asp
             85                  90                  95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
        100                 105                 110Gly Ala Gln Lys Cys Ala lle Ser Pro Pro Asp Ala Ala Lys Ala Ala
    115                 120                 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130                 135                 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145                 150                 155                 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg
           165<210>3<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Ala Pro Pro Arg Leu lle Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1               5                  10                  15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Cys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
         20                  25                  30Cys Ser Leu Asn Glu Cys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
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 50                  55                  60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65                  70                  75                  80Leu Ala Cys Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp
             85                  90                  95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
        100                 105                 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Cys Ala Ala
    115                 120                 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130                 135                 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145                 150                 155                 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg
            165

Claims (77)

1.一种促红细胞生成性合成蛋白，该蛋白联接有一种或多种水溶性聚合物。
2.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，该蛋白在体内具有提高红细胞产量的生物活性。
3.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，该蛋白包含一段具有核糖体特定促红细胞生成素氨基酸序列的多肽链，以及通过一种或多种化学连接位点共价结合的一种或多种非重叠肽段。
4.权利要求3的促红细胞生成性合成蛋白，其中，一种或多种所述水溶性聚合物是通过与所述核糖体特定促红细胞生成素的糖基化位点相对应的一个位点联接于所述多肽链。
5.权利要求3的促红细胞生成性合成蛋白，其中的核糖体特定促红细胞生成素来源于人。
6.权利要求3的促红细胞生成性合成蛋白，其中的核糖体特定促红细胞生成素糖蛋白是非天然蛋白。
7.权利要求6的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述非天然的核糖体特定促红细胞生成素具有一个或多个非天然的糖基化位点。
8.权利要求2的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述水溶性聚合物只通过与所述核糖体特定促红细胞生成素的糖基化位点相对应的一个或多个位点联接于所述多肽链。
9.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，一种或多种所述水溶性聚合物包含一种重复单元，该重复单元包括聚环氧烷、聚酰胺环氧烷，或其衍生物。
10.权利要求9的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述聚环氧烷和聚酰胺环氧烷包含一种通式为-(CH2-CH2-O)-的环氧乙烷重复单元。
11.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，一种或多种所述水溶性聚合物呈分支型。
12.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，一种或多种所述水溶性聚合物带有一种在生理条件下为负值的净电荷。
13.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白的等电点为3-7。
14.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述水溶性聚合物呈单分散状态。
15.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白呈单分散状态。
16.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白包含一种分子量大于25kDa的单体。
17.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白包含一种分子量大于40kDa的单体。
18.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白包含一种分子量大于50kDa的单体。
19.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白包含一种分子量大于60kDa的单体。
20.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白包含一种分子量大于70kDa的单体。
21.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述多肽链含有一种或多种不规则氨基酸。
22.权利要求21的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述不规则氨基酸具有一种非天然的侧链。
23.权利要求21的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述不规则氨基酸包括一种假氨基酸。
24.权利要求23的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述假氨基酸是假谷氨酸酯。
25.权利要求22的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述非天然侧链与一种水溶性聚合物共价结合。
26.权利要求25的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述水溶性聚合物通过一种由化学连接形成的键与所述侧链共价结合。
27.权利要求26的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述由化学连接形成的键选自酰胺键、肟键、腙键、噻唑烷键、恶唑烷键和硫酯键。
28.权利要求3的促红细胞生成性合成蛋白，其中，一种或多种所述化学连接位点包含一种酰胺键。
29.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述水溶性聚合物是通过所述多肽链的化学连接位点上的一种氨基酸侧链与该多肽链相联接。
30.权利要求1的促红细胞生成性合成蛋白，其中，该蛋白含有一种选自SEP-1和SEP-3的促红细胞生成性合成蛋白的氨基酸序列。
31.一种促红细胞生成性合成蛋白，该蛋白选自SEP-0、SEP-1、SEP-3，及其类似物。
32.权利要求31的促红细胞生成性合成蛋白，其中，所述类似物选自SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50、SEP-1-B51和SEP-1-B52。
33.一种药用组合物，该组合物含有权利要求1的一种促红细胞生成性合成蛋白，或其药学容许的盐类。
34.权利要求33的药用组合物，该组合物含有一种或多种选自缓冲液、载体蛋白、氨基酸、洗涤剂、脂类、水溶性聚合物和防腐剂的赋形剂。
35.权利要求33的药用组合物，该组合物除所述促红细胞生成性合成蛋白之外还含有一种或多种额外的生物活性剂。
36.一种提高哺乳动物红细胞比容的方法，该方法包括将权利要求1的一种促红细胞生成性合成蛋白以有效的剂量给药于所述哺乳动物，从而使所述哺乳动物体内的红细胞比容提高。
37.一种提高哺乳动物体内红细胞产量的方法，该方法包括将权利要求1的一种聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白以有效的剂量给药于所述哺乳动物，从而使所述哺乳动物体内的红细胞产量提高。
38.一种提高哺乳动物体内血红蛋白产量的方法，该方法包括将权利要求1的一种聚合物修饰促红细胞生成性合成蛋白以有效的剂量给药于所述哺乳动物，从而使所述哺乳动物体内的血红蛋白产量提高。
39.一种提高哺乳动物体内网织红细胞数的方法，该方法包括将权利要求1的一种促红细胞生成性合成蛋白以有效的剂量给药于所述哺乳动物，从而使所述哺乳动物体内的网织红细胞数提高。
40.一种产生含有促红细胞生成性合成蛋白多肽链的方法，该方法包括，将含有所述促红细胞生成性合成蛋白的非重叠性多肽链氨基酸序列的一些肽段进行化学连接，从而产生一种含有所述促红细胞生成性合成蛋白的多肽链。
41.权利要求40的方法，该方法进一步包括使所述多肽链折叠，从而产生一种具有生物活性的促红细胞生成性合成蛋白。
42.权利要求40的方法，其中，一种或多种所述肽段被部分保护。
43.权利要求40的方法，其中，一种或多种所述肽段未被保护。
44.权利要求40的方法，其中，一种或多种所述肽段联接有一种水溶性聚合物。
45.权利要求40的方法，其中，所述化学连接包括一种选自天然化学连接、扩展的天然化学连接、假天然化学连接、肟键形成化学连接、腙键形成化学连接、恶唑烷键形成化学连接、噻唑烷键形成化学连接和硫酯键形成化学连接的化学选择性连接。
46.权利要求40的方法，其中，所述多肽链联接有一种或多种水溶性聚合物。
47.权利要求40的方法，其中，所述多肽链含有一种核糖体特定促红细胞生成素氨基酸序列。
48.权利要求46的方法，其中，一种或多种所述水溶性聚合物是通过与所述核糖体特定促红细胞生成素的糖基化位点相对应的一个位点联接于所述多肽链。
49.权利要求48的方法，其中，所述核糖体特定促红细胞生成素糖蛋白是利用重组方法产生的。
50.权利要求48的方法，其中，所述核糖体特定促红细胞生成素糖蛋白是非天然的。
51.权利要求50的方法，其中，所述非天然核糖体特定促红细胞生成素糖蛋白具有一个或多个非天然的糖基化位点。
52.权利要求47的方法，其中，所述核糖体特定促红细胞生成素来源于人。
53.权利要求48的方法，其中，所述水溶性聚合物只通过与所述核糖体特定促红细胞生成素的糖基化位点相对应的一个位点联接于所述多肽链。
54.权利要求46的方法，其中，一种或多种所述水溶性聚合物包含一种重复单元，该重复单元包括聚环氧烷、聚酰胺环氧烷，或其衍生物。
55.权利要求54的方法，其中，所述聚环氧烷和聚酰胺环氧烷包含一种通式为-(CH2-CH2-O)-的环氧乙烷重复单元。
56.权利要求46的方法，其中，一种或多种所述水溶性聚合物呈分支型。
57.权利要求46的方法，其中，一种或多种所述水溶性聚合物带有一种在生理条件下为负值的净电荷。
58.权利要求41的方法，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白的等电点为3-7。
59.权利要求46的方法，其中，所述水溶性聚合物呈单分散状态。
60.权利要求40的方法，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白呈单分散状态。
61.权利要求46的方法，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白包含一种分子量大于25kDa的单体。
62.权利要求46的方法，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白包含一种分子量大于40kDa的单体。
63.权利要求46的方法，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白包含一种分子量大于50kDa的单体。
64.权利要求46的方法，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白包含一种分子量大于60kDa的单体。
65.权利要求46的方法，其中，所述促红细胞生成性合成蛋白包含一种分子量大于70kDa的单体。
66.权利要求40的方法，其中，所述多肽链含有一种或多种不规则氨基酸。
67.权利要求66的方法，其中，所述不规则氨基酸具有一种非天然的侧链。
68.权利要求67的方法，其中，所述不规则氨基酸包括一种假氨基酸。
69.权利要求40的方法，其中，所述多肽链含有一种化学连接位点，该位点具有一种选自酰胺、肟、腙、噻唑烷、恶唑烷和硫酯的键。
70.权利要求46的方法，其中，所述水溶性聚合物与具有非天然侧链的所述多肽链的一种氨基酸相联接。
71.权利要求46的方法，其中，所述水溶性聚合物通过一种由化学连接形成的键与所述侧链共价结合。
72.权利要求71的方法，其中，所述由化学连接形成的键选自酰胺键、肟键、腙键、噻唑烷键、恶唑烷键和硫酯键。
73.权利要求46的方法，其中，所述水溶性聚合物是通过所述多肽链的化学连接位点上的一种氨基酸侧链与该多肽链相联接。
74.权利要求41的方法，其中，所述具有生物活性的促红细胞生成性合成蛋白在体内具有提高红细胞产量的生物活性。
75.权利要求40的方法，其中，所述多肽链含有一种选自SEP-1和SEP-3的促红细胞生成性合成蛋白的氨基酸序列。
76.权利要求40的方法，其中的促红细胞生成性合成蛋白选自SEP-0、SEP-1、SEP-3，及其类似物。
77.权利要求76的方法，其中，所述类似物选自SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50、SEP-1-B51和SEP-1-B52。
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