JPH10510151A

JPH10510151A - Ｒａｎｔｅｓペプチドおよびフラグメント並びにそれを含んでなる炎症治療用組成物

Info

Publication number: JPH10510151A
Application number: JP8517418A
Authority: JP
Inventors: ナイジェルカールウェルズ，チモシー; エリザベスインズプラウドフート，アマンダ
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1994-12-08
Filing date: 1995-12-07
Publication date: 1998-10-06
Also published as: CZ171997A3; CA2207036A1; US6159711A; CN1168697A; MX9703889A; HU221089B1; FI972433A0; FI972433A; NZ296570A; HUT77075A; AU4120896A; US6555105B1; EP0796330A1; PL320565A1; WO1996017935A3; WO1996017935A2; CN1087346C; AU688641B2; NO972620D0; PL182786B1

Abstract

(57)【要約】ＲＡＮＴＥＳに対する修飾から、ＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ‐１αアンタゴニストとして作用する修飾ポリペプチドを得ることができる。このようなアンタゴニストは炎症を減少させる治療に使用できる。それらはＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ‐１αの性質を研究する上でも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ＲＡＮＴＥＳペプチドおよびフラグメント並びにそれを含んでなる炎症治療用組成物本発明はＲＡＮＴＥＳの誘導体とそれらの用途に関する。ＲＡＮＴＥＳとして知られるタンパク質は、Stanford University School of MedicineのKrensky's研究室でSchall T.J.et al.（J.Immunol.141,1018-1025(19 88)）により初めてクローニングされた。ＲＡＮＴＥＳという用語は"Raised on activation,normal T-cell derived and secreted"という語句（下線部分の関連文字）からきている。その発現はＴ細胞の抗原刺激または変異原活性化により誘導される。そのタンパク質はケモカインスーパーファミリーのメンバーである（ Schall T.J.,Cytokine 3,165-183(1991)；Oppenheim,J.J.et al.,Ann.Rev.Immun ol.9,617-48(1991)）。純粋なタンパク質は１９９２年に血小板において初めて同定された（Kameyoshi et al.,J.Exp.Med.176,587-592(1992)）。それは好酸球、ＣＤ４⁺ＣＤ４５ＲＯ⁺Ｔ細胞と、更に単球にとって強力な誘引物質である。それは６８のアミノ酸配列を有している。ＲＡＮＴＥＳのレセプターが最近クローニングされ（Gao,J.L.et al.,J.Exp.M ed.177,1421-7(1993)；Neote,K.,et al.,Cell 72,415-25(1993)）、これはＭＩＰ‐１α＞ＲＡＮＴＥＳの効力順序でケモカインと結合することが示された。本発明はＲＡＮＴＥＳおよび／またはＭＩＰ‐１αのアンタゴニストであるポリペプチドを提供する。一般的にサイトカインに関する相当な関心と、特にＲＡＮＴＥＳおよびＲＡＮＴＥＳレセプターについて上記された研究にもかかわらず、本発明の以前には、上記アンタゴニストまたはこのようなアンタゴニストの利用可能性について開示がなかった。本発明によれば、ＲＡＮＴＥＳと実質的なアミノ酸配列相同性を有し、かつ下記のうち１以上：（ａ）ＲＡＮＴＥＳに応答したおよび／またはＭＩＰ‐１αに応答したＴＨＰ ‐１細胞の走化性；（ｂ）ＲＡＮＴＥＳの存在および／またはＭＩＰ‐１αの存在によるＴＨＰ‐ １細胞におけるカルシウムイオンの移動；および（ｃ）ＴＨＰ‐１細胞のレセプターへのＲＡＮＴＥＳおよび／またはＭＩＰ‐ １αの結合に関して、ＲＡＮＴＥＳおよび／またはＭＩＰ‐１αのアンタゴニストとして機能するポリペプチドが提供される。本発明により提供されるポリペプチドは、ＲＡＮＴＥＳとその効果を更に特徴付ける上で、例えばＲＡＮＴＥS誘導走化性、カルシウムイオンの移動性およびレセプター結合性について研究する上で有用である。それらはレセプターへのＲＡＮＴＥＳの結合性の特徴付けにも有用である。それらは対応した理由についてＭＩＰ‐１αを研究する上で有用である。しかも、本発明のポリペプチドは、後で説明されているように、様々な疾患の治療に有用であると考えられる。本発明の好ましいポリペプチドは（ＲＡＮＴＥＳの対応位置に存在せず、したがってＲＡＮＴＥＳのＮ末端に存在するものに対して追加のＮ末端アミノ酸としてみなすことができる）１以上のＮ末端アミノ酸の存在により、ＲＡＮＴＥＳおよび／またはＭＩＰ‐１αのアンタゴニストとして作用する。これらのＮ末端アミノ酸は（組換えＤＮＡ技術を用いるか、またはペプチド融合技術により組込むことができる）天然（Ｌ‐）アミノ酸であることが好ましい。しかしながら、非天然アミノ酸（例えばＤ‐アミノ酸）も用いることができる。これらは化学合成技術を用いて組込むこともできる。このような追加アミノ酸は１つだけでもよく、その場合には例えばロイシンまたはメチオニンである。このようなポリペプチドはいずれか適切な技術により（例えば、遺伝子クローニング技術、化学合成などを用いることにより）作製できる。本発明の１つの態様において、それらは望ましい配列を含んだ大きなポリペプチドを用意して、その後酵素開裂を用いて望ましい配列からなるポリペプチドを作ることにより作製される。本発明のポリペプチドは２以上の追加Ｎ末端アミノ酸を含んでいてもよく、例えばそれらは５以内、１０以内または２０以内の追加アミノ酸を含んでいてもよい。一部の場合には、２０を超えるＮ末端アミノ酸が存在していてもよい。更に、いかなる適切な技術もこのようなポリペプチドを作製するために使用できる。本発明の様々な態様が以下で更に詳細に記載されている。本発明者らは、成熟ヒトＲＡＮＴＥＳに相当する（即ち、シグナル配列が除かれた）形でＲＡＮＴＥＳを発現するE.coli発現系を用いると、追加Ｎ末端メチオニンが存在する（これは内在E.coliプロテアーゼにより残留配列から開裂されない）ポリペプチドが発現されることを発見した。この追加アミノ酸の存在はＲＡＮＴＥＳの場合と比較してポリペプチドの特徴を実質的に変化させることが意外にもわかった。メチオニル化ポリペプチド（以下、メチオニル化ＲＡＮＴＥＳまたはＭｅｔ‐ＲＡＮＴＥＳと称される）は様々なアッセイでＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ‐１αのアンタゴニストとして作用することがわかり、いかなる実質的アゴニスト活性も有しないことがわかった。Ｎ末端メチオニル化がE.coliで生じる多くの場合において、ポリペプチドの性質にはほとんどまたは全く差異を生じないか、あるいはその以前の生物活性のレベルを単に減少させるだけであることは明らかなはずである。したがって、Ｎ末端メチオニル化が本発明において実際上アンタゴニスト活性になるとは、全体として予測されなかった。この効果がＮ末端メチオニンの存在に限定されるのかどうかを調べるために、Ｎ末端メチオニンがＮ末端ロイシンに代えられたもう１つのポリペプチドが作られた。これもＲＡＮＴＥＳのアンタゴニストとして作用することがわかり、Ｎ末端メチオニンがＮ末端グルタミンに代えられた別のポリペプチドでもそうであった。好ましい形において、本発明のポリペプチドは下記配列：（ｉ）ＭＳＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳ（場合によって本明細書において“Ｍｅｔ‐ＲＡＮＴＥＳ”と称される）（ii）ＬＳＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳ（場合によって本明細書において“Ｌｅｕ‐ＲＡＮＴＥＳ”と称される）または（iii）ＱＳＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳ（場合によって本明細書において“Ｇｌｎ‐ＲＡＮＴＥＳ”と称される）を有するか、または上記配列のいずれかと実質上相同的である配列を有している。ポリペプチドはグリコシル化形でも、または非グリコシル化形であってもよい。 “実質上相同的”という用語は、本明細書で用いられるとき、所定配列と（好ましい順序で）少くとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相同性を有したアミノ酸配列を含む。この用語には、得られるポリペプチドがＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ‐１αに対するアンタゴニストとして作用するのであれば、限定されないが所定配列に対して１〜２０、１〜１０または１〜５の単一アミノ酸欠失、挿入または置換を有するアミノ酸配列も含む。ポリペプチドは実質上純粋な形であってもよい。それは天然ポリペプチドから単離してもよい。ポリペプチドの性質に実質的変化を生じさせずにあるアミノ酸が他に代えうることは当業界で周知であることに留意しておくべきである。このような可能性は本発明の範囲内である。ポリペプチドの性質を実質的に変えないアミノ酸の欠失または挿入がしばしばなしうることも留意しておくべきである。本発明には（上記された具体的なアンタゴニスト配列の長さの例えば１０、２０または５０％以内で）このような欠失または挿入を含む。本発明には、本発明のポリペプチドがもう１つの部分と融合された融合タンパク質もその範囲内に含んでいる。これは例えば標識目的または医薬目的で行ってもよい。本発明者らは、本発明によるポリペプチドがＴＨＰ‐１細胞（単球細胞系）で走化性、カルシウム移動およびレセプター結合に関するＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ‐１αの効果へのアンタゴニストとして作用しうることを証明した。これらの細胞はＡＴＣＣ（American Tissue Culture Collection）から入手でき、ＲＡＮＴＥＳを研究する上で良いモデル系として働くが、その理由はそれらがＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ‐１αと、ＭＣＰ‐１のような他のケモカインに対してカルシウム応答および走化性応答を示すからである。本ポリペプチドは、これらの細胞で走化性、カルシウム移動およびレセプター結合に関するＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ‐１αのアンタゴニストとしても作用できる。ＭＩＰ‐１αはマクロファージ炎症ポリペプチドフラクション（ＭＩＰ‐１αおよび‐βに分けられる）の一部として最初に同定された（Obaru,K et al.,J.Biochem.99:885-894(1988)；Sip pel,P.F.et al.,J.Immunol.142:1582-1590(1989)）。それはＴ細胞および単球に対して走化活性を示す。それは幹細胞増殖の強いインヒビターであることも示された。これらの観察に基づくと、本発明のポリペプチドはＲＡＮＴＥＳおよび／またはＭＩＰ‐１αの効果を遮断する上で有益であり、したがって治療上有用であると考えられる。本発明によるポリペプチドの好ましい用途は、前炎症細胞の補充および／または活性化に際してＲＡＮＴＥＳおよび／またはＭＩＰ‐１αの効果を遮断することである。したがって、本発明は喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム／アテローム性動脈硬化症およびリウマチ様関節炎のような疾患の治療に有用である。上記ポリペプチドに加えて、本発明はこのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（単離または組換え形でもよい）と、このような配列を組込んだベクターと、本発明のポリペプチドを発現できるこのようなベクターを組込んだ宿主細胞とをもまた包含している。本発明によるポリペプチドは、適切なＤＮＡコード配列を利用して、原核または真核宿主細胞からの発現により産生することができる。適切な技術はSambrook et al.,(1989),Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor ,Laboratory Press,USAに記載されている。一方、それらはＲＡＮＴＥＳを共有結合で修飾することにより産生してもよい。これは例えばＲＡＮＴＥＳをそのＮ末端でメチオニル化することにより行える。本発明は、下記添付図面を参考にして例としてのみ記載される：図１は、E.coliでクローニングされたＲＡＮＴＥＳコード配列のヌクレオチド配列を、このヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列とともに示すものである。図２はプラスミドｐＣＢＡ‐Ｍの地図を示すものである。図３はプラスミドｐＴ７‐７の地図を示すものである。図４は様々なケモカインがＴＨＰ‐１細胞において走化性を誘導できることを示している。図５は、Ｍｅｔ‐ＲＡＮＴＥＳがＴＨＰ‐１細胞においてＭＩＰ‐１αおよびＲＡＮＴＥＳ誘導走化性を阻害できることを示している。図６は様々なケモカインがＴＨＰ‐１細胞においてカルシウム流動を誘導できることを示している。図７は、Ｍｅｔ‐ＲＡＮＴＥＳがＴＨＰ‐１細胞においてＲＡＮＴＥＳ誘導カルシウム応答を阻害できることを示している。図８はＣＣＫＲ１レセプターに対するＭｅｔ‐ＲＡＮＴＥＳとＲＡＮＴＥＳとの競合的結合について示している。図９はＬｅｕ‐ＲＡＮＴＥＳがＲＡＮＴＥＳ誘導走化性のアンタゴニストとして作用できることを示している。図１０はＧｌｎ‐ＲＡＮＴＥＳがＲＡＮＴＥＳ誘導走化性のアンタゴニストとして作用できることを示している。例（ａ）ＰＣＲによるヒトＲＡＮＴＥＳコード配列のクローニングヒトＲＡＮＴＥＳはＰＣＲによりヒト骨髄λＧＴ１１ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）からクローニングした。簡単に言えば、骨髄ライブラリー中の全ｃＤＮＡインサートを、２μｌのファージストック(１０⁶pfus）、１０ｍＭ Tris ‐ＨＣｌｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭｄＮＴＰ、２．５単位AMPLITAQ^TM（Perkin Elmer-Cetus）および１ μＭの各プライマー（λＧＴ１１ＰＣＲ‐１（フォワードプライマー）５′ＧＡＴＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣＴおよびλＧＴ１１ＰＣＲ‐２（リバーズプライマー）５′ＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＧＣＧＡＣ）を含有した反応液１００μｌ中において、Techne ＰＨＣ‐２サーモサイクラーで９５℃２分間、５５℃２分間および７２℃５分間の３０サイクルにわたり、ＥｃｏＲＩクローニング部位に隣接するλＧＴ１１プライマーを用いて最初に増幅させた。次いで反応混合液の１／１０を、公表されたＲＡＮＴＥＳ配列（Schall T.J.et al.,(J .Immunol.141,1018-1025(1988))）に基づく特定プライマー（ＲＡＮＴＥＳ‐１５′ＣＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＧＣＧＧＣＡＣセンスおよびＲＡＮＴＥＳ ‐２５′ＣＣＴＡＧＣＴＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧアンチセンス）各々１μ Ｍを含有した反応液１００μｌ中で、９５℃２分間、５５℃２分間および７２℃ ２分間の３０サイクルにわたり、２回目のＰＣＲに付した。ＰＣＲ産物は３％Nu -Sieve（ＦＭＣ）アガロースゲル上で０．５μg/ml臭化エチジウムで染色させて視覚化させ、予想サイズのＲＡＮＴＥＳｃＤＮＡ（２７８ｂｐ）で移動するバンドを標準法によりゲル精製した（Sambrook J.et al.,(1989),Molecular Cloni ng-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Laboratory Press,USA）。次いでゲル精製されたＤＮＡを、５０μｌの全容量中３７℃で１時間にわたり、製造業者の指示に従いＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）での連続処理により平滑末端化させた。この後、２．５ｍＭｄＮＴＰ２．５μｌおよびE.coli ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片（New England Biolabs）１μｌを加え、インキュベートを３７℃で更に３０分間続けた。次いで反応混合液を７０ ℃で３０分間かけて熱不活化させ、その後Tris‐ＨＣｌｐＨ８．０飽和フェノール／クロロホルム（１：１ｖ／ｖ）で１回抽出した。ＤＮＡを３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５１０μｌ、グリコーゲン（２０mg/ml）（Boehringer）１μｌおよびエタノール２５０μｌの添加により−２０℃で沈降させた。ＤＮＡを１０，０００×ｇで２０分間かけて４℃で遠心により回収し、７０％エタノールで洗浄した。最終ペレットを１０ng/μｌの濃度で滅菌水に再懸濁した。平滑末端ＰＣＲ産物（１０ｎｇ）を、１５℃で少くとも１６時間にわたりＴ４ＤＮＡリガーゼ（４００，０００単位/ml）（New England Biolabs）２μｌを用いて、２０μｌの容量中で、ＥｃｏＲＶ切断アルカリホスファターゼ処理ｐBl uescript II ＳＫ‐プラスミド（Stratagene）５０ｎｇに連結させた。連結産物を１×ＴＥ（１０ｍＭ Tris-ＨＣｌｐＨ８．０／１ｍＭＥＤＴＡ）で１００ μｌまで希釈し、前記のようにフェノール／クロロホルム抽出した。連結産物を３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５１０μｌ、グリコーゲン（２０mg/ml）１μｌおよびエタノール２５０μｌの添加により−７０℃で１５分間かけて沈降させた。ＤＮＡを前記のように遠心で回収し、滅菌水１０μｌに再懸濁した。次いで再懸濁された連結産物５μｌを製造業者の指示に従いBio Rad Geneパルサーを用いてエレクトロコンピテントE.coli株ＸＬ‐１ブルー（４０μｌ）中にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後に、ＬＢ培地１ｍｌを加え、細胞を３７℃で１時間増殖させた。この後、培地の一部１００μｌを１００μg/mlアンピシリン含有ＬＢプレート上におき、３７℃で１６時間増殖させた。次いで個別の細菌コロニーを１００μg/mlアンピシリン含有ＬＢ５ｍｌ中に拾い出し、３７℃で一夜増殖させた。次いで小規模のプラスミドＤＮＡ調製物（mini-prep）を製造業者の指示に従いWIZARD^TMmini-prep ＤＮＡ精製系（Promega）を用いて各培養物３ｍｌから作った。次いでmini-prep ＤＮＡの一部３μｌを製造業者の指示に従い１５μｌの反応容量中で制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩ（双方ともNew England Biolabs製）で切断した。反応産物を０．５μg/ml臭化エチジウム含有１％アガロースゲル上で分析した。次いで約２８０ｂｐのインサートサイズを示したmini-prep ＤＮＡを、製造業者の指示に従いＴ３およびＴ７プライマーとSequenase（ＵＳＢ）を用いてＤＮＡ配列分析に付した。ｐBluescript II ＳＫ‐クローニングベクターを下記のように作った：ＣｓＣｌ勾配精製プラスミド２０μｇを製造業者の指示に従いＥｃｏＲＶ（New England Biolabs）２００単位で１００μｌの反応容量中３７℃で２時間かけて切断した。２時間後、切断されたベクターを３７℃で更に３０分間かけて子牛腸アルカリホスファターゼ（２０単位／ml）（Boehringer）１０μｌで処理した。反応混合液を６８℃で１５分間加熱することにより不活化させ、その後Tris‐ＨＣｌｐＨ８．０飽和フェノール／クロロホルム（１：１ｖ／ｖ）で１回抽出した。プラスミドＤＮＡを３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５１０μｌおよびエタノール２５０μｌの添加により−２０℃で沈降させた。ＤＮＡを１０，０００×ｇで２０分間かけて４℃で遠心により回収し、７０％エタノールで洗浄した。最終ペレットを５０ng/mlの濃度で滅菌水に再懸濁した。配列決定では、得られたすべてのクローンが、ＲＡＮＴＥＳプロペプチドの提示シグナル配列でＡｒｇからＰｒｏに代わったＰＣＲ配列の２２位ヌクレオチドにおける単一の塩基変化を除いて、公表された配列と同一であることを示した。これは図１で示されており、そこではクローニングされたＤＮＡコード配列が対応アミノ酸配列と一緒に掲載されている。（ｂ）メチオニル化ＲＡＮＴＥＳ（ＲＡＮＴＥＳアンタゴニスト）に関する発現ベクターの作製ＲＡＮＴＥＳに関する遺伝子を含んだ構築体は、下記プライマーを用いてＰＣＲに付した：５′‐ＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＣＧＡＴＴＣＡＴＡＴＧ．ＴＣＣ．ＣＣＡ．ＴＡＴ．ＴＣＣ．ＴＣＧ．ＧＡＣ．ＡＣ‐３′ 上記において２つの下線部分は各々ＣｌａＩおよびＮｄｅＩ制限部位である（ＮｄｅＩ部位は開始メチオニンコドンの部分を含んでいる）５′‐ＴＡＣＴＧＡＴＡＴＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＣＴＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＴＴＧ‐３′ 次いでこの断片を５′末端でＣｌａＩおよび３′末端でＸｂａＩにより切断した。次いで図２に示されたプラスミドｐＣｂａ‐ＭをＸｂａＩ／ＳａｌＩで切断した。大きな断片をＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断した。次いで３通りの連結を第一切断物から小さなＳａｌＩ／ＸｂａＩ断片、第二切断物からＳａｌＩ／ＣｌａＩ断片、およびＰＣＲ断片を用いて行い、ｍＴＮＦ遺伝子が開始メチオニンで始まるヒトＲＡＮＴＥＳの分泌形のものに代えられたｐＣｂａ‐Ｍと類似した構築体を得た（分泌形のヒトＲＡＮＴＥＳは図１に示されたアミノ酸配列の初めの２３アミノ酸を含んでいない。それは図１に示された残りのアミノ酸を含んでいて、アミノ酸ＳＰＹ．．．で始まる）。次いでこのＮｄｅＩ／ＳａｌＩ断片をこのベクターから除いて、図３に示された発現プラスミドｐＴ７‐７中に入れた。この断片は対象遺伝子＋６００ｂｐの他物質を含んでいるが、後の実験（本明細書に含まれていない）では他物質（ベクター配列）の除去が発現レベルに影響を有しないことを示した。ｐＴ７タイプ発現ベクターはStudier FW,Rosenberg AH et al.,Meth.Enzymol. 185,60-89(1990)に記載されている。次いで構築体をプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Chang and Cohen,J.Bact.134,1141,1978）にＬｙｓＳ遺伝子を含んだE.coli ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｆ−ｏｍｐＴ、ｈｓｄＳ_B（ｒ_B ^-、ｍ_B ^-））中に組込んで形質転換させた。発現ベクターはタンパク質発現を行わせるためにＴ７ポリメラーゼを誘導させることを要する。Ｔ７ポリメラーゼは培地へのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）の添加により細胞で誘導される。（ｃ）Ｍｅｔ‐ＲＡＮＴＥＳが実際にアンタゴニスト活性を示す証明（ｉ）走化性アッセイインビトロ走化は、製造業者の指示に従い９６ウェルチャンバー（Neuro Prob e ＭＢシリーズ、Cabin John,MD 20818,USA）を用いて行った。ＣＣケモカイン、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ‐１αおよびＭＣＰ‐１により誘導される走化性はヒト単球細胞系ＴＨＰ‐１を用いて調べた。２％不活化牛胎児血清を含有したＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco）２００μｌ中で４×１０⁵ＴＨＰ‐１細胞を上部チャンバーの各ウェルでインキュベートした。化学誘引物質（即ち、ケモカイン）を含有したＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＣＳなし）３７０μｌを適切な希釈倍率で下部チャンバーに入れた。走化性の阻害のため、化学誘引物質を各ケモカインについて既に調べられたＥＣ₅₀×５の一定濃度に保ち、Ｍｅｔ‐ＲＡＮＴＥＳを様々な濃度で加えた。チャンバーを５％ＣＯ₂下３７℃で１時間インキュベートした。培地を上部チャンバーから除去し、２０ｍＭＥＤＴＡ含有ＰＢＳと入れ換え、チャンバーを４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳを上部ウェルから除去してから、ふきとり乾燥させた。ユニットを１８００ｒｐｍで１０分間遠心して底部チャンバーにある細胞を収集し、上澄を吸引除去した。底部チャンバーにある細胞は、テトラゾリウムブルーからそのホルマザン生成物への変換をモニターするCell Titer 88^TM Non-Radioactive Cell Proliferation Assay（Promeg a,Madison,USA）を用いて測定した。ＲＰＭＩ１６４０培地中色素の１０％溶液１００μｌを各ウェルに加え、チャンバーを５％ＣＯ₂下３７℃で一夜インキュベートした。次いで可溶化溶液１００μｌを各ウェルに加え、吸光度をThermoma x微量滴定プレートリーダー（Molecular Devices,Palo Alto,CA）で４時間後に５９０ｎｍで読取った。結果は図４および図５に示されている。（ii）カルシウム流動ケモカインＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ‐１αにより誘導されるカルシウム流動は、Tsien R.Y.,Pozzan T.and Rink T.J.((1982)"Calcium homeostasis in inta ct lymphocyte: cytoplasmic free calcium monitored with a new,intracellul arly trapped fluorescent indicator",J.Cell Biolog y94)に従い、但し蛍光指示薬としてＱｕｉｎ２の代わりにFura-2/AM（Fluka）を用いて測定した。ＴＨＰ‐１細胞は、それらが確かに指数期にあるように１０⁶／ml以下で収集した。細胞を０．２％Fura-2/AMおよび１mg/ml ＢＳＡを含有したKrebs-Ringe r溶液に１０⁶／mlの濃度で再懸濁し、光の不在下３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を遠心により収集し、Krebs-Ringer溶液に再懸濁し、氷上においた。一部１ｍｌを使用前に３７℃で２分間インキュベートした。ケモカインを撹拌下で細胞懸濁液に加えた。Ｍｅｔ‐ＲＡＮＴＥＳによる阻害を研究するために、アンタゴニストの一部を３７℃で２分間のインキュベート中に様々な濃度で細胞に加えた。結果は図６および図７に示されている。（iii）レセプター結合アッセイ競合アッセイは、１ｍＭＣａＣｌ₂、５mＭＭｇＣｌ₂および０．５％ＢＳＡを含有した５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．２（結合緩衝液）で２時間前処理された９６ウェルマルチスクリーンフィルタープレート（Millipore,MADV N6500）で実施した。アッセイは組換えＣＣ‐ＣＫＲ１レセプターを発現するＴＨＰ‐１細胞またはＣＯＳ細胞を用いて行った（Neote,K.,DiGregorio,Mak,J.Y. ,Horuk,R.and Schall,T.J.,(1993)Molecular cloning,functional expression a nd signalling characteristics of a C-C chemokine receptor,Cell 72,415-42 5；Gao,J.L.et al,J.Exp.Med.177,1421-7(1993)）。各ウェルは０．４ｎＭ〔Ｉ¹ ²⁵ 〕ＭＩＰ‐１αまたは０．４ｎＭ〔Ｉ¹²⁵〕ＲＡＮＴＥＳ（new England Nucle ar,ＮＥＸ２７７）と様々な濃度の競合Ｍｅｔ‐ＲＡＮＴＥＳを含有した結合緩衝液１５０μｌの容量中に１０⁵細胞を含んでいた。アッセイは重複して３回行った。４℃で９０分間のインキュベート後、細胞は０．５ＭＮａＣｌを含有した氷冷結合緩衝液２００μｌで４回洗浄し、これを吸引除去した。フィルターを乾燥させ、Ultima Gold Scintillation液（Packard）３．５ｍｌを加え、Beckma n LS5000カウンターでカウントした。結果は図８に示されている。（ｄ）Ｌｅｕ‐ＲＡＮＴＥＳ（以下Ｌ‐ＲＡＮＴＥＳとも称される）の作製および拮抗作用の証明Ｌ‐ＲＡＮＴＥＳ発現ベクターを２ステップで作製した。最初のＰＣＲは、第一システインコドン内でヒトＲＡＮＴＥＳの遺伝子を切り取って、その遺伝子の末端にユニーク制限部位を導入するために利用した。このＰＣＲ産物は、遺伝子の５′末端に導入されたＳａｃＩ部位と、遺伝子の３′末端でＨｉｎｄIII適合性オーバーハングを得るためのＢｓｍＡＩ部位を用いて、Ｔ７ベースE.coli発現ベクターｐＥＴ２３ｄ（Novagen）中にクローニングした。次いでヒトＲＡＮＴＥＳのＮ末端変異体についてエンコードする遺伝子を、その変異体についてエンコードするオリゴヌクレオチドをＲＡＮＴＥＳコード配列のすぐ５′側に挿入することにより作製した。この目的のために、ｐＥＴ２３ｄにおける端部切欠ＲＡＮＴＥＳクローンをＳａｃＩで切断してから、ＳａｃＩにより残された突出３′ オーバーハングを除去するためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後２回目の切断をＮｃｏＩで行った。次いでペプチド配列ＭＫＫＫＷＰＲＬＳＰＹＳＳＤＴＴＰについてエンコードするオリゴヌクレオチドを切断されたベクター中にクローニングした。ｐＥＴ２３ｄ／Ｌ‐ＲＡＮＴＥＳ構築体の発現はｐＴ７‐７構築体について記載されたように行った。 pET23d/RANTES NcoI pET23d/RANTES SacI/T4 ５′ＣＣＴＧＣＴＴＴ３′ ３′ＧＧＴＡＣＧＡＣＧＡＡＡ５′ Ｌ‐ＲＡＮＴＥＳオリゴヌクレオチドｐＥＴ２３ｄ／Ｌ‐ＲＡＮＴＥＳ構築体は、１位に異なるアミノ酸をもつＲＡＮＴＥＳを作るために使用できる、一連の発現ベクターの１つである。これらのＴ７発現ベクターはＭＫＫＫＷＰＲ‐Ｘ‐ＲＡＮＴＥＳのＮ末端配列を有するタンパク質についてエンコードしている。Ｘには、例えばＬ、Ｉ、Ｑ、ＥまたはＧがある。エンド‐Ａｒｇ‐Ｃの開裂は異なるＸ‐ＲＡＮＴＥＳタンパク質を作り出す。Ｌｅｕ‐ＲＡＮＴＥＳの精製は下記のように実施した： E.coli細胞ペースト４ｇを、１ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭベンズアミジン‐ＨＣｌ、０．１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドおよびＤＮアーゼ（０．０２mg/ml）を含有した５０ｍＭ Tris-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．８１５ｍｌに懸濁した。細胞をFrench Pressureセルに３回通過させて破壊し、各通過後に氷上で１分間音波処理した。得られた溶液を１０，０００×ｇで８０分間遠心した。ペレットを８Ｍグアニジン‐ＨＣｌおよび１ｍＭジチオスレイトールを含有した１００ｍＭ Tris-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０２ｍｌに溶解した。溶液を６０℃で６０分間加熱して確実にモノマー化させ、室温まで冷却し、同緩衝液で平衡化されたSuperdex‐２００１６／６０カラムでゲルロ過した。組換えＲＡＮＴＥＳ構築体を含有したフラクション（１６ｍｌ）は１ｍＭ酸化グルタチオンおよび０．１ｍＭ還元グルタチオンを含有した１００ｍＭ Tris-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０３８４ｍｌへの滴下により再生させ、一夜撹拌した。この溶液を５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５に対して透析し、その後同緩衝液で平衡化されたH1 Load SP26/10カラムに適用した。タンパク質を同緩衝液で０〜２ＭＮａＣｌの直線勾配により溶出させた。再生タンパク質を含有したフラクションは１％酢酸３×５ｌに対して透析し、凍結乾燥させた。融合タンパク質からＫＫＫＷＰＲヘキサペプチドを除去するために、凍結乾燥粉末を水に溶解させ、１mg/ml ５０ｍＭ Tris-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０に調整した。この溶液２ｍｌにエンドプロテイナーゼＡｒｇＣ（Boehringer Mannheim ）２０μｇを加え、溶液を３７℃で２時間インキュベートした。切断タンパク質は０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化されたNucleosil-Ｃ₈（１０×２５０ｍｍ）カラムを用いて逆相ＨＰＬＣにより出発物質から分離させた。そのタンパク質を０．１％トリフルオロ酢酸中２２．５〜４５％アセトニトリルの勾配で溶出させ、凍結乾燥して、−８０℃で貯蔵した。ＴＨＰ‐１細胞のＲＡＮＴＥＳ誘導走化性に関するアンタゴニスト活性は、Ｍｅｔ‐ＲＡＮＴＥＳタンパク質について記載されたように試験した。結果は図９に示されている。（ｅ）Ｇｌｎ‐ＲＡＮＴＥＳ（時々Ｑ‐ＲＡＮＴＥＳと称される）の作製および拮抗作用の証明上記操作（ｄ）を、Ｇｌｎ‐ＲＡＮＴＥＳを作製するために、必要な変更を加えて繰り返した。ＴＨＰ‐１細胞のＲＡＮＴＥＳ誘導走化性に関するＧｌｎ‐ＲＡＮＴＥＳのアンタゴニスト活性を、Ｍｅｔ‐ＲＡＮＴＥＳタンパク質について記載されたように試験した。結果は図１０に示されている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１１月１８日【補正内容】請求の範囲１．ＲＡＮＴＥＳと少くとも４０％のアミノ酸配列相同性を有し、かつ下記のうち１以上：（ａ）ＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ‐１αに応答したＴＨＰ‐１細胞の走化性、（ｂ）ＲＡＮＴＥＳの存在またはＭＩＰ‐１αの存在によるＴＨＰ‐１細胞におけるカルシウムイオンの移動、および（ｃ）ＴＨＰ‐１細胞のレセプターへのＲＡＮＴＥＳの結合に関して、ＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ‐１αのアンタゴニストとして機能するポリペプチドであって、１以上のＮ末端アミノ酸の存在によりＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ‐１αのアンタゴニストとして作用する、ポリペプチド。２．１以上のＮ末端アミノ酸が、配列ＳＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳのＮ末端に存在する、請求項１に記載のポリペプチド。３．前記１以上のＮ末端アミノ酸が、メチオニン、ロイシンまたはグルタミンを含むものであるか、またはそれらからなる、請求項１または２に記載のポリペプチド。４．メチオニン、ロイシンまたはグルタミンが前記ポリペプチドのＮ末端にある、請求項３に記載のポリペプチド。５．前記ポリペプチドが、下記配列：（ｉ）ＭＳＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳ（ii）ＬＳＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳ（iii）ＱＳＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳを有するか、あるいは上記配列のいずれかと実質上相同的である配列を有してなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。６．請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列。７．請求項６に記載の配列を含んでなる、ベクター。８．請求項７に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。９．ヒトまたは非ヒト動物における治療または診断に用いられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。１０．ＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ‐１αにより媒介される炎症を阻害または減少させることにより疾患を治療するために用いられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。１１．喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム／アテローム性動脈硬化症またはリウマチ様関節炎の治療に用いられる、請求項１０に記載のポリペプチド。１２．請求項８に記載の宿主細胞にポリペプチドを発現させることからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドの産生方法。１３．実質的に添付の例に記載されたようなポリペプチド。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/52 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＦＣ１２Ｎ 5/10 ＡＢＸＣ１２Ｐ 21/02 ＡＢＭ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者プラウドフート，アマンダエリザベスインズスイス国プラン−レ−ズアート、シュマン、ド、オール、14、グラクソ、インスティテュート、フォー、モレキュラー、バイオロジー、ソシエテ、アノニム内

Claims

【特許請求の範囲】１．ＲＡＮＴＥＳと実質的アミノ酸配列相同性を有し、かつ下記のうち１以上：（ａ）ＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ‐１αに応答したＴＨＰ‐１細胞の走化性、（ｂ）ＲＡＮＴＥＳの存在またはＭＩＰ‐１αの存在によるＴＨＰ‐１細胞におけるカルシウムイオンの移動、および（ｃ）ＴＨＰ‐１細胞のレセプターへのＲＡＮＴＥＳの結合に関して、ＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ‐１αのアンタゴニストとして機能するポリペプチド。２．前記ポリペプチドが、１以上のＮ末端アミノ酸の存在により、ＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ‐１αのアンタゴニストとして作用するものである、請求項１に記載のポリペプチド。３．前記１以上のＮ末端アミノ酸が、配列ＳＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳのＮ末端に存在する、請求項２に記載のポリペプチド。４．前記１以上のＮ末端アミノ酸が、メチオニン、ロイシンまたはグルタミンを含むものであるか、またはそれらからなる、請求項２または３に記載のポリペプチド。５．メチオニンまたはロイシンが前記ポリペプチドのＮ末端にある、請求項３に記載のポリペプチド。６．前記ポリペプチドが、下記配列：（ｉ）ＭＳＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳ、（ii）ＬＳＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳ、（iii）ＱＳＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳを有するか、または上記配列のいずれかと実質上相同的である配列を有してなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。７．請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列。８．請求項７に記載の配列を含んでなる、ベクター。９．請求項８に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。１０．ヒトまたは非ヒト動物における治療または診断に用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。１１．ＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ‐１αにより媒介される炎症を阻害または減少させることにより疾患を治療するために用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。１２．喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム／アテローム性動脈硬化症またはリウマチ様関節炎の治療に用いられる、請求項１１に記載のポリペプチド。１３．請求項９に記載の宿主細胞にポリペプチドを発現させることからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの産生方法。１４．実質的に添付の例に記載されたようなポリペプチド。