CZ290850B6 - Polypeptid, způsob jeho výroby, kódující DNA nebo RNA, vektor a buňka - Google Patents

Abstract

Modifikac polypeptidu RANTES vznik modifikovan² polypeptid, p sob c jako antagonista polypeptid RANTES nebo MIP-1.alfa.. T chto antagonist je mo no pou t p°i l b pro omezen z n t a pro studium vlastnost polypeptid RANTES nebo MIP-1.alfa..\

Description

Polypeptid, způsob jeho výroby, kódující DNA nebo RNA, vektor a buňka

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká derivátů proteinu RANTES a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Protein známý jako RANTES byl původně klonován v Krenského laboratoři Stanford University School of Medicine (Schall T. J. a další, J. Immunol. 141 1018 - 1025 (1988)). Termín RANTES je odvozen z názvu „Raised on activation, normál, T-cell derived and secreted“ (podtržena jsou odpovídající písmena). Jeho exprese je indukovatelná stimulací antigenem nebo aktivací mutagenem T-buněk. Protein je členem rodiny chemokinů (Schall T. J., Cyíokine 3 165-183 (1991); Oppenheim, J. J., a další, Ann. Rev. Immunol. 9 617-48 (1991)). Poprvé byl čistý protein identifikován v roce 1992 v destičkách (Kameyoshi, a další, J. Exp. Med. 176 587 - 592 (1992)). Tento protein je látka silně přitahující eosinofily, CD4⁺CD45RO⁺ T-buňky a také monocyty. Délka její sekvence je 68 aminokyselin.

Nedávno byl klonován receptor pro RANTES (Gao, J. L., a další, J. Exp. Med. ΥΊΊ 1421-7 (1993); Neote, K., a další, Cell 72 415 - 25 (1993)) a bylo ukázáno, že se váže na chemokiny úměmě pořadí MlP-lcc > RANTES.

Předkládaný vynález poskytuje polypeptidy, které jsou antagonisty RANTES a/nebo ΜΙΡ-Ια.

I když byla věnována velká pozornost cytokinům obecně a ve výše uvedených pracích zvláště RANTES a receptorům RANTES, dosud nebyly nikde popsáni výše uvedení antagonisté nebo možné použití takových antagonistů.

Podstata υλ nálezu

Podle předkládaného vynálezu se poskytuje polypeptid, který má alespoň 40% homologii sekvence aminokyselin s polypeptidem RANTES a který působí jako antagonista polypeptidů RANTES nebo ΜΙΡ-Ια v jednom nebo více z následujících hledisek:

(a) chemotaxe buněk THP-1 jako odpověď na RANTES a/nebo jako odpověď na ΜΙΡ-Ια;

(b) mobilizace iontů vápníku v buňkách THP-1 způsobená přítomností RANTES a/nebo přítomností ΜΙΡ-Ια; a (c) vazba RANTES na receptory buněk THP-1;

přičemž polypeptid působí jako antagonista polypeptidů RANTES nebo ΜΙΡ-Ια díky přítomnosti alespoň jedné N-koncové aminokyseliny zvolené ze skupiny methionin, leucin nebo glutamin.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou použitelné pro další charakterizaci peptidu RANTES a jeho účinků - například při studii chemotaxe indukované peptidem RANTES, mobilizace iontů vápníku a vazby receptorů. Jsou také použitelné pro charakterizaci vazby peptidu RANTES na jeho receptory. Dále jsou použitelné pro studia ΜΙΡ-Ια zodpovídajících důvodů.

-1 CZ 290850 B6

Navíc se předpokládá, že polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou použitelné při léčení různých onemocnění, jak bude diskutováno později.

Výhodný polypeptid podle předkládaného vynálezu působí jako antagonista RANTES a/nebo 5 ΜΙΡ-Ια kvůli přítomnosti jedné nebo více N-koncových aminokyselin (které nejsou přítomny v odpovídajících pozicích v peptidu RANTES a které proto mohou být pokládány jako dodatečné N-koncové aminokyseliny vzhledem k aminokyselinám, přítomným na N-konci peptidu RANTES). Těmito N-koncovými aminokyselinami jsou s výhodou přirozeně se vyskytující (L-) aminokyseliny, které mohou být zavedeny použitím technik rekombinantní DNA nebo techni10 kami fúze peptidů nebo pomocí chemické syntézy, zvolené ze skupiny methionin, leucin nebo glutamin.

Může jít pouze o jednu takovou dodatečnou aminokyselinu, a to například leucin nebo methionin. Takové polypeptidy je možno připravit pomocí vhodných technik, například použitím genového 15 klonování, chemické syntézy apod. V jednom z provedení předkládaného vynálezu se připravují z většího polypeptidu, který obsahuje požadovanou sekvenci a poté enzymatickým štěpením za vzniku polypeptidu s požadovanou sekvencí.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat více než jednu dodatečnou 20 N-koncovou aminokyselinu, mohou například obsahovat až 5, až 10 nebo až 20 dodatečných aminokyselin. V některých případech může být přítomno více než 20 N-koncových dodatečných aminokyselin.

Pro přípravu takových polypeptidů lze opět použít vhodných technik.

Nyní budou podrobněji diskutovány další aspekty předkládaného vynálezu.

Nyní bylo autory vynálezu zjištěno, že v expresním systému E. coli, který měl exprimovat peptid RANTES ve formě odpovídající maturnímu lidskému peptidu RANTES (tj. s odstraněnou 30 signální sekvencí), byl exprimován polypeptid, ve kterém byl přítomen dodatečný N-koncový methionin (ten nebyl odštěpen od zbývající sekvence endogenními proteázami E. coli). Bylo překvapivě zjištěno, že přítomnost této dodatečné aminokyseliny podstatně změnila vlastnosti polypeptidu vzhledem k vlastnostem RANTES. Methionylovaný polypeptid (zde označovaný jako methionylovaný RANTES nebo Met-RANTES) totiž při různých testech působí jako 35 antagonista RANTES a ΜΙΡ-Ια a nebylo zjištěno, že by měl nějakou podstatnou aktivitu agonisty.

Předpokládalo by se, že v mnoha případech, kde se v E. coli vyskytuje koncová methionylace, bude pouze malý nebo žádný rozdíl ve vlastnostech polypeptidu nebo dojde pouze ke snížení 40 úrovně jeho původní biologické aktivity. Zcela nečekané tedy bylo zjištění, že N-koncová methionylace v případě předkládaného vynálezu má ve skutečnosti antagonistickou aktivitu.

Aby bylo možno určit, zda je tento efekt omezen na přítomnost N-koncového methioninu, byl vyroben další polypeptid, ve kterém N-koncový methionin byl nahrazen N-koncovým leucinem. 45 Bylo opět zjištěno, že působí jako antagonista RANTES, stejně jako tomu bylo u dalšího polypeptidu, ve kterém byl N-koncový methionin nahrazen N-koncovým glutaminem.

Ve výhodném provedení má polypeptid podle předkládaného vynálezu sekvenci;

(i) MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR

QVCANPEKKW VREYINSLEM S (označovaný zde také jako „Met-RANTES“), (ii) LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR

QVCANPEKKW VREYINSLEM S (označovaný zde také jako „Leu-RANTES“),

-2CZ 290850 B6 nebo (iii) QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S (označovaný zde také jako „Gln-RANTES“), nebo má sekvenci, která je s některou z výše uvedených sekvencí v podstatě homologní. Polypeptid může být v glykosylované nebo neglykosylované formě.

Termín „v podstatě homologní zde má označovat sekvence aminokyselin, které mají s udanou sekvencí (v pořadí podle výhodnosti) sekvenční homologii 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % nebo 99 %. Tento termín může zahrnovat (ale není na ni omezen) sekvenci aminokyselin s 1 - 20, 1-10 nebo 1 - 5 delecemi, inzercemi nebo substitucemi jednotlivých aminokyselin, vzhledem k udané sekvenci - za předpokladu, že výsledný polypeptid působí jako antagonista RANTES nebo ΜΙΡ-Ια.

Polypeptid může být v podstatě v čisté formě. Může být izolován z přírodně se vyskytujících polypeptidů.

Je třeba uvést, že jak je v oboru dobře známo, určité aminokyseliny je možno nahradit jinými, aniž by došlo k podstatné změně ve vlastnosti polypeptidů. Takové možnosti jsou rovněž v rámci předkládaného vynálezu.

Je třeba také uvést, že je často možno provést delece nebo inzerce aminokyselin, které podstatně nezmění vlastnosti polypeptidů. Předkládaný vynález zahrnuje takové delece nebo inzerce (které například mohou být až do 10, 20 nebo 50 % z celkové délky sekvence antagonistů, uvedené výše). V rámci předkládaného vynálezu jsou rovněž fúzní proteiny, ve kterých jsou polypeptidy podle předkládaného vynálezu připojeny k jiným skupinám. To je možno provádět například pro účely značení nebo pro lékařské účely.

Nyní bylo autory vynálezu ukázáno, že polypeptid podle předkládaného vynálezu může působit jako antagonista účinků RANTES nebo ΜΙΡ-Ια při chemotaxi, mobilizaci vápníku a vazbě receptorů v buňkách THP-1 (monocytámí buněčná linie). Tyto buňky jsou dostupné v ATCC (Američan Tissue Culture Collection) a slouží jako dobrý modelový systém pro studium RANTES, protože se u nich vyskytuje odezva na vápník a chemotaktické účinky způsobené RANTES a ΜΙΡ-Ια, stejně jako jinými chemokiny, jako je MCP-1. Polypeptid může také působit v těchto buňkách jako antagonista RANTES nebo ΜΙΡ-Ια při chemotaxi, mobilizaci vápníku a vazbě na receptory. ΜΙΡ-Ια byl původně identifikován jako část makrofágové zánětlivé polypeptidové frakce, která se dělí na ΜΙΡ-Ια a -β (Obaru, K., a další, J. Biochem. 99:885-894 (1988), Sippel, P. F., a další, J. Immunol. 142:1582 - 1590 (1989)). Vykazuje chemotaktickou aktivitu vzhledem k T-buňkám a monocytům. Bylo rovněž ukázáno, že je mocným inhibitorem proliferace kmenových buněk.

V závislosti na těchto pozorováních se předpokládá, že polypeptidy podle vynálezu naleznou použití při blokování účinků RANTES a/nebo ΜΙΡ-Ια, a proto mohou nalézt použití v lékařství. Výhodným použitím polypeptidů podle předkládaného vynálezu je blokování účinků RANTES a/nebo ΜΙΡ-Ια při doplňování a/nebo aktivaci prekurzorů zánětlivých buněk. Předkládaný vynález může proto být použitelný při léčení onemocnění jako je astma, alergická rhinitida, atopická dermatitida, ateroma/ateroskleróza a revmatoidní artritida.

Navíc kvýše uvedeným polypeptidům pokrývá předkládaný vynález takové sekvence DNA, které tyto polypeptidy kódují (které mohou být izolovány nebo jejich rekombinantní formy), vektory obsahující takové sekvence a hostitelské buňky obsahující takové vektory, které jsou schopné exprese polypeptidů podle předkládaného vynálezu.

-3 CZ 290850 B6

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být získávány expresí z prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk s použitím vhodné kódující sekvence DNA. Vhodné metody se popisují v Sambrook a další, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, USA. Mohou být také vyrobeny kovalentní modifikací RANTES. To může být například provedeno methionylací RANTES na jehoN-konci.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje sekvenci nukleotidů kódující sekvence RANTES, klonované v E. coli, spolu se sekvencí aminokyselin, kterou tato nukleotidová sekvence kóduje.

Obr. 2 ukazuje mapu plazmidu pCBA-M.

Obr. 3 ukazuje mapu plazmidu pT7-7.

Obr. 4 ukazuje, že chemotaxi u buněk THP-1 mohou indukovat různé chemokiny.

Obr. 5 ukazuje, že Met-RANTES může inhibovat chemotaxi u THP-1 buněk, indukovanou ΜΙΡ-Ια a RANTES.

Obr. 6 ukazuje možnost indukce přítoku vápníku do THP-1 buněk různými chemokiny.

Obr. 7 ukazuje inhibici odezvy vápníku v buňkách THP-1 indukované RANTES polypeptidem Met-RANTES.

Obr. 8 ukazuje kompetitivní vazbu Met-RANTES a RANTES na receptory CCKR1.

Obr. 9 ukazuje antagonistický účinek Leu-RANTES na chemotaxi, indukovanou RANTES.

Obr. 10 ukazuje antagonistický účinek Gln-RANTES na chemotaxi, indukovanou RANTES.

Příklady provedení vynálezu (a) Klonování kódující sekvence lidského RANTES pomocí PCR

Lidský RANTES by) klonován z knihovny lidské kostní dřeně XGTl 1 cDNA (Clontech) pomocí PCR. Stručně, inzerty celkové cDNA v knihovně kostní dřeně byly nejprve amplifikovány s použitím primerů LGTl 1, které sousedily s klonovacím místem EcoRI v objemu reakce 100 μΐ, obsahující 2 μΐ zásobního fága (10⁶ pfu), 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs, 2,5 jednotek Amplitaq™ (Perkin Elmer-Cetus) a 1 μΜ každého z primerů (XGTl 1PCR-1 (dopředný primer) 5'GATTGGTGGCGACGACTCCT a XGTl 1PCR-2 (reverzní primer) 5'CAACTGGTAATGGTAGCGAC) během třiceti cyklů, vždy 95 °C dvě minuty, 55 °C 2 min a 72 °C 5 min v zařízení Techne PHC-2 thermal cycler. Jedna desetina reakční směsi byla potom vystavena druhé amplifikaci PCR ve 100 μΐ, nyní obsahujícím 1 μΜ každého ze specifických primerů (RANTES-1 5'CCATGAAGGTGTCCGCGGCAC ve správném smyslu a RANTES-2 5'CCTAGCTCATCTCCAAAGAG v opačném smyslu), založených na publikované sekvenci RANTES (Schall T. J. a další, J. Immunol. 141 1018- 1025 (1988) v průběhu třiceti cyklů vždy 95 °C 2 min, 55 °C 2 min a 72 °C 2 min. PCR produkty byly vizualizovány na 3% agarózových gelech Nu-Sieve (FMC), obarvených 0,5 pg/ml ethidiumbromidu a pruhy, které se pohybovaly podle předpovězené velikosti RANTES cDNA (278 bp) byly čištěny na gelu standardními metodami (Sambrook J. a další, (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, USA). DNA vyčištěná na gelu byla potom zatupena

-4CZ 290850 B6 postupným Štěpením T4 polynukleotidkinázou (New England Biolabs) podle předpisu výrobce v celkovém objemu 50 μΐ po dobu jedné hodiny při 37 ^CC. Potom bylo přidáno 2,5 μΐ 2,5 mM dNTP s a 1 μΐ Klenowova fragmentu DNA polymerázy I (New England Biolabs) a inkubace pokračovala dalších 30 min při 37 °C. Reakční směs byla potom inaktivována teplem 30 min při 70 °C a potom jednou extrahována fenol/chloroformem (1:1 obj.), nasyceným Tris-HCl pH 8,0. DNA byla vysrážena přídavkem 10 μΐ 3 M acetátu sodného pH 5,5, 1 μΐ glykogenu (20 mg/ml) (Boehringer) a 250 μΐ ethanolu při - 20 °C. DNA byla oddělena centrifugací při 10 000 x g po dobu 20 min při 4 °C a promyta 70% ethanolem. Konečný centrifugát byl resuspendován ve sterilní vodě na koncentraci 10 ng/μΐ.

PCR produkt se zatupenými konci (10 ng) byl ligován do 50 ng plazmidu pBluescript II SK (Stratagene), který byl štěpen EcoRV a alkalickou fosfatázou v objemu 20 μΐ s použitím 2 μΐ T4 DNA ligázy (400 000 jednotek/ml) (New England Biolabs) alespoň 16 hod při 15 °C. Produkty ligace byly zředěny na 100 μΐ 1 x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0/1 mM EDTA) a extrahovány fenol/chloroformem, jak je popsáno výše. Ligační produkty byly vysráženy přídavkem 10 μΐ 3 M acetátu sodného pH 5,5, 1 μΐ glykogenu (20 mg ml) (Boehringer) a 250 μΐ ethanolu při -70 °C po dobu 15 min. DNA byla oddělena centrifugací jak je popsáno výše a resuspendována v 10 μΐ sterilní vody. 5 μΐ resuspendovaných produktů ligace bylo potom vneseno elektroporací do elektrokompetentních buněk E. coli kmen XL-1 blue (40 ul) s použitím zařízení Bio Rad Gene Pulser podle doporučení výrobce. Po elektroporací bylo přidáno 1 ml média LB a buňky rostly 1 hod při 37 °C. Potom byly vysety alikvoty 100 μΐ kultivačního média na plotny LB s obsahem 100 pg/ml ampicilinu a ponechány růst 16 hod při 37 °C. Jednotlivé kolonie bakterií byly potom odpíchnuty do 5 ml média LB s obsahem 100 pg/ml ampicilinu a ponechány růst přes noc při 37 °C. Potom byly připraveny preparáty DNA (miniprepy) vždy ze tří ml každé kultury s použitím systému Wizard™ mini-prep DNA purification systém (Promega) podle doporučení výrobce. Alikvoty 3 μΐ DNA z miniprepů byly potom štěpeny restrikčními enzymy HindlII a £coRI (oba firmy New England Biolabs) podle návodu výrobce v reakčním objemu 15 μΐ. Reakční produkty potom byly analyzovány na 1% agarózových gelech s obsahem 0,5 pg/ml ethidiumbromidu. Preparáty DNA, které poskytly velikost inzertu přibližně 280 bp byly potom analyzovány sekvenováním s použitím příměrů T3 a T7 a kitu Sequenase (USB) podle návodu výrobce.

Klonovací vektor pBluescript II SK byl připraven následujícím způsobem: 20 pg plazmidu, čištěného v gradientu CsCl bylo štěpeno v reakčním objemu 100 μΐ po dobu 2 hodin při 37 °C 200 jednotkami EcoRV (New England Biolabs) podle doporučení výrobce. Po dvou hodinách byl rozštěpený vektor vystaven působení 10 μΐ telecí žaludeční alkalické fosfatázy (20 jednotek/ml) (Boehringer) dalších 30 min při 37 °C. Tato reakční směs byla inaktivována zahříváním 15 min při 68 °C a potom jednou extrahována fenol/chloroformem (1 : 1 obj.), nasyceným Tris-HCl pH 8,0. Plazmidová DNA byla vysrážena přídavkem 10 μΐ 3M acetátu sodného pH 5,5 a 250 μΐ ethanolu při - 20 °C. DNA byla oddělena centrifugace při 10 000 x g 20 min při 4 °C a promyta 70% ethanolem. Konečný centrifugát byl resuspendován ve sterilní vodě v koncentraci 50 ng/ml.

Sekvenování odhalilo, že všechny získané klony byly identické s publikovanou sekvencí, s výjimkou jediné změny báze v nukleotidu 22 v sekvenci PCR, která měla za následek změnu Arg na Pro v navrhované signální sekvenci propeptidu RANTES.

To je ilustrováno na obrázku 1, který ukazuje klonovanou kódující sekvenci DNA spolu s odpovídající sekvencí aminokyselin.

(b) Příprava expresního vektoru methionylovaného RANTES (antagonista polypeptidu RANTES)

Pomocí PCR byl získán konstrukt, obsahující gen prostředků pro RANTES s použitím primerů

5'TTAATTAATTAAATCGATTCATATG.TCC.CCA.TAT.TCC.TCG.GAC.AC-3' kde dva podtržené úseky jsou restrikČní místa Clal aNdel (místo Ndel zahrnuje část iniciačního methioninového kodonu) a '-TACTG AT AT AAATCTAG ACTAGCTCATCTCCAAAGAGTTG-3'

Tento fragment byl potom štěpen Clal na 5'konci a Xbal na 3'konci. Plazmid pCba-M, ukázaný na obr. 2, byl potom štěpen Xbal/Sall. Velký fragment byl potom štěpen Sall a Clal. Potom byla provedena trojí ligace s použitím malého fragmentu Sall/Xbal z prvního štěpení, Sall/Clal fragmentu z druhého štěpení a fragmentu PCR za vytvořené konstruktu podobného pCba-M, kde gen mTNF byl nahrazen genem pro sekrenovanou formu lidského RANTES, počínaje iniciačním methioninem (sekrenovaná forma lidského RANTES nezahrnuje prvních 23 aminokyselin sekvence, ukázané na obr. 1. Zahrnuje zbývající aminokyseliny ukázané na obr. 1 a začíná aminokyselinami SPY...).

Tento fragment Ndel/Sall byl pak z tohoto vektoru odstraněn a vložen do t7 expresního plazmidu pT7-7, ukázaného na obr. 3. Tento fragment obsahuje požadovaný gen + 600 bp jiného materiálu, ale pozdější experimenty (zde neuvedené) ukazují, že odstranění tohoto dalšího materiálu (sekvencí vektoru) nemělo žádný vliv na úroveň exprese.

Expresní vektor typu pT7 se diskutuje v Studier FW, Rosenberg AH a další, Meth Enzymol, 185, 60-89, (1990). Konstrukt byl potom transformován do kmene E. coli BL21 (DE3) (F-ompT, hsd Sb (Rb , m_B~) obsahujícího gen LysS na plazmidu pACYC184 (Chang a Cohen, J. Bact, 134, 1141, 1978). Expresní vektor vyžaduje pro indukci T7 polymerázu, aby se uskutečnila exprese. T7 polymeráza je v buňkách indukována přídavkem IPTG (izopropylthiogalaktosid) do média.

(c) Ukázka, že Met-RANTES skutečně ukazuje antagonistické účinky (i) Test chemotaxe

Chemotaxe in vitro byla prováděna s použitím komůrek s 96 jamkami (Neuro Probe MB series, Cabin John, MD 20818, USA) podle doporučení výrobce. Chemotaxe indukovaná CC chemokiny, RANTES, ΜΙΡ-Ια a MCP-1 byla testována s použitím lidské monocytámí buněčné linie THP-1. V každé jamce horní komůrky bylo inkubováno 4 x 10⁵ THP-1 buněk v 200 μΐ média RPMI 1640 (Gibco) s obsahem 2 % inaktivovaného fetálního telecího séra. Do dolní komůrky bylo umístěno 370 μΐ média RPMI 1640 (bez FCS) obsahující chemoatraktant (tj. chemokin). Pro inhibici chemotaxe byla koncentrace chemoatraktantu udržována na konstantní úrovni 5 x EC50, již dříve určené pro každý chemokin, a v různých koncentracích byl přidáván Met-RANTES. Komůrky byly inkubovány jednu hodinu při 37 °C v atmosféře 5 % CÓ2. Z horní komůrky bylo odstraněno médium a nahrazeno PBS obsahujícím 20 mM EDTA a komůrky byly inkubovány 30 min při 4 °C. Z horních jamek bylo odstraněno PBS a jamky byly vytřeny do sucha. Jednotka byla 10 min při 1800 min^-1 centrifugována, aby byly sklizeny buňky ve spodní komůrce a supematant byl odsát. Buňky ve spodní komůrce byly měřeny s použitím kitu Cell Titer 98 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, USA), který sleduje přeměnu tetrazolinové modři na její formazanový produkt. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ 10% roztoku barviva v médiu RPMI 1640 a komůrka byla inkubována přes noc při 37 °C v atmosféře 5 % CO2. Do každé jamky bylo potom přidáno 100 μΐ solubilizačního roztoku a absorbance byla

-6CZ 290850 B6 odečítána po čtyřech hodinách při 590 nm na zařízení Thermomax microtitre plate reader (Molecular Devices, Palo Alto, CA).

Výsledky jsou ukázány na obrázcích 4 a 5.

(ii) Tok vápníku

Tok vápníku indukovaný chemokiny RANTES a ΜΙΡ-Ια byl měřen podle Tsien R. Y., Pozzan T., a Rink T. J., (1982) „Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new intracellularly trapped fluorescent indicator“, J. Cell Biology 94, ale s použitím látky Fura-2/AM (Fluka) namísto Quin 2 jako fluorescenčního indikátoru. Buňky THP-1 byly sklízeny v koncentraci menší než 10⁶/ml, aby bylo zajištěno, že jsou v exponenciální fázi. Buňky byly resuspendovány v Krebs-Ringerově roztoku obsahujícím 0,2 % Fura-2/AM a 1 mg/ml PSA v koncentraci 10⁶/ml a inkubovány při 37 °C 30 minut v nepřítomnosti světla. Buňky byly sklizeny centrifugací, resuspendovány v Krebs-Ringerově roztoku a uchovávány na ledu. Před použitím byly lml alikvoty inkubovány dvě minuty při 37 °C. Za míchání byly k suspenzi buněk přidávány chemokiny. Pro studium inhibice polypeptidem Met-RANTES byly přidány k buňkám alikvoty antagonistů v různých koncentracích v průběhu dvou minut inkubace při 37 °C. Výsledky jsou ukázány na obrázcích 6 a 7.

(iii) Test vazby na receptory

Kompetitivní test byl prováděn na 96 jamkových destičkách multiscreen filter-plates (Millipore, MADV N6500), na které bylo předem působeno 2 hodiny pufrem 50 mM HEPES pH 7,2, obsahujícím 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂ a 0,5 % BSA (vazebný pufr). Test byl prováděn buď s buňkami THP-1 nebo buňkami COS, exprimujícími rekombinantní receptor CC-CKR1 (Neote, K., DiGregorio, Mak, J. Y., Horuk, R., a Schall, T. J., (1993) Molecular cloning, functional expression and signalling characteristics of a C-C chemokine receptor, Cell 72 415 - 425; Gao, J. L., a další, J. Exp. Med. 177 1421-7 (1993)). Každá buňka obsahovala 10⁵ buněk v objemu 150 μΐ vazebného pufru obsahujícího 0,4 nM [I¹²⁵]Mip-la nebo 0,4 nM [I^I2’]RANTES (New England Nuclear, NEX 277) a různé koncentrace soutěžícího MetRANTES. Testy byly prováděny na triplikátech. Po 90 min inkubace při 4 °C byly buňky promyty 4 x 200 μΐ ledového vazebného pufru obsahujícího 0,5 M NaCl, který byl odstraněn odsátím. Filtry byly usušeny, bylo přidáno 3,5 ml scintilační kapaliny Ultima Gold Scintillation fluid (Packard) a měření bylo prováděno na přístroji Beckamn LS5000 counter. Výsledky jsou ukázány na obr. 8.

(d) Příprava Leu-RANTES (zde označovaného také jako L-RANTES) a demonstrace antagonismu

Expresní vektor L-RANTES byl připraven ve dvou krocích. Nejdřív bylo použito PCR pro štěpeni genu pro lidský RANTES v prvním kodon a vložení jedinečných štěpících míst na oba konce genu. Tento PCR produkt byl klonován do expresního vektoru pET23d (Novagen), založeného na T7 E. coli, s použitím štěpícího místa Sací, vloženého na 5'konci genu a místa BsmAl, navrženého pro získání překrývajících se úseků kompatibilních s Hindlll na 3'konci genu. Geny, kódující N-koncové varianty lidského RANTES byly pak vytvořeny vložením oligonukleotidů kódujících tyto varianty bezprostředně za 5'konec kódující sekvence RANTES. Pro tento účel byl klon RANTES vložený v pET23d štěpen Sací, potom následovalo štěpení T4 DNA polymerázou pro odstranění 3'překrývajících se konců zanechaných Sací a poté druhé štěpení enzymem Ncol. Oligonukleotidy kódující peptidovou sekvenci MKKKWPRLSPYSSDTTP byly potom klonovány do štěpeného vektoru. Exprese konstruktu pET23d/L-RANTES probíhala tak, jak je popsáno pro konstrukt pT7-7.

pET23d/RANTES Ncol pET23d/RANTES Sacl/T4

-7CZ 290850 B6

5' C C TGC TTT 3'

3' GGTAC G ACG AAA 5'

Oligonukleotidy L-RANTES

5' CATGAAAAAAAAATGGCCAAGGCTGTCCCCGTACTCCTCC₃- TTTTTTTTTACCGGTTCCGACAGGGGCATGAGGAGG-GACACCACCCCGTG

-CTGTGGTGGGGCAC

Konstrukt pET23d/L-RANTES je jeden z řady expresních vektorů, kterých může být použito pro vytváření RANTES s různými aminokyselinami v poloze 1. Tyto T7 expresní vektory kódují io proteiny s N-terminálními sekvencemi MKKKWPR-X-RANTES. X může být například jakákoliv z aminokyselin L, I, Q, E nebo G. Štěpení endo-Arg-C poskytne jiné proteiny X-RANTES.

-8CZ 290850 B6

+2 MKK K W P R L S P YSS D T T

CATGAAAAAA AAATGGCCAA GGCTGTCCCC GTACTCCTCC GACACCACCC

GTACTTTTTT TTTACCGGTT CCGACAGGGG CATGAGGAGG CTGTGGTGGG +2PCCF AYI ARPL PRA HIK

CGTGCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TGCCCCGTGC CCACATCAAG

GCACGACGAA ACGGATGTAA CGGGCGGGTG ACGGGGCACG GGTGTAGTTC + 2EYFY TSG KCS NPAV V F V

1O1GAGTATTTCT ACACCAGTGG CAAGTGCTCC AACCCAGCAG TCGTCTTTGT CTCATAAAGA TGTGGTCACC GTTCACGAGG TTGGGTCGTC AGCAGAAACA + 2 TRK NRQV CAN PEK KWV

151CACCCGAAAG AACCGCCAAG TGTGTGCCAA CCCAGAGAAG AAATGGGTTC GTGGGCTTTC TTGGCGGTTC ACACACGGTT GGGTCTCTTC TTTACCCAAG + 2REYI NSL Ε M S *

HINDIII NOTI XBOI

201GGGAGTACAT CNACTCTTTG GAGATGAGCT AAAGCTTGCG GCCGCACTCG CCCTCATGTA GTTGAGAAAC CTCTACTCGA TTTCGAACGC CGGCGTGAGC

-9CZ 290850 B6

Čištění Leu-RANTES bylo prováděno následujícím způsobem:

g buněčné pasty E. coli bylo suspendováno v 15 ml 50 mM pufru Tris-HCl pH 7,6, obsahujícího 1 mM dithiothreitolu, 5 mM benzamidinu-HCl, 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu a DNázu (0,02 mg/ml). Buňky byly rozbity třemi průchody homogenizátorem French Pressure cell, přičemž po každé pasáži byla prováděna sonikace na ledu po dobu 1 min. Výsledný roztok byl centrifugo ván 60 min při 10 000 x g. Centrifugát byl rozpuštěn ve 2 mí 10 mM pufru Tris-HCl pH 8,0, obsahujícího 6 M guanidin-HCl a 1 mM dithiothreitolu. Roztok byl zahříván 60 min při 60 °C pro dosažení monomerizace, ochlazen na pokojovou teplotu a filtrován na gelové koloně Superdex-200 16/60, ekvilibrované ve stejném pufru. Frakce obsahující rekombinantní konstrukt RANTES (16 ml) byly renaturovány přikapáváním 384 ml 100 mM pufru Tris-HCl pH 8,0, obsahujícího 1 mM oxidovaného glutathionu a 0,1 mM redukovaného glutathionu a mícháním přes noc. Tento roztok byl dialyzován proti 50 mM pufru s acetátem sodným pH 4,5 a potom nanesen na kolonu HILoad SP26/10, ekvilibrovanou ve stejném pufru. Proteiny byly eluovány lineárním gradientem 0 - 2 M NaCl ve stejném pufru. Frakce, obsahující renaturovaný protein, byly dialyzovány proti 3x51 1% kyseliny octové a lyofilizovány.

Pro odstranění hexapeptidu KKKWPR z fúzovaného proteinu byl lyofilizovaný prášek rozpuštěn ve vodě a koncentrace nastavena na 1 mg/ml 50 mM Tris-HCl pufrem pH 8,0. Ke 2 ml tohoto roztoku bylo přidáno 20 pg Endoproteinázy Arg C (Boehringer Mannheim) a roztok byl inkubován 2 hod při 37 °C. Rozštěpený protein byl oddělen od výchozího materiálu HPLC na reverzní fázi s použitím kolony Nucleosil-C₈ (10 x250 mm), ekvilibrované v 0,1% kyselině trifluoroctové. Proteiny byly eluovány gradientem 22,5-45 % acetonitrilu v 0,1% kyselině trifluoroctové, lyofilizovány a skladovány při - 80 °C.

Antagonistické účinky na chemotaxi buněk THP-1, indukovanou RANTES byly testovány stejným způsobem jak bylo popsáno pro protein Met-RANTES.

Výsledky jsou ukázány na obr. 9.

(e) Příprava Gln-RANTES (někdy označovaného jako Q-RANTES) a demonstrace antagonismu

Pro přípravu Gln-RANTES byl použit postup, popsaný v odst. (d).

Antagonistické účinky Gln-RANTES na chemotaxi buněk THP-1, indukovanou RANTES, byly testovány stejným způsobem, jak je popsáno pro protein Met-RANTES. Výsledky jsou ukázány na obr. 10.

Claims (10)

1. Polypeptid, který má alespoň 40% homologii sekvence aminokyselin s polypeptidem RANTES a který působí jako antagonista polypeptidů RANTES nebo ΜΙΡ-Ια v jednom nebo více z následujících hledisek:

(a) chemotaxe buněk THP-1 jako odpověď na RANTES a/nebo jako odpověď na ΜΙΡ-Ια;

(b) mobilizace iontů vápníku v buňkách THP-1 způsobená přítomností RANTES a/nebo přítomností ΜΙΡ-Ια; a

-10CZ 290850 B6 (c) vazba RANTS na receptory buněk THP-1;

přičemž polypeptid působí jako antagonista polypeptidů RANTES nebo MIP-lcc díky přítomnosti alespoň jedné N-koncové aminokyseliny zvolené ze skupiny methionin, leucin nebo glutamin.

2. Polypeptid podle nároku 1, kde uvedená jedna nebo více N-koncové aminokyseliny jsou N-koncové k sekvenci SPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S.

3. Polypeptid podle některého z předcházejících nároků, který má sekvenci:

(i) MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, označovaný zde také jako „Met-RANTES“, (ii) LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, označovaný zde také jako „Leu-RANTES“, (iii) QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, označovaný zde také jako „Gln-RANTES“, nebo má sekvenci, která je s jakoukoliv z vý še uvedených sekvencí homologní.

4. Sekvence DNA nebo RNA, kódující polypeptid podle některého z předcházejících nároků.

5. Vektor obsahující sekvenci podle nároku 4.

6. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 5.

7. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 3 pro použití při léčení nebo diagnóze onemocnění lidí nebo zvířat.

8. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 3 pro použití při léčení onemocnění inhibicí nebo omezením zánětu, zprostředkovaného polypeptidy RANTES nebo ΜΙΡ-Ια.

9. Polypeptid podle nároku 8 pro použití při léčení astmatu, alergické rhinitidy, atopické dermatitidy, ateroma/aterosklerózy nebo revmatoidní artritidy.

10. Způsob výroby polypeptidů podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že zahrnuje vyvolání exprese uvedeného polypeptidů u hostitelské buňky podle nároku 6.