PL182786B1

PL182786B1 - Polipeptyd, sekwencja kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza, środek farmaceutyczny, oraz sposób otrzymywania polipeptydu

Info

Publication number: PL182786B1
Application number: PL95320565A
Authority: PL
Inventors: Timothy N.C. Wells; Amanda E.I. Proudfoot
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1994-12-08
Filing date: 1995-12-07
Publication date: 2002-02-28
Also published as: US6159711A; FI972433A0; MX9703889A; AU688641B2; NO972620D0; HUT77075A; CN1168697A; NO972620L; NZ296570A; CZ171997A3; WO1996017935A2; JPH10510151A; FI972433A; CA2207036A1; HU221089B1; BR9509890A; CZ290850B6; AU4120896A; EP0796330A1; US6555105B1

Abstract

1 Polipeptyd posiadajacy przynajmniej 40% homologie z sekwencja aminokwasowa bialka RANTES 1 dzialajacy jako antagonista bialka RANTES lub bialka MIP-1a pod wzgledem jednej lub wiecej sposród nastepujacych aktywnosci (a) chemotaksja komórek THP-1 w odpowiedzi na oddzialywanie bialka RANTES lub bialka MIP-1a, (b) mobilizacja jonów wapnia w komórkach THP-1 w wyniku obecnosci bialka RANTES lub w wyniku obecnosci bialka MIP-1a; oraz (c) wiazanie bialka RANTES z receptorami komórek THP-1; przy czym polipeptyd ten dziala jako antagonista bialka RANTES lub bialka MIP-1a w wyniku obecnosci jednego, lub wiekszej ilosci N-koncowych aminokwasów 9 Sekwencja kwasu nukleinowego kodujaca polipeptyd bedacy antagonista bialka RANTES lub bialka MIP-1 a posia- dajacy przynajmniej 40% homologie sekwencji aminokwasowej z bialkiem RANTES, przy czym ten polipeptyd zawiera je- den, lub wiecej dodatkowych N-koncowych aminokwasów 12 Wektor zawierajacy sekwencje kwasu nukleinowego kodujaca polipeptyd bedacy antagonista bialka RANTES lub bialka MIP-1a posiadajacy przynajmniej 40% homologie sekwencji aminokwasowej z bialkiem RANTES, przy czym ten polipeptyd zawiera jeden, lub wiecej dodatkowych N-koncowych aminokwasów 15 Komórka gospodarza zawierajaca wektor zawierajacy sekwencje kwasu nukleinowego kodujaca polipeptyd bedacy antagonista bialka RANTES lub bialka MIP-1a posiadajacy przynajmniej 40% homologie sekwencji aminokwasowej z bialkiem RANTES, przy czym ten polipeptyd zawiera jeden, lub wiecej dodatkowych N-koncowych aminokwasów 18 Srodek farmaceutyczny do leczenia schorzenia obejmujacego stan zapalny, w którym posredniczy bialko RANTES lub bialko MIP-1 a, takiego jak astma, alergiczny niezyt nosa, atopowe zapalenie skóry, ognisko miazdzycowe/miazdzyca te- tnic lub reumatoidalne zapalenie stawów, zawierajacy czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, znamienny tym, ze jako czynnik aktywny zawiera polipeptyd bedacy antagonista bialka RANTES lub bialka MIP- 1 a posiadajacy przynaj- mniej 40% homologie sekwencji aminokwasowej z bialkiem RANTES, przy czym ten polipeptyd zawiera jeden, lub wiecej dodatkowych N-koncowych aminokwasów 22 Sposób wedlug zastrz 21, znamienny tym, ze sekwencja kwasu nukleinowego jest sekwencja RNA albo DNA PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd będący antagonistą białka RANTES lub białka MIP-la_t posiadający przynajmniej 40% homologię sekwencji aminokwasowej z białkiem RANTES, przy czym ten polipeptyd zawiera jeden, lub więcej dodatkowych N-końcowych aminokwasów.

Korzystnie sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku charakteryzuje się tym, że koduje polipeptyd wybrany spośród:

(i) Met-RANTES: MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo (n) Leu-RANTES: LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo (iii) Gln-RANTES: QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFYTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo sekwencję, która jest zasadniczo homologiczna z dowolną z powyższych sekwencji.

182 786

Korzystnie sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku jest sekwencją RNA albo

DNA:

Przedmiotem wynalazku jest także wektor zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd będący antagonistą białka RANTES lub białka ΜΙΡ-la posiadający przynajmniej 40% homologię sekwencji aminokwasowej z białkiem RANTES, przy czym ten pohpeptyd zawiera jeden, lub więcej dodatkowych N-końcowych aminokwasów.

Wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd wybrany spośród:

(i) Met-RANTES: MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW YREYINSLEM S, albo (ii) Leu-RANTES: LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW YREYINSLEM S, albo (iii) Gln-RANTES: QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW YREYINSLEM S, albo sekwencję, która jest zasadniczo homologiczna z dowolną z powyższych sekwencji.

Korzystnie, w wektorze według wynalazku sekwencja kwasu nukleinowego jest sekwencją RNA albo DNA.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza zawierająca wektor zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd będący antagonistą białka RANTES lub białka MlP-laposiadający przynajmniej 40% homologię sekwencji aminokwasowej z białkiem RANTES, przy czym ten polipeptyd zawiera jeden, lub więcej dodatkowych N-końcowych aminokwasów.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd wybrany spośród:

(i) Met-RANTES: MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVYFVTRKNR QVCANPEKKW YREYINSLEM S, albo (ii) Leu-RANTES: LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW YREYINSLEM S, albo (in) Gln-RANTES: QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW YREYINSLEM S, albo sekwencję, która jest zasadniczo homologiczna z dowolną z powyższych sekwencji. Korzystnie sekwencja kwasu nukleinowego jest sekwencją RNA albo DNA.

Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny do leczenia schorzenia obejmującego stan zapalny, w którym pośredniczy białko RANTES lub białko ΜΙΡ-lo, takiego jak astma, alergiczny nieżyt nosa, atopowe zapalenie skóry, ognisko miażdżycowe/miażdżyca tętnic lub reumatoidalne zapalenie stawów, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera polipeptyd będący antagonistąbiałka RANTES lub białko MIP- laposiadający przynajmniej 40% homologię sekwencji aminokwasowej z białkiem RANTES, przy czym ten polipeptyd zawiera jeden, lub więcej dodatkowych N-końcowych aminokwasów.

Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera polipeptyd wybrany spośród:

(i) Met-RANTES: MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW YREYINSLEM S, albo (ii) Leu-RANTES: LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW YREYINSLEM S, albo (iii) Gln-RANTES: QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVYFVTRKNR QVCANPEKKW YREYINSLEM S, albo polipeptyd, który jest zasadniczo homologiczny z dowolnym z powyższych polipeptydów.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania polipeptydu działającego jako antagonista białka RANTES lub białka ΜΙΡ-la obejmujący doprowadzanie do ekspresji wspomnianego polipeptydu przez komórkę gospodarza, charakteryzujący się tym, że do ekspresji sto182 786 suje się komórkę gospodarza transformowaną wektorem zawierającym sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd będący antagostą białka RANTES lub białka MIP- la posiadający przynajmniej 40% homologię sekwencji aminokwasowej z białkiem RANTES, przy czym ten polipeptyd zawiera jeden, lub więcej dodatkowych N-końcowych aminokwasów.

Korzystnie, w sposobie tym, sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd wybrany spośród:

(i) Met-RANTES: MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QYCANPEKKW YREYINSLEM S, albo (ii) Leu-RANTES: LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AYYFYTRKNR QVCANPEKKW YREYINSLEM S, albo (iii) Gln-RANTES: QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW YREYINSLEM S, albo sekwencję, która jest zasadniczo homologiczna z dowolną z powyższych sekwencji.

Korzystnie, sekwencja kwasu nukleinowego jest sekwencją RNA albo DNA.

Wynalazek zostanie opisany jedynie przez przykład, z odniesieniem się do towarzyszących mu rysunków, przedstawiających co następuje.

Figura 1 pokazuje sekwencję nukleotydów sekwencji kodującej białko RANTES, klonowanej w E. coli, razem z sekwencją aminokwasów kodowanąprzez wspomnianą sekwencję nukleotydów.

Figura 2 pokazuje mapę plazmidu pCBA-M.

Figura 3 pokazuje mapę plazmidu pT7-7.

Figura 4 pokazuje, że różne chemokiny mogą indukować chemotaksję komórek THP-1.

Figura 5 pokazuje, że białko Met-RANTES może hamować indukowaną przez MIP-la białko RANTES chemotaksję komórek THP-1.

Figura 6 pokazuje, że różne chemokiny mogą indukować przepływ wapnia w komórkach THP-1.

Figura 7 pokazuje, że białko Met-RANTES może hamować reakcję wapnia indukowaną przez białko RANTES w komórkach THP-1.

Figura 8 pokazuje wiązanie się białka Met-RANTES z receptorami CCKR1, konkurencyjne w stosunku do wiązania się białka RANTES.

Figura 9 pokazuje, że białko Leu-RANTES może działać antagonistycznie w stosunku do chemotaksji indukowanej białkiem RANTES.

Figura 10 pokazuje, że białko Gln-RANTES może działać antogonistycznie w stosunku chemotaksji indukowanej białkiem RANTES.

Przykład.

(a) Klonowanie sekwencji kodującej ludzkie białko RANTES metodą PCR.

Ludzkie białko RANTES klonowano metodąPCR z wykorzystaniem biblioteki cDNA ludzkiego szpiku kostnegoZGTl 1 (Clontech). Mówiąc krótko, wpierw całość insertu cDNA w bibliotece szpiku kostnego powielano przy użyciu starterów ZGTll, które flankowały miejsce klonowania EcoRI, w mieszaninie reakcyjnej o objętości 100 μΐ, zawierającej 2 μΐ podstawowej hodowli faga [10⁶ jednostek łysinkowych (pfus)], 10 mM Tris-HCl pH 8,3,50 mM KC1,1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTP-ów, 2,5 jednostki AM-PLITAQ™ (Perkin Elmer-Cetus) i 1 μΜ każdego ze starterów [kGTIIPCR-l (starter „do przodu”) 5'GATTGGTGGCGACGACTCCT i XGT11PCR-2 (starter „w przeciwnym kierunku”) 5'CAACTGGTAATGGTAGCGAC], w 30 cyklach (95°C, 2 min; 55°C, 2 min i 72°C, 5 min) w termobloku Techne PHC-2. Następnie, jedną dziesiątą mieszaniny reakcyjnej poddano w dwu rundach PCR, w 100 μΐ mieszaniny reakcyjnej zawierającej w tym przypadku 1 μΜ każdego z określonych starterów (RANTES-1 5'CCATGAAGGTCTCCGCGGCAC sensowny i RANTES-2 5'CCTAGCTCATCTCCAAAGAG antysensowny) w oparciu o opublikowaną sekwencję RANTES [T.J. Schall i in., J. Immunol., 141 1018-1025 (1988)], w 30 cyklach 95°C, 2 min; 55°C, 2 min i 72°C, 2 min. Produkty PCR wizualizowano na żelach agarozowych 3% Nu-Sieve (FMC) (wybarwianie przy użyciu 0,5 pg/ml bromku etidium) i pasma migrujące w przewidywanym rozmiarze cDNA RANTES (278 pz) poddano

182 786 oczyszczaniu na żelu z wykorzystaniem metod typowych [J. Sambrook i in., Molecular Cloning - A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, USA (1989)]. Następnie końce oczyszczonego na żelu DNA stężono za pomocą sekwencyjnego działania kinaząpolinukleotydową T4 (New England Biolabs) zgodnie z instrukcją wytwórcy, w ogólnej objętości 50 μΐ (1 godzina, 37°C). Po upływie tego czasu, dodano 2,5 μΐ 2,5 mM dNTP-ów i 1 μΐ fragmentu Klenowapohmerazy DNA i E. coli (New England Biolabs) i inkubację kontynuowano w ciągu dalszych 30 mm, w temperaturze 37°C. Następnie, mieszaninę reakcyjnąpodano inaktywacji cieplnej w temperaturze 70°C w ciągu 30 minut, po czym poddano jednorazowo ekstrakcji mieszaniną układu fenol/chloroform (1:1, obj/obj) nasyconej Tris-HCl (1:1, obj/obj). DNA wytrącono za pomocą dodania 10 μΐ 3 M octanu sodowego pH 5,5,1 μΐ glikogenu (20 mg/ml) (Boehringer) i 250 μΐ etanolu, w temperaturze -20°C. DNA odzyskano za pomocą odwirowania przy 10000 x g w ciągu 20 minut, w temperaturze 4°C, po czym przemyto 70% etanolu. Końcowy osad zawieszono w jałowej wodzie w stężeniu 10 ng/μΐ.

ng produktu o końcach stępionych metodą PCR ligowano do 50 ng trawionego EcoW, potraktowanego fosfataząalkalicznąplazmidu pBluescript IISK (Stratagene), w objętości 20 μΐ, przy użyciu 2 μΐ ligazy DNA T4 (400000 jednostek/ml) (New England Biolabs), w ciągu co najmniej 16 godzin, w temperaturze 15°C. Produkty ligacji rozcieńczono do objętości 100 μΐ 1 x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0/1 rnM EDTA) i poddano ekstrakcji mieszaninąfenolu/chloroformu, jak to poprzednio opisano. Produkty ligowania wytrącano za pomocądodania 10 μΐ 3 M octanu sodowego pH 5,5, 1 μ1 glikogenu (20 mg/ml) i 250 μΐ etanolu, w ciągu 15 minut, w temperaturze -70°C. Następnie, wyodrębniono DNA za pomocą odwirowania sposobem powyżej opisanym i zawieszono w 10 μΐ jałowej wody, po czym 5 μΐ zawiesiny produktów ligowania poddano elektroporacji do elektrokompetentnych komórekE. coli szczep XL-1 blue (40 μΐ), przy użyciu pulsatora Bio Rad Gene zgodnie z instrukcjami wytwórcy. Po przeprowadzeniu elektroporacji, dodano 1 ml podłoża LB i komórki hodowano w ciągu godziny, w temperaturze 37°C. Po upływie tego czsu, 100 μ! porcje podłoża hodowlanego umieszczono na płytkach LB zawierających 100 pg/ml ampicyliny i hodowlę prowadzono w ciągu 16 godzin, w temperutzre 37°C. Następnie pobrano pojedyncze kolonie bakterii i wysiano na 5 ml podłoża LB zawierającego 100 pg/ml ampicyliny. Hodowlę prowadzono przez noc, w temperautzre 37°C. Następnie sporządzono w małej skali preparaty plazmidowego DNA (minipreparaty) wykorzystując do tego po 3 ml każdej hodowli, przy użyciu urządzenia „mini-prep DNA purification system WIZARD™” (Promega), zgodnie z instrukcjami wytwórcy.

Następnie, 3 μΐ porcje mim-prep DNA poddano trawieniu z udziałem enzymów restrykcyjnych HindlH i FcoRI (oba z New England Biolabs), zgodnie z instrukcjami wytwórcy, przy objętości mieszaniny reakcyjnej 15 μΐ. Produkty reakcji analizowano na 1% żelach agarozowych zawierających 0,5 pg/ml bromku etidium. Następnie, mini-prep DNA, które dostarczały insert o wielkości około 280 pz poddano analizie sekwencji DNA przy użyciu starterów T3 i T7 oraz preparatu Sequenase (USB), zgodnie z instrukcjami wytwórcy.

Wektor klonujący pBluescript II SK- otrzymano w sposób następujący.

pg plazmidu oczyszczonego w gradiencie CsCl trawiono, przy objętości mieszaniny reakcyjnej 100 μΐ, w ciągu 2 godzin, w temperaturze 37°C, przy użyciu 200jednostek £coRV (New England Biolabs), zgodnie z instrukcjami wytwórcy. Po upływie 2 godzin, strawiony wektor poddano, w ciągu dalszych 30 minut, w temperaturze 37°C, działaniu 10 μΐ fosfatazy alkalicznej z jelit cielęcych, użytej w ilości 20 jednostek/ml (Boehringer). Mieszaninę reakcyjną zinaktywowano z pomocą ogrzewania w temperaturze 68°C w ciągu 15 minut, po czym poddano jednorazowo ekstrakcji mieszaniną fenolu i chloroformu (1:1, obj/obj), nasyconej Tris-HCl pH 8,0. Plazmidowy DNA wytrącono za pomocądodania 10 μΐ 3 M octanu sodowego pH 5,51250 pl etanolu, w temperaturze -20°C. DNA wyodrębniono za pomocą odwirowania przy 10000 x g, w ciągu 20 minut, w temperaturze 4°C i przemyto 70% etanolem. Końcowy osad zawieszono w wodzie jałowej w stężeniu wynoszącym 50 ng/ml.

Sekwencjonowanie dowiodło, że wszystkie tak wytworzone klony były identyczne z sekwencją opublikowaną z wyjątkiem pojedynczej zmiany zasady przy nukleotydzie 22 w sekwen182 786 cji otrzymanej metodą PCR, prowadzącej do zmiany Arg na Pro w proponowanej sekwencji sygnałowej propeptydu RANTES.

Objaśniono to na fig. 1, na której pokazano sekwencję kodującą DNA razem z odpowiednią sekwencją aminokwasów.

(b) Otrzymywanie wektora ekspresyjnego dla metionylowanego białka RANTES (antagona białka RANTES).

Produkt konstrukcji zawierający gen dla białka RANTES poddano obróbce metodąPCR z zastosowaniem następujących starterów:

5TTAATTAATTAAATCGATTCATATG.TCC.CCA.TAT.TCC.TCG GAC AC-3' w którym dwa podkreślone odcinki są to miejsca restrykcyjne Clal i Ndel (miejsce Ndell obejmuje część kodonu inicjacji metioniny), oraz

5'-TACTGATATAAATCTAGACTAGCTCATCTCCAAAGAGTTG-3'.

Następnie fragment ten rozszczepiono, przy użyciu Ckal na końcu 5' i przy użyciu Xbal na końcu 3'. Potem, przy użyciu Xba 1 (Sal 1, rozszczepiono plazmid pCba-M pokazany na fig. 2, po czym duży fragment rozszczepiono przy użyciu Sali i Clal. Następnie przeprowadzono ligowanie na trzech drogach, przy użyciu małego fragmentu Sall/Xbal z pierwszego trawienia, fragmentu Sali/Clal z drugiego trawienia i fragmentu PCR, w celu utworzenia produktu konstrukcji podobnego do pCba-M, z zastąpieniem genu mTNF genem dla wydzielanej postaci ludzkiego białka RANTES, rozpoczynającym się od inicjującej metioniny. (Wydzielana postać ludzkiego białka RANTES nie zawiera dwudziestu trzech pierwszych aminokwasów sekwencji aminokwasów pokazanej na fig. 1. Obejmuje ona pozostałe aminokwasy uwidocznione na fig. 11 rozpoczyna się od aminokwasów SPY...).

Następnie wspomniany fragment Ndel/Sali usunięto z omawianego wektora i wstawiono do t7 plazmidu ekspresyjnego pT7-7, pokazanego na fig. 3. Fragment ten zawiera gen będący przedmiotem zainteresowania oraz 600 pz innej substancji. Jednakże późniejsze eksperymenty (których opisu nie włączono do niniejszego tekstu) wykazały, że usunięcie innej substancji (sekwencji wektora) nie wywierało żadnego wpływu na poziom ekspresji.

Wektor ekspresji typu pT7 został omówiony przez F.W. Studiera, J. Rosenberga i in. w Meth. Enzymol., 185, 60-89 (1990). Następnie, produkt konstrukcji został transformowany do komórek E coli szczep BL21 (DE3) (F-ompT, hsd s_B (r_B, m_B’) zawierających gen LyzS na plazmidzie pACYC 184 [Chang i Cohen, J. Bact. 134,1141 (1978)]. Wektor ekspresji wymaga zaindukowania polimerazy T7, aby mogło dojść do ekspresji białka. Polimerazę T7 indukuje się w komórkach za pomocą dodania do podłoża IPTG (izopropylotiogalaktozydu).

(c) Zademonstrowanie, że Met-RANTES rzeczywiście wykazuje aktywność antagonistyczną.

(i) Test chemotaksji.

In vitro chemotaksję przeprowadzono przy użyciu komór 96-studzienkowych (Neuro Próbę MB Senes, Cabin John, MD 20818, USA) zgodnie z instrukcjami wytwórcy. Chemotaksję wywoływaną przez chemokiny CC, RANTES, ΜΙΡ-Ια i MCP-1 badano z zastosowaniem linii ludzkich monocytów THP-1.4 χ 10⁵ komórek THP-1 w 200 μΐ podłoża RPMI 1640 (Gibco) zawierającego 2% inaktywowanej płodowej surowicy cielęcej inkubowano w każdej ze studzienek komory górnej. W dolnej komorze umieszczono 370 μΐ podłoża RPMI 1640 (bez FCS) zawierającego chemoatraktant (to jest chemokinę) w stosowanym rozcieńczeniu. W celu zahamowania chemotaksji, chemoatraktant utrzymywano w stałym stężeniu wynoszącym 5 x EC₅₀, którą to wartość ustalono uprzednio dla każdej chemokiny. Met-RANTES dodawano w stężeniu zmiennym. Komory inkubowano w ciągu godziny, w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO₂. Następnie usunięto podłoże z komory górnej i zastąpiono je PBS zawierającym 20 mM EDTA, po czym komory inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C. PBS usunięto z górnych dołków, które następnie wytarto do sucha. Zestaw wirowano w ciągu 10 minut przy 1800 obr/min w celu zebrania komórek w komorze dolnej i supematant usunięto za pomocą odessania. Komórki w komorach dolnych policzono z zastosowaniem testu „Celi Titer 96™ Non-Radioactive Celi Proliferation Assay” (Promega, Madison, USA), przy śledzeniu i kontrolowaniu przekształcenia

182 786 błękitu tetrazoliowego w jego pochodną formazanową. Do każdej studzienki wprowadzono 100 μ]

10% roztworu barwnika w podłożu RPMI1640 i komorę inkubowano w temperaturze 3 7°C w atmosferze 5% CO₂. Następnie do każdej studzienki dodano 100 μΐ roztworu do solubilizacji i odczytano wartość absorbancji przy 590 nM po upływie 4 godzin przy użyciu czytnika „Thermomax Microtitre Platę Reader” (Molecular Devices, Pało Alto, CA).

Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. fig. 4 i 5.

(ii) Przepływ wapnia

Przepływ wapnia spowodowany oddziaływaniem chemokin RANTES i MIP-la mierzono zgodnie z doniesieniem literaturowym: R.Y. Tsien, T. Pozzan i T.J. Rink, „Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, mtracellularly trapped fluorescent indicator”, J. Celi Biology 94 (1984), z tą różnicą, że zamiast Quin2 jako wskaźnika fluorescencyjnego, używano preparatu Fura-2/ΑΜ (Fluka). Komórki THP-1 zebrano przy stężeniu poniżej 10⁶/ml po to, aby być pewnym, że znajdują się one w logarytmicznej fazie wzrostu. Następnie, komórki zawieszono w roztworze Krebsa-Ringera zawierającym 0,2% Fura-2/ΑΜ i 1 mg/ml BSA, w stężeniu 10⁶/ml, po czym inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut, bez dostępu światła. Komórki zebrano za pomocą odwirowania i ponownie zawieszono w roztworze Krebsa-Ringera, po czym przetrzymywano na lodzie. Przed użyciem, 1 ml porcje inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 2 minut. Chemokiny dodawano do zawiesiny przy mieszaniu. W celu zbadania rozmiarów hamowania przez Met-RANTES, do komórek, w trakcie 2 minut inkubacji, w temperaturze 37°C, porcje antagona wprowadzano przy różnych jego stężeniach. Otrzymane wyniki pokazano na fig. fig. 6 i 7.

(iii) Test wiązania z receptorem

Badanie współzawodnictwa przeprowadzono w 96-studzienkowych płytkach „Multiscreen Filter-plates” (Millipore, MADV N6500), uprzednio poddanych w ciągu 2 godzin działaniu 50 mM buforu HEPES, pH 7,2, zawierającego 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂ i 0,5% BSA (bufor do wiązania). Test przeprowadzono przy użyciu albo komórek THP-1, albo komórek COS, w przypadku których dochodzi do ekspresji rekombinantowego receptora CC-CKR1 [K. Neote, D. DiGregorio, J.Y. Mak, R. Horuk i T.J. Schall: ,Molecular cloning, functional expression and signalhng characteristics of C-C chemokine receptor”, Celi, 72,415-425 (1993); J.L.Gao i m., J. Exp. Med., 177,1421-1427 (1993)]. Każda studzienka zawierała 10⁵komórekw 150 μΐ buforu do wiązania, zawierającego 0,4 nM [¹²⁵J]MIP-lalub 0,4 nM [¹²⁵J]RANTES (New EnglandNuclear, ΝΕΧ 277) oraz konkurencyjne białko Met-RANTES w różnych stężeniach. Próby wykonywano w trzech powtórzeniach. Po upływie 90 minut inkubacji w temperaturze 4°C, komórki przemyto 4 razy 200 μΐ lodowato zimnego buforu do wiązania zawierającego 0,5 M NaCl, który usuwano za pomocą odessania. Sączki wysuszono, po czym dodano 3,5 ml płynu scyntylacyjnego Ultima Gold Scintillation Fluid (Packard) i dokonano zliczenia przy użyciu licznika Beckman LS5000. Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 8.

(d) Otrzymywanie Leu-RANTES (określanego w niniejszym opisie także jako L-RANTES) i zademonstrowanie antagonizmu.

Wektor ekspresyjny L-RANTES wytworzono w dwóch etapach. Wpierw, zastosowano metodę PCR do skrócenia genu dla ludzkiego białka RANTES w obrębie kodonu pierwszej cysteiny i wprowadzenia unikalnych miejsc restrykcyjnych na obu końcach genu. Tak utworzony produkt PCR sklonowano do opartego na T7 wektora ekspresyjnego E. coli pET23d (Novagen) przy wykorzystaniu miejsca SAcI wprowadzonego na końcu 5' genu oraz miejsca BsmAI (przeznaczonego do dostarczania zgodnego z Hindlll wystającego „zwisu”) przy końcu 3' genu. Następnie tworzono geny kodujące N-końcowe warianty ludzkiego białka RANTES, przez wstawianie oligonukleotydów kodujących warianty bezpośrednio 5' do sekwencji kodującej RANTES. W tym celu, klon skróconego białka RANTES w pET23d poddano trawieniu przy użyciu Sad, a następnie polimerazy DNA T4 (w celu usunięcia wystającego „zwisu” 3' pozostawionego po podziałaniu SacI), a następnie drugiemu trawieniu, przy użyciu Ncol. Następnie, do poddanego trawieniu wektora sklonowano oligonukleotydy kodujące sekwencję peptydową

182 786

MKKKWPRLSPYSSDTTP. Ekspresję produktu konstrukcji pET23d/L-RANTES przeprowadzono sposobem opisanym odnośnie do konstruktu pT7-7.

pET23d/RANTESNcoI pER23d/RANTES Sacl/T4

5'C C TGC TTT 3'

3' GGTAC G ACG AAA 5'

Oligonukleotydy L-RANTES

3' CATGAAAAAAAAATGGCCAAGGCTGTCCCCGTACTCCTCCGACACCACCCCGTG

3' TTTTTTTTTACCGGTTCCGACAGGGGCATGAGGAGGCTGTGGTGGGGCAC

Konstrukt pET23d/L-RANTES jest jednym z szeregu wektorów ekspresyjnych, których można użyć do tworzenia białka RANTES o różnych aminokwasach w pozycji 1. Te wektory ekspresyjne T7 kodują białka zawierające sekwencje końcowe białka MKKKWPR-X-RANTES, przy czym X może oznaczać, na przykład, albo L, I, Q, E, albo G. Rozszczepienie przy użyciu endo-Arg-C prowadzi do uzyskania odmiennych białek X-RANTES.

LrHANTES

BSMAicam) asMAi«soda>

MOnCMO) nom

Ρ8ΓΓ23ΟΛ--«ΑΝΤΚΒ

3034 ta

ALWM037O iwnn—o

MMM (1799

9099 99*1 eami099 *2 Μ X X X W P R Ł 3 P Y 3 8 D T T 1 CASGAAAAAA AAATGGCCAA GGCTGTCCCC GXAC5CCTCC GACACCACCC GSACTTTTTT TTTACCGGW CCGACAGGGG CAIGAGGAGG CTOTGGTGGG +2 P C C F A Y S A R P L P R A Η I X 51 CG7GCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TOCCCCGTGC CCACASCAAG GCACGACGAA ACGGATGSAA CGGGCOGGTG ACGGGGCACG GGTGTAGTTC *2 X Y F Y T 8 G XCS Η P λ V V P. V 101 GAGTAKTCT ACACCAGTCG CAAGTOCTCC AACCCAGCAG ¢¢01¾¾¾¾¾¾ CTCAZAAAGA TOTGGTCACC GTTCACGAGG TTGGGTCGTC AGGMUAACA *2 T R X M R Q V C λ X P 3 X X W V 151 CACCCGAAAG AACCGCCAAG TGIGTGCCAA CCCAGAGJUUS AAAZGGGTIC GTGGGCTTTC TTGGCGGMC ACAOCGGTT GGGTC7CTTC TTSACCCAAG ♦2 R X Y X H S Ł

EMS* ηιμοχχχ sctx

ΧΗΟΙ

201

GGGAGTACAT CAACTCTITG GAGAZGAGCT AAAGCTTGCG GCCGCACTCG

CCCTCATGTA G2ZCGAGAAAC CTCZACTCGA CTTCGAACGC CGGCGSGAGC

182 786

Oczyszczanie Leu-RANTES przeprowadzono w sposób następujący.

W 15 ml 50 mM buforu Tris-HCl, pH 7,6, zawierającego 1 mM ditiotreitolu, 5 mM chlorowodorku benzamidyny, 0,1 mM fluorku fenylometylosulfonylu i 0,02 mg/ml DNazy zawieszono 4 g pasty komórek E. coli. Komórki rozbito w trzech przejściach przez prasę „French Pressure celi”, z 1 -minutowym nadźwiękawianiem po każdym przejściu. Otrzymany tak roztwór wirowano w ciągu 60 minut przy 10000 x g, po czym osad rozpuszczono w 2 ml 1000 mM buforu Tris-HCl, pH 8,0, zawierającego 6 M chlorowodorku guanidyny i 1 mM ditiotreitolu. Utworzony roztwór ogrzewano w ciągu 60 minut w temperaturze 60°C w celu osiągnięcia monomeryzacji, po czym oziębiono do temperatury pokojowej i poddano filtracji żelowej na kolumnie Superdex-200 16/60 zrównoważonej tym samym buforem. Frakcje zawierające konstrukt rekombinantowego białka RANTES (o objętości 16 ml) poddano renaturacji za pomocą wkroplema do 384 ml 100 mMbuforuTris-HCl, pH 8,0, zawierającego 1 mMutlenionego glutationui0,0,l mM zredukowanego glutationu, po czym całość mieszano przez noc. Następnie roztwór ten poddano dializie wobec 50 mM buforu z octanem sodowym, pH 4,5, a potem naniesiono na kolumnę HILoad SP26/10 zrównoważoną tym samym buforem. Białka wyeluowano liniowym gradientem 0-2 M NaCl w tym samym buforze. Frakcje zawierające zrenaturowane białko dializowano wobec 3x5 litrów 1% kwasu octowego, a następnie zliofilizowano.

W celu usunięcia ze sprzężonego białka heksapeptydu KKKWPR, liofilizat w postaci proszku rozpuszczono w wodzie i doprowadzono do stężenia 1 mg/ml przy użyciu 50 mM buforu Tris-HCl, pH 8,0. Do 2 ml otrzymanego tak roztworu wprowadzono 20 pg preparatu Endoproteinase Arg C (Boehringer Mannheim) i otrzymany roztwór inkubowano w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C. Strawione białko oddzielono od reszty surowca metodą HPLC z odwróconymi fazami z zastosowaniem kolumny Nucleosil-C₈ (10 x 250 mm) zrównoważonej 0,1% kwasem trifluorooctowym. Białka wyeluowano gradientem 22,5-45% acetonitrylu w 0,1% kwasie tnfluorooctowym, po czym zliofilizowano i przechowywano w temperaturze -80°C.

Aktywność antagonistyczną w stosunku do spowodowanej oddziaływaniem białka RANTES chemotaksji komórek THP-1 zbadano sposobem opisanym odnośnie do białka Met-RANTES. Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 9.

(e) Otrzymywanie Gln-RANTES (niekiedy określanego jako Q-RANTES) i zademonstrowanie antagonizmu.

Powtórzono sposób postępowania opisany w pkt. (d) z potrzebnymi zmianami w celu wytworzenia Gln-RANTES.

Aktywność antagonistyczną białka Gln-RANTES w stosunku do spowodowanej oddziaływaniem białka RANTES chemotaksji komórek THP-1 zbadano sposobem opisanym odnośnie do Met-RANTES. Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 10.

182 786

Fig. 1

ATGAAGGTCTCCGCGGCACGCCTCGCTGTCATCCTCATTGCTACTGCCCTCTGCGCTCCT 86

MKVSAARLAVILIATALCAP

GCATCTGCCTCCCCATATTCCTCGGACACCACACCCTGCTGCTTTGCCTACATTGCCCGC 146 ASASPYSSDTTPCCFAYIAR

147 CCACTGCCCCGTGCCCACATCAAGGAGTATTTCTACACCAGTGGCAAGTGCTCCAACCCA 206 PLPRAH1KEYFYTSGKCSNP

207 GCAGTCGTCTTTGTCACCCGAAAGAACCGCCAAGTGTGTGCCAACCCAGAGAAGAAATGG 266

AVVFVTRKNRQVCANPEKKW

267 GTTCGGGAGTACATCAACTCTTTGGAGATGAGCTAGG 303 YREYINSLEMS ·

182 786

FIG. 2

Ciał

182 786

FIG. 3 pT7-7

Zawiera promotor polimerazy RNA T7 010 i miejsce inicjacji translacji dla genu T7 białka 10 (T7 pz 22857 do 22972), wstawione pomiędzy miejsca PvuII a Ciał w pT7-5. Unikalnymi miejscami restrykcji dla tworzenia białek sprzężonych (po wypełnieniu końców 5 ) są: ramka q_: ramka IzNdcI, Smal. Cal r amka 2: BamHI. SalL HlndUI

Miejsce pierwotnego polilinkera usunięte przez delecję. Należy zauważyć obecność dodatkowego miejsca Xbal w górę kodonu inicjacyjnego.

Łącznik BglU

Hincll

CnZ El origin

BglU

T7:22857

T7 promotor wstawiony w miejsce Ndell palzmidu pT7-7 opozycja 2297 pBR322)

2473 bp

010

Xbal

CGATrCGAACmCTCCATTCCAACTTCTGATAGACrrCCAAATTAATACCACTCACrATAGGCACA

Ndcl osp * - 4ατ...

Ma ała erg ik

CCACAACGGTTTCCCTCrAGAAATAATTrTGTTrAACTrTAAGAAGGAGATATACAT/|rG CCT ACA ATt| pT7-7 erg ala arg gly ser ser ag val asp ku gin pro lys CCC CCC

Sm* I BamHI Xb*I Sali Ρπ I

Hind 111

Pst I

Sali

Xbal

BamHI

Sma I

EcoRI

Ndcl iU

22972

Hindm

0*1

182 786

FIG. 4

Chemokiny CC indukują chemotaksje komórek THP-1

Wskaźnik chemotaksji

w⁵ icr w³ w² w' w⁰ w io² w³

[Chemokina] (nM)

MCP-1 MlP-la RANTES

EC_S0 (nM)

0.2

0.68

182 786

Fig. 5

Hamowanie przez Met-Rantes (GR 231774) chemotaksji indukowanej przez chemokinę

10^ W³ 10² W¹ 10° 10¹ 10² 10³

[Met-RANTES] (nM)

[Agon ] = 5xEC₅₀

IC₅₀ (nM) o MIP-1a • RANTES □ MCP-1

0.49

8.18

182 786

FIG, 6

Chemokiny CC indukują przepływ wapnia w komórkach

THP-1

Przepływ wapnia

[Chemokina] (nM)

MIP-1a

RANTES

EC₅₀ (nM)

4.6

13.21

182 786

FigHamowanie przez Met-RANTES przepływu wapnia indukowanego przez białko RANTES w komórkach THP-1

10’² 10’’ 10° 10’ 10² 1 0³ 10⁴

[Met-RANTES] (nM)

RANTES w stężeniu 5 x

182 786

Fig. 8 związania

Wiązanie sie Met-RANTES (GR 231774) z komórkami THP-1, 125 konkurencyjne w stosunku do J-RANTES i ιιιιιη i iumq hhiiii) i iiiuq i iuuq-nTiiiq

I I mml u umil i imiiii i imnil i ntmil tumu) iimniil

10’³ 10² 10’’ 10° 10' 10² 10³ 10⁴

[Met-RANTES] (nM)

IC₅₀ = 25 +/- 1.2 nM (n = 4 eksperymenty) o, 4 nu [’²⁵J]RANTES

182 786

FIG. 9

Działanie antagonistyczne Leu-RANTES w stosunku do chemotaksji indukowanej przez RANTES

Wskaźnik chemotaktyczny

[Lau-RANTES] nM

182 786

FIG. 10

Działanie antagonistyczne Glutamina-RANTES (Q-RANTES) w stosunku do chemotaksji komórek

THP-1 indukowanej przez RANTES

10* 10·’ 10° 10' 10² 10³ (ORANTES](nM)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Polipeptyd posiadający przynajmniej 40% homologię z sekwencją aminokwasową białka RANTES i działający jako antagonista białka RANTES lub białka MIP- lapod względem jednej lub więcej spośród następujących aktywności:

(a) chemotaksja komórek THP-1 w odpowiedzi na oddziaływanie białka RANTES lub białka MIP-la;

(b) mobilizacja jonów wapnia w komórkach THP-1 w wyniku obecności białka RANTES lub w wyniku obecności białka MIP-la; oraz (c) wiązanie białka RANTES z receptorami komórek THP-1; przy czym polipeptyd ten działa jako antagonista białka RANTES lub białka ΜΙΡ-Ια w wyniku obecności jednego, lub większej ilości N-końcowych aminokwasów.
2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jeden, lub więcej mż jeden ze wspomnianych N-końcowych aminokwasów jest N-końcowym aminokwasem dla sekwencji SPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKE FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S.
3. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jeden, lub więcej ze wspomnianych N-końcowych aminokwasów obejmuje lub stanowi metioninę.
4. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jeden, lub więcej ze wspomnianych N-końcowych aminokwasów obejmuje lub stanowi leucynę albo glutaminę.
5. Polipeptyd według zastrz. 3, w którym wspomniana metionina znajduje się naN-końcu polipeptydu.
6. Polipeptyd według zastrz. 4, w którym wspomniana leucyna albo glutamina znajduje się na N-końcu polipeptydu.
7. Polipeptyd według zastiz. 1 albo 2, albo 3, albo 5, znamienny tym, że posiada sekwencję MetRANTES: MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo posiada sekwencję zasadniczo homologiczną do tej sekwencji.
8. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2, albo 4, albo 6, znamienny tym, że posiada sekwencję:

(i) Leu-RANTES: LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo sekwencję:

(ii) Gln-RANTES: QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo sekwencję zasadniczo homologiczną do dowolnej z powyższych sekwencji.
9. Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd będący antagonistąbiałka RANTES lub białka MIP-la posiadający przynajmniej 40% homologię sekwencji aminokwasowej z białkiem RANTES, przy czym ten polipeptyd zawiera jeden, lub więcej dodatkowych N-końcowych aminokwasów.
10. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 9, znamienna tym, że koduje pohpeptyd wybrany spośród:

(i) Met-RANTES: MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYTNSLEM S, albo (ii) Leu-RANTES: LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo (iii) Gln-RANTES· QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo sekwencję, która jest zasadniczo homologiczna z dowolną z powyższych sekwencji.

182 786
11. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 10, znamienna tym, że jest sekwencją

RNA albo DNA.
12. Wektor zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd będący antagonistąbiałka RANTES lub białka MIP- laposiadający przynajmniej 40% homologię sekwencji aminokwasowej z białkiem RANTES, przy czym ten polipeptyd zawiera jeden, lub więcej dodatkowych N-końcowych aminokwasów.
13. Wektor według zastrz. 12, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd wybrany spośród:

(i) Met-RANTES: MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo (ii) Leu-RANTES: LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo (iii) Gln-RANTES: QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo sekwencję, która jest zasadniczo homologiczna z dowolną z powyższych sekwencji.
14. Wektor według zastrz. 12, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest sekwencją RNA albo DNA.
15. Komórka gospodarza zawieraj ąca wektor zawieraj ący sekwencj ę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd będący antagonistą białka RANTES lub białka MIP-la posiadający przynajmniej 40% homologię sekwencji aminokwasowej z białkiem RANTES, przy czym ten pohpeptyd zawiera jeden, lub więcej dodatkowych N-końcowych aminokwasów.
16. Komórka gospodarza według zastrz. 15, znamienna tym, że sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd wybrany spośród:

(i) Met-RANTES: MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo (ii) Leu-RANTES: LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo (iii) Gln-RANTES: QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo sekwencję, która jest zasadniczo homologiczna z dowolną z powyższych sekwencji.
17. Komórka gospodarza według zastrz. 16, znamienna tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest sekwencją RNA albo DNA.
18. Środek farmaceutyczny do leczenia schorzenia obejmującego stan zapalny, w którym pośredniczy białko RANTES lub białko ΜΙΡ-Ια, takiego jak astma, alergiczny nieżyt nosa, atopowe zapalenie skóry, ognisko miażdżycowe/miażdżyca tętnic lub reumatoidalne zapalenie stawów, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera polipeptyd będący antagonistą białka RANTES lub białka MIP-la posiadający przynajmniej 40% homologię sekwencji aminokwasowej z białkiem RANTES, przy czym ten polipeptyd zawiera jeden, lub więcej dodatkowych N-końcowych aminokwasów.
19. Środek farmaceutyczny według zastrz. 18, znamienny tym, że zawiera polipeptyd wybrany spośród:

(i) Met-RANTES: MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo (ii) Leu-RANTES: LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo (iii) Gln-RANTES: QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo polipeptyd, który jest zasadniczo homologiczny z dowolnym z powyższych polipeptydów.
20. Sposób otrzymywania polipeptydu działającego jako antagonista białka RANTES lub białka MIP-la obejmujący doprowadzanie do ekspresji wspomnianego polipeptydu przez komórkę gospodarza, znamienny tym, że do ekspresji stosuje się komórkę gospodarza transformowaną wektorem zawierającym sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd będący

182 786 antagonistą białka RANTES lub białka MIP-la posiadający przynajmniej 40% homologię sekwencji aminokwasowej z białkiem RANTES, przy czym ten polipeptyd zawiera jeden, lub więcej dodatkowych N-końcowych aminokwasów.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd wybrany spośród:

(i)Met-RANTES: MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP

AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo (ii) Leu-RANTES: LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP

AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo (iii) Gln-RANTES: QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP

AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo sekwencję, która jest zasadniczo homologiczna z dowolną z powyższych sekwencji.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest sekwencją RNA albo DNA.

* * *

Przedmiotem niniejszego wynalazku są pochodne białka RANTES i ich zastosowania.

Białko znane pod nazwą RANTES zostało pierwotnie sklonowane przez T.J. Schalla i in. [J. Immunol., 141,1018-1025 (1988)] w laboratorium Krensk/ego w Stanford University School of Medicine. Nazwa RANTES wywodzi się ze zdania: „Raised on ąctivation, normal T-cell denved and secreted (stosowne litery podkreślono). Jego ekspresję można indukować stymulacją antygenową lub aktywacją mutagenową komórek T. Białko to jest członkiem nadrodziny chemokin [TJ. Schall, Cytokine, 3, 165-183 (1991); J.J. Oppenheim i in., Ann. Rev. Immunol., 9, 617-648 (1991)]. Czyste białko zidentyfikowano po raz pierwszy w 1992 w płytkach krwi [Kameyoshi i in., J. Rxp. Med., 176, 587-592 (1992)]. Stanowi ono czynnik silnie odziaływujący „przyciągająco” (ang. attractor) na eozynofile i komórki T CD4⁺CD45RO⁺, a także monocyty. Zawiera ono sekwencję 68 aminokwasów.

Obecnie sklonowano receptora dla białka Rantes [J.L. Gao i in., J. Exp. Med., 177, 1421-1427 (1993); K. Neote i in., Celi, 72,415-425 (1993)] i wykazano, że wiąże on chemokiny zgodnie z następującą kolejnością przejawianej siły wiązania: MIP-la> RANTES.

Wynalazek niniejszy dotyczy polipeptydów będących antagonami białka RANTES i/lub białka MIP-la.

Pomimo znacznego zainteresowania dotyczącego cytokin w ogólności, a także mimo powstania omówionych powyżej opracowań odnoszących się do białka RANTES i receptorów RANTES w szczególności, w dotychczasowym stanie techniki, a zatem przed opracowaniem niniejszego wynalazku, nie pojawiło się żadne ujawnienie związane z powyższymi antagonami lub ich możliwymi zastosowaniami.

Wynalazek niniejszy dotyczy polipeptydu o podstawowej sekwencji aminokwasów homologicznej do sekwencji białka RANTES i funkcjonującego jako antagon białka RANTES i/lub ΜΙΡ-lapod względem jednej lub więcej niż jednej zponiższych aktywności' (a) chemotaksja komórek THP-1 w odpowiedzi na oddziaływanie białka RANTES i/Iub w odpowiedzi na oddziaływanie białka MIP-la;

(b) mobilizacja jonów wapnia w komórkach THP-1 w wyniku obecności białka RANTES i/lub w wyniku obecności białka MIP-la; oraz (c) wiązanie białka RANTES i/lub białka MIP-la z receptorami komórek THP-1.

Polipeptydy otrzymywane sposobem według niniejszego wynalazku są użyteczne, jeśli chodzi o dalsze charakteryzowanie białka RANTES i jego działania, na przykład w badaniu spowodowanej przez białko RANTES chemotaksji komórek, mobilizacji jonów wapnia i wiązania przez receptory. Są one użyteczne także w charakteryzowaniu wiązania białka RANTES z jego receptorami. Są one także przydatne w badaniu pod tym samym względem białka MIP-la.

182 786

Oprócz tego sądzi się, że polipeptydy według niniejszego wynalazku sąużyteczne w leczeniu rozmaitych chorób, jak to zostanie omówione w dalszej części niniejszego opisu.

Korzystny polipetyd według mniejszego wynalazku działa jako antagon białka RANTES i/lub białka ΜΙΡ-Ια dzięki obecności w jego cząsteczce jednego, lub większej ilości N-końcowych aminokwasów (które nie występują w odnośnych pozycjach w białku RANTES i które, dlatego, można traktować jako N-końcowe aminokwasy dodatkowe w stosunku do już obecnych w N-końcu białka RANTES). Korzystnie, tymi N-końcowymi aminokwasami są aminokwasy występujące w naturze (L-) i można je włączyć z zastosowaniem metody rekombinantowego DNA lub metodą sprzęgania peptydów. Jednakże, można także tu użyć aminokwasów nie występujących w naturze (na przykład D-aminokwasów). Włącza się je z wykorzystaniem metod syntezy chemicznej.

Takim dodatkowym aminokwasem może być tylko sam jeden aminokwas i w tym przypadku może nim być, na przykład, leucyna lub metionina. Polipeptydy takie można wytworzyć z wykorzystaniem każdej odpowiedniej metody (na przykład metody klonowania genów, syntezy chemicznej itd.). W jednym ze sposobów wykonania niniejszego wynalazku wytwarza się je posiłkując się wpierw większym polipeptydem zawierającym pożądaną sekwencję, z następującym później przeprowadzeniem do rozszczepienia enzymatycznego, w wyniku czego otrzymuje się polipeptyd składający się z sekwencji pożądanej.

Polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą zawierać więcej mz jeden dodatkowy N-końcowy aminokwas, to znaczy, że mogą zawierać do pięciu, do dziesięciu lub do dwudziestu dodatkowych aminokwasów. W pewnych przypadkach obecnych być może więcej niż dwadzieścia dodatkowych N-końcowych aminokwasów.

Także i w tym przypadku, w celu otrzymania tego rodzaju pohpeptydów, posłużyć się można jakimkolwiek dogodnym sposobem wytwarzania.

W następującej części opisu omówione zostaną szczegółowo różne aspekty niniejszego wynalazku.

Twórcy niniejszego wynalazku odkryli, że w wyniku użycia układu ekspresyjnego E. coli w przeznaczeniu polegającym na spowodowaniu ekspresji białka RANTES w postaci odpowiadającej dojrzałemu ludzkiemu białku RANTES (to znaczy z usuniętą sekwencją sygnałową) dochodziło do ekspresji polipeptydu, w którym obecna była dodatkowa, N-końcowa metionina (nie usuwana z pozostałej części sekwencji działaniem endogennych proteaz E. coli). Nieoczekiwanie stwierdzono, że obecność tego dodatkowego aminokwasu w istotny sposób zmieniała właściwości polipeptydu w porównaniu z właściwościami białka RANTES. Stwierdzono, że ten metionylowany polipeptyd (określany w niniejszym opisie jako metionylowane białko RANTES lub Met-RANTES) oddziaływuje, w różnych testach, jako antagon białka RANTES i białka ΜΙΡ-Ια, natomiast me zaobserwowano, aby przejawiał jakąkolwiek znaczącą aktywność agonistyczną.

Należy zaznaczyć, że w licznych przypadkach, gdy u E. coli dochodzi do metionylowania na N-końcu, me występuje wcale (albo zachodzi tylko w nieznacznym stopniu) zmiana właściwości polipeptydu, względnie dochodzi jedynie do obniżenia poziomu jego poprzedniej aktywności biologicznej. Toteż całkowicie niespodziewane było to, że (jak w przypadku niniejszego wynalazku) N-końcowe metionylowanie rzeczywiście doprowadza do zaistnienia aktywności antagonistycznej.

W celu ustalenia, czy skutek taki był, czy tez nie był, ograniczony jedynie do przypadku obecności N-końcowej metioniny, wytworzono inny polipetyd, w którym N-końcową metioninę zastąpiono N-końcową leucyną. Także i w tym przypadku stwierdzono antagonistyczne działanie takiego polipetydu w stosunku do białka RANTES. To samo stwierdzono w przypadku następnego polipeptydu, w którym N-końcową metioninę zastąpiono N-końcową glutaminą.

W korzystnej postaci, polipeptyd według niniejszego wynalazku ma sekwencję następującą:

(i)MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S (niekiedy określany jest on jako „Met-RANTES”)

182 786 (ii)LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR

QVCANPEKKW YREYINSLEM S (niekiedy określany jest on jako „Leu-RANTES”) lub (iii) QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVYFVTRKNR QVCANPEKKW YREYINSLEM S (niekiedy określany jest on jako „Gln-RANTES”), albo posiada sekwencję zasadniczo homologiczną do którejkolwiek z powyższych sekwencji. Polipeptyd może występować w postaci glikozylowanej lub jako nie glikozylowany.

Stosowany w niniejszym opisie termin „zasadniczo homologiczna” obejmuje sekwencje aminokwasów homologiczne co najmniej w 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% lub 99% do danej sekwencji (w kolejności pierwszeństwa). Termin ten może obejmować (ale bez ograniczania się tylko do nich) sekwencje aminokwasów zawierające od 1 do 20, od 1 do 10 lub od 1 do 5 pojedynczych aminokwasowych delecji, insercji lub podstawień w porównaniu z daną sekwencją z tym, że utworzony tak polipeptyd działa jako antagon białka RANTES lub białka MIP-la

Polipeptyd może występować w postaci zasadniczo czystej. Można go wyodrębnić spośród polipeptydów występujących w naturze.

Należy zauważyć, że w tej dziedzinie techniki bardzo dobrze znana jest możliwość zastąpienia pewnych aminokwasów innymi aminokwasami bez powodowania zaistnienia j akiej kolwiek zasadniczej zmiany właściwości danego polipeptydu. Wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem tego rodzaju możliwości.

Należy także zauważyć, ze często można dokonywać delecji lub insercji aminokwasów bez powodowania zasadniczej zmiany właściwości polipeptydu. Wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem tego rodzaju delecje lub insercje (które mogą stanowić, na przykład, do 10,20 lub 50% długości powyżej przedstawionej sekwencji konkretnego antagona). Tak więc, wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem także białka sprzężone, w których polipeptydy według niniejszego wynalazku zostały sprzężone z innym ugrupowaniem. Można to wykonać w celu, na przykład, oznakowania lub w przeznaczeniu medycznym.

Twórcy niniejszego wynalazku wykazali, że pohpetyd według niniejszego wynalazku może wykazywać aktywność antagonistyczną w stosunku do czynności białka RANTES lub ΜΙΡ-Ια w chemotaksji, mobilizacji wapnia i wiązania z receptorem w komórkach THP-1 (hma monocytów). Komórki te dostępne sąz ATCC (American Tissue Culture Collection). Funkcjonują one jako dobry układ modelowy do badania białka RANTES, ponieważ uwidaczniają one reakcję wapnia i odpowiedź chemotaktyczną na oddziaływanie białka RANTES i ΜΙΡ-Ια, jak również innych chemokin, takich j ak MCP-1. Omawiany polipeptyd może także być czynny j ako antagon białka RANTES lub ΜΙΡ-Ια w chemotaksji, mobilizacji wapnia i wiązania z receptorem w tych komórkach. MIP-la był pierwotnie zidentyfikowany jako część frakcji makrofagalnego polipeptydu zapalnego (który był rozszczepiany na ΜΙΡ-Ια i ΜΙΡ-1β) [K. Obaru i in., J. Biochem., 99, 885-894 (1088); P.F. Sippel i in., J. Immunol., 142,1582-1590 (1989)]. Przejawia on aktywność chemotaktyczną wobec komórek T i monocytów. Wykazano również, że jest on silnym inhibitorem proliferacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego.

W oparciu o te obserwacje sądzi się, że polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być przydatne pod względem blokowania czynności białka RANTES i/lub MIP-la, dlatego też mogą znaleźć zastosowanie w lecznictwie. Korzystne zastosowanie polipeptydów według niniejszego wynalazku polega na blokowaniu działania białka RANTES i/lub MIP-la w rekrutacji i/lub aktywacji komórek prozapalnych. Wynalazek niniejszy może więc być użyteczny w leczeniu chorób takich jak astma, nieżyt nosa alergiczny, zapalenie skóry atopowe, ogniska miażdżycowe/miażdżyca tętnic i zapalenie stawów reumatoidalne.

Oprócz omówionych powyżej polipeptydów, wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem również sekwencje DNA kodujące te polipeptydy (które to sekwencje mogąbyć otrzymane na drodze izolacji lub rekombinacji), wektory włączające takie sekwencje oraz komórki-gospodarze z takimi wektorami, zdolne do doprowadzenia do ekspresji polipeptydów według niniejszego wynalazku.

182 786

Polipeptydy według niniejszego wynalazku można wytworzyć na drodze ekspresji z udziałem prokanotycznych lub eukariotycznych komórek-gospodarzy, wykorzystując odpowiednią sekwencję kodującą DNA. Stosowane sposoby postępowania ujawnione sąw: Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, USA (1989). Alternatywnie, polipeptydy te wytworzyć można na drodze kowalentnego modyfikowania białka RANTES. Można to przeprowadzić, na przykład, za pomocą metionylowania białka RANTES na jego N-końcu.

W związku z powyższym, przedmiotem wynalazku jest polipeptyd posiadający przynajmniej 40% homologię z sekwencjąaminokwasowąbiałka RANTES i działający jako antagonista białka RANTES lub białka MIP- lapod względem jednej lub więcej spośród następujących aktywności:

(a) chemotaksja komórek THP-1 w odpowiedzi na oddziaływanie białka RANTES lub białka MIP-la;

(b) mobilizacja jonów wapnia w komórkach THP-1 w wyniku obecności białka RANTES lub w wyniku obecności białka MIP-la; oraz (c) wiązanie białka RANTES z receptorami komórek THP-1; przy czym polipeptyd ten działa jako antagonista białka RANTES lub białka ΜΙΡ-Ια w wyniku obecności jednego, lub większej ilości N-końcowych aminokwasów.

Korzystnie, polipeptyd ten charakteryzuje się tym, że jeden, lub więcej niż jeden ze wspomnianych N-końcowych aminokwasów jest N-końcowym aminokwasem dla sekwencji SPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKE FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEMS.

Korzystnie, polipeptyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że jeden, lub więcej ze wspomnianych N-końcowych aminokwasów obejmuje lub stanowi metioninę. Również korzystnie, polipeptyd ten charakteryzuje się tym, że jeden, lub więcej ze wspomnianych N-końcowych aminokwasów obejmuje lub stanowi leucynę albo glutaminę.

Korzystnie, wspomniana metionina znajduje się na N-końcu polipeptydu.

Korzystnie, wspomniana leucyna albo glutamina znajduje się na N-końcu polipeptydu.

Również korzystnie, polipeptyd ten charakteryzuje się tym, że posiada sekwencję Met-RANTES: MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo posiada sekwencję zasadniczo homologiczną do tej sekwencji.

Również korzystnie, polipeptyd ten charakteryzuje się tym, że posiada sekwencję:

(i) Leu-RANTES: LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo sekwencję:

(n) Gln-RANTES: QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AWFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, albo sekwencję zasadniczo homologiczną do dowolnej z powyższych sekwencji.