CN1087346C - 用于炎症治疗的rantfs肽和片段及包括它们的组合物 - Google Patents

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Abstract

对RANTES的修饰可得到用作RANTES或MIP-1α拮抗剂的修饰多肽。这样的拮抗剂在治疗上可用于减轻炎症。它们在研究RANTES或MIP-1α性质中也是有用的。

Description

用于炎症治疗的RANTFS肽和片段及包括它们的组合物
物质及其它们的应用
本发明涉及RANTES衍生物和它们的应用。
已知的RANTES蛋白最初由斯坦福大学医学院Krensky实验室的Schall T.J.等(《免疫学杂志》，141 1018-1025(1988)克隆。术语RANTES来自词组“激活条件下培养的正常T-细胞产生和分泌( Raised on  activation， normal  T-cell derived andsecreted”)(有关的划线字母)。可通过抗原刺激或诱变剂激活T-细胞而诱导其表达。该蛋白是趋化因子超家族的一个成员(Schall T.J.，《细胞因子》3 165-183(1991)；Oppenheim，J.J.等，《免疫学年评》(Ann.Rev.Immunol.)9 617-48(1991))。纯化蛋白于1992年首先在血小板中得以鉴定(Kameyoshi等，《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)176 587-592(1992))。对于嗜酸性细胞、CD4+CD45RO+T-细胞，该蛋白为有效的引诱剂(attractor)，对于单核细胞也是如此。它是一个68氨基酸的序列。
最近，RANTES受体已被克隆(Gao，J. L.等，《实验医学杂志》，177 1421-7(1993)；Neote，K.，等，细胞》72 415-25(1993))-且显示其结合趋化因子的能力顺序为MIP-1α＞RANTES。
本发明提供为RANTES和/或MIP-1α拮抗剂的多肽。
尽管通常对细胞因子的相当大兴趣及其上述讨论的RANTES和RANTES受体的工作，在本发明以前还没有公开过上面的拮抗剂或该拮抗剂的可能用途。
根据本发明提供与RANTES具有基本氨基酸序列同源的多肽并在以下的一个或多个方面作为RANTES和/或MIP-1α的拮抗剂而发挥作用：
(a)对RANTES应答和/或对MIP-1α应答时THP-1细胞的趋
   化性；
(b)由于RANTES存在和/或由于MIP-1α存在，THP-1细胞
   中钙离子的流动；和
(c)RANTES和/或MIP-1α与THP-1细胞受体的结合。
本发明提供的多肽可进一步用于对RANTES和其效应的特征描述-例如用于研究RANTES诱导的趋化性、钙离子流动和受体结合。它们也可用于对RANTES和其受体结合进行特征描述。相应的原因它们用于研究MIP-1α。
此外，本发明的多肽被认为在多种疾病的治疗中是有用的，这将在后面讨论。
由于一个或多个N-末端氨基酸存在(它们在RANTES中相应位置不存在并且因此相对于那些RANTES N-末端来说可被认为是额外的N-末端氨基酸)本发明优选的多肽作为RANTES和/或MIP-1α拮抗剂而起作用。这些N-末端氨基酸优选为天然存在的(L-)氨基酸(它们可通过重组DNA技术或肽融合技术而被插入)。然而，非天然存在的氨基酸(如，D-氨基酸)也可被使用。这些氨基酸可通过化学合成技术而被插入。
也许只有一个这样的额外氨基酸，例如它可以是亮氨酸或甲硫氨酸。可通过任何适当的技术(如，通过使用基因克隆技术，化学合成技术等)制备这样的多肽。在本发明的一个实施方案中，它们是通过提供一个包括所需序列的较大多肽，然后用酶裂解以产生由所需序列所组成的多肽而制备。
本发明的多肽可以包括不止一个额外N-末端氨基酸，如它们可包括多达5个，10个或20个额外氨基酸。在有些场合可存在多于20个额外N-末端氨基酸。
再一次，任何合适的技术可用于制备这样的多肽。
本发明的各个方面现将在下面进一步详细讨论。
本发明人发现用大肠杆菌(E.coli)表达系统试图以相应于成熟的人RANTES形式(即去除了信号序列)表达RANTES时，表达出N-末端具有一个额外甲硫氨酸(未被内源性大肠杆菌蛋白酶从保留的序列中切除)的多肽。惊奇地发现该额外氨基酸的存在基本上改变了该多肽相应于RANTES的那些特征。发现甲硫氨酸化的(methionylated)多肽(这里指甲硫氨酸化的RANTES或Met-RANTES)在各种试验中是作为RANTES和MIP-1α的拮抗剂而起作用而并未发现具有任何的基本的激动剂活性。
应该认识到在大肠杆菌中有许多发生N-末端甲硫氨酸化的情况，对多肽的性质很少或不产生影响或者仅导致其比以前的生物活性水平有所降低。因此，本发明的N-末端甲硫氨酸化将实际上得到拮抗活性是完全出乎意料的。
为了测定该效应是否只限于N-末端甲硫氨酸的存在，产生了另一种N-末端甲硫氨酸以N-末端亮氨酸替代的多肽。又一次发现它可作为RANTES的拮抗剂而起作用，进一步以N-末端谷氨酰胺替代N-末端甲硫氨酸的多肽也是如此。
以优选的形式，本发明的多肽具有的序列为：
(i)MSPYSSDT  TPCCFAYIAR  PLPRAHIKEY  FYTSGKCSNP
   AVVFVTRKNR  QVCANPEKKW  VREYINSLEM  S(有
   时在本文称为“Met-RANTES”)
(ii)LSPYSSDT  TPCCFAYIAR  PLPRAHIKEY  FYTSGKCSNP
    AVVFVTRKNR  QVCANPEKKW  VREYINSLEM  S(有
    时在本文称为“Leu-RANTES”)或
(iii)QSPYSSDT TPCCFAYIAR  PLPRAHIKEY  FYTSGKCSNP
     AVVFVTRKNR  QVCANPEKKW  VREYINSLEM  S(有
     时在本文称为“Gln-RANTES”)
或者具有与任何上述序列基本上同源的序列。多肽可以为糖基化形式或非糖基化形式。
这里使用的“基本上同源”术语包括氨基酸序列具有与给定序列至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列同源(按优选级)。如果得到的多肽作为RANTES或MIP-1α的拮抗剂而起作用，该术语会包括但不限于相对于一给定序列，氨基酸序列中从1到20，从1到10或从1到5的单氨基酸缺失、插入或替代。
多肽可以为基本上纯化的形式。它们可从天然存在的多肽中得以分离。
应该注意到在本领域中众所周知某些氨基酸可被其它所替代而不会导致多肽性质的实质性改变。这种可能性也在本发明的发明范围之内。
应该注意到经常出现的氨基酸缺失或插入基本不改变多肽的性质。本发明包括这样的缺失或插入(例如可达到上面给定的特定拮抗物序列长度的10、20或50％)。本发明也将融合蛋白包括在其范围内，其中本发明的多肽被融合到另一部分。例如，这可被用于标记或药用。
本发明者证实本发明的多肽能在THP-1细胞(一种单核细胞系)的趋化性、钙离子流动和在受体结合中作为RANTES或MIP-1α效应的拮抗剂而起作用。这些细胞可从ATCC(美国典型培养物保藏中心)(American Tissue Culture Collection)获得并可用作研究RANTES的良好模型系统，因为它们对RANTES和MIP-1α以及其它细胞因子如MCP-1显示钙离子应答和趋化性应答。该多肽也可在这些细胞的趋化性、钙离子活化和受体结合中作为RANTES或MIP-1α的拮抗剂。MIP-1α最初被鉴定为巨噬细胞炎症多肽级分(断裂成MIP-1α和MIP-1β)的一部分(Obaru，K等，《生化杂志》99：885-894(1988)，Shippel，PF等，《免疫学杂志》142：1582-1590(1989))。它对T-细胞和单核细胞显示趋化性活性。也被显示为干细胞增殖有效的抑制剂。
根据这些资料认为本发明的多肽可用于阻止RANTES和/或MIP-1α的效应并且因此可用于治疗。本发明多肽的一个优选使用是阻止在促炎症细胞(pro-inflammatory cells)的募集和/或激活过程中RANTES和/或MIP-1α的效应。因此本发明可用于治疗如气喘、过敏性鼻炎、特异性皮炎、动脉粥样化/动脉粥样硬化和类风湿性关节炎等疾病。
除了上面讨论的多肽以外，本发明也包括编码该多肽(可以为分离的或重组的形式)的DNA序列、插入有该序列的载体和整合有该载体能表达本发明多肽的宿主细胞。
本发明的多肽可利用适当的DNA编码序列通过原核或真核宿主细胞的表达来生产。适当的技术公开于Sambrook等(1989)《分子克隆：实验指南》，冷泉港实验室出版社，美国。可选择地，它们可以通过共价修饰RANTES而生产。例如，可通过甲硫氨酸化RANTES作为其N-末端而完成。
本发明现将仅通过实施例来加以描述，参考附图，其中：
图1显示克隆入大肠杆菌中的RANTES编码序列的核苷酸序列以及
由该核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图2显示质粒pCBA-M的图谱。
图3显示质粒pT7-7的图谱。
图4显示能诱导THP-1细胞趋化性的各种趋化因子。
图5显示Met-RANTES能抑制MIP-1α和RANTES诱导的THP
-1细胞趋化性。
图6显示各种趋化因子能诱导THP-1细胞中的钙流动。
图7显示Met-RANTES能抑制RANTES诱导THP-1细胞的钙
应答。
图8显示Met-RANTES与RANTES竞争性结合CCKR1受体。
图9显示Leu-RANTES能作为RANTES诱导趋化性的拮抗剂而起
作用。
图10显示Gln-RANTES能作为RANTES诱导趋化性的拮抗剂而
起作用。
实施例(a)用PCR克隆人RANTES编码序列人RANTES用PCR从人骨髓λGt11 cDNA文库(Clontech)中被克隆。简言之，骨髓文库中总cDNA插入子首先在100μl反应体系中用位于EcoRI克隆位点两侧的λGT11引物加以扩增，该反应体系包括2μl噬菌体贮备液(106pfus)，10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，2.5单位AMPLITAQ(Perkin Elmer-Cetus)和1μM每种引物(λGT11 PCR-1(正向引物)5′GATTGGTGGCGACGACTCCT和λGT11 PCR-2(反向引物)5′CAACTGGTAATGGTAGCGAC)，在Techne PHC-2热循环仪中95℃2分钟，55℃2min和72℃5分钟进行30个循环。将十分之一的反应混合物再进行第二轮PCR，反应体系为100μl，现在是含有1μM根据发表的RANTES序列(Schall T.J.等，(《免疫学杂志》，1411018-1025(1988))的每种特定的引物(RANTES-1 5′CCATGAAGGTCTCCGCGGCAC有义链和RANTES-2 5′CCTAGCTCATCTCCAAAGAG反义链)在95℃2分钟，55℃2分钟和72℃2分钟进行30个循环。PCR产物在以0.5μg/ml溴化乙锭染色的3％NuSieve(FMC)琼脂糖凝胶上加以观察并且按预期RANTEScDNA(278bp)大小迁移的条带通过标准方法(Sambrook J.等，(1989)《分子克隆-实验指南》，冷泉港实验室出版社，美国)进行凝胶纯化。凝胶纯化的DNA然后根据制造商的操作指南在总体积为50μl体系中以T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)在37℃连续处理1小时使其末端补平。过后，再加入2.5μl 2.5mM dNTP和1μl大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段(New England  Biolabs)并在37℃进一步孵育30分钟。反应混合物然后在70℃加热30分钟失活再以Tris-HCl pH8.0饱和的酚/氯仿(1∶1 v/v)抽提一次。加入10μl 3M醋酸钠pH 5.5，1μl糖元(20mg/ml)(宝灵曼)和250μl乙醇在-20℃沉淀DNA。4℃10,000×g离心20分钟回收DNA并以70％的乙醇洗。最终的沉淀物以10ng/μl的浓度重悬于无菌水中。
在20μl体系中用2μl T4 DNA连接酶(400,000单位/毫升)(NewEngland Biolabs)在15℃至少16小时将平末端PCR产物(10ng)，连接到50ng EcoRV消化、碱性磷酸酶处理的pBluescript II SK-质粒上(Stratagene)。连接产物从1×TE(10mM Tris-HClpH8.0/1mM EDTA)稀释至100μl然后按前述的方法酚/氯仿抽提。加入10μl 3M醋酸钠pH5.5，1μl糖元(20mg/ml)和250μl乙醇在-70℃15分钟沉淀连接产物。DNA按上述用沉淀回收并且重悬于10μl无菌水。根据制造商的操作指南用Bio Rad基因脉冲仪(pulser)将5μl重悬的连接产物电穿孔进入电感受态的(electroccompetent)大肠杆菌XL-1 blue菌株(40μl)。电穿孔以后，加入1ml LB培养基并在37℃培养细胞1小时。此后，以100μl的培养产物铺板于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上并在37℃培养16小时。然后将单菌落挑入5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基并37℃培养过夜。根据制造商的操作指南，用WizardTM少量制备(mini-prep)DNA纯化系统(Promega)从3ml每个培养物中制备少量的质粒DNA制品少量制备(mini-preps)。根据制备商的操作指南，在15μl反应体系中以限制性酶HindIII和EcoRI(均来自New England Biolabs)酶切3μl少量制备的DNA的等分试样。反应产物在含有0.5μg/ml溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上加以分析。带有约280bp大小的插入子的少量制备DNAs然后根据制造商的操作指南，用T3和T7引物以及测序酶(USB)进行DNA序列分析。
pBluescript II SK-克隆载体按如下制备：根据制造商的操作指南，20μg氯化铯梯度纯化的质粒在100μl的反应体系中以200单位的EcoRV(New England Biolabs)在37℃消化2小时。2小时后，消化的载体用10μl小牛肠碱性磷酸酶(20 units/ml)(宝灵曼)进一步在37℃处理30分钟。反应混合物在68℃加热失活15分钟然后用Tris-HCl pH8.0饱和的酚/氯仿(1∶1 v/v)抽提一次。加入10μl 3M醋酸钠pH5.5和250μl乙醇在-20℃沉淀质粒DNA。4℃10,000×g离心20分钟回收DNA，以70％乙醇洗。最终沉淀以50ng/ml的浓度重悬于无菌水中。
测序表明，除了PCR序列核苷酸22发生单碱基改变而导致RANTES前肽(propeptide)预期信号序列中精氨酸到脯氨酸的改变外，获得的所有克隆均与发表的序列一致。
这在图1中被描述，其中给出了克隆DNA的编码序列与相应的氨基酸序列。
(b)甲硫氨酸化RANTES(RANTES拮抗剂)表达载体的制备
将含有RANTES基因的构建体进行PCR，使用引物为
5′TTAATTAATTAA ATCGATT CATATG.
TCC.CCA.TAT.TCC.TCG.GAC.AC-3′
其中2个划线部分分别为Clal和Ndel限制位点(Ndel位点包括起始甲硫氨酸密码子的一部分)和5′-TACTGATATAAATCTAGACTAGCTCATCTCCAAAGAGTTG-3′
该片段然后在5′端以Clal切割且3′端以Xbal切割。图2所示的质粒pCba-M然后以Xbal/Sall切。大片段以Sall和Clal切。然后用第一次Sall/Xbal酶切的小片段、第二次Sall/Clal酶切片段和PCR片段进行三批连接以产生类似pCba-M的构建体，其中的mTNF基因被以甲硫氨酸起始的分泌型人RANTES基因所替代。(分泌型人RANTES不包括图1所示的氨基酸序列的前23个氨基酸。它包括图1所示的其余氨基酸并以SPY…起始)。
然后从该载体中切下Ndel/Sall片段并装入图3所示的t7表达质粒pT7-7。该片段含有感兴趣的基因和600bp的其它成分，但后来的实验(未包括在此)显示去除其余成分(载体序列)对表达水平没有影响。
pT7型表达载体由Studier FW，Rosenberg AH等，在《酶学方法》(Meth Enzymol)，185，60-89，(1990)中讨论过。构建体然后转化进入大肠杆菌BL21(DE3)菌株(F-ompT，hsd sB(rB-，mB-)，含有pACYC184质粒(Chang和Cohen，J.Bact，134，1141，1978)上的LysS基因)。该表达载体需要T7聚合酶被顺序诱导以使蛋白表达发生。在细胞中T7聚合酶通过加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至培养基而被诱导。
(c)Met-RANTES的确显示拮抗活性的证明
(i)趋化性分析
根据制造商的操作指南，用96孔小室(Neuro Probe MB series，Cabin John，MD 20818，USA)进行体外趋化性分析。用人单核细胞系，THP-1分析CC趋化因子，RANTES，MIP-1α和MCP-1诱导的趋化性。4×105个THP-1细胞于200μl含2％灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco)中在每孔的上层室中孵育。含有适当稀释度化学引诱剂(即趋化因子)的370μl RPMI 1640培养基(无FCS)置于下层室(lower chamber)。为了趋化性抑制，趋化因子保持5×EC50的恒定浓度，事先测定每种趋化因子，且Met-RANTES以不同浓度加入。小室于5％CO2中37℃孵育1 小时。去除上层室中培养基且替代以含20mM EDTA的PBS并将孔板室在4℃孵育30分钟。移去上层室中的PBS并擦干。整体以1800rpm离心10分钟以收获下层室细胞且上清液通过蒸发去除。用Cell Titer(细胞滴度)88TM Non-Radioactive Cell Proliferation Assay.(非放射性细胞增殖分析)(Promega，Madison USA)测量下层室细胞，这种分析可监测四唑鎓蓝(tetrazolium blue)向其甲(formazan)产物的转化。向每孔中加入100μl含10％Dye溶液的RPMI 1640培养基，并将小室于5％CO2中孵育过夜。每孔中加入100μl增溶剂(Solubilisation solution)且在Thermomax微量滴定板计数器(microtitre plate reader)(MolecularDevicas，Palo Alto CA)中4小时后在500nm处读其吸收值。
结果显示于图4和图5。
(ii)钙流动
根据Tsien R Y.，Pozzan T.，和Rink T J.，((1982)“在完整的淋巴细胞中钙的稳态：以一种新的细胞内诱捕荧光指示剂监测细胞质游离钙”，《细胞生物学杂志》94)但用Fura-2/AM(Fluka)代替Quin 2作为荧光指示剂测量趋化因子RANTES和MIP-1α诱导的钙流动。在不到106/ml时收获THP-1细胞以确保它们处于指数期。细胞按106/ml浓度重悬于含0.2％Fura-2/AM和1mg/ml BSA的Krebs-Ringer溶液并在避光条件下37℃孵育30分钟。离心收获细胞并重悬于Krebs-Ringer溶液置冰上。使用前取1ml该悬液37℃孵育2分钟。边搅拌边向细胞悬液中加入趋化因子。为研究Met-RANTES的抑制，按不同浓度将拮抗剂等分试样在37℃孵育2分钟过程中加入细胞中。结果显示于图6和图7中。
(iii)受体结合分析
在96孔多重滤网滤板(96well mutiscreen filter-plates)(Millipore，MADV N6500)中进行竞争性分析，该滤板以pH7.2含1mM CaCl2，5mM MgCl2和0.5％BSA，(结合缓冲液)的50mMHEPES缓冲液预处理2小时。用THP-1细胞或表达重组CC-CKR1受体(Neote，K.，DiGregorio，Mak，J.Y.，Horuk，R.，和Schall，T.J.，(1993)C-C趋化因子受体的分子克隆，功能表达和信号特征，《细胞》72 415-425；Gao，J.L.等《实验医学杂志》，177 1421-7(1993))的COS细胞进行分析。每孔含150μl结合缓冲液，内有105个细胞，该缓冲液含0.4nM[I125]Mip-1α或0.4nM[I125]RANTES(new England Nuclear，NEX 277)且变换竞争Met-RANTES的浓度。分析重复3次。4℃孵育90分钟以后，以200μl含0.5MNaCl的冰冷的结合缓冲液洗细胞4次并以蒸发将其去除。滤孔(filters)干燥后，加入3.5ml Ultima Gold闪烁液(Packard)并在BeckmanLS5000计数器上计数。结果显示于图8。
(d)Leu-RANTES(这里也称L-RANTES)的制备和其拮抗作用的证明
L-RANTES表达载体分两步构建。首先PCR用于在第一半胱氨酸密码子中截下人RANTES基因并在基因两端导入单一的限制位点。用基因5′端导入的SacI位点和基因3′端设计的产生与HindIII粘端相容的BsmAI位点将该PCR产物克隆到基于T7的大肠杆菌表达载体pET23d(Novagen)上。编码人RANTES N-末端变异的基因然后通过向RANTES编码序列紧接5′端插入编码变异的寡核苷酸而产生。于这个目的，pET23d中截短的RANTES克隆以SacI酶切，后用T4 DNA聚合酶去除SacI留下的3′突出端然后再用NcoI进行第二次酶切。编码肽序列为MKKKWPRLSPYSSDTTP的寡核苷酸然后克隆到酶切过的载体上。pET23d/L-RANTES构建体的表达按pT7-7构建体的描述进行。
pET23d/RANTES NcoI    pET23d/RANTES  SacI/T4
5′C                    C  TGC   TTT  3′
3′GGTAC                G  ACG   AAA  5′
L-RANTES寡核苷酸
5′    CATGAAAAAAAAATGGCCAAGGCTGT
    CCCCGTACTCCTCCGACACCACCCCGTG
3′    TTTTTTTTTACCGGTTCCGACA
GGGGCATGAGGAGGCTGTGGTGGGGCAC
pET23d/L-RANTES构建体是表达载体系列之一，它们可用于产生在-1位置具有不同氨基酸的RANTES。这些T7表达载体编码N-末端序列为MKKKWPR-X-RANTES的蛋白。例如X可以为L，I， Q，E或G。用内切-Arg-C蛋白酶(endo-Arg-C)切割将产生不同的X-RANTES蛋白。+2    M  K  K   K  W  P  R   L  S  P   Y  S  S   D  T  T1   CATGAAAAAA AAATGGCCAA GGCTGTCCCC GTACTCCTCC GACACCACCC
 GTACTTTTTT TTTACCGGTT CCGACAGGGG CATGAGGAGG CTGTGGTGGG+2  P  C  C  F   A  Y  I   A  R  P  L   P  R  A   H  I  K51   CGTGCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TGCCCCGTGC CCACATCAAG
 GCACGACGAA ACGGATGTAA CGGGCGGGTG ACGGGGCACG GGTGTAGTTC+2  E  Y  F  Y   T  S  G   K  C  S   N  P  A  V   V  F  V101 GAGTATTTCT ACACCAGTGG CAAGTGCTCC AACCCAGCAG TCGTCTTTGT
CTCATAAAGA TGTGGTCACC GTTCACGAGG TTGGGTCGTC AGCACAAACA+2   T  R  K   N  R  Q  V   C  A  N   P  E  K   K  W  V151 CACCCGAAAG AACCGCCAAG TGTGTGCCAA CCCAGAGAAG AAATGGGTTC
GTGGGCTTTC TTGGCGGTTC ACACACCGTT GGGTCTCTTC TTTACCCAAG+2 R  E  Y  I   N  S  L   E  M  S  *
                                  HINDIII NOTI    XHOI
                                  --------------  ----201 GGGAGTACAT CAACTCTTTG GAGATGAGCT AAAGCTTGCG GCCGCACTCG
CCCTCATGTA GTTGAGAAAC CTCTACTCGA TTTCGAACGC CGGCGTGAGC
Leu-RANTES的纯化按如下进行：
4g E.coli细胞团悬浮于pH7.6，含1mM二硫苏糖醇，5mM苯甲酰胺-HCl，0.1mM苯甲基磺酰氟和DNA酶(0.02mg/ml)的15ml50mM Tris-HCl缓冲液中。细胞通过French Pressure Cell用三种途径(passages)破碎，每种途径后冰上超声粉碎1分钟。得到的溶液在10 000×g离心60分钟。沉淀溶于pH8.0，含6M盐酸胍和1mM二硫苏糖醇的2ml100mM Tris-HCl缓冲液中。溶液于60℃加热60分钟以确保形成单体(monomerisation)，冷却至室温并在用相同缓冲液平衡的Superdex-200 16/60柱子上凝胶过滤。含有重组RANTES构建体的级分(16ml)逐渐加入到pH8.0，含1mM氧化型谷胱甘肽和0.1mM还原型谷胱甘肽的384ml 100mM Tris-HCl缓冲液中而变性并搅拌过夜。溶液用pH4.5的50mM醋酸钠缓冲液透析，然后上样于以相同缓冲液平衡的HlLoad SP26/10柱。蛋白通过相同缓冲液中0-2M NaCl线性梯度进行洗脱。含有变性蛋白的部分进行3×5 liter 1％醋酸透析并冷冻干燥。
为了从融合蛋白中去除KKKWPR六肽，将冷冻干粉溶于水且于50mM Tris-HCl缓冲液中调至1mg/ml，pH8.0。向2ml该溶液中加入20μg蛋白内切酶Arg C(宝灵曼)且将溶液于37℃孵育2小时。用0.1％三氟乙酸平衡的Nucleosil-C5(10×250mm)柱通过反相HPLC从蛋白消化的起始材料中加以分离。蛋白以0.1％三氟乙酸中22.5％-45％的乙腈梯度进行洗脱，冷冻干燥并保存于-80℃。
按Met-RANTES蛋白描述，对RANTES诱导的THP-1细胞趋化性的拮抗活性进行测试。
结果显示于图9。
(e)Gln-RANTES的制备(有时称为Q-RANTES)和拮抗作用的证明
为了制备Gln-RANTES，重复上面(d)描述的步骤，在细节上作必要的修改。
按照对Met-RANTES蛋白的描述方法测试Gln-RANTES对RANTES诱导的THP-1细胞趋化性拮抗活性。结果显示于图10。

Claims (6)

1.一种多肽，其具有如下序列：(i)MSPYSSDT  TPCCFAYIAR  PLPRAHIKEY  FYTSGKCSNP
AVVFVTRKNR  QVCANPEKKW  VREYINSLEM  S(Met-RANTES)；或(ii)LSPYSSDT  TPCCFAYIAR  PLPRAHIKEY  FYTSGKCSNP
AVVFVTRKNR  QVCANPEKKW  VREYINSLEM  S(Leu-RANTES)；或(iii)QSPYSSDT  TPCCFAYIAR  PLPRAHIKEY  FYTSGKCSNP
AVVFVTRKNR  QVCANPEKKW  VREYINSLEM  S(Gln-RANTES)。
2.权利要求1的多肽，其中该多肽的序列为：MSPYSSDT  TPCCFAYIAR  PLPRAHIKEY  FYTSGKCSNP
AVVFVTRKNR  QVCANPEKKW  VREYINSLEM  S(Met-RANTES)。
3.编码权利要求1或2的多肽的DNA或RNA序列。
4.含有权利要求3的序列的载体。
5.含有权利要求4载体的宿主细胞。
6.生产权利要求1或2的多肽的方法，包括使权利要求5的宿主细胞表达所述的多肽。
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