HU221089B1 - Rantes peptide derivates with antagonistic effect and uses thereof - Google Patents

Rantes peptide derivates with antagonistic effect and uses thereof Download PDF

Info

Publication number
HU221089B1
HU221089B1 HU9702199A HU9702199A HU221089B1 HU 221089 B1 HU221089 B1 HU 221089B1 HU 9702199 A HU9702199 A HU 9702199A HU 9702199 A HU9702199 A HU 9702199A HU 221089 B1 HU221089 B1 HU 221089B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
rantes
polypeptide
protein
sequence
cells
Prior art date
Application number
HU9702199A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT77075A (hu
Inventor
Amanda Elizabeth Inn Proudfoot
Timothy Nigel Carl Wells
Original Assignee
Glaxo Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9424835.8A external-priority patent/GB9424835D0/en
Priority claimed from GBGB9512319.6A external-priority patent/GB9512319D0/en
Application filed by Glaxo Group Ltd filed Critical Glaxo Group Ltd
Publication of HUT77075A publication Critical patent/HUT77075A/hu
Publication of HU221089B1 publication Critical patent/HU221089B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

A találmány tárgyát a RANTES-protein – az eredeti proteinhez képestantagonista hatással rendelkező – származékai képezik, továbbá aszármazékokat kódoló nukleinsavak, a nukleinsavakat tartalmazóvektorok, a vektorokat hordozó gazdasejtek, valamint az említettpolipeptidek terápiás és diagnosztikus alkalmazása és a polipeptidekelőállítására szolgáló eljárások. A találmány szerinti polipeptidek, aRANTES-protein vagy MIP–1?-protein közvetítette gyulladás gátlásánvagy annak csökkentésén keresztül, alkalmasak különböző megbetegedésekkezelésére. ŕ

Description

A találmány tárgyát a RANTES-protein - az eredeti proteinhez képest antagonista hatással rendelkező származékai képezik, továbbá a származékokat kódoló nukleinsavak, a nukleinsavakat tartalmazó vektorok, a vektorokat hordozó gazdasejtek, valamint az említett polipeptidek terápiás és diagnosztikus alkalmazása és a polipeptidek előállítására szolgáló eljárások.
A találmány szerinti polipeptidek, a RANTES-protein vagy ΜΙΡ-Ια-protein közvetítette gyulladás gátlásán vagy annak csökkentésén keresztül, alkalmasak különböző megbetegedések kezelésére.
A RANTES néven ismert proteint eredetileg Schall T. J. és munkatársai: klónozták [J. Immunoi. 141 1018 (1988)], a Krensky-laboratóriumban („Stanford University School of Medicine”). A „RANTES” elnevezés rövidítés, a „Raised on activation, normál T-cell derived and secreted” (aktiváció hatására, normális T-sejtekből származó és azok által szekretált) kifejezés kezdőbetűiből áll (a megfelelő betűket aláhúzással jelöltük). A protein expressziója T-sejtek antigén-stimulációjával vagy mutagénnel történő aktivációjával váltható ki. A protein a kemokinek főcsaládjába tartozik [Schall T. J.: Cytokine 3, 165 (1991); Oppenheim J. J. és munkatársai: Ann. Rév. Immunoi. 9, 617 (1991)]. A tisztított proteint először 1992-ben azonosították, vérlemezkékben [Kameyoshi és munkatársai: J. Exp. Med. 176, 587 (1992)]. A protein eozinofil sejtek, CD4+CD45RO+-Tsejtek és monociták hatásos attraktora. A fenti protein aminosavszekvenciája hatvannyolc aminosavból áll.
A RANTES-protein receptorát nemrégiben klónozták [Gao J. L. és munkatársai: J. Exp. Med. 177, 1421 (1993); Neote K. és munkatársai: Cell 72, 415 (1993)], és arról kimutatták, hogy a következő rangsor szerint képes kemokinek kötésére: MIP-la>RANTES.
A találmány tárgyát képezik polipeptidek, amelyek a RANTES- és/vagy ΜΙΡ-Ια-proteinek antagonistái.
A nagy érdeklődés ellenére, amely általánosságban a citokineket övezi - és közelebbről, a RANTES-protein és a RANTES-receptorok jellemzésére irányuló említett vizsgálatok ellenére -, a fenti antagonistákra és az ilyen antagonisták alkalmazási lehetőségeire vonatkozó leírás a szakirodalomban nem található.
A találmány tárgyát képezik a RANTES-proteinnel jelentős aminosavszekvencia-homológiát mutató polipeptidek, amelyek a RANTES-protein és/vagy a ΜΙΡ-Ιαprotein antagonistáiként hatnak, a következő pontok egyikének vagy azok közül többnek vonatkozásában:
(a) a RANTES- vagy MIP-Ια-proteinek által THP-l-sejtekre gyakorolt kemotaktikus hatás;
(b) RANTES-protein és/vagy MIP-Ια-proteinek jelenléte által, THP-l-sejtekben előidézett kalciumionmobilizáció;
(c) RANTES-protein THP-1-sejtreceptorokhoz történő kötődése.
A találmány szerinti polipeptidek alkalmazhatók a RANTES-protein és annak hatásai további jellemzésére, például RANTES-protein által kiváltott kemotaxis, a kalciumion-mobilizáció és a receptorkötődés vizsgálatára. Az említett polipeptidek, hasonló okokból, alkalmazhatók továbbá, ΜΙΡ-Ια-protein vizsgálatára.
Ezen felül, a találmány szerinti polipeptidek alkalmazhatók különböző betegségek kezelésére, az alábbiakban ismertetettek szerint.
A találmány szerinti polipeptidek előnyösen, a RANTES-protein és/vagy ΜΙΡ-Ια-protein antagonistáiként hatnak, egy vagy több, N-terminális aminosav jelenlétének következtében (amelyek a RANTES-proteinben nincsenek jelen a megfelelő pozíciókban, és ezért a RANTES-protein N-terminális aminosavaihoz képest járulékos N-terminális aminosavaknak tekinthetők). Ezek az N-terminális aminosavak előnyösen, a természetben előforduló (L-)-aminosavak (amelyek rekombináns DNS-technikák vagy peptidfúziós technikák alkalmazásával a szekvenciába beépíthetők). Alkalmazhatók azonban, természetben elő nem forduló aminosavak (például D-aminosavak) is. Ezek beépítése kémiai szintézistechnikák alkalmazásával történhet.
A protein tartalmazhat csupán egyetlen további aminosavat, mely esetben, ez lehet például leucin vagy metionin. Ilyen polipeptideket bármely alkalmas eljárással előállíthatunk (például génklónozásra alkalmazható technikákkal, kémiai úton történő szintézissel stb.). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az említett polipeptideket úgy kapjuk meg, hogy a kívánt szekvenciát tartalmazó, nagyobb polipeptidet állítjuk elő, majd azt enzimatikus úton hasítjuk, hogy a kívánt szekvenciával rendelkező polipeptidhez jussunk.
A találmány szerinti polipeptidek tartalmazhatnak egynél több, járulékos N-terminális aminosavat, például tartalmazhatnak öt, tíz vagy akár húsz további aminosavat. A találmány egy további megvalósítási módja szerint, a polipeptidben húsznál több, járulékos N-terminális aminosav lehet jelen.
Ilyen polipeptideket szintén bármely alkalmas eljárással előállíthatunk.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.
Kimutattuk, hogy RANTES-érett, humán RANTES-protein formájában (azaz, olyan protein formájában, amelyről a szignálszekvencia el lett távolítva) történő expresszálására szolgáló E. coli expressziós rendszerben olyan polipeptid expresszálódott, amelyben egy járulékos N-terminális aminosav volt jelen (amelyet az endogén E. co/i-proteázok nem hasítottak le a megmaradó szekvenciáról). Meglepő módon azt találtuk, hogy ennek a járulékos aminosavnak a jelenléte, az eredeti RANTES-proteinhez képest, lényegesen megváltozott tulajdonságokkal rendelkező polipeptidet eredményezett. A járulékos metionin-aminosavat tartalmazó polipeptidről (amelyet a leírásban metionilezett RANTES-proteinként vagy Met-RANTES-proteinként említünk) kimutattuk, hogy az különböző vizsgálati rendszerekben a RANTES-protein és a MIP-la-protein antagonistájaként viselkedik, és jelentősebb mértékű agonista hatást nem mutat.
Megjegyzendő, hogy számos olyan esetben, amikor E. coliban N-terminális metionilezés fordul elő, az csak kismértékben változtatja meg vagy egyáltalán nem változtatja meg a polipeptid sajátságait, vagy csak kismértékben csökkenti annak eredeti biológiai aktivitá2 i
HU 221 089 B1 sát. Ezért teljesen váratlanul ért bennünket az a tény, hogy a jelen esetben, az N-terminális metionilezés antagonista aktivitású proteint eredményezett.
Annak megállapítása céljából, hogy az említett hatás létrejötte az N-terminális metionin jelenlétére korlátozódik-e, előállítottunk egy másik polipeptidet, amelyben az N-terminális metionint N-terminális leucinnal helyettesítettük. Ez a polipeptid szintén a RANTES-protein antagonistájaként hatott, mint ahogy az a polipeptid is, amelyben az N-terminális metionint N-terminális glutaminnal helyettesítettük.
A találmány szerinti polipeptidek előnyösen, a következő szekvenciával rendelkeznek:
(i) MSPYSSDT TPCCFAY1AR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S (amelyet a leírásban esetenként „Met-RANTES-proteinnek” nevezünk);
(ii) LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S (amelyet a leírásban esetenként „Leu-RANTES-proteinnek” nevezünk); valamint (iii) QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S (amelyet a leírásban esetenként „Gln-RANTES-proteinnek” nevezünk);
vagy a fenti szekvenciák valamelyikével lényegében homológ szekvenciával rendelkeznek. A polipeptid lehet glikozilezett vagy nem glikozilezett formában.
Akkor mondjuk, hogy egy szekvencia az adott aminosavszekvenciával „lényegében homológ”, ha a két szekvencia egymással legalább 40%-os, 50%-os, 60%os, 70%-os, 80%-os, 90%-os, 95%-os vagy 99%-os homológiát mutat (az előnyösebb megvalósítási mód sorrendjében). A fenti meghatározás - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - vonatkozik olyan aminosavszekvenciákra, amelyek a kérdéses szekvenciához képest 1-20, 1-10, vagy 1-5 aminosavdeléciót, -inszerciót, vagy -szubsztitúciót tartalmaznak, amennyiben az így kapott polipeptid a RANTES-protein vagy a ΜΙΡ-Ια-protein antagonistájaként viselkedik.
A polipeptid lehet lényegében tiszta formában. Azt izolálhatjuk a természetben előforduló natív polipeptidekből.
A technika állása szerint jól ismert az a tény, hogy bizonyos aminosavak más aminosavakkal helyettesíthetők, anélkül, hogy a polipeptid sajátságai lényegesen megváltoznának. A találmány tárgyát képezik ilyen változtatások is.
Megjegyzendő továbbá, hogy létrehozhatók olyan aminosavdeléciók vagy -inszerciók, amelyek nem eredményezik a polipeptid sajátságainak lényeges megváltozását. A találmány tárgyát képezik ilyen deléciók vagy inszerciók is (amelyek érinthetik például a fenti antagonista szekvenciák 10%-át, 20%-át vagy 50%-át). A találmány tárgyát képezik továbbá fúziós proteinek, amelyekben a találmány szerinti polipeptidek más csoportokkal vannak füzionáltatva. A fúziót végrehajthatjuk jelölés céljából vagy a vegyület orvosi felhasználása céljából.
Kimutattuk, hogy a találmány szerinti polipeptidek a RANTES-protein vagy a ΜΙΡ-Ια-protein antagonistáiként hatnak, a következő hatások tekintetében: a RANTES-protein vagy a MIP-Ια-protein kemotaktikus hatása tekintetében; a kalciummobilizáció tekintetében; és a THP-l-sejtek (egy monocitaeredetű sejtvonal) receptoraihoz történő kötődés tekintetében. Az említett sejtek hozzáférhetők az „American Type Culture Collection” (ATCC) gyűjteményéből, és azok megfelelő modellrendszert képeznek a RANTES-protein vizsgálatához, mivel RANTES-protein és a MIP-la-protein, valamint egyéb kemokinek, például MCP-l-protein hatására kalciummobilizációs és kemotaktikus válaszreakciót mutatnak. A polipeptid, a fenti sejtek alkalmazása esetén, a RANTES-proteinhez vagy a ΜΙΡ-Ια-proteinhez képest antagonista hatást is kifejthet, annak kemotaktikus hatása, kalciummobilizációs hatása, valamint receptorokhoz történő kötődése tekintetében. A ΜΙΡ-Ια-proteint először a makrofágokban, gyulladás hatására képződő (inflammatorikus) polipeptidfrakció („Macrophage Inflammatory Polypeptide Fraction”) részeként azonosították (amely utóbb, MIP-la- és ΜΙΡ-Ιβ-proteinekre hasad) [Obaru K. és munkatársai: J. Biochem. 99, 885 (1988); Sipple P. F. és munkatársai: J. Immunoi. 142, 1582 (1989)]. Ez a vegyület kemotaktikus aktivitást mutat T-sejtekkel és monocitákkal szemben. Ezenfelül, a fenti protein hatékony inhibitora a törzssejt-proliferációnak.
A fenti megfigyelések alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a találmány szerinti polipeptidek alkalmazhatók RANTES- és/vagy ΜΙΡ-Ια-protein hatásainak gátlására, ezáltal alkalmasak terápiás célú felhasználásra. A találmány szerinti polipeptidek előnyösen alkalmazhatók RANTES- és/vagy ΜΙΡ-Ια-protein hatásainak gátlására, a proinflammatorikus sejtek toborzása és/vagy aktiválása tekintetében. A találmány szerinti polipeptidek alkalmazhatók betegségek kezelésére, például asztma, allergiás ormyálkahártya-gyulladás (allergiás rhinitis), atópiás dermatitisz (bőrgyulladás), atheroma (az érfal ateroszklerotikus beszűrődése)/ateroszklerózis (érelmeszesedés) és reumatoid artritisz (reumatoid ízületi gyulladás) kezelésében.
Az említett polipeptideken felül, a találmány tárgyát képezik az ilyen polipeptideket kódoló DNS-szekvenciák (amelyek lehetnek izolált vagy rekombináns formák); az említett szekvenciákat tartalmazó vektorok; valamint ilyen vektorokat tartalmazó, a találmány szerinti polipeptidek expresszálására képes gazdasejtek.
A találmány szerinti polipeptidek előállíthatok prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekben történő expresszió útján, a megfelelő DNS kódolószekvenciák alkalmazásával. A fenti célra alkalmazhatók például az alábbi szakirodalmi helyen ismertetett technikák: Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, „Cold Spring Harbor Laboratory Press”, USA (1989). Az említett polipeptidek előállíthatok továbbá a RANTES-protein kovalens módosításával. Az utóbbit végezhetjük például a RANTES-protein N-terminális végen történő metionilezésével.
HU 221 089 Β1
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásokhoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábrán a RANTES-protein kódolószekvenciájának E. coliba klónozott nukleotidszekvenciája, valamint a fenti nukleotidszekvencia által kódolt aminosavszekvencia látható.
A 2. ábrán a pCBA-M-plazmid térképét ábrázoltuk.
A 3. ábrán a pT7-7-plazmid térképét ábrázoltuk.
A 4. ábra azt mutatja, hogy különböző kemokinek képesek ΊΉΡ 1 -sejtekben kemotaxist kiváltani.
Az 5. ábra azt szemlélteti, hogy Met-RANTES THP-l-sejtek alkalmazása esetén, képes a ΜΙΡ-Ια- és RANTES-proteinek által kiváltott kemotaxis gátlására.
A 6. ábra azt mutatja, hogy különböző kemokinek THP-l-sejtekben képesek kalciumáramlás kiváltására.
A 7. ábrán az látható, hogy a Met-RANTES THP-l-sejtekben képes a RANTES-protein által kiváltott kalciumáramlás gátlására.
A 8. ábra azt mutatja, hogy a Met-RANTES RANTES-proteinnel kompetitív módon kötődik CCKR1-receptorokhoz.
A 9. ábra szerint, a Leu-RANTES, RANTES-protein által kiváltott kemotaxis tekintetében antagonistaként viselkedik.
A 10. ábrán az látható, hogy a Gln-RANTES, RANTES-protein által kiváltott kemotaxis vonatkozásában antagonistaként hat.
All. ábrán a pET23d/L-RANTES-plazmid hasítási térképét és az L-RANTES-gén kódolószekvenciáját láthatjuk.
1. példa
Humán RANTES-proteint kódoló szekvencia klónozása PCR-eljárással
Humán RANTES-proteint humáncsontvelő-eredetű ZGTl 1 -cDNS-génkönyvtárból klónoztunk (Clontech), PCR-eljárással. Röviden, először a csontvelő-génkönyvtárban található összes cDNS-inszertet, az EcoRI klónozási helyet közrefogó Xgt láncindító oligonukleotidok alkalmazásával amplifikáltuk, 100 μΐ olyan reakcióelegyben, amely az alább felsoroltakat tartalmazta: 2 μΐ fágtörzs (106 plakképző egység); 10 mmol/1 Tris-HCl (pH=8,3); 50 mmol/1 KC1; 1,5 mmol/1 MgCl2; 0,2 mmol/1 az egyes dNTP-kből; 2,5 egység AMPLITAQ™ (Perkin Elmer-Cetus); és 1 μιηοΐ/l az egyes láncindító oligonukleotidokból (ZGT11PCR-1 (előreirányuló láncindító oligonukleotid), 5’-GATTGGTGGCGACGACTCCT és XGTllPCR-2 (reverz láncindító oligonukleotid), 5’-CAACTGGTAATGGTAGCGAC]; a reakciót „Techne PHC-2” termociklusos készülékben végeztük, 30 ciklus és az alábbi körülmények alkalmazásával: 95 °C-on, 2 perc; 55 °C-on, 2 perc; és 72 °C, 5 perc. Ezt követően a reakcióelegy egy tizedét egy második PCR-reakciónak vetettük alá, 100 μΐ olyan reakcióelegyben, amely az alább felsoroltakat tartalmazta: 1-1 pmol/l, a RANTES-protein közölt szekvenciája [Schall T. J. és munkatársai: J. Immunoi. 141, 1018 (1988)] alapján tervezett specifikus láncindító oligonukleotid [RANTES-1, 5’-CCATGAAGGTCTCCGCGGCAC (szensz); és RANTES-2, 5’-CCTAGCTCATCTCCAAAGAG (antiszensz)]; a reakciót 30 ciklus és az alábbi körülmények alkalmazásával végeztük: 95 °C-on, 2 perc; 55 °C-on, 2 perc; és 72 °C, 2 perc. A PCR-termékeket 0,5 pg/ml etidiumbromiddal festett, 3%-os „Nu-Sieve” (FMC) agarózgéleken tettük láthatóvá, és a RANTES-cDNS méretének (278 bázispár; bp) megfelelően vándorolt csíkokat, ismert eljárások alkalmazásával gélen tisztítottuk [Sambrook J. és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, „Cold Spring Harbor Laboratory Press”, USA (1989)]. Ezt követően a gélen tisztított DNS-t tompa végűvé alakítottuk úgy, hogy a DNSt 50 μΐ össztérfogatú reakcióelegyben, 1 órán át, 37 °Con ismételten T4-polinukleotid-kinázzal kezeltük, a gyártó utasításai szerint (New England Biolabs). Ezt követően a reakcióelegyhez 2,5 μΐ, az egyes dNTP-ket 2,5 mmol/1 koncentrációban tartalmazó oldatot, valamint 1 μΐ E. coli DNS-polimeráz 1. Klenow-fragmenst adtunk (New England Biolabs), és az inkubációt 37 °Con, további 30 percig folytattuk. Ezután a reakcióelegyet 30 percig, 70 °C-on hővel inaktiváltuk, majd Tris-HCl-pufferrel (pH=8,0) telített fenol/kloroform eleggyel (1:1 térfogat/térfogat) extraháltuk. A DNS-t 10 μΐ, 3 mol/1 nátrium-acetát (pH=5,5), 1 μΐ glikogén (20 mg/ml) (Boehringer) és 250 μΐ etanol hozzáadásával, -20 °C-on precipitáltuk. A DNS-t, 4 °C-on, 10 000 g-n, 20 percig végzett centrifugálással kinyertük, és 70%-os etanollal mostuk. Az így kapott üledéket 10 ng/μΐ koncentrációban, steril vízben szuszpendáltuk.
A tompa végűvé alakított PCR-terméket (10 ng), 2 μΐ T4-DNS-ligáz alkalmazásával (New England Biolabs), 15 °C-on, 16 óráig tartó inkubálással, 50 ng, EcoRI-emésztett, alkalikus foszfatázzal kezelt pBluescript-IISK-plazmidba (Stratagene) ligáltuk. A ligálással kapott terméket 1 χ TE-pufferrel (10 mmol/1 Tris-HCl (pH=8,0); 1 mmol/1 (EDTA) 100 μΐ térfogatra hígítottuk, és fenol/kloroform eleggyel, az előzőekben ismertetettek szerint extraháltuk. A ligálással kapott termékeket 10 μΐ, 3 mol/1 nátrium-acetát (pH=5,5), 1 μΐ glikogén (20 mg/ml) és 250 μΐ etanol hozzáadásával, 15 perc alatt, -70 °C-on precipitáltuk. Ezt követően DNS-t az előzőekben ismertetettek szerint centrifugálással kinyertük, és 10 ng/μΐ koncentrációban, steril vízben szuszpendáltuk. A szuszpendált ligációs termék 5 μΐ térfogatú mintáját elektroporációval, „Bio Rád Gene Pulser” készülék alkalmazásával, elektrokompetens E. coli XL-1-blue-sejtekbe (40 μΐ) juttattuk, a gyártó utasításai szerint eljárva. Az elektroporációt követően a sejtekhez 1 ml LB-táptalajt adtunk, és a sejteket 1 órán át, 37 °C-on tenyésztettük. Ezt követően a tenyésztő tápfolyadékból 100 μΐ térfogatú mintákat, 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezekre oltottunk, és a lemezeket 16 órán át, 37 °C-on inkubáltuk. Különálló baktériumtelepeket, 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-táptalajba vittünk át, és a baktérium4
HU 221 089 Β1 sejteket egy éjszakán át, 37 °C-on tenyésztettük. Az egyes tenyészetek 3 ml térfogatú mintájából kis mennyiségű plazmid-DNS-készítményeket állítottunk elő (,,mini-prep”-DNS), „Wizard”™ mini-prep DNStisztító reagenskészlet (Promega) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint. Ezt követően a mini-prepDNS 3 μΐ térfogatú mintáját 15 pl reakcióelegyben, HindlII és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük (New England Biolabs), a gyártó utasításai szerint eljárva. A reakció termékét 0,5 μg/ml etidium-bromidot tartalmazó, 1%-os agarózgéleken analizáltuk. A körülbelül 280 bp méretű inszertet tartalmazó mini-prep-DNSkészítményeket szekvenciaanalízisnek vetettük alá, T3 és T7 jelű láncindító oligonukleotidok, valamint „Sequenase” (USB) reagenskészlet alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint.
A pBluescript-IISK jelű klónozó vektort az alábbi módon állítottuk elő: 20 pg, CsCl-gradiensen tisztított plazmidot 100 μΐ reakcióelegyben, 2 órán át, 37 °C-on, 200 egység EcoRV-enzimmel emésztettünk (New England Biolabs), a gyártó utasításai szerint. Két óra elteltével az emésztett vektort további 30 percig 37 °C-on, 10 μΐ, borjúbélből izolált alkalikus foszfatázzal kezeltük (10 egység/ml; Boehringer). A reakcióelegyet 15 percig, 68 °C-on történő inkubálással, hővel inaktiváltuk, majd Tris-HCl-pufferrel (pH = 8,0) telített fenol/kloroform eleggyel (1:1 térfogat/térfogat), egy alkalommal extraháltuk. A plazmid-DNS-t 10 μΐ, 3 mol/1 nátrium-acetát (pH=5,5) és 250 μΐ etanol hozzáadásával, -20 °C-on precipitáltuk. A DNS-t 4 °C-on, 10 000 g-n, 20 percig végzett centrifugálással kinyertük, és 70%-os etanollal mostuk. Az így kapott üledéket 50 ng/μΐ koncentrációban, steril vízben szuszpendáltuk.
A szekvenálás szerint, valamennyi kapott klón szekvenciája megegyezett a szakirodalomban közölt szekvenciával, egyetlen báziscsere kivételével, amely a PCR-termék esetében, a RANTES-propeptid feltételezett szignálszekvenciájában, a 22. pozícióban Arg-aminosav helyett Pro-aminosavat eredményezett.
A fentieket szemlélteti az 1. ábra, amelyen a klónozott DNS klónozószekvenciáját ábrázoltuk, a megfelelő aminosavszekvenciával együtt.
2. példa
Expressziós vektor előállítása, metionilezett RANTES-protein (egy RANTES-antagonista) expresszálására
A RANTES-proteint kódoló gént tartalmazó konstrukciót PCR-elj árásnak vetettük alá, a következő láncindító oligonukleotidok alkalmazásával:
’ -TTAATTAATTAAATCGATTCATATG.TCC .CCA.TAT.TCC.TCG.GAC.AC-3’, ahol a két aláhúzott szekvenciarész Clal és Ndel hasítási helyeknek felel meg (a Ndel-hely tartalmazza a metionin-kezdőkodon egy részét); és ’ -TACTGATATAAATCTAGACTAGCTCATC TCCAAAGAGTTG-3’.
Ezt a fragmenst az 5’-végen Clal-enzimmel, a 3’-végen Xbal-enzimmel hasítottuk. A 2. ábrán bemutatott pCba-M-plazmidot Xbal/Sall enzimekkel emésztettük. Ezután az előző emésztés során kapott nagyobbik fragmenst Sáli- és Clal-enzimmel hasítottuk. Ezt követően ligálást végeztünk az alábbi három fragmens alkalmazásával: az első emésztésből származó, kisebbik Sall/Xbal fragmens; a második emésztésből származó, nagyobbik Sall/Clal fragmens; és a fenti PCR-fragmens; ily módon, a pCba-M-konstrukcióhoz hasonló konstrukciót nyertünk, amelyben azonban az mTNFgént, a kezdő metioninkodonnal kezdődően, a humán RANTES-protein szekretálódott formájának megfelelő proteint kódoló génnel helyettesítettük. (A humán RANTES-protein szekretált formája nem tartalmazza az 1. ábrán látható aminosavszekvencia szerinti első huszonhárom aminosavat. Az említett protein tartalmazza az 1. ábrán látható további aminosavakat, a SPY... aminosavakkal kezdődően.)
Ezt a Ndel/Sall fragmenst a fenti vektorból eltávolítottuk, és a 3. ábrán látható pT7-7 jelű, t7 expressziós vektorba juttattuk. Ez a fragmens tartalmazza a kívánt gént, valamint 600 bázispár hosszúságú további szekvenciát, de további kísérletek során (amelyeket a leírásban részletesen nem ismertettünk) kimutattuk, hogy a járulékos szekvenciák (vektorszekvenciák) eltávolítása nincs hatással az expresszió szintjére.
A pT7 típusú expressziós vektort Studier F. W., Rosenberg A. H. és munkatársai írták le [Meth. Enzymol. 185, 60 (1990)]. A konstrukciót a LysS-gént a pACYC184-plazmidon tartalmazó E. coli BL21(DE3) törzsbe transzformáltuk [F-ompT, hsd sB (rB-, mB-)] [Chang és Cohen: J. Bact. 134, 1141 (1978)]. Ahhoz, hogy az expressziós vektor proteinexpressziót eredményezzen, a T7-polimeráz működését indukálnunk kell. A sejtekben a T7-polimeráz működését úgy indukáltuk, hogy a táptalajhoz IPTG-t (izopropiltiogalaktozidot) adtunk.
3. példa
Annak kimutatása, hogy a Met-RANTES-protein valóban antagonista aktivitással rendelkezik (i) Vizsgálati eljárás, a kemotaxis kimutatására
Az in vitro kemotaxis kimutatását, 96 vájatú kamrák alkalmazásával végeztük („Neuro Probe MB” sorozat, Cabin John, MD, 20818, USA), a gyártó utasításai szerint. A CC-kemokinek - a RANTES-protein, MIP- Ια-protein és MCP- 1-protein - által kiváltott kemotaktikus aktivitást a THP-1 jelű, humán monocita sejtvonal alkalmazásával vizsgáltuk. A felső kamrákban 200 μΐ, 2% inaktivált fotális borjúszérumot („fetal calf serum”, FCS) tartalmazó RPMI-1640-táp folyadékban (Gibco), 4χ 105 THP-1-sejtet inkubáltunk. Az alsó kamrákba 370 μΐ, a kemoattraktánst (azaz, kemokint) megfelelő hígításban tartalmazó (FCS-t nem tartalmazó) RPMI-1640-tápfolyadékot tettünk. A kemotaxis gátlása céljából, a kemoattraktánst állandó, 5 χ EC50-koncentrációban alkalmaztuk - amely koncentrációt valamennyi kemokin esetében a korábbiakban már meghatároztunk -, a Met-RANTES-proteint pedig változó koncentrációban adtuk a reakcióhoz. A kamrákat 1 órán át, 37 °C-on inkubáltuk, 5% CO2-ot
HU 221 089 Β1 tartalmazó atmoszférában. A tápfolyadékot a felső kamrából eltávolítottuk, és 20 mmol/1 EDTA-t tartalmazó PBS-sel helyettesítettük, majd a kamrákat 30 percig, °C-on inkubáltuk. A PBS-t a felső kamrákból eltávolítottuk, majd azokat szárazra töröltük. Az egységet 10 percig, 1800 ford/perc mellett centrifugáltuk, hogy a sejteket az alsó kamrában összegyűjtsük, majd a felülúszókat leszívással eltávolítottuk. Az alsó kamrában található sejtek számát „Cell Titer 88™ Non-Radioactive Cell Proliferation Assay” (Promega, Madison USA) reagenskészlet alkalmazásával határoztuk meg, amely tetrazóliumkék formazántermékké történő átalakulását méri. Valamennyi vájathoz 100 pl, 10%-os, RPMI-1640-tápfolyadékban készített festékoldatot adtunk, és a kamrákat egy éjszakán át, 37 °C-on, 5% CO2-t tartalmazó atmoszférában inkubáltuk. Ezt követően, valamennyi vájathoz 100 pl szolubilizáló oldatot adtunk, és 4 óra elteltével, „Thermomax Microtitre Plate Reader” készülékben (Molecular Devices, Palo Alto, CA), 500 nm hullámhosszon meghatároztuk a fényelnyelést.
Az eredményeket a 4. és 5. ábrákon összegeztük.
(ii) Kalciumáramlás
A RANTES- és MIP- Ια-kemokinek által kiváltott kalciumáramlást Tsien R. Y. Pozzan T, valamint Rink T. J. eljárásával határoztuk meg [„Calcium homeostasis in intact lymphocytes: Cytoplasmic free calcium monitored with a new intracellularly trapped fluorescent indicator”, J. Cell Biology 94, (1982)], azzal az eltéréssel, hogy fluoreszcens indikátorként „Quin2” helyett „Fura-2/AM”-t használtunk (Fluka). A THP-1-sejteket 106/ml sűrűség elérése előtt gyűjtöttük össze, hogy biztosak legyünk abban, hogy azok még az exponenciális fázisban vannak. A sejteket 0,2% „Fura-2/AM”-t és 1 mg/ml BSA-t tartalmazó Krebs-Ringer-oldatban szuszpendáltuk, 106/ml sűrűségben, majd azokat fénytől elzárva, 37 °C-on 30 percig inkubáltuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, Krebs-Ringer-oldatban szuszpendáltuk, és jégen tartottuk. A felhasználást megelőzően 1 ml térfogatú mintákat 2 percig, 37 °C-on inkubáltunk. A kemokineket állandó keverés mellett adtuk a sejtszuszpenziókhoz. A Met-RANTES-protein gátló hatásának vizsgálata céljából az antagonistát a 37 °C-on, 2 percig történő inkubáció alatt, változó koncentrációk alkalmazása mellett adtuk a sejtekhez. Az eredményeket a 6. és 7. ábrákon összegeztük.
(iii) Receptorkötődési vizsgálati eljárás
A kompetíciós vizsgálati eljárást 96 vájatú „multiscreen” (több vizsgálat egyidejű elvégzésére alkalmas) filterlemezeken végeztük (Millipore, MADV N6500), amelyeket 2 órán át, a következő összetételű pufferrel (kötődésvizsgálati pufferrel) kezeltünk: 50 mmol/1 HEPES-puffer (pH = 7,2); 1 mmol/1 CaCl2;
mmol/1 MgCl2; és 0,5% BSA. A vizsgálati eljárást a rekombináns CC-CKR1-receptort expresszáló THP-1-sejtek vagy COS-sejtek alkalmazásával végeztük [Neote K., DiGregorio, Mák J. Y., Horuk R. és Schall T. J.: „Molecular cloning, functional expression and signalling characteristics of a C-C chemokine receptor”, Cell 72, 415 (1993); Gao J. L. és munkatársai: J. Exp. Med. 177, 1421 (1993)]. Valamennyi vájat 105 sejtet tartalmazott, 150 pl, 0,4 nmol/1 [I125]Mip-la-t vagy 0,4 nmol/1 [I125]RANTES-t (New England Nuclear, NEX 277) tartalmazó kötődésvizsgálati pufferben, ezen felül, az egyes vájatokhoz változó koncentrációban, kompetícióba lépő Met-RANTES-proteint adtunk. A vizsgálatokat triplikátumokban végeztük. Kilencven (90) percig, 4 °C-on végzett inkubációt követően, a sejteket 200-200 pl, 0,5 mol/1 NaCl-t tartalmazó jéghideg kötődés vizsgálati pufferrel négyszer mostuk, amelyet leszívással távolítottunk el. A filtereket szárítottuk, azokhoz 3,5 ml „Ultima Gold Scintillation” szcintillációs folyadékot adtunk (Packard), és „Beckman-LS5000” számlálóban a beütésszámot meghatároztuk.
4. példa
Leu-RANTES (más néven L-RANTES) előállítása és antagonista hatásának kimutatása
Az L-RANTES expressziós vektort két lépésben állítottuk elő. Először PCR-eljárást alkalmaztunk, hogy a humán RANTES-proteint kódoló gént az első ciszteinkodonon belül csonkítsuk, és a gén mindkét végén egyedi restrikciós helyeket hozzunk létre. Ezt a PCR-terméket a T7-promotert tartalmazó, pET23d jelű E. coli expressziós vektorba klónoztuk (Novagen), a gén 5’-végén létrehozott Sacl-hely, valamint egy BsmAI-hely felhasználásával, amely utóbbit abból a célból terveztünk, hogy a gén 3’ végén HindlIIhellyel kompatibilis túlnyúló vég keletkezzék. Ezt követően a humán RANTES-protein N-terminális variánsait kódoló géneket állítottunk elő oly módon, hogy a megváltoztatott szekvenciát kódoló oligonukleotidokat a RANTES-proteint kódoló szekvenciától közvetlenül 5’ irányba inszertáltuk. Ebből a célból a pET23d-plazmidban található csonka RANTES-klónt Sacl-enzimmel emésztettük, majd T4-DNS-polimerázzal kezeltük, hogy a Sacl-emésztés után visszamaradt túlnyúló 3’ véget eltávolítsuk, majd egy második emésztést végeztünk, Ncol-enzim alkalmazásával. Ezt követően az emésztett vektorba a MKKKWPRLSPYSSDTTP peptidszekvenciát kódoló oligonukleotidot klónoztuk. A pET23d/L-RANTES konstrukció expresszióját a pT7-7-konstrukciónál leírtak szerint végeztük.
pET23d/RANTES Ncol pET23d/RANTES Sacl/T4 5’C CTGCTTT3’
3’GGTAC GACGAAA5’
L-RANTES-oligonukleotidok ’ - C ATGAA AAAA AAATGGCC AAGGCTGTCCC
CGTACTCCTCCGACACCACCCCGTG ’ _ TTTTTTTTTACCGGTTCCG AC AGGGGCATG
AGGAGGCTGTGGTGGGGCAC
A pET23d/L-RANTES konstrukció egy olyan expressziósvektor-sorozat tagja, amely alkalmas az 1. pozícióban különböző aminosavakat tartalmazó RANTESproteinek előállítására. Ezek a T7-promotert tartalmazó expressziós vektorok a következő N-terminális szekvenciával rendelkező proteineket kódolnak: „MKKK6
HU 221 089 Β1
WPR-X-RANTES”. X lehet például L, I, Q, E vagy G. A fenti proteinek endo-Arg-C hasítása különböző X-RANTES-proteineket eredményez.
A Leu-RANTES-protein tisztítását a következőképp végeztük:
g ülepített E. coli sejtet 15 ml, 1 mmol/1 dithiothreitolt, 5 mmol/1 benzamidin-HCl-t, 0,1 mmol/1 fenil-metil-szulfonil-fluoridot, valamint DNáz-t (0,02 mg/ml) tartalmazó, 50 mmol/1 Tris-HCl-pufferben (pH=7,8) szuszpendáltunk. A sejteket oly módon roncsoltuk, hogy azokat „French Pressure” készülékben háromszor passzáltuk, a passzálások közt pedig
-1 percig, jégen, ultrahanggal kezeltük. A kapott oldatot 60 percig, 10 000 g-n centrifugáltuk. Az üledéket ml, 6 mol/1 Guanidin-HCl-t és 1 mmol/1 dithiothreitolt tartalmazó, 100 mmol/1 Tris-HCl-pufferben (pH=8,0) szuszpendáltuk. Az oldatot, monomerek képzése céljából 60 percig, 60 °C-on hevítettük, szobahőmérsékletre hűtöttük, majd a fentivel megegyező összetételű pufferrel ekvilibrált „Superdex-200”-gélen, 16/60 méretű oszlopon gélszűrést végeztünk. A rekombináns RANTES-konstrukciót tartalmazó frakciókat (16 ml) 384 ml, 1 mmol/1 oxidált glutationt és 0,1 mmol/1 redukált glutationt tartalmazó, 100 mmol/1 Tris-HCl-puffer (pH = 8,0) cseppenként történő hozzáadásával renaturáltuk, és egy éjszakán át kevertük. Ezt az oldatot 50 mmol/1 nátrium-acetát-pufferrel szemben (pH=4,5) dializáltuk, majd a fentivel megegyező összetételű pufferrel ekvilibrált „HILoad-SP26/10”oszlopra vittük fel. A proteineket a fenti összetételű pufferben készített, 0-2 mol/1, lineáris NaCl-gradienssel eluáltuk. A renaturált proteineket tartalmazó frakciókat 3x5 1, 1%-os ecetsavval szemben dializáltuk, és liofilizáltuk.
Abból a célból, hogy a fúziós proteinről a „KKKWPR”-hexapeptidet eltávolítsuk, a liofilizált port vízben oldottuk, és a proteinkoncentrációt úgy állítottuk be, hogy az oldat 50 mmol/1 Tris-HCl-pufferben (pH = 8,0) oldva 1 mg/ml proteint tartalmazzon. A fenti oldat 2 ml térfogatához 20 pg „Endoproteinase-ArgC”-enzimet adtunk (Boehringer Mannheim), majd az oldatot 2 órán át, 37 °C-on inkubáltuk. Az emésztett proteint a kiindulási anyagtól reverz fázisú HPLCeljárással, 0,1% triflór-ecetsavval ekvilibrált „Nucleosil-C5”-oszlop (10x250 mm) alkalmazásával elválasztottuk. A proteineket 0,1% triflór-ecetsavban oldott, 22,5-45% acetonitritet tartalmazó gradienssel eluáltuk, liofilizáltuk, és -80 °C-on tároltuk.
A RANTES-protein THP-l-sejtekre gyakorolt kemotaktikus hatásával szemben mutatott antagonista aktivitást a Met-RANTES-protein esetében ismertetett módon vizsgáltuk.
Az eredményeket a 9. ábrán összegeztük.
5. példa
Gln-RANTES (más néven Q-RANTES) előállítása és antagonista hatásának kimutatása
A Gln-RANTES-protein előállítását mutatis mutandis, a 4. példában ismertetett eljárással megegyező módon végeztük.
A RANTES-protein THP-l-sejtekre gyakorolt kemotaktikus hatásával szemben mutatott antagonista aktivitást a Met-RANTES-protein esetében ismertetett módon vizsgáltuk.
Az eredményeket a 10. ábrán összegeztük.

Claims (12)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Polipeptid, melynek szekvenciája a RANTESprotein aminosavszekvenciájával legalább 80%-os homológiát mutat, valamint a RANTES- és MIP-la-proteinek hatásával szemben antagonista hatást fejt ki, a következők közül egy vagy több vonatkozásában:
    (a) a RANTES- vagy ΜΙΡ-Ια-proteinek által THP-l-sejtekre gyakorolt kemotaktikus hatás;
    (b) RANTES- vagy ΜΙΡ-Ια-proteinek jelenléte által, THP-1 -sejtekben előidézett kalciumion-mobilizáció; vagy (c) RANTES-protein THP-1-sejtreceptorokhoz történő kötődése;
    és amely polipeptid a RANTES- vagy a ΜΙΡ-Ιαproteinekhez képest antagonista hatást kiváltó, egy vagy több N-terminális aminosavat tartalmaz.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, amely egy vagy több N-terminális aminosavként az SPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S szekvenciához képest N-terminálisan elhelyezkedő szekvenciát tartalmaz.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypontok szerinti polipeptid, amely egy vagy több N-terminális aminosavként metionint, leucint vagy glutamint tartalmaz, vagy metionint, leucint vagy glutamint tartalmazó szekvenciát tartalmaz.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti polipeptid, amely a metionint, leucint vagy glutamint N-terminális aminosavként tartalmazza.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, melynek szekvenciája megegyezik a (a) MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S;
    (b) LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S; vagy (c) QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S szekvenciák bármelyikével, vagy szekvenciája lényegében homológ az (a)-(c) szekvenciák bármelyikével.
  6. 6. DNS- vagy RNS-szekvencia, amely 1-5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódolja.
  7. 7. Vektor, amely 6. igénypont szerinti szekvenciát tartalmaz.
  8. 8. Gazdasejt, amely 7. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
  9. 9. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, emberben vagy nemhumán állatfajban történő terápiás vagy diagnosztikus alkalmazásra.
    HU 221 089 Β1
  10. 10. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, betegségek RANTES-protein vagy ΜΙΡ-Ιαprotein által közvetített gyulladás gátlása vagy csökkentése általi kezelésében történő alkalmazásra.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti polipeptid, asztma, al- 5 lergiás ormyálkahártya-gyulladás (allergiás rhinitis), atópiás dermatitisz (bőrgyulladás), atheroma (az érfal ateroszklerotikus beszűrődése), ateroszklerózis (érelme szesedés) vagy reumatoid artritisz (reumatoid ízületi gyulladás) kezelésében történő alkalmazásra.
  12. 12. Eljárás az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a polipepiidet a 8. igénypont szerinti gazdasejtben expresszáltatjuk.
HU9702199A 1994-12-08 1995-12-07 Rantes peptide derivates with antagonistic effect and uses thereof HU221089B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9424835.8A GB9424835D0 (en) 1994-12-08 1994-12-08 Substances and their uses
GBGB9512319.6A GB9512319D0 (en) 1995-06-16 1995-06-16 Substances and their uses
PCT/GB1995/002861 WO1996017935A2 (en) 1994-12-08 1995-12-07 Rantes peptide and fragments and compositions comprising it for treatment of inflammation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT77075A HUT77075A (hu) 1998-03-02
HU221089B1 true HU221089B1 (en) 2002-08-28

Family

ID=26306133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9702199A HU221089B1 (en) 1994-12-08 1995-12-07 Rantes peptide derivates with antagonistic effect and uses thereof

Country Status (15)

Country Link
US (2) US6159711A (hu)
EP (1) EP0796330A1 (hu)
JP (1) JPH10510151A (hu)
CN (1) CN1087346C (hu)
AU (1) AU688641B2 (hu)
BR (1) BR9509890A (hu)
CA (1) CA2207036A1 (hu)
CZ (1) CZ290850B6 (hu)
FI (1) FI972433A0 (hu)
HU (1) HU221089B1 (hu)
MX (1) MX9703889A (hu)
NO (1) NO972620L (hu)
NZ (1) NZ296570A (hu)
PL (1) PL182786B1 (hu)
WO (1) WO1996017935A2 (hu)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0796330A1 (en) * 1994-12-08 1997-09-24 Glaxo Group Limited Rantes peptide and fragments and compositions comprising it for treatment of inflammation
FR2748938B1 (fr) * 1996-05-22 1998-07-31 Pasteur Institut Utilisation de molecules antagonistes de chemokines pour leur activite antivirale notamment contre un retrovirus de type vih
WO1998013495A1 (en) * 1996-09-25 1998-04-02 British Biotech Pharmaceuticals Limited Human rantes mutants incapable of aggregate formation
US6100387A (en) 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
US6852508B1 (en) 1997-02-28 2005-02-08 Genetics Institute, Llc Chemokine with amino-terminal modifications
IT1291353B1 (it) * 1997-05-12 1999-01-07 San Raffaele Centro Fond Peptidi con attivita' antivirale
US6168784B1 (en) 1997-09-03 2001-01-02 Gryphon Sciences N-terminal modifications of RANTES and methods of use
EP0906954A1 (en) * 1997-09-29 1999-04-07 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Amino-terminal truncated c-c chemokines as chemokine antagonist
MXPA00003885A (es) * 1997-10-22 2004-04-23 Inst Genetics Llc Quimiocinas con modificiaciones de la terminacion amino.
CA2316447C (en) * 1997-12-23 2009-07-28 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Rantes mutants and therapeutic applications thereof
US6121023A (en) 1998-01-22 2000-09-19 Akzo Nobel N.V. Isothermal transcription based assay for the detection and quantification of the chemokine rantes
EP1000626A1 (en) 1998-09-18 2000-05-17 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Chemokine receptor antagonist and cyclosporin in combined therapy
IT1303736B1 (it) * 1998-11-11 2001-02-23 San Raffaele Centro Fond Peptidi derivati da rantes con attivita' anti-hiv.
WO2000056879A1 (en) * 1999-03-22 2000-09-28 Universität Zürich TRANSFORMING GROWTH FACTOR (TFG) β SUPERFAMILY ANTAGONISTS
HUP0303854A2 (hu) 2000-09-08 2004-03-01 Gryhon Therapeutics, Inc. Szintetikus erythropoiesis-stimuláló proteinek
US8153121B2 (en) * 2000-10-06 2012-04-10 Los Angeles Biomedical Research Institute at Harbor—UCLA Medical Center Diagnosis and therapy of antibody-mediated inflammatory autoimmune disorders
US7998681B2 (en) * 2000-10-06 2011-08-16 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Diagnosis and therapy of antibody-mediated inflammatory auto-immune disorders
US20030082135A1 (en) * 2001-10-30 2003-05-01 Dorf Martin E. Pathway of RANTES-mediated chemokine synthesis in astrocytes and methods of use therefor
DE60231057D1 (de) * 2001-12-17 2009-03-19 Serono Lab Chemokine mutanten, die als chemokine antagonisten wirken
US20040191215A1 (en) * 2003-03-25 2004-09-30 Michael Froix Compositions for induction of a therapeutic response
WO2007002465A2 (en) * 2005-06-23 2007-01-04 Rapid Pharmaceuticals, Llc Stabilizing alkylglycoside compositions and methods thereof
WO2008015199A1 (en) * 2006-07-31 2008-02-07 Laboratoires Serono S.A. Chemokine antagonists
CA2695237A1 (en) 2007-08-02 2009-04-30 Novimmune S.A. Anti-rantes antibodies and methods of use thereof
KR101784177B1 (ko) * 2010-02-08 2017-10-11 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 Ｒａｎｔｅｓ를 암호화하는 핵산 분자, 그리고 이를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법
US20140271680A1 (en) 2011-08-12 2014-09-18 Universite Paris-Est Creteil Val De Marne Methods and pharmaceutical compositions for treatment of pulmonary hypertension
AU2022359841A1 (en) 2021-10-06 2024-05-02 Virothera Ltd Novel immune regulator

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0796330A1 (en) * 1994-12-08 1997-09-24 Glaxo Group Limited Rantes peptide and fragments and compositions comprising it for treatment of inflammation

Also Published As

Publication number Publication date
NO972620D0 (no) 1997-06-06
FI972433A (fi) 1997-06-06
HUT77075A (hu) 1998-03-02
PL320565A1 (en) 1997-10-13
WO1996017935A3 (en) 1996-08-22
CN1168697A (zh) 1997-12-24
CN1087346C (zh) 2002-07-10
CZ290850B6 (cs) 2002-10-16
NZ296570A (en) 1998-11-25
NO972620L (no) 1997-08-06
EP0796330A1 (en) 1997-09-24
US6159711A (en) 2000-12-12
FI972433A0 (fi) 1997-06-06
CZ171997A3 (en) 1997-11-12
PL182786B1 (pl) 2002-02-28
WO1996017935A2 (en) 1996-06-13
US6555105B1 (en) 2003-04-29
AU688641B2 (en) 1998-03-12
CA2207036A1 (en) 1996-06-13
MX9703889A (es) 1997-08-30
AU4120896A (en) 1996-06-26
JPH10510151A (ja) 1998-10-06
BR9509890A (pt) 1997-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU221089B1 (en) Rantes peptide derivates with antagonistic effect and uses thereof
CA2294516C (en) Ikk-.beta. proteins, nucleic acids and methods
MXPA97003889A (en) Peptido rantes and fragments and compositions that contain it, for the treatment of inflamac
AU724178B2 (en) NIK proteins, nucleic acids and methods
Tovey et al. Cloning and sequencing of a cDNA expressing a recombinant house dust mite protein that binds human IgE and corresponds to an important low molecular weight allergen.
WO2003062273A2 (en) Modulator of the notch signalling pathway and use thereof in medical treatment
US20020034764A1 (en) Diarylsulfonylurea binding proteins
AU726294B2 (en) Ikk-alpha proteins, nucleic acids and methods
De Valck et al. A20 inhibits NF-κB activation independently of binding to 14-3-3 proteins
Gaillard et al. Identity of the RNA-binding protein K of hnRNP particles with protein H16, a sequence-specific single strand DNAbinding protein
US6368845B1 (en) Polypeptides having L-asparaginase activity
JP6870091B2 (ja) プリン受容体のペプチドモジュレータ
Fujiwara et al. cDNA cloning of p42, a shared subunit of two proteasome regulatory proteins, reveals a novel member of the AAA protein family
AU702844B2 (en) Interleukin-1 receptor-associated protein kinase and assays
Bautsch et al. A recombinant hybrid anaphylatoxin with dual C3a/C5a activity
Miele et al. A peptidylprolyl cis/trans isomerase from Xenopus laevis skin: cloning, biochemical characterization and putative role in the secretion
WO1999046380A2 (en) Human membrane spanning proteins
US20010025098A1 (en) Human membrane-spanning proteins
US6713060B1 (en) Nek1-related protein kinase
Stirling et al. The Genetic Dissection of Protein Translocation Across the Yeast ER Membrane

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee