EA003940B1 - Усеченный по амино-концу хемокин rantes и способы его использования - Google Patents

Усеченный по амино-концу хемокин rantes и способы его использования Download PDF

Info

Publication number
EA003940B1
EA003940B1 EA200000379A EA200000379A EA003940B1 EA 003940 B1 EA003940 B1 EA 003940B1 EA 200000379 A EA200000379 A EA 200000379A EA 200000379 A EA200000379 A EA 200000379A EA 003940 B1 EA003940 B1 EA 003940B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
mcp
cells
amino
diseases
truncated
Prior art date
Application number
EA200000379A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200000379A1 (ru
Inventor
Поль Прост
Софи Стрюйф
Йо Вам Дамме
Original Assignee
Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8227408&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA003940(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. filed Critical Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В.
Publication of EA200000379A1 publication Critical patent/EA200000379A1/ru
Publication of EA003940B1 publication Critical patent/EA003940B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4813—Exopeptidases (3.4.11. to 3.4.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к усеченным по амино-концу хемокинам RANTES, у которых отсутствует NH-концевые аминокислоты, соответствующие аминокислотным остаткам 1-2 природного RANTES, и которые обладают антагонистической активностью по отношению к хемокинам; а также к кДНК-последовательностям, кодирующим такие RANTES; к их применению для лечения и/или диагностики заболеваний, терапия которых основана на антагонистической активности в отношении хемокинов МСР-3, МСР-1α, МСР-1β и RANTES; и к фармацевтическим композициям, содержащим указанные RANTES.

Description

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к усеченным по амино-концу ΚΑΝΤΕ8, у которых отсутствуют NН2-концевые аминокислоты, соответствующие аминокислотным остаткам 1-2 природного ΚΑΝΤΕ8, и которые обладают антагонистической активностью против хемокинов; а также к кДНК-последовательностям, кодирующим такие ΚΑΝΤΕ8, к их применению для лечения и/или диагностики заболеваний, терапия которых основана на антагонистической активности в отношении хемокинов МСР-3, МСР-1а, МСР-Ιβ и ΚΑΝΤΕ8, и к фармацевтическим композициям, содержащим указанные ΚΑΝΤΕ8.
Предпосылки создания изобретения
Хемокины представляют семейство малых провоспалительных цитокинов, обладающих свойствами, стимулирующими хемотаксис и активацию лейкоцитов. В зависимости от положения первых цистеинов, это семейство хемокинов может быть подразделено на С-С-, С-ХС- и С-Х3-С-хемокины (ВадщоНш М. е! а1., 1994; ВаддюНш М. е! а1., 1997 и Τοιώ Ό. е! а1., 1996).
Многие С-Х-С-хемокины, такие как интерлейкин-8 (1Ь-8), являются факторами, вызывающими хемотаксис нейтрофилов, тогда как СС-хемокины, такие как моноцитарный хемотаксический белок-3 (МСР-3), являются активными по отношению к ряду лейкоцитов, включая моноциты, лимфоциты, эозинофилы, базофилы, ΝΚ-клетки и дендритные клетки.
ХН2-концевой домен хемокинов, участвующий в связывании с рецептором и ΝΗ2концевом процессинге, может либо активировать хемокины, снижать активность хемокинов, либо делать хемокины полностью неактивными.
Основный белок тромбоцитарного С-Х-Схемокина становится хемотаксическим пептидом для нейтрофилов (ΝΑΡ-2) только после удаления 24 ИН2-концевых остатков (\Уа1х Α. е! а1., 1989 и Уап Оатше 1. е! а1., 1990).
Делеция вплоть до 8 ИН2-концевых остатков у 1Ь-8 приводит к увеличению хемотаксической активности, но дополнительное отщепление мотива О1и-Ьеи-Агд, который расположен перед первым Сук во всех нейтрофильных хемотаксических С-Х-С-хемокинах, приводит к их полной инактивации (С1атк-ЬеЮк I. е!а!., 1991).
Аналогичный ИН2-концевой протеолиз (вплоть до 8 аминокислот) другого С-Х-Схемокина, гранулоцитарного хемотаксического белка-2 (ОСР-2), не оказывает влияния на хемотаксическую активность нейтрофилов (Ртоок! Р. е! а1., 1993а).
ΚΑΝΤΕ8 (акроним Кеди1а!еб ироп Аейуа!юп, №гта11у Τ Бхргеккеб апб ртекитаЫу 8еете!еб) представляет собой С-С-хемокин, кДНК-клон которого был выделен из кДНКбиблиотеки, обогащенной Т-клеточно-специфическими последовательностями (8с11а11 Τ.Ι. е! а1., 1988).
Синтетические С-С-хемокины МСР-1, МСР-3 и ΚΑΝΤΕ8, у которых отсутствуют 8-9 ИН2-концевых аминокислот, являются неактивными по отношению к моноцитам и могут быть использованы как антагонисты рецепторов (Оопд 1. е! а1., 1996; и Оопд 1. е! а1., 1995).
Удлинение ΚΑΝΤΕ8 на один метионин приводит к полной инактивации молекулы, и Мй-КАКГБЗ начинает действовать как антагонист для аутентичного ΚΑΝΤΕ8 (РтоибТоо! Α.Ε. е! а1., 1996).
Описание изобретения
Главной целью настоящего изобретения является получение усеченного по амино-концу ΚΑΝΤΕ8, у которого отсутствует ИН2-концевые аминокислоты, соответствующие аминокислотным остаткам 1-2 природного ΡΑΝΤΕ8. и который обладает антагонистической активностью против хемокинов.
Конкретной целью настоящего изобретения является получение ΚΑΝΤΕ8 (3-68), у которого отсутствуют первые 2 аминокислоты, как показано на фиг. 1 и в 8ΕΟ ГО №: 2.
Такой усеченный по амино-концу ΚΑΝΤΕ8 настоящего изобретения может присутствовать в гликозилированной или в негликозилированной форме.
Термин антагонист хемокинов означает антагонист, который оказывает антагонистическое действие на зрелые полноразмерные природные хемокины.
Другой целью настоящего изобретения является получение ДНК-молекул, содержащих ДНК-последовательности, кодирующие усеченный по амино-концу ΚΑΝΤΕ8 настоящего изобретения, включая нуклеотидные последовательности, кодирующие, в основном, тот же ΚΑΝΤΕ8. кДНК-последовательность интактного ΚΑΝΤΕ8 описана 8с11а11 Τ.Γ е! а1. (1988), а кДНК усеченного ΚΑΝΤΕ8 может быть легко выведена.
Термин нуклеотидные последовательности, кодирующие, в основном, тот же ΚΑΝΤΕ8, означает все другие нуклеотидные последовательности, которые вследствие вырожденности генетического кода также кодируют данные аминокислотные последовательности.
Настоящее изобретение также относится к экспрессирующим векторам, которые содержат вышеуказанные ДНК, к клеткам-хозяевам, трансформированным такими векторами, и к способу получения указанных усеченных по амино-концу ΚΑΝΤΕ8 настоящего изобретения путем культивирования указанных трансформированных клеток в соответствующих культуральных средах.
ДНК-последовательность, кодирующая белки настоящего изобретения, может быть встроена и лигирована в соответствующую плазмиду. После ее продуцирования, экспрессирующий вектор вводят в подходящую клетку хозяина, которая затем экспрессирует вектор(ы) с получением нужного белка.
Экспрессия любого рекомбинантного белка настоящего изобретения, упоминаемого в данном описании, может быть осуществлена в эукариотических клетках (например, в клетках дрожжей, насекомых или млекопитающих) или в прокариотических клетках с использованием подходящих экспрессирующих векторов. В этих целях может быть использован любой метод, известный специалистам.
Например, ДНК-молекулы, кодирующие белки, полученные любым из вышеуказанных методов, встраивают в соответствующим образом сконструированные экспрессирующие векторы способами, хорошо известными специалистам (см. 8атЬтоок с1 а1., 1989). Двухцепочечную кДНК присоединяют к плазмидным векторам путем гомополимерного наращивания или путем рестрикционного лигирования, включая методы с использованием синтетических ДНКлинкеров или методы лигирования по тупым концам, т. е. для лигирования ДНК-молекул используют ДНК-лигазы, а нежелательное связывание предотвращают путем обработки щелочной фосфатазой.
Для экспрессии нужного белка, экспрессирующий вектор должен также включать специфические нуклеотидные последовательности, содержащие транскрипционные и трансляционные регуляторные элементы, присоединенные к ДНК, кодирующей нужный белок так, чтобы обеспечивалась экспрессия гена и продуцирование белка. Сначала для того чтобы происходила транскрипция гена, необходимо, чтобы ему предшествовал промотор, который распознается РНК-полимеразой и с которым связывается эта полимераза, что приводит, тем самым, к инициации процесса транскрипции. Существует ряд подходящих для использования промоторов, которые действуют с различной эффективностью (сильные и слабые промоторы).
Для эукариотических хозяев могут быть использованы различные транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности в зависимости от вида хозяина. Они могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирус, вирус коровьей папилломы, обезьяний вирус или т.п., где указанные регуляторные сигналы ассоциированы с конкретным геном, имеющим высокий уровень экспрессии. В качестве примеров могут служить промотор ТК вируса герпеса, ранний промотор 8У40, промотор гена да1 4 дрожжей и т.п. Могут быть выбраны регуляторные сигналы инициации транскрипции, обеспечивающие подавление и активацию так, чтобы экспрессия генов могла быть модулирована.
ДНК-молекулу, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок настоящего изобретения, встраивают в вектор(ы), содержащий правильно присоединенные сигналы регуляции транскрипции и трансляции, и способный интегрировать нужные генные последовательности в клетку-хозяина.
Клетки, которые были стабильно трансформированы введенной ДНК, могут быть отобраны посредством введения одного или нескольких маркеров, позволяющих проводить отбор клеток-хозяев, содержащих этот экспрессирующий вектор. Указанный маркер может также наделять ауксотрофного хозяина фототрофией, резистентностью к биоцидам, например к антибиотикам, или к тяжелым металлам, таким как медь и т.п. Ген селективного маркера может быть непосредственно присоединен к ДНК-последовательности экспрессируемого гена или введен в ту же самую клетку путем котрансфекции. Для оптимального синтеза белков настоящего изобретения могут быть также использованы дополнительные элементы.
Важными факторами при отборе конкретного плазмидного или вирусного вектора являются легкость, с которой клетки-реципиенты, содержащие указанный вектор, могут быть идентифицированы и отделены от тех клетокреципиентов, которые не содержат указанного вектора; число копий вектора, которое должно присутствовать в данном хозяине; и требование к способности данного вектора реплицироваться в клетках-хозяевах разных видов.
После получения вектора(ов) или ДНКпоследовательности, содержащей конструкцию(и), предназначенную для экспрессии, эта ДНК-конструкция(и) может быть введена в соответствующую клетку-хозяина различными подходящими методами, такими как трансформация, трансфекция, конъюгирование, слияние протопластов, электропорация, преципитация фосфатом кальция, прямая микроинъекция и т.п.
Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими. Предпочтительными являются эукариотические хозяева, например, клетки млекопитающих, такие как клетки человека, обезьяны, мыши и клетки яичника китайского хомячка (СНО), поскольку они позволяют вносить посттрансляционные модификации в молекулы белка, включая соответствующую укладку или гликозилирование в нужных сайтах. Дрожжевые клетки также могут вносить посттрансляционные пептидные модификации, включая гликозилирование. Существует ряд технологий рекомбинантных ДНК, где используются последовательности сильных промоторов и высококопийное число плазмид, которые могут быть использованы для продуцирования нужных белков в дрожжах. Дрожжи распознают лидерные последовательности на клонированных продуктах генов млекопитающих и секретируют пептиды, несущие лидерные последовательности (т.е. препептиды).
После введения указанного вектора(ов), клетки-хозяева культивируют в селективной среде, которая обеспечивает селективный рост векторсодержащих клеток. Экспрессия клонированной генной последовательности(ей) приводит к продуцированию нужных белков.
Усеченный по амино-концу ΚΆΝΤΕ8 настоящего изобретения может быть получен любыми другими хорошо известными методами, а в частности, хорошо разработанными методами химического синтеза с использованием автоматических синтезаторов для твердофазного пептидного синтеза с последующей хроматографической очисткой.
Хемокины настоящего изобретения могут быть, например, синтезированы с использованием групп Ешое (9-флуоренилметоксикарбонила) и ΐ-Вос (т-бутоксикарбонила) или любым другим аналогичным методом химического синтеза с использованием или без использования соответствующих боковых защитных групп на различных аминокислотах. Аминокислоты с соответствующими боковыми защитными группами или без них предварительно активируют, например, группами ΗΒΤυ/ΗΟΒΐ [2(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат(1 -гидроксибензотриаол)] и присоединяют к растущей пептидной цепи. Перед добавлением следующего остатка, защитную группу (например, Етос) отщепляют от α-аминогруппы. После синтеза все защитные группы удаляют, интактные полноразмерные пептиды очищают и химически или ферментативно укладывают (включая образование дисульфидных мостиков между цистеинами) с получением соответствующих хемокинов настоящего изобретения.
Очистку природных, синтетических или рекомбинантных белков осуществляют любым из хорошо известных методов, используемых для этих целей, т.е. любым стандартным методом, включая экстракцию, преципитацию, хроматографию, электрофорез и т.п. (см., например, Ρτοοδΐ с1 а1., 1996). Дополнительной процедурой очистки, которая может быть предпочтительно использована для очистки белка настоящего изобретения, является аффинная хроматография с использованием моноклональных антител или аффинности к гепарину, где указанные антитела или гепарин связываются с целевым белком и где их продуцируют и иммобилизуют на гелевой матрице, находящейся в колонке. Препараты, содержащие белки с примесями, пропускают через колонку. Этот белок связывается с колонкой посредством гепарина или посредством специфического антитела, а примеси проходят через колонку. После промывки белок элюируют из геля путем изменения рН или ионной силы.
Усеченные по амино-концу ΚΑΝΤΕ8 настоящего изобретения могут быть использованы для лечения и/или диагностики заболеваний, терапия которых основана на антагонистической активности в отношении хемокинов МСР
3, МСР-1а, МСР-13 и ΚΑΝΤΕ8. Примерами таких заболеваний являются воспалительные заболевания; заболевания, ассоциированные с ангиогенезом и гемопоэзом: опухоли; инфекционные заболевания, включая ВИЧ-инфекцию, аутоиммунные заболевания, атеросклероз, легочные заболевания и кожные болезни. Предпочтительным является использование для лечения ВИЧ-инфекций.
Поэтому в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению белка настоящего изобретения для изготовления лекарственного средства для лечения вышеупомянутых заболеваний.
Лекарственное средство предпочтительно изготавливают в форме фармацевтической композиции, содержащей белки настоящего изобретения в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или наполнителями. Такие фармацевтические композиции входят в еще один аспект настоящего изобретения.
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ лечения вышеупомянутых заболеваний, предусматривающий введение фармакологически активного количества усеченных по амино-концу ΚΑΝΤΈ8 настоящего изобретения пациентам с риском развития таких заболеваний или пациентам, у которых уже имеются указанные патологии.
Было также обнаружено, что СЭ26/ЭРР IV способен генерировать усеченный по ИН2-концу ΚΑ.ΝΤΕ8 ίη νίΐτο. ΚΑΝΤΕ8 представляет собой первый цитокин, о котором сообщалось, что его биологическая активность может быть модулирована ί.Ό26/ΌΡΡ IV.
Поэтому в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению СЭ26/ЭРР IV для лечения и/или диагностики заболеваний, при которых требуется антагонистическая активность против действия хемокинов, направленная, в частности, против воспалительных, иммунных и инфекционных заболеваний.
Таким образом, был представлен первый пример идентифицированного механизма эндогенно регулируемой модификации хемокина с образованием антагониста, аналогичный физиологическому процессингу, но опосредованный другими факторами (протеазами). Применение таких факторов (протеаз) для лечения и/или диагностики вышеуказанных заболеваний также входит в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение описано в нижеследующих примерах, которые не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения. Ниже представлено конкретное описание чертежей.
Описание чертежей
На фиг. 1 показаны аминокислотные последовательности ΚΑΝΤΕ8. Сигнальные последовательности указаны курсивом, а С-остатки указаны жирным шрифтом. Стрелками показаны первые аминокислоты усеченного по амино концу ΡΑΝΤΕ8 настоящего изобретения, называемого также ΚΆΝΤΕ8 (3-68).
На фиг. 2 проиллюстрировано сравнение хемотаксической активности интактной и усеченной по NН2-концу форм природного или рекомбинантного ΚΆΝΤΕ8 по отношению к моноцитам ТНР-1 в анализе с использованием микрокамеры Бойдена: природный ΚΆΝΤΕ8 (168) (Δ); природный усеченный ΚΆΝΤΕ8 (3-68) (□); интактный рекомбинантный ΚΆΝΤΕ8 (1-68) (▲ ); и рекомбинантный ΚΆΝΤΕ8 (3-68), расщепленный СО26/ЭРР IV (). Результаты представляют собой среднее значение хемотаксического индекса ± ср.кв.ош. из четырех или более независимых экспериментов.
На фиг. 3 проиллюстрировано действие природного ΚΆΝΤΕ8 (3-68) (□), природного ΚΆΝΤΕ8 (1-68) (Δ), рекомбинантного ΚΆΝΤΕ8 (1-68) (▲) и рекомбинантного ΚΆΝΤΕ8 (3-68), обработанного СО26/ПРР IV (), на |Са21|, в клетках ТНР-1. Результаты представляют собой среднее значение увеличения [Са2+]1 ± ср.кв.ош. из трех или более независимых экспериментов.
На фиг. 4 показана десенсибилизация Са2+мобилизирующей активности интактного ιόοΚΛΝΤΕΞ (1-68) под действием ΚΆΝΤΕ8 (368). Клетки ТНР-1 сначала стимулировали буфером или различными концентрациями рекомбинантного ΚΆΝΤΕ8 (1-68) или Κ.ΆΝΤΕ8 (3-68). Результаты представляют собой среднее значение увеличения [Са2+]1 ± ср.кв.ош. (из трех или более независимых экспериментов) в ответ на воздействие 30 нг/мл интактного рекомбинантного ΚΆΝΤΕ8 как второго стимулятора.
На фиг. 5 приведено сравнение хемотаксической способности усеченного Κ.ΆΝΤΕ8 (3-68) со способностью интактного ΚΆΝΤΕ8 (1-68). Эозинофильную гранулоцитарную хемотаксическую активность природного (па!) и рекомбинантного (гес) усеченного ΚΛΝΤΕ8. интактного ΚΆΝΤΕ8 и синтетического МСР-3 определяли в анализе с использованием микрокамеры. Результаты представляют собой среднее значение хемотаксического индекса (ХИ) ± ср.кв.ош. из двух или более независимых экспериментов (каждый проводили в тройном дубликате).
На фиг. 6 показана десенсибилизация мобилизации кальция интактным ΚΆΝΤΕ8 в ССЯтрансфектантах. Эксперименты по мобилизации кальция проводили на клетках НО8, трансфецированных СЭ4 и рецепторами СС-хемокина ССЯ1 или ССЯ5. Сначала клетки стимулировали различными концентрациями интактного или усеченного ЯΑNΤΕ8 с последующей стимуляцией 100 нг/мл интактного ΚΑΝΤΕ8. Показан процент ингибирования увеличения [Са2+]1, индуцированного вторым стимулятором. Этот процент вычисляли путем сравнения ответа на 100 нг/мл интактного Κ.ΛΝΤΕ8 после добавления ЯΑNΤΕ8 (1-68) или ΡΑΝΤΕ8 (3-68) с отве том после стимуляции буфером (100%). Результаты представляют собой среднее значение процента ингибирования ± ср.кв.ош. из двух или более экспериментов.
На фиг. 7 показано сильное ингибирующее действие ΡΑΝΤΕ8 (3-68) на инфицирование мононуклеарных клеток вирусом ВИЧ-1. ФГАактивированные МКПК были инфицированы Мтропным штаммом ВИЧ-1 Ва-Ь в присутствии различных концентраций ЯΑNΤΕ8 (1-68) или ΚΑΝΤΕ8 (3-68) (0-1000 нг/мл добавляли во время инфицирования). Через десять дней прослеживали выход вируса в клеточном супернатанте в условиях ρ-24-Α§-ΕΕΙ8Α (один репрезентативный эксперимент из четырех проведенных экспериментов).
На фиг. 8 показано действие ЯАИ1Ъ8 (168) и ΡΑΝΤΕ8 (3-68) на инфицирование штаммом 8Е162 вируса ВИЧ-1 в ФГА-активированных МКПК. Выход вируса прослеживали через десять дней после инфицирования в клеточном супернатанте в условиях ρ-24-Α§-ΕΕΙ8Α. Показаны результаты одного репрезентативного эксперимента из трех проведенных экспериментов,* внизу означает предел детекции ρ-24-ЛдΕΕΙ8Α (<5 пг/мл).
На фиг. 9 показана экспрессия СЭ26 на клетках НО8.СИ4.ССЯ5, И87.СП4.ССЯ5 и свежевыделенных ПКМК. В каждой гистограмме показан процент (%) СО26-позитивных клеток.
На фиг. 10 показано действие ЯΑNΤΕ8 (168), ЯΑNΤΕ8 (1-68) плюс §СИ26 (50 ед./л) и ЯΑNΤΕ8 (3-68) на инфицирование клеток НО8.СИ4.ССЯ5 штаммом ВаЬ ВИЧ-1. Выходы вируса прослеживали через 8 дней после инфицирования в клеточном супернатанте в условиях ρ-24-Α§-ΕΕΙ8Α. Показаны результаты одного репрезентативного эксперимента из трех проведенных экспериментов.
Примеры
Пример 1. Усеченный по амино-концу ЯΑNΤΕ8.
Материалы и методы.
Реагенты.
Природный ЯΑNΤΕ8 человека продуцировали в клетках гепатосаркомы Малаву (Ма1ауи), в клетках остеосаркомы МС-63 или в лейкоцитах периферической крови (Центры по переливанию крови в Антверпене и Лёвене) и очищали методом, описанным ранее (Ргоок! Р. е! а1., 1996 и Ргоок! Р. е! а1., 1993). МСР-2, МСР-3 и ССР-2 синтезировали методом химического синтеза с использованием Етос (Ргоок! Р. е! а1., 1995 и Уиу!§ Α. е! а1., 1997), рекомбинантный ΡΑΝΤΕ8 человека получали от Рерго!есй (Яоску Ηί11, ΝΙ), а рекомбинантный МСР-1 был любезно предоставлен Ότ. II Орреийета (ΝΕΙ-ΝΙΗ, Ртебепск, МИ).
Клетки остеосаркомы человека (НО8), трансфецированные СЭ4 и одним из рецепторов СС-хемокина ССЯ1, ССЯ3 или ССЯ5 (Иеид Н., е! а1., 1996), культивировали в ЭМБМ с глутамаксом. В эту среду добавляли пуромицин (1 мкг/мл) в качестве селективного агента. Все культуральные среды (С1Ьсо ВВЬ/ЫТе ТесНηοίοβίοδ. РаЫеу, ИК) обогащали 10% ЕС8.
СЭ26/ЭРР IV человека получали из простасом, органелл, происходящих из предстательной железы, которые в свободном состоянии находятся в семенной плазме. Этот фермент очищали до гомогенности, как описано ранее, с использованием ионообменной хроматографии с последующей аффинной хроматографией на аденозин-дезаминазе (Эе МееМег I. е! а1., 1996).
Инкубирование хемокинов с СЭ26/ЭРР IV и детектирование протеолитического процессинга.
100-1000 молярного избытка хемокинов инкубировали в течение ночи с СЭ26/ЭРР IV в 100 мМ Трис/НС1 рН 7,7. Хемокины отделяли от ί.Ό26/ΩΡΡ IV посредством электрофореза в ПААГ с ДСН на трис/трицин-гелевой системе, как описано ранее (Ртоок! Р. е! а1., 1996).
Белки подвергали электроблоттингу на ПВДФ-(поливинилиденфторидных) мембранах (РтоЬ1ой, Регкт Е1тег, Еойег Сйу, СА) и окрашивали кумасси бриллиантовым голубым К250. После обесцвечивания, мембраны промывали, по крайней мере, 5 раз сверхчистой водой (МЫ1 О; Мййроте, ВебТотб, МА).
Для получения достаточных количеств чистого усеченного хемокина для биологических анализов, приблизительно 50 мкг рекомбинантного хемокина обрабатывали С'О26/ЭРР IV и продукт расщепления подкисляли 0,1% трифторуксусной кислотой (ТЕ А). Для предотвращения прилипания хемокинов к пробиркам добавляли Твин 20 (0,01%).
Хемокины отделяли от С’О26/ЭРР IV в градиенте ацетонитрила на колонке Ациароге КР-300 с С-8 (1x50 мм) (Регкт Е1тег). Фракции, содержащие белки, анализировали посредством электрофореза в ПААГ с ДСН и окрашивали серебром, как было описано ранее.
С’О26/ЭРР I У-обработанные хемокины, очищенные с помощью ОФ-ВЭЖХ или вырезанные из ПВДФ-блотов, подвергали ΝΗ2концевому секвенированию посредством деградации по Эдману на импульсном жидкофазном секвенаторе 477А/120А для секвенирования белков (Регкт Е1тег) с использованием Νметилпиперидина в качестве связывающего основания.
Детекция хемотаксической активности.
Хемокины тестировали на их хемотаксическую способность по отношению к свежевыделенным нейтрофильным гранулоцитам периферической крови (106 клеток/мл) или культивированным моноцитам ТНР-1 (0,5х106 клеток/мл) в микрокамере Бойдена (Ртоок! Р. е! а1., 1996 & РтооЦ Р. е! а1., 1993).
После 45-минутного (гранулоциты) или 2часового (клетки ТНР-1) инкубирования при 37°С, клетки фиксировали и окрашивали. Клет ки, которые мигрировали через поликарбонатные мембраны с порами размером 5 мкм, подсчитывали в десяти полях объектива микроскопа с масляной иммерсией.
Хемотаксический индекс (Х.И.) образца (тройные дубликаты в каждой камере) подсчитывали как число клеток, мигрировавших в образец, деленное на число клеток, мигрировавших в контрольную среду. Для экспериментов на десенсибилизацию клетки инкубировали с биологически инактивированными вариантами хемокинов в течение 10 мин при 37°С перед переносом в камеру.
Для оценки десенсибилизации хемотаксиса вычисляли % ингибирования Х.И., полученного при десенсибилизации с использованием НВ88обработанных контрольных клеток.
Детекция внутриклеточных концентраций Са2+.
Внутриклеточные концентрации кальция ([Са2+ф) измеряли, как описано ранее (^иу!§ А. е! а1., 1997). Вкратце, очищенные клетки инкубировали с флуоресцентным индикатором фура2 (фура-2/АМ, 2,5 мкМ; молекулярные зонды. Мо1еси1аг РтоЬек Еигоре ВV, Ьейеп, ТНе №1йет1апб§) и 0,01% плюроника Е-127 (81дта, 8!.Ьош5 МО).
После выдерживания в течение 30 мин клетки два раза промывали, ресуспендировали в НВ88 с 1 мМ Са2+ и инкубировали в течение 10 мин при 37°С, а затем измеряли фура-2флуоресценцию в люминесцентном спектрофотометре Б850В (Регкт Е1тег). После возбуждения при 340 и 380 нм, флуоресценцию детектировали при 510 нм. Уровень [Са2+]1 вычисляли по уравнению Гринкевича (Сгупке\\зс/ е! а1., 1985).
Для определения Ктах, клетки лизировали 50 мкМ дигитонином. Затем рН доводили до 8,5 с использованием 20 мМ Триса, и величину К.тш получали при добавлении 10 мМ ЕСТА к лизированным клеткам. Величина Ка, используемая для калибрации, составляла 224 нМ. Для экспериментов на десенсибилизацию, клетки сначала стимулировали буфером или хемокином в различных концентрациях. Хемокины в качестве второго стимулятора добавляли в концентрации, индуцирующей значимое увеличение [Са2+]1 после предварительной стимуляции буфером. Вычисляли процент ингибирования увеличения [Са2+]1 в ответ на предварительную стимуляцию клеток вторым стимулятором.
Ингибирование ВИЧ-1-инфекции.
М-тропные штаммы ВИЧ-1, ВаЬ и 8Е162 были получены в соответствии с программой МКС по изучению СПИД-реагентов (Ней8, ИК). Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), взятые от здоровых доноров, выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности (5,23) и стимулировали ФГА при 1 мкг/мл (81дта, Вогпет, Ве1дшт) в течение 3 дней при 37°С. Активированные клетки (ФГА-стимули рованные бласты) три раза промывали РВ8 и инфицировали вирусом, как описано ранее (8сйо1к Ό. с1 а1., 1997). ВИЧ-1-инфицированные или псевдоинфицированные ФГА-стимулированные бласты культивировали в присутствии 25 ед./мл ГЬ-2 и различных концентраций ΚΑΝΤΕ8 (1-68) или ΚΑΝΤΕ8 (3-68). На 10-й день собирали клеточные супернатанты и коровий антиген ВИЧ-1 в супернатанте анализировали с помощью набора для р-24-Ад-ЕЬ18А (ΌπΡοηί/ΝΕΝ ЫГс 8с1еисе Ртобис!к, Вгикке1к, Ве1дшт).
Результаты
Идентификация и биологическая характеризация природного усеченного по МТ2-концу ΚΑΝΤΕ8.
Были предварительно выделены различные усеченные по NΗ2-концу формы ССР-2 человека (Ргоок! Р. е! а1., 1993). Наиболее усеченную ССР-2-форму расщепляли в сайте после Рго в предпоследнем положении [ССР-2(3-75)]. С использованием аналогичной стандартной процедуры очистки, С-С-хемокин ΚΑΝΤΕ8 выделяли из лейкоцитов периферической крови или из клеток саркомы (Ргоок! Р. е! а1., 1996).
В частности, кондиционированные среды от клеток МС-63 или клеток саркомы Малаву, индуцированных смесью цитокинов, фракционировали для выделения природных вариантов хемокинов. Эти хемокины последовательно очищали с помощью аффинной хроматографии с использованием антитела или гепарина, катионнообменной хроматографии (моно-8-ЖЭХБ) и ОФ-ВЭЖХ, и иммунореактивные формы детектировали с помощью хемокинспецифического ЕЫ8А. Было обнаружено, что на катионообменной колонке ГЬ-8 элюируется в непосредственной близости от ΚΑΝΤΕ8 (между 0,7 и 0,75М №101). Тем не менее, оба хемокина отделяли друг от друга с помощью ОФ-ВЭЖХ (ΚΑΝΤΕ8 и ГЬ-8 элюировались при 27,5 и 30% ацетонитрила соответственно). Анализ аминокислотных последовательностей очищенных белков подтвердил, что 1Ь-8 встречается в различных усеченных по ИН2-концу формах, которые были ранее выделены, исходя из их хемотаксической активности (Уаи Эатте 1. е! а1., 1989). Однако для ΚΑΝΤΕ8 была выделена только одна форма, в которой, по сравнению с интактным ΚΑΝΤΕ8, отсутствовали два ΝΗ2концевых остатка. Для проверки его хемотаксической активности в отношении моноцитов и эозинофилов этот ΚΑΝΤΕ8 (3-68) был проанализирован более тщательно на частоту его встречаемости. В частности, ΚΑΝΤΕ8 (3-68) был протестирован на хемотаксическую активность и/или на активность высвобождения внутриклеточного Са2+ и его биологическую эффективность по сравнению с эффективностью соответствующих интактных хемокинов.
ХН2-концевая делеция двух остатков ΚΑΝΤΕ8 приводила к значительному снижению моноцитарной хемотаксической активности и Са2+-высвобождающей активности. По сравнению с интактным природным ΚΑΝΤΕ8 (минимальная эффективная доза 3-10 нг/мл), природный ΚΑΝΤΕ8 (3-68) оказался полностью неактивным при тестировании в концентрациях вплоть до 300 нг/мл в микрокамере Бойдена (фиг. 2). Кроме того, для достижения Са2+ответа, аналогичного ответу ΚΑΝΤΕ8 (1-68), для природного ΚΑΝΤΕ8 (3-68) потребовались в 10 раз более высокие концентрации (фиг. 3).
СО26/ЭРР ГУ способствует удалению ΝΗ2концевых дипептидов хемокинов.
Для того чтобы определить, является ли аминопептидаза СО26/ПРР ГУ ответственной за ХН2-концевое усечение ΡΑΝΤΕ8. интактный хемокин инкубировали в течение ночи с СО26/ЭРР ГУ, блотировали на ПВДФ-мембраны, окрашивали Кумасси синим и подвергали автоматической деградации по Эдману. СО26/ЭРР ГУ-обработка ΚΑΝΤΕ8 приводила к удалению ХН2-концевых дипептидов. Параллельное инкубирование хемокина с буфером без СО26/ЭРР гУ не дало эффекта.
Поскольку другие хемокины содержали консенсусную последовательность для СЭ26/ ЭРР ГУ-расщепления и поскольку было показано, что ХН2-конец МСР играет решающую роль в биологической активности (Соид 1. е! а1., 1996 и Соид 1. е! а1., 1995), то МСР-1, МСР-2 и МСР3 были также инкубированы с СО26/ЭРР ГУ.
После обработки МСР блотировали на ПВДФ-мембранах и окрашивали кумасси синим для подтверждения того, что для деградации по Эдману было выделено достаточное количество белка.
Однако ЫН2-концевая последовательность не могла быть обнаружена, что указывает на то, что СО26/ЭРР ГУ не модифицирует МТ2-конец МСР, который блокируется пироглутаминовой кислотой при деградации по Эдману.
Сравнение биологической активности интактного и СО26/ЭРР ГУ-обработанного ΚΑΝΤΕ8.
Аналогично природному ΚΑΝΤΕ8 (3-68), С-8-ОФ-ВЭЖХ-очищенный, СЭ26/ЭРР ГУобработанный рекомбинантный ΚΑΝΤΕ8 был неактивным в микрокамере Бойдена в экспериментах по хемотаксису с использованием в концентрациях вплоть до 1 мкг/мл, тогда как при концентрациях интактного рекомбинантного ΚΑΝΤΕ8 от 30 до 100 и выше наблюдался значимый хемотаксический ответ моноцитов (фиг. 2).
При оценке эффекта усечения, проведенной в анализе на мобилизацию Са2+, ΚΑΝΤΕ8 (3-68) при концентрации 100 нг/мл индуцировал низкое, но значимое увеличение мобилизации Са2+, однако, интактный ΚΑΝΤΕ8 становился активным уже при 10 нг/мл (фиг. 3). И наконец, несмотря на то, что были удалены только два ХН2-концевых остатка, моноцитарная хемотак сическая и Са2+-мобилизирующая способность Κ.ΑΝΤΕ8 при этом снижалась в 10-100 раз.
Κ.ΑΝΤΕ8 (3-68) является природным антагонистом хемотаксиса по сравнению с интактным Κ.ΑΝΤΕ8.
Принимая во внимание отсутствие активности Κ.ΆΝΤΕ8 (3-68) в экспериментах по хемотаксису моноцитов, авторы провели анализ для того, чтобы определить, может ли этот усеченный Κ.ΆΝΤΕ8 действовать как антагонист. Κ.ΆΝΤΕ8 (3-68) при концентрации 1 мкг/мл почти полностью (82%) десенсибилизировал хемотаксическое действие 100 нг/мл интактного Κ.ΑΝΤΕ8 (табл. 1).
При добавлении в верхнюю лунку 3кратного избытка Κ.ΑΝΤΕ8 (3-68), хемотаксис клеток ТНР-1 в направлении интактного
Κ.ΑΝΤΕ8 ингибировался приблизительно на 5070%. ΒΑΝΤΕ8 (3-68) при 300 нг/мл еще был способен ингибировать приблизительно 30% хемотаксического ответа в направлении равной концентрации интактного ΒΛΝΤΕ8.
В экспериментах на мобилизацию Са2+ в клетках ТНР-1 (фиг. 4), интактный Κ.ΑΝΤΕ8 при 30 нг/мл способен десенсибилизировать действие 30 нг/мл интактного ΒΛΝΤΕ8 на 39±5%. Для достижения того же самого уровня десенсибилизации необходимо использовать приблизительно в 10 раз большие концентрации Κ.ΆΝΤΕ8 (3-68). Однако при 300 нг/мл, Κ.ΑΝΤΕ8 (368) сам дает значимый Са2+-ответ. Этот Са2+ответ сопоставим с ответом, полученным с использованием 30 нг/мл интактного ΚΑΝΤΕ8.
Таблица 1
ΒΑΝΤΕ8 (3-68) десенсибилизирует хемотаксис моноцитов, индуцированный ΒΑΝΤΕ8 (1-68)1
Хемокин, нг/мл Хемотаксический ответ (Х.И.)
Нижняя лунка Верхняя лунка % ингибирования
Κ.ΑΝΤΕ8 (1-68) Κ.ΑΝΤΕ8 (3-68) А В С Ό Среднее ± ср.кв.ош. Среднее ± ср.кв.ош.
300 1000 12,5 7,5 27,5 50,5 25 ± 10 67 ± 8
300 22,0 20,5 72,5 79,5 49 ± 16 31 ± 13
0 41,0 46,0 71,5 97,0 64 ± 13 0
100 1000 4,0 3,0 13,5 11,0 8 ± 3 82 ± 4
300 7,5 7,0 29,0 33,0 19 ± 7 53 ± 11
0 24,0 21,5 50,0 44,5 35 ± 7 0
1 Результаты представляют собой хемотаксический индекс (Х.И.) из четырех (Α-Ό) независимых экспериментов (включая среднее значение ± ср.кв.ош.) и процент (%) ингибирования (среднее значение ± ср.кв.ош. % ингибирования из четырех экспериментов) хемотаксического ответа на Κ.ΑΝΤΕ8 (1-68) после предварительного инкубирования клеток ТНР-1 с неактивным ΒΑΝΤΕ8 (3-68) или с буфером.
Пониженная хемотаксическая активность Κ.ΑΝΤΕ8 (3-68) для моноцитов и эозинофилов человека.
В табл. 2 хемотаксическую способность природного Κ.ΑΝΤΕ8 (3-68) сравнивают со способностью моноцитарного хемотаксического белка МСР-3 и интактного Κ.ΑΝΊΈ8 (1-68). Как можно видеть, МСР-3 и Κ.ΑΝΤΕ8 (1-68) при концентрациях 3 и 30 нг/мл соответственно, еще обладают хемотаксической активностью для свежевыделенных моноцитов периферической крови, тогда как природный Κ.ΑΝΤΕ8 (3-68) остается неактивным при 100 нг/мл.
Пониженная хемотаксическая способность этого природного варианта была подтверждена с использованием рекомбинантного ΚΑΝΤΕ8 (3-68). Хотя очищенный рекомбинантный Κ.ΑΝΤΕ8 (3-68) обладал слабой хемотаксической активностью для моноцитов (при 1 мкг/мл), однако, он обнаруживал специфическую активность, которая была в 10 раз ниже, чем активность интактного рекомбинантного Κ.ΑΝΤΕ8.
И, наконец, хемотаксическая активность Κ.ΑΝΤΕ8 (3-68) была подтверждена на эозинофилах человека, которые были еще восприимчивыми к 100 нг/мл интактного Κ.ΑΝΤΕ8 и 30 нг/мл МСР-3 (фиг. 5). Аналогично моноцитам, миграция эозонофилов стимулировалась лишь Κ.ΑΝΤΕ8 (3-68) при 1 мкг/мл.
Таблица 2
Сравнение моноцитарной хемотаксической активности Κ.ΑΝΤΕ8 (3-68) с активностью
ΒΑΝΊΈ8 (1-68) и МСР-3
Конц, нг/мл Моноцитарная хемотаксическая активностьа)
МСР-3 ιιαίΒΑΧΊΈΧ (3-68) ιβ^ΑΝΤΕδ (1-68) ι^ΚΑΝΤΕδ (3-68)
1000 >) - 3,6 ± 0,8 (6) 3,3 (1)
300 6,0 ± 1,2 (6) - - -
100 - 1,1 ± 0,1 (3) 3,3 ± 0,4 (6) 1,0 (1)
30 6,9 ± 1,0 (6) 1,7 ± 0,2 (3) - -
10 - 1,9 ± 0,6 (3) 1,9 ± 0,4 (6) < 1,0 (1)
3 4,1 ± 0,4 (6) - - -
ι) среднее значение хемотаксического индекса (Х.И.) ± ср кв.ош. (п) для свежевыделенных моноцитов периферической крови. Ь) не определяли.
Κ.ΛΝΤΕ8 (3-68) передают сигналы и десенсибилизируют Κ.ΑΝΤΕ8 (1-68) посредством ССК5, но не посредством ССК1 и ССК3.
Для объяснения пониженной хемотаксической активности ΚΑΝΤΕ8 (3-68) была проверена способность этого варианта хемокина связываться и передавать сигнал посредством известных рецепторов, используемых ΚΑΝΤΕ8.
В анализе на передачу сигнала, в котором измеряли повышение внутриклеточной концентрации кальция, были использованы клетки ΗΘ8, трансфецированные хемокиновыми рецепторами ССК1, ССК3 или ССК5. При концентрациях вплоть до 300 нг/мл, ΚΑΝΤΕ8 (3-68) не дает увеличения | Са' |, в клетках ΗΘ8, трансфецированных ССК1 (табл. 3) или ССК3 (данные не приводятся), тогда как концентрации 30 и 100 нг/мл интактного ΚΑΝΤΕ8 оказались достаточными для индуцирования увеличения | Са2'|, в ССК1- и ССКБ-трансфектантах соответственно.
Однако как интактный, так и усеченный ΚΑΝΤΕ8 были способны индуцировать значимое увеличение | Са|, в ССК5-трансфектантах при 30 нг/мл. Кроме того, при предварительном инкубировании ССЯ5-трансфецированных клеток с 3-10-кратным избытком либо ΚΑΝΤΕ8 (368), либо интактного Κ.ΑΝΤΕ8 наблюдалось одинаковое ингибирование (около 75%) увели чения | Са2'|, при последующей стимуляции интактным ΚΑΝΤΕ8 (100 нг/мл) (фиг. 6).
В противоположность этому, 300 нг/мл ΚΑΝΤΕ8 (3-68) давал лишь незначительную десенсибилизацию кальциевой реакции ССК1- и ССК3-трансфецированных клеток в ответ на 100 нг/мл интактного Κ.ΑΝΤΕ8. тогда как 3-кратный избыток интактного Κ.ΑΝΤΕ8, используемый в качестве первого стимулятора, почти полностью ингибировал повышение | Са2'|, в этих клетках при последующей стимуляции ΚΑΝΤΕ8 (1-68). Исходя из этого, можно сделать вывод, что удаление двух ИН2-концевых остатков у ΚΑΝΤΕ8 оказывает существенное влияние на передачу сигнала, в результате чего хемокиновые рецепторы ССК1 и ССК3 больше не могут функционально распознаваться. Поэтому пониженная хемотаксическая активность Κ.ΑΝΤΕ8 (3-68) может быть объяснена его неспособностью функционировать посредством ССК1 и ССК3. В противоположность этому, ΚΑΝΤΕ8 (3-68) полностью сохраняет способность к ССК5-опосредованной передаче сигнала, характерной для интактного Κ.ΑΝΤΕ8. ΚΑΝΤΕ8 (3-68) может оказывать противовоспалительное действие посредством конкуренции с интактным ΚΑΝΤΕ8, но он может действовать еще как ингибитор ВИЧ, благодаря сохранению своей способности к связыванию с ССК5.
Таблица 3
Мобилизация кальция ΚΑΝΤΕδ-формами в ССК-1- и ССК-5-трансфектантах
Хемокин Конц., нг/мл Повышение |Са2+|ь нМа)
ССК1 ССК5
ΚΑΝΤΕ8 (1-68) 300 133 ± 5 (3) 96 ± 1 (2)
100 100 ± 28 (3) 60 ± 4 (2)
30 25 ± 8 (3) 24 ± 2 (2)
10 <15 (2) <15 (1)
ΚΑΝΤΕ8 (3-68) 300 19 ± 9 (3) 119 ± 5 (2)
100 <15 ± 0 (3) 76 ± 4 (2)
30 <15 (2) 56 ± 13 (2)
10 <15 (1)
среднее увеличение Са2+| в нМ ± ср.кв.ош., полученное из двух или более независимых экспери-
ментов.
Ингибирование ΚΑΝΤΕ8 (3-68)-формой хемотаксиса, индуцированного СС-хемокином в клетках моноцитов человека.
Для того чтобы подтвердить, происходит ли ингибирование передачи сигнала ССхемокином под действием ΚΑΝΤΕ8 (3-68) также в клетках моноцитов, были проведены эксперименты по ингибированию в клетках ТНР-1. Эсперимент показал, что ΚΑΝΤΕ8 (3-68) обна руживает в 10 раз более низкую способность к повышению | Са21|, в моноцитах по сравнению с интактным ΚΑΝΤΕ8 (данные не приводятся). Кроме того, хемотаксическое действие интактного ΚΑΝΤΕ8 (30 нг/мл) на моноциты ингибируется (71%) при инкубировании тестируемых клеток с 300 нг/мл ΚΑΝΤΕ8 (3-68), как показано в табл. 4.
Это свидетельствует о том, что ΚΑΝΤΕ8 (3-68) действует как ингибитор широкого спектра миграции клеток моноцитов, индуцированной другими СС-хемокинами.
Таблица 4
Кроме того, ΚΑΝΤΕ8 (3-68) способствует снижению хемотаксической реакции в ответ на другие СС-хемокины, включая моноцитарный хемотаксический белок-3 (МСР-3) (67%), макрофагальный белок воспаления ΜΙΡ-1α (61%) и М1Р-1в (80%).
Ингибирование ΒΑΝΊΈ8 (3-68) клеточного хемотаксиса моноцитов, вызываемого СС-хемокинами
Ингибирование хемотаксиса клеток ТНР-1
Хемокина) Конц., нг/мл БуферЬ,с) ΚΑΝΤΕ8 (3-68)Ьс % ингибированияб)
ΚΑΝΤΕ8 30 19,0 ± 6,6 3,7 ± 0,6 71 ± 16
МСР-3 30 48,5 ± 9,3 24,9 ± 2,0 45 ± 10
МСР-3 3 7,6 ± 2,5 3,1 ± 0,8 67 ± 13
ΜΙΡ-1α 30 6,2 ± 2,4 3,0 ± 1,1 61 ± 22
ΜΙΡ-1β 300 4,3 ± 1,0 1,9 ± 0, 6 80 ± 12
Контроль 1,5 ± 0,5 1,0 ± 0,5
а) ΚΑΝΤΕ8, МСР-3, ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β и буфер добавляли в качестве хемоаттрактантов в нижние лунки микрокамеры.
b) верхние лунки микрокамеры заполняли клетками ТНР-1, предварительно инкубированными (10 мин, 37°С) с 300 нг/мл ΚΑΝΤΕ8 (3-68) или с буфером.
c) среднее ХИ ± ср.кв.ош. из четырех независимых экспериментов.
б) Ингибирование миграции, индуцированной интактными хемокинами, в присутствии ΚΑΝΤΕ8 (368) при 300 нг/мл.
СБ26-специфическое усечение ΚΑΝΤΕ8 необходимо для его противовирусной активности.
Сначала оценивали действие различных форм ΚΑΝΤΕ 8 против двух различных Мтропных штаммов ВИЧ-1 (ВаЬ и 8Р162) в МКПК человека, взятых из крови здоровых доноров. 1С50 для интактного ΚΑΝΤΕ8 (1-68) по отношению к штамму ВаЬ составлял 3,4 нМ, а 1С50 для ΚΑΝΤΕ8 (3-68) составлял 0,39 нМ. Величина 1С90 для Κ.ΑΝΤΕ8 (1-68) составляла 71 нМ, которая приблизительно в 10 раз превышала величину 1С90 для ΚΑΝΤΕ8 (3-68). Что касается штамма 8Е162, то при оценке в ПКМК, ΚΑΝΤΕ8 (1-68) (1С50: 23 нМ; 1С90: 95 нМ) был более чем в 10 раз менее активным, чем ΚΑΝΤΕ8 (3-68). (1С50: 2 нМ; 1С90: 8,2 нМ) (табл. 5). Зависимое от концентрации действие обоих хемокинов при концентрациях в пределах от 133 до 0,2 нМ против репликации 8Е162 ВИЧ-1 в ПКМК проиллюстрировано на фиг. 8. Концентрация 5,2 нМ ΚΑΝΤΕ8 (3-68) оказалась достаточно эффективной для снижения репликации вируса, тогда как Κ.ΑΝΤΕ8 (1-68) был неактивен при этой концентрации. Какого-либо отличия в антивирусной активности между интактными ΚΑΝΤΕ8, полученными от РертТссЬ или К&Б 8у51еш5, не наблюдалось.
Резкое различие в антивирусной активности между двумя формами ΚΑΝΤΕ8 было даже более заметно при тестировании в ССК5трансфецированных клетках человека. В клетках И78.СБ4.ССК5, 1С50 для ΚΑΝΤΕ8 (1-68) и ΚΑΝΤΕ8 (3-68) по отношению к штамму ВаЬ составляли 21 нМ и 0,65 нМ соответственно. 1С90 для ΚΑΝΤΕ8 (1-68) составлял более чем 133 нМ, тогда как 1С90 для ΚΑΝΤΕ8 (3-68) со ставлял 63 нМ. В табл. 5 также показано, что ΚΑΝΤΕ8 (1-68) был фактически неактивным в клетках НО8.СБ4.ССК5 (1С50 >133 нМ), тогда как ΚΑΝΤΕ8 (3-68) оказался сильным ингибитором репликации ВаЬ ВИЧ-1 в этих клетках (1С50: 5,5 нМ). Однако для обеих форм ΚΑΝΤΕ8 в этих клетках не были достигнуты значения 1С90.
Противовирусная активность ΚΑΝΤΕ8 зависит от присутствия мембраноассоциированного или растворимого СБ26 (кСБ26).
Была оценена экспрессия СБ26 на двух различных ССК5-трансфецированных клеточных линиях и на свежевыделенных ПКМК. Трансфектанты НО8 были негативными в отношении экспрессии СБ26. как было определено путем анализа методом проточной цитометрии, тогда как трансфектанты И87 окрашивались слабо, но обнаруживали значимо позитивную реакцию с тΑЬ против СБ26 (фиг. 9). Кроме того, было обнаружено, что субпопуляция свежевыделенных МКПК оказалась в высокой степени положительной в отношении экспрессии СБ26 (фиг. 9).
Зависимое от концентрации действие ΚΑΝΤΕ8 (1-68) и ΚΑΝΤΕ8 (3-68) на продуцирование вирусного р-24-Ад штаммом ВаЬ в трансфецированных клетках НО8.СБ4.ССК5 в присутствии кСБ26 показано на фиг. 10. Добавление 8СБ26 вместе с ΚΑΝΤΕ8 (1-68) в начале ВИЧ-инфицирования значительно повышало антивирусную активность интактного ΚΑΝΤΕ8 в клетках НО8-СБ4.ССР.5. При добавлении кСБ26 при 50 ед./л вместе с ΚΑΝΤΕ8, 1С50 для ΚΑΝΤΕ8 составляло 13 нМ. Добавление только одного кСБ26 не оказывало какого-либо влияния на репликацию вируса. Добавление кСБ26 к
ΡΑΝΤΕ8 (3-68) также не влияло на антивирусную активность ΡΑΝΤΕ8 (3-68) (данные не приводятся). Таким образом, присутствие С.Р26 играет важную роль в сообщении интактному ΚΑΝΤΕ8 противовирусной активности.
Усечение природного ΜΙΡ-1α по аминоконцу не влияет на его анти-ВИЧ-1, хемотаксическую и Са2+-мобилизирукщую активность.
Поскольку большинство природных ΜΙΡ1α является усеченными по ИН2-концу (на четыре аминокислоты), то авторами было проведено исследование для того, чтобы определить, имеет ли этот усеченный ΜΙΡ-1α (5-70) измененную ВИЧ-1-ингибирующую способность. В отличие от результата, полученного для ΡΑΝΤΕ8, какого-либо значимого различия в величинах 1С50 для интактного ΜΙΡ-1α и для ΜΙΡ-1α (5-70) в МКПК или в ССК5-трансфецированных клетках (табл. 5, фиг. 8) обнаружено не было.
Кроме того, был проведен сравнительный анализ влияния интактного ΜΙΡ-1α и усеченного ΜΙΡ-1α (5-70) на хемотаксис моноцитов ТНР-1 и мобилизацию в них внутриклеточного Са2+. В табл. 6 продемонстрировано, что минимальная эффективная доза ΜΙΡ-1α (5-70), индуцирующая повышение [Са2+]1, была лишь незначительно ниже, чем доза интактного ΜΙΡ-1α. Более того, хотя максимальная миграция, наблюдаемая при 0,13 нМ в анализе на хемотаксис, была выше для интактного ΜΙΡ-1α, однако, минимальные подавляющие концентрации обеих изоформ ΜΙΡ-1α были почти аналогичными. В целом, можно сделать вывод, что NΗ2-концевой процессинг ΜΙΡ-1α, в отличие от ΚΑΝΤΕ8, лишь незначительно ослабляет его противовоспалительную и анти-ВИЧ-1-активность.
Таблица 5
Анти-ВИЧ-1-активность ΡΑΝΤΕ8 и ΜΙΡ-1α в ФГА-стимулированных МКПК, клетках.И87.СР4.ССР.5
ΚΑΝΤΕ8 (1-68) ΚΑΝΤΕ8 (3-68) ΜΙΡ-1α (1-70) ΜΙΡ-1α (5-70)
Κ?50 1С90 Κ?50 ГС90 Κ?50 ГС90 Κ?50 1С90
РМВС ВаЬ 3,4 71 0,39 6,9 1,9 62 1,6 13
8Р162 23 95 2,0 8,2 3,1 30 3,6 32
И87.СР4.ССК.5 ВаЬ 21 >130 0,65 63 ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΡ
НО8.СР4.ССК.5 ВаЬ >130 >130 5,5 >130 32 >130 21 >130
Мониторинг выхода вируса в бесклеточном супернатанте проводили через 8-12 дней после инфицирования вирусным р-24-Ад в ΕΗ8Α. Представлены средние величины Ιί.'50 и К'. (в нМ). Данные представляют собой сред ние значения, полученные из 2-4 независимых экспериментов. Величина, обозначенная >130, указывает на то, что 50%- или 90%-ное ингибирование не достигалось при 130 нМ. ΝΡ - не определяли.
Таблица 6
Отсутствие различия в биологических активностях интактного и усеченного ΜΙΡ-1α
Хемокин Хемотаксис* Увеличение в [Са2+]1**
нМ Х.И. нМ НМ [Са2+]1
ΜΙΡ-1α(1-70) 1,3 8,5 ± 3,3 3,9 240/195
0,13 22,2 ± 4,4 0,39 120/130
0,013 5,7 ± 1,6 0,34 30/14
0,0013 4,0 ± 3,1
ΜΙΡ-1α(5-70) 1,3 14,2 ± 0,4 4,0 196/178
0,13 11,4 ± 2,9 0,4 71/33
0,013 3,8 ± 1,4 0,04 10/<10
0,0013 2,1 ± 0,6
* Миграция моноцитов ТНР-1 через 5,0 мкм-поры в микрокамере. Результат представляет собой среднее значение ± ср.кв.ош. из трех независимых экспериментов.
** Детекция увеличения [Са2+]1 в клетках ТНР-1. Приводятся результаты, полученные из двух независимых экспериментов.
Литература
ВаддюНш Μ. е! а1., Αηη. Рсу. Iттиηο1., 55, 97-179, 1994.
ВаддюНш Μ. е! а1., Αηη. Рсу. Iттиηο1., 15, 675-705, 1997.
С’1агк-Ес\\з5 Ι. е! а1., 1. Вю1. Скет., 266, 23128-23134, 1991.
Ре Μее8ΐе^ Ι. е! а1., 1. Iттиηο1. Μеΐкοά8
189, 99-10526, 1996.
Реод Н. е! а1., №11иге.. 381, 661-666, 1996. Οοη§ 1. е! а1. 1. Εχρ. Μеά., 181, 631-640, 1995.
Οοη§ 1. е! а1., 1. Вю1. Скет. 271, 1052110527, 1996.
Сгупк1с\у|сх 6. е! а1., 1. ΒίοΙ. Скет., 260, 3440, 1985.
Ргоок! Р. е! а1., Вюскетщйу, 32, 1017010177, 1993а.
Ргоок! Р. е! а1., 1. 1ттипо1., 150, 1000-1010,
1993.
Ргоок! Р. е! а1., Су!окше, 7, 97-104, 1995.
Ргоок! Р. е! а1., Мебюбк: А сотрашоп !о Ме!кобк ίη Епгуток, 10, 82, 1996.
РгоибЕоо! А.Е. е! а1., 1. Вю1. Скет., 271, 2599-2603, 1996.
8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А 1аЬога!огу Мапиа1 Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ, 1989.
8ска11 Т.1. е! а1., 1. 1ттипо1., 141, 19181025, 1988.
8ско1к Ό. е! а1., 1. Ехр. Меб., 186, 13831388, 1997.
8оххаш 8. е! а1., 1. 1ттипо1., 152, 3615,
1994.
ТаиЬ Ό. е! а1., Су!окше & ОгоМк Рас!ог Реу1е\\ъ. 7, 335-76, 1996.
Уап Эатте 1. е! а1., Еиг. 1. Вюскет., 181, 337-344, 1989.
Уап Эатте 1. е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1., 20, 2113-8, 1990.
Уап Эатте 1. е! а1., 1. Ехр. Меб., 176, 59,
1992.
\Уа1х А. е! а1., Вюскет. Вюркук. Рек. Соттип., 159, 969-75, 1989.
^иу!к А. е! а1., Вюскет1кбу, 36, 2716-2723,
1997.
Список последовательностей (1) Общая информация:
(ί) Заявитель (A) Имя: Αρρίίβά ВезеагсЬ ЗуэЬетз Агз НоЬсИпд Ν.ν.
(B) Улица: 14 ДоЬп В. ЗогзЬгаиед (C) Город: Сигасао (Е) Страна: ТЬе ЫеДИегТапсбз АпЫЫез (Е) Почтовый индекс (ΖΪΡ): нет (С) Телефон: 599-9-639300 (Н) Телефакс: 599-9-614129 (ϋ) Название изобретения: Усеченные по амино-концу ΚΑΝΤΕ5 как антагонисты хемокинов (ϋί) Число последовательностей: 2 (ίν) Форма компьютерного считывания:
(A) Тип носителя: гибкий диск (B) Компьютер: РС совместимая с ΙΒΜ (C) Операционная система: РС-ОО5/М5-ОО5 (ϋ) Программное обеспечение: РаРепЫп Ке1еазе # 1.0,
УегзЬоп #1.30 (ЕРО) (2) Данные последовательности ЗЕО Ιϋ Νο: 1:
(ί) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 91 аминокислота (B) Тип: аминокислотная (C) Цепочечность:
(ϋ) Топология: линейная (ϋ) Тип молекулы: белок (ίίί) Гипотетичность: нет (ίν) Антисмысловая: нет (ίχ) Отличительный признак:
(A) Имя/ключ: Белок (B) Локализация: 1..68 (χί) Описание последовательности ЗЕО Ιϋ Νο: 1:
МеС Ьуз УаЬ Зег АЬа АЬа Ахд Ьеи АЬа УаЬ Не Ьеи 11е АЬа ТЬе АЬа
-20 -15 -10
Ьеи Суз АЬа -5 Рго А1а Зег АЬа Зех 1 Рго Туг Зег Зег 5 Азр ТЬг ТЬе Рео
Суз 10 Суз РЬе АЬа Туг 11е 15 АЬа Агд РЕО Ьеи Рго 20 АГ5 АЬа НЬз 11е Ьуз 25
<51и Туг РЬе Туг ТЬг 30 Зег СЬу Ьуз Суз Зег 35 Азп Рго АЬа УаЬ УаЬ 40 РЬе
УаЬ ТЬг Агд Ьуз 45 Азп Агд (51 п УаЬ Суз 50 АЬа Азп •Рго (51и Ьуз 55 Ьуз Тхр
УаЬ Агд <51и 60 Туг 11е Азп Зех Ьеи 65 С1и МеС Зех
(2) Данные последовательности ЗЕО Ю Νο: 2:
(ί) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 66 аминокислоты (B) Тип: аминокислотная (C) Цепочечность:
(Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: белок (ϊϋ) Гипотетичность: нет (ίν) Антисмысловая: нет (χί) Описание последовательности 5Е<2 Ιϋ Νο: 2
Туг Зег Зех Азр ТЬе ТЬг Рео Суз Суз РЬе АЬа Туг Не АЬа Агд Рго
1 5 10 15
Ьеи Рхо Ахд АЬа НЬз 11е Ьуз СЬи Туг РЬе ТУЕ ТЬг Зег <51у Ьуз Суз
20 25 30
Зег Азп Рго АЬЖ УаЬ УаЬ РЬе УаЬ ТЬг Ахд Ьуз Азп Ахд (51л УаЬ Суз
35 40 45
АЬа Азп Рхо СЬи Ьуз Ьуз Тгр УаЬ Ахд 61 и ТуЕ 11е Азп Зег Ьеи СЬи
55 60
МеС Зег €5

Claims (10)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Усеченный по амино-концу хемокин К.А№ТЕ8, у которого отсутствуют Ν^концевые аминокислоты, соответствующие аминокислотным остаткам 1-2 природного К.А№ТЕ8, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 Ш №:2, который обладает антагонистической активностью в отношении хемокинов МСР-3, МСР-1а, МСР-13 и ΚΛΝТЕ8.
  2. 2. Усеченный по амино-концу ΒАNТЕ8 по п.1 в гликозилированной форме.
  3. 3. Молекула ДНК, кодирующая усеченный по амино-концу КА№ТЕ8 по п.1 или 2.
  4. 4. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу ДНК по п.3.
  5. 5. Клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор по п.4.
  6. 6. Рекомбинантный способ получения белка по п.1 или 2, включающий культивирование клеток по п.5 в соответствующей питательной среде и выделение продукта экспрессии.
  7. 7. Применение белка по п.1 или 2 в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний, терапия которых основана на антагонистической активности в отношении хемокинов МСР-3, МСР-1а, МСР-1 β и КАКТЕ8.
  8. 8. Применение белка по п.1 или 2 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или диагностики заболеваний, терапия которых основана на антагонистической активности в отношении хемокинов МСР-3, МСР-1а, МСР1β и КА№ТЕ8.
  9. 9. Применение по п.8 для изготовления лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний, ВИЧ-инфекций, заболе ваний, ассоциированных с ангиогенезом и гемопоэзом, и опухолей.
  10. 10. Фармацевтическая композиция, содержащая белок по п.1 или 2, в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями и/или наполнителями для лечения за болеваний, терапия которых основана на антагонистической активности в отношении хемокинов МСР-3, МСР-1а, МСР-Ιβ и ΚΑΝΤΕ8.
EA200000379A 1997-09-29 1998-09-28 Усеченный по амино-концу хемокин rantes и способы его использования EA003940B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97116863A EP0906954A1 (en) 1997-09-29 1997-09-29 Amino-terminal truncated c-c chemokines as chemokine antagonist
EP97122471A EP0905240A1 (en) 1997-09-29 1997-12-19 Amino-terminally truncated c-c chemokines as chemokine antagonists
EP98104216A EP0905241A1 (en) 1997-09-29 1998-03-10 Amino-terminally truncated c-c chemokines as chemokine antagonists
PCT/EP1998/006143 WO1999016877A1 (en) 1997-09-29 1998-09-28 Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200000379A1 EA200000379A1 (ru) 2000-10-30
EA003940B1 true EA003940B1 (ru) 2003-10-30

Family

ID=8227408

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200000378A EA003942B1 (ru) 1997-09-29 1998-09-28 Усеченный по амино-концу моноцитарный хемотаксический белок (mcp-2) и способы его использования
EA200000379A EA003940B1 (ru) 1997-09-29 1998-09-28 Усеченный по амино-концу хемокин rantes и способы его использования

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200000378A EA003942B1 (ru) 1997-09-29 1998-09-28 Усеченный по амино-концу моноцитарный хемотаксический белок (mcp-2) и способы его использования

Country Status (29)

Country Link
US (5) US6977071B2 (ru)
EP (6) EP0906954A1 (ru)
JP (2) JP4233214B2 (ru)
KR (2) KR100542934B1 (ru)
CN (3) CN1233415C (ru)
AR (2) AR013528A1 (ru)
AT (3) ATE263242T1 (ru)
AU (2) AU750341B2 (ru)
BG (2) BG64679B1 (ru)
BR (2) BR9812565A (ru)
CA (2) CA2305017A1 (ru)
CY (1) CY1110927T1 (ru)
CZ (2) CZ299479B6 (ru)
DE (3) DE69822856T2 (ru)
DK (3) DK1021541T3 (ru)
EA (2) EA003942B1 (ru)
EE (2) EE200000152A (ru)
ES (3) ES2287601T3 (ru)
HK (3) HK1062637A1 (ru)
HU (2) HU226414B1 (ru)
IL (2) IL135351A (ru)
NO (2) NO20001584D0 (ru)
NZ (3) NZ516027A (ru)
PL (2) PL196427B1 (ru)
PT (3) PT1439231E (ru)
SK (2) SK286439B6 (ru)
UA (2) UA73081C2 (ru)
WO (2) WO1999016877A1 (ru)
ZA (2) ZA988676B (ru)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7067117B1 (en) 1997-09-11 2006-06-27 Cambridge University Technical Services, Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
US6989435B2 (en) 1997-09-11 2006-01-24 Cambridge University Technical Services Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
US6534626B1 (en) * 1997-12-01 2003-03-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Chemokine variants
US7238711B1 (en) 1999-03-17 2007-07-03 Cambridge University Technical Services Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
DE60030749T2 (de) * 1999-10-25 2007-09-20 Pharis Biotec Gmbh Prozessiertes menschliches chemokin phc-1
EP1167527A1 (en) * 2000-06-22 2002-01-02 Euroscreen S.A. Processed human chemokines PHC-1 and PHC-2
AU2505601A (en) * 1999-11-15 2001-05-30 Wolf-Georg Forssmann Novel use of hcc-2
CA2316405A1 (en) * 2000-05-26 2001-11-26 Ian Clark-Lewis Modulation of inflammation by protease products
EP1176200A3 (de) 2000-06-20 2005-01-12 Switch Biotech Aktiengesellschaft Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Diagnose oder Behandlung von Hauterkrankung oder Wundheilung sowie ihre Verwendung zur Indentifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen
UA77950C2 (en) * 2000-10-04 2007-02-15 Applied Research Systems Use of mutants of cc chemokines for treatment of multiple sclerosis
GB2373785A (en) * 2001-03-28 2002-10-02 Rega Inst For Medical Res Truncating chemokines using dipeptidyl peptidase IV
US7553483B2 (en) 2001-12-17 2009-06-30 Merck Serono Sa Chemokine mutants acting as chemokine antagonists
WO2004104216A2 (en) * 2003-05-21 2004-12-02 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with dipeptidylpeptidase iv (dpp4)
DE102005049637A1 (de) * 2005-10-14 2007-04-26 Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen Antagonisten gegen die Interaktion von PF4 und RANTES
DK2185719T3 (en) 2007-08-02 2014-02-17 Novimmune Sa ANTI-RANTES ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
WO2011097567A1 (en) * 2010-02-08 2011-08-11 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Rantes multiplexed assay, rantes variants related to disease, and rantes variants related to enzymatice activity
US9296803B2 (en) 2010-03-11 2016-03-29 Health Research, Inc. Methods and compositions containing Fc fusion proteins for enhancing immune responses
TW201718851A (zh) * 2015-09-18 2017-06-01 通用醫院公司 具有抗化學排斥(anti-fugetactic)性質之經修飾自然殺手細胞及其用途
EP3813869B1 (en) 2018-05-28 2023-10-18 Université de Genève Ccr5 inhibitor for use in treating a neuroinflammatory disorder that involves cerebral inflammation
US11629196B2 (en) 2020-04-27 2023-04-18 Incelldx, Inc. Method of treating SARS-CoV-2-associated hypercytokinemia by administering a human monoclonal antibody (PRO-140) that inhibits CCR5/CCL5 binding interactions
US11402391B2 (en) 2020-12-21 2022-08-02 Incelldx, Inc. Methods of treating a long-hauler subject for chronic COVID-19 by administering a CCR5 or CCL5 antagonist

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01265099A (ja) 1987-10-08 1989-10-23 Stichting Rega Vzw 抗ｈｉｖ活性をもつ３’，−フルオロプリン−２’，３’−ジデオキシリボシド類
US5739103A (en) * 1993-11-12 1998-04-14 Dana-Farber Cancer Institute Chemokine N-terminal deletion mutations
WO1996017935A2 (en) * 1994-12-08 1996-06-13 Glaxo Group Limited Rantes peptide and fragments and compositions comprising it for treatment of inflammation
WO1997025427A1 (en) * 1996-01-12 1997-07-17 Genetics Institute, Inc. Beta-chemokine, h1305 (mcp-2)
WO1997035982A2 (en) * 1996-03-27 1997-10-02 Icos Corporation Monocyte chemotactic protein-5 materials and methods
FR2748938B1 (fr) * 1996-05-22 1998-07-31 Pasteur Institut Utilisation de molecules antagonistes de chemokines pour leur activite antivirale notamment contre un retrovirus de type vih
US6168784B1 (en) * 1997-09-03 2001-01-02 Gryphon Sciences N-terminal modifications of RANTES and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
AR013528A1 (es) 2000-12-27
NZ516027A (en) 2003-05-30
AU750606B2 (en) 2002-07-25
CN1148447C (zh) 2004-05-05
DK1439231T3 (da) 2007-11-05
US20050201977A1 (en) 2005-09-15
JP4233214B2 (ja) 2009-03-04
PT1019507E (pt) 2004-06-30
KR20010024213A (ko) 2001-03-26
HUP0003563A3 (en) 2005-11-28
NZ503235A (en) 2002-08-28
EP1439231A3 (en) 2004-12-22
ES2218860T3 (es) 2004-11-16
HK1032425A1 (en) 2001-07-20
KR20010024214A (ko) 2001-03-26
DE69823218T2 (de) 2004-08-26
US20050164936A1 (en) 2005-07-28
KR100560275B1 (ko) 2006-03-10
ATE263242T1 (de) 2004-04-15
CN1271385A (zh) 2000-10-25
HU226414B1 (en) 2008-11-28
IL135351A (en) 2006-08-20
CN1145693C (zh) 2004-04-14
EP1021541B1 (en) 2004-04-14
CN1490049A (zh) 2004-04-21
DE69838188D1 (de) 2007-09-13
JP4230659B2 (ja) 2009-02-25
US6905676B2 (en) 2005-06-14
PL197569B1 (pl) 2008-04-30
EA003942B1 (ru) 2003-10-30
DK1019507T3 (da) 2004-07-19
AU750341B2 (en) 2002-07-18
SK286495B6 (sk) 2008-11-06
ZA988676B (en) 1999-12-03
HUP0003505A3 (en) 2005-11-28
KR100542934B1 (ko) 2006-01-11
PT1439231E (pt) 2007-08-20
SK286439B6 (sk) 2008-10-07
CA2305017A1 (en) 1999-04-08
EE200000151A (et) 2001-02-15
HK1062637A1 (en) 2004-11-19
DK1021541T3 (da) 2004-08-02
CZ20001146A3 (cs) 2000-09-13
AU9442098A (en) 1999-04-23
SK4502000A3 (en) 2000-09-12
BG104267A (en) 2000-11-30
NZ503234A (en) 2002-06-28
EP1439231A2 (en) 2004-07-21
CZ20001147A3 (cs) 2000-09-13
ZA988675B (en) 1999-11-24
US6977071B2 (en) 2005-12-20
PT1021541E (pt) 2004-07-30
CN1233415C (zh) 2005-12-28
HU226468B1 (en) 2008-12-29
US7326411B2 (en) 2008-02-05
PL339545A1 (en) 2000-12-18
NO20001584L (no) 2000-03-27
EP1019507A1 (en) 2000-07-19
EP1439231B1 (en) 2007-08-01
DE69822856T2 (de) 2004-08-19
UA73080C2 (en) 2005-06-15
EP1021541A1 (en) 2000-07-26
WO1999016877A1 (en) 1999-04-08
EP1019507B1 (en) 2004-03-31
AR013529A1 (es) 2000-12-27
EP0906954A1 (en) 1999-04-07
DE69838188T2 (de) 2007-11-22
BR9812394A (pt) 2000-09-12
IL135352A (en) 2006-08-20
HK1032426A1 (en) 2001-07-20
PL196427B1 (pl) 2008-01-31
UA73081C2 (en) 2005-06-15
NO20001609D0 (no) 2000-03-28
ATE368742T1 (de) 2007-08-15
HUP0003505A2 (hu) 2001-02-28
US20030124677A1 (en) 2003-07-03
SK4512000A3 (en) 2000-09-12
CA2304827A1 (en) 1999-04-08
CN1271386A (zh) 2000-10-25
EA200000378A1 (ru) 2000-10-30
CZ299479B6 (cs) 2008-08-06
NO20001609L (no) 2000-03-28
JP2001518296A (ja) 2001-10-16
US20050220790A1 (en) 2005-10-06
BG64679B1 (bg) 2005-11-30
CY1110927T1 (el) 2015-06-10
JP2001518297A (ja) 2001-10-16
WO1999016876A1 (en) 1999-04-08
EA200000379A1 (ru) 2000-10-30
BR9812565A (pt) 2000-08-01
ES2215324T3 (es) 2004-10-01
ATE264390T1 (de) 2004-04-15
US20030119148A1 (en) 2003-06-26
EE200000152A (et) 2001-02-15
BG104266A (en) 2000-11-30
ES2287601T3 (es) 2007-12-16
PL339559A1 (en) 2000-12-18
BG64757B1 (bg) 2006-02-28
CZ299478B6 (cs) 2008-08-06
HUP0003563A2 (hu) 2001-02-28
EP0905241A1 (en) 1999-03-31
EP0905240A1 (en) 1999-03-31
US7338653B2 (en) 2008-03-04
DE69823218D1 (de) 2004-05-19
NO20001584D0 (no) 2000-03-27
DE69822856D1 (de) 2004-05-06
AU9747498A (en) 1999-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7326411B2 (en) Use of amino-terminally truncated RANTES to inhibit HIV viral replication
KR100393508B1 (ko) 인간 인터루킨 4의 안타고니스트 또는 부분적 아고니스트로서의 신규hIL-4 변이단백질
EP0544719A1 (en) Cytokine production
IE75902B1 (en) Interleukin-4-binding protein-gamma
MXPA00002881A (en) Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU